CN114751878B

CN114751878B - 一种BcTol1基因靶向剂及其应用

Info

Publication number: CN114751878B
Application number: CN202210316770.1A
Authority: CN
Inventors: 梁文星; 杨倩倩; 王雅梦; 张佳男
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-03-29
Also published as: CN114751878A

Abstract

本发明公开了一种BcTol1基因靶向剂及其应用。所述BcTol1基因靶向剂包括化合物5664‑0417、化合物6623‑1943中的至少一种。本发明经实验验证，BcTol1基因与灰葡萄孢的致病力相关，其敲除突变体能够明显降低植物灰霉病菌的致病力，并且BcTol1基因靶向剂可以与BcTol1蛋白的特定氨基酸残基结合，影响该蛋白的功能，最终达到灰霉病害防控的目的。此外，实验证实这两个小分子化合物对多种植物病原菌，例如稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌也有较好的防治效果，具有广谱抑菌性。

Description

一种BcTol1基因靶向剂及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种BcTol1基因靶向剂及其应用。

背景技术

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是蔬菜、水果种植上最为常见的一类病害，可侵染近1000种植物，造成严重的经济损失。作为一种死体营养型病原真菌，灰葡萄孢致病机制非常高效，在作物采收前后都可以造成严重危害。近年来我国保护地种植面积日益扩大，为灰霉病的大发生提供了极为有利的条件，造成严重损失。

灰葡萄孢以菌丝和分生孢子进行传播和侵染，生长和繁殖速度快，分生孢子数量巨大，极易造成病害的扩散和传播。此外，其分生孢子可在病残体中存活4-6个月，而由菌丝形成的菌核可存活长达数年，是病原菌初侵染的主要来源。分生孢子和菌核具有极强的环境耐受能力，可在极端条件下仍保持萌发或生长的能力。加上灰葡萄孢的寄主范围广，难以通过农业手段减少田间初侵染来源，因此灰霉病防治一直是生产上的难题。

虽然其他防治措施在灰霉病防治中也发挥一定作用，但目前该病害最为有效的防治手段仍然是化学防治。灰葡萄孢具有寄主范围广、生活周期短、基因易变异的特点，被认为是高风险的抗药菌，抗药问题给该病害的防治带来严重挑战。世界范围内灰葡萄孢对常见杀菌，比如苯并咪唑，二甲酰亚胺，苯吡咯，苯胺基嘧啶等的抗药情况已有广泛报道。不仅是灰葡萄孢，其他多种植物病原菌的抗药性甚至多药抗性水平的不断升高，给植物病害的防治带来极大困难。因此，寻找新的抑制植物病原菌的化合物或杀菌剂对于未来农业的发展具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种BcTol1基因靶向剂及其应用。所述BcTol1基因与灰葡萄孢的致病力相关，通过以BcTol1基因为靶标筛选得到两个化合物，其可以作为BcTol1基因靶向剂，实验验证发现其对多种植物病原菌具有广谱抑菌性。

为实现以上发明目的，本发明通过以下方案实现：

本发明提供了一种BcTol1基因靶向剂，所述BcTol1基因靶向剂包括化合物5664-0417、化合物6623-1943中的至少一种。

进一步的，所述化合物5664-0417的化学结构式为：

；所述化合物6623-1943的化学结构式为/>

。

进一步的，所述BcTol1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述BcTol1基因的敲除突变体具有抑制灰葡萄孢的致病力的作用。

进一步，所述BcTol1基因靶向剂能够与BcTol1基因表达的BcTol1蛋白结合，从而起到靶向BcTol1基因的作用。

进一步的，所述化合物5664-0417 与BcTol1蛋白的K76、R83、D120和K122形成疏水结构；所述化合物6623-1943与BcTol1蛋白的D120形成氢键，与K76、R83和K122形成疏水结构。

本发明还提供了所述的BcTol1基因靶向剂在抑制植物病原菌中的应用。

进一步的，所述BcTol1基因靶向剂的使用方法为：当植物生长至长出叶片时，将BcTol1基因靶向剂调配至使用浓度，给予植物整株喷施的处理。

进一步的，所述BcTol1基因靶向剂的使用浓度为10 µM~100 µM。

进一步的，所述病原菌包括灰葡萄孢、稻瘟病菌、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌。

进一步的，所述植物包括绿豆、水稻、小麦、番茄。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果：

1、本发明通过实验得到了一个灰葡萄孢中与其致病力相关的基因BcTol1。利用同源重组的方法对该基因进行基因敲除得到的基因敲除突变体，其抑制番茄、绿豆等多种植物的灰葡萄孢的致病力。

2、本发明利用分子对接的方法筛选到两个小分子化合物：5664-0417和6623-1943，均可以与BcTol1蛋白VHS功能域的特定氨基酸残基结合，影响该蛋白的功能，最终达到灰霉病害防控的目的。此外，实验证实这两个小分子化合物对多种植物病原菌，例如稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌也有较好的防治效果，具有广谱抑菌性。

附图说明

图1是BcTol1基因敲除的电泳检测结果，其中最左侧为Marker，B05.10为野生型，ΔBcTol1 为BcTol1基因敲除突变体；

图2是BcTol1基因敲除突变体不影响灰葡萄孢的生长，野生型B05.10和敲除突变体ΔBcTol1在PDA培养基上生长60小时后拍照结果，右侧对菌落直径进行测量和统计；

图3是BcTol1基因敲除突变体导致灰葡萄孢的致病力下降，Buffer为阴性对照，野生型B05.10和敲除突变体ΔBcTol1在绿豆叶片上接种后培养4天后结果，右侧对病斑直径进行测量和统计；

图4是化合物5664-0417和6623-1943与BcTol1的结合模式图；

图5是化合物5664-0417和6623-1943在10 µM浓度下显著抑制灰葡萄孢的致病力，NT是未做任何处理的阴性对照，孢子接种后4天后拍照，右侧是对病斑直径进行测量和统计；

图6是化合物5664-0417和6623-1943在10 µM浓度下显著抑制稻瘟病菌、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌的致病力，NT是未做任何处理的阴性对照，右侧是对病斑直径或者病情指数进行测量和统计；

图7是化合物5664-0417和6623-1943在100 µM浓度下对寄主植物生长无明显的影响；绿豆、水稻、小麦和番茄在出苗后喷施100 µM对应药剂，并以DMSO作为对照；寄主植物继续生长两周后拍照，右侧是对植物株高进行测量和统计。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料、药品、仪器等，如无特殊说明均为市售商品。下述实施例中的定量统计，均为三次重复实验，并取平均值。

实施例1：BcTol1的基因序列获取及敲除载体构建

本发明从Genebank获取灰葡萄孢BcTol1（Bcin09g07000）的基因序列，全长共5973bp（序列如SEQ ID NO.1所示），CDS序列长1371bp（序列如SEQ ID NO.2所示）编码456个氨基酸（序列如SEQ ID NO.3所示）。该蛋白属于Tom1-Like家族，包含VHS，GAT和一个C端结构域，与泛素货物蛋白的分选有关。

根据BcTol1基因的序列设计基因敲除载体，设计引物如表1所示：

表1：载体构建所用引物

利用CTAB法提取灰葡萄孢的DNA。利用上表中的引物以灰葡萄孢的DNA为模板，扩增BcTol1的up、down片段，利用HPH-F/R引物从pSilent-1质粒上扩增潮霉素基因（SEQ IDNO.12）。采用融合RCR的方法将三个片段连接成大片段BcTol1-up-HPH-down，最后利用BcTol1-K-F/R扩增大片段，预备进行原生质转化。

实施例2：灰葡萄孢BcTol1敲除突变体的构建及鉴定

敲除突变体的获得是通过PEG介导的原生质体转化进行。

（1）灰葡萄孢的分生孢子收集后加入用YEPD培养基（10% 酵母粉，20%蛋白胨，20%葡萄糖）培养幼植体，180 rpm，25°C，24-36小时后收集。

（2）用裂解酶（0.6M KCl，0.5%的Glucanex（购买自sigma））处理后得到灰葡萄孢的原生质，离心收集。

（3）用1 ml STC（0.8 M Sorbitol，50 mM Tris-HCl，50 mM CaCl₂）溶液重悬原生质，10 °C，5000 rpm离心2 min；弃上清，再用800 μl STC溶液重悬沉淀，逐滴加入200 μlSPTC（40 % PEG4000的STC溶液）溶液，冰上放置待用。每个转化原生质体量约10⁸。

（4）原生质体转化：将30 μg实施例1中PCR扩增的大片段加入到转化管中，轻轻混匀，冰上放置30 min；加入1 ml SPTC溶液，混匀，室温放置20 min；

（5）原生质复壁：将转化混合液加到50 ml三角瓶中，加入10-20 ml再生培养液SH（0.6 M 蔗糖，5 mM HEPES），25 °C，100 rpm摇培过夜；

（6）倒板：次日将恢复好的菌丝混入温度适中 (约45 °C) 的100-200 ml PDA（马铃薯 200克，葡萄糖 20克，琼脂 15~20克，蒸馏水1000毫升）培养基中，加入潮霉素（sigma）至100 μg/mL，倒平板，25 °C培养3-4 d后挑转化子。

分离到的转化子提取基因组，用鉴定转化子的引物进行扩增：

BcTol1-in-F：TTGAATTTGACTGACCATGGA（SEQ ID NO.13），

BcTol1-in-R：AGGGGGAAGGCGATGAGTA（SEQ ID NO.14）。

PCR鉴定图如图1所示，敲除突变体ΔBcTol1中已经无BcTol1基因的存在，不能扩增该片段。

实施例3：灰葡萄孢BcTol1敲除突变体ΔBcTol1的致病力检测

将实施例2筛选到的转化子ΔBcTol1在PDA培养基上25℃培养60小时，拍照并测量菌落大小。结果如图2所示，与野生型相比，ΔBcTol1的生长无明显差别。

利用1/2的PDB溶液（马铃薯 100克葡萄糖 10克，蒸馏水1000毫升）收集在PDA培养基上培养8天左右的野生型B05.10及ΔBcTol1的分生孢子，显微镜下调节其孢子浓度至10⁵/ml。将孢子液分别滴在绿豆叶片中央，保湿培养4天后拍照并测量叶片上的病斑直径。

具体结果见图3，与野生型相比，滴加ΔBcTol1的叶片上的病斑直径明显减小。说明BcTol1基因与灰葡萄孢的致病力密切相关，且该致病力的变化并不是由于其影响病原菌的生长引起的。

实施例4：以BcTol1为靶标筛选灰葡萄孢的有效药剂

利用MODELLER 9.11软件构建了BcTol1的3D结构，利用该3D结构定向筛选ChemDiv数据库，结果显示有两个化合物可与BcTol1蛋白结合。

其中，化合物5664-0417的具体化学结构如下所示：

；

化合物6623-1943的具体化学结构如下所示：

。

具体结果如图4所示，5664-0417与BcTol1的K76、R83、D120和K122形成疏水结构，6623-1943与D120形成氢键，与K76、R83和K122形成疏水结构。

实施例5：5664-0417和6623-1943对灰霉病的抑制试验

收集在PDA培养基上培养8天左右的野生型B05.10的分生孢子，显微镜下调节其孢子浓度至10⁵/ml。化合物5664-0417和6623-1943分别用DMSO溶解为100 mM母液，稀释后加入孢子液中，调整最终浓度为10 µM。将孢子液分别滴在绿豆叶片中央，保湿培养4天后拍照并测量病斑直径。

结果见图5，与对照组相比，10 µM的5664-0417和6623-1943显著抑制灰葡萄孢的致病力。

实施例6：5664-0417和6623-1943对稻瘟病菌、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌的抑制试验

1、收集燕麦琼脂培养基（20%的燕麦，15%琼脂粉）上的稻瘟病菌的分生孢子，调整浓度至10⁵/ml。化合物5664-0417和6623-1943分别用DMSO溶解，加入孢子液中调整最终浓度为10 µM，以0.1% DMSO作为对照。2周大小的水稻剪下叶片，滴上准备好的孢子液，3天后拍照，并测量病斑直径。

2、禾谷镰刀菌PDA培养基上生长3天后，加入绿豆培养基（1%绿豆汤）中光照180rpm，25°C培养3天后收集分生孢子，调整浓度至10⁵/ml，以0.1% DMSO作为对照。化合物5664-0417和6623-1943分别用DMSO溶解，稀释后加入孢子液中调整最终浓度为10 µM。小麦胚芽生长12-24小时后去掉顶部叶鞘，在伤口处滴上孢子液，3天后拍照，并测量病斑直径。

3、尖孢镰刀菌PDA培养基上生长3天后，加入PDB培养基中培养1-2天后收集分生孢子，调整浓度至10⁵/ml，以0.1% DMSO作为对照。化合物5664-0417和6623-1943分别用DMSO溶解，加入孢子液中调整最终浓度为10 µM。番茄幼苗在蛭石上生长2周后，将小苗从蛭石中拔出并清洗根系，造成微伤口。根系分别浸入对照，10 µM 5664-0417和10 µM 6623-1943中5分钟后种回蛭石中。3周后拍照并对番茄苗进行病情分级。

结果如图6所示，与对照组相比，10 µM的5664-0417和6623-1943显著抑制稻瘟病菌、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌的致病力。

实施例7：5664-0417和6623-1943对寄主植物生长无明显影响

两种药剂5664-0417和6623-1943分别用DMSO溶解至100 mM，吸取1ml母液加入999mL水中，配成终浓度为100 µM 5664-0417及100 µM 6623-1943备用。

绿豆和番茄出芽至两片真叶刚长出、水稻和小麦有一片叶子展开这个时期，整株喷施100 µM 5664-0417或者100 µM 6623-1943溶液，以0.1% DMSO作为对照。2周后拍照并测量植物的高度。

结果如图7所示，与对照组相比，5664-0417和6623-1943在100 µM浓度下对寄主植物生长无明显的影响，说明这两种化合物不会影响植物的正常生长。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种BcTol1基因靶向剂及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5973

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgctcttc ctcttaagaa gcccgaattg ctttctatct ttgggtacga tgcaccggtg 60

ccaagtcaga gtaacattgg aaacagccga tattcgtatg ggatggaagc tattttggat 120

ctcaatataa ctgacactcc catcgatatc tcattgcaaa tcgcaagcaa cggtactctt 180

attgctggag gtaagatgag ttcgatacac ccaacaagac agcacatgtt aacaacctgt 240

ataggtggaa gcggctcaaa cgccccgcca tatatctctg ccccttttga tgcgctacag 300

gaacaagctt ataatgatga cacaagtatt ttctgggact gtaagtttat gtcgttttat 360

gtttttaagt cttactcata gatcatagtt gtttccgttg accccgacgt tgatgccggc 420

tcggatgctt gccttgtgtt cctcaacgca tattctatcg agaatagtga tagacctggt 480

ctttatggtt agttcagcat tccctgccgc acttgagaag tctaatacta acacatgcag 540

atgacttctc tgataccttg gtaaataatg ttgcatcaaa atgcaataac acaattgtga 600

ccattcataa tgttgggata cgcctggttg atcaatggat cgagcatcca aacgtcacgg 660

ccgtgatttt tggtcatctg cccggtcaag atagtggtcg agcacttgtt aaattgttgt 720

acggtgttga atcgttctcc ggtaaattgc catatacgat cgcaaagaac gagtcagatt 780

acaatgtgta taaccactcg gcacctgagg gtatttatac acaattccca cagagcgatt 840

tttcagaggg tgtttatctc gattatcgcg attttgatgc tcaaaatata actccaagat 900

ttgaatttgg attcggatta acatacacta cttttgagta ttccgacctt tcgagctcag 960

ttgtttcgaa tgcgagcaca gcttacttcc cgccaattac caccatcatt cagggtggag 1020

cccagtctct ctgggacgtt gtcgcaaagg ttcaagcaac tgtgtcaaac aacggaacaa 1080

tgactgccat ggaggttgca cagttgtatg tcggtattcc gaatggacca gtcagacagt 1140

tgagaggttt cgagaaggtc aacataccag ttggagaaag cgcggttgtg gaatttgagt 1200

tgacgagaag ggatttgagt gagtggagcg tggaggaaca aagttgggta ttacaacagg 1260

gaagttatgg gatctgggtt ggatcgagta gtagggattt gccattgagt ggaaatttga 1320

tcattggagg atcgtgagat tgagagggat agtagatgaa tcgccaacgg gaatgaatag 1380

taatgataat gatacaacca tcaaacccag agtttcaatt cttcacgaca actagagcct 1440

gcttgcttgt gttgtgcgct ctctaaggtt atcgtgtgag attgtaggaa tgccttgcac 1500

actctgttgt atcacgacgc tcctcaccaa agtcccccgg tgccatgtat cccttttggg 1560

tatgaatgaa tgcagagctt ccttcacgga ggaatatcaa cattcgttcc tccataagct 1620

tcgcatcgat acaggacatc ccgtgatcta ctcggagact tcagaaatcg caccacgaca 1680

aatctcttcg taatcttatg ccagctcaac cgttgctggt gtatggtttc tcctccatat 1740

gaagtgattc tgcggcaaac tgtcaaagta cgtgttctgc aagctccacg tgttcttgac 1800

gtgtcattag cctcaacact agattggggt tgaggttggt gttggtgtgt cagatctggt 1860

ccgcaagctt gccaatttat ccttgagctc tctccacttg cagcgttcag gctctcttga 1920

agaacatttg cagagcccta ttaataacat cgcggccact ttccaaatga cgacaagctc 1980

agccaccatc caatcaatcc ggcaatccgg ggatgttagc gttcgctcga ggtcgatagg 2040

atgaggcgtg tttgtttcat cgctatgcaa ttatacacag tacacagcac gcagtacgag 2100

atataccgtg atcttgaggg gaaggctgtg ttgcttggcg acggcgatga tttgtgaagc 2160

gactgttgag ggttacgacg aggtgacgaa ctcaaactgg atactgattg ccacatgatg 2220

gctttgagga caagctggcg gggaggtagt taggtagcca ggttcttgtt ctttgtccca 2280

gtatatggat cgtacctcag gatgtattta agccgtttca gacatagtag ctatcattgt 2340

cgacgacaaa atccatccac ggtacaagta gttcaaagta aatcttccat tcggaaacat 2400

tcacaggacc attctccgtc tcctccttct tccccttcgc cttcctcttc tcattcttac 2460

ctgccaattg aagagataca ctgaaatttt tgaccggatt gggatttgat aaaaactacg 2520

ccgcaccgct gcattttcca aattgctatc aattgccatc aattgctatc atatcagcct 2580

tctaccgcct tgccaaaaat aaccgcccat caaataaaaa tctactttcc ttccttgaaa 2640

atttaatata caggaaaaca tctcgaagaa tatccaagag aacgaaacaa actgtgtatc 2700

gaaaatatca gttgaaactt catgcagaac atcgacggtc cacagcctat ggtgatataa 2760

tctaagcaac ggctttcgtt atcgcagtac atcgcatctc gctatcacat tccctacaag 2820

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gcagtcacag ccatgaaagc catgaagaat atgggcatga atcgcatgct gggttcactg 2940

aagcgatgta ggtagatctc ggaggagttc cactacttat gcgccataaa gtaagggcgt 3000

tgatttgaat ttgactgacc atggatattc tctcttttag ccaaagactc caatgaagaa 3060

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tctcgaaaat gaccgaaagt tatagtattg atcgtaatac agcgctcgtt ctgcgaatct 3180

gggggtccaa atggttcggt atgtacattc actcgactgc gaatctcctt tcaccaagtg 3240

gcatatctaa cattttacag ggtgaagaag ttggttatct gcctgcgata gttgaagccg 3300

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aggacaacca cagcaaagcc tacgtacaat ataatgcaat tatgttgatt cggatcctga 3420

ccgataaccc tggaatgacc tttacgagga atatcgatgc gaaatttgta caaacggtca 3480

aggagcttct gagaactgga agagatccaa gtgttaagca gatattgatg gaaactttga 3540

tcacattcac gagagacaag gcaaacgatg aaacattggc tcctcttatt gagatgtgga 3600

agaaagagca agagaaaatg atgaaagtag cagcaagttc ccccaagcat tatggtcgac 3660

gaatttactc ttctaataca tcgcagggtc cggcaggtcc ggcaggtccg cgaaccctca 3720

tcgctccacc ctttgatcct aattcgcaaa attacttcgg gcgaaatcac catactcatc 3780

gccttccccc tccacacgaa ctctcgtccc gtatcgaaga ggcacgcact tccgcaaaac 3840

tcctctccca agtcgtacaa tctacacctc cttccgaact tcttgctaat gaacttatcc 3900

gcgaatttgc tgatcgttgt caatctgcaa gcagaagtgt acaagcgtac atggtttcag 3960

aaaatccagc accggacaat gataccatgg aaaccttaat tgagaccaat gaacaattaa 4020

gtaaagctat gaatcaacat caaagagcag tgctacatgc gcggaaactc atggggcttg 4080

ggaatggaga tagtactcct ccggcaggaa caagctcggg atttacacca ccacctggtc 4140

cgccacccaa ccaagtttca aaacctgtcc caagtaatgg taagagatca gtgccaccga 4200

ttcctccacc aggagatatc gcgcctatgg atgacgagga cgatgaacga aatcctttca 4260

gtgacccaga gccaaactca tcaaggagac caccattccc atctgatgcg ccaccgaaaa 4320

cgactgctca gttcaatgat actcttggtg tcgaaccata tcaccctgga ttcaaagaaa 4380

ccaagagcta tgtcggaagg caagatagta gtataggcaa tgtcacaatg catgctgcag 4440

ttaatgagca gttatcagat gatgaggacg acgagccaag atactcagta gctcagggta 4500

agcaacctgt ctatcgatac tagatgattt tgaaggatat ataacgcacg ggtaaagaga 4560

tttcagatct tggggtggat attgaagaat tgatgcattt acgatttgat ggatgtatat 4620

tggagcgatc ttttcgggtt gagagcgaag cggcattttg ataccttggg gttataagat 4680

tactaagcgg agttttaatg ggtggtagta gctgtcaatt taagatcgag attatattct 4740

ttcgatccga ttttccttca catcttgaat cacaggactg gtccaagaga ttggacggat 4800

tggatcaatg tattagatca atcgggctct gatgctattc ccactgtatg ttagcccatt 4860

ccccactgcg gaatcatcat ttgcaggctg atagattgga atgcatccaa cgctcaaggt 4920

ggtatgtcag aaggtctcca tccgcctctg acgttaatcc ccgcatgatt ttaggctaag 4980

acgttcgaag tgtattgtag attgaaaggg ctggaaggca ccggaaactt tgggatcgta 5040

tcgtcaatgc ttcatcccat ctatgagaat ttccggtccc gaatccgaga ttatcactat 5100

gcaggtacat attcaagtac ttgtcatggg aaagttatga caaaattctc atatctaaca 5160

aagattgggc gaactcatta tcaaccgcct atcaatctta taaaaaacgc ctatcaacac 5220

accccactaa tatacagttg atgtatggat ctagcttgag ccgaacttta ccccacccga 5280

gcttcgagct tccttattag gttaatcccc tgacctctcc ccgccatctc ggaaataccc 5340

ttggctcggg gtctaatatc aacgtgagga tggaagccaa tgagataaca actgaacagt 5400

caattagatc ttcaagcaag tacctcgtat gagactcatt caaggttttt tccaatcatt 5460

agatggggaa cttacgcggc tcagccatga ttcctatcgt tgtgttgcgg tgtcagatat 5520

acctgcaagt tcctgcatta tcaataactc tagataatga caaaccgatt tcggtgttca 5580

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cattcttggc cccattgcca tcaccttttt gtacaaattt tcggcttgaa gtttcaagat 5820

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aaaagctaca tcgataccac taaactcgac ctcagttaat gatggaaaga atggagccgt 5940

tgctagtgaa agttctattt gcacagacat tgg 5973

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaagcca tgaagaatat gggcatgaat cgcatgctgg gttcactgaa gcgatccaaa 60

gactccaatg aagaaactgg agaccctcag cacgatacac ccgaagcaaa tgcagccaga 120

aatattcgct cgttctgcga atctgggggt ccaaatggtt cgggtgaaga agttggttat 180

ctgcctgcga tagttgaagc cgcagaatcc tctccgggag ctgcgaaaga atgcgcctac 240

catattcgaa agttcctctc caaggacaac cacagcaaag cctacgtaca atataatgca 300

attatgttga ttcggatcct gaccgataac cctggaatga cctttacgag gaatatcgat 360

gcgaaatttg tacaaacggt caaggagctt ctgagaactg gaagagatcc aagtgttaag 420

cagatattga tggaaacttt gatcacattc acgagagaca aggcaaacga tgaaacattg 480

gctcctctta ttgagatgtg gaagaaagag caagagaaaa tgatgaaagt agcaggtccg 540

gcaggtccgg caggtccgcg aaccctcatc gctccaccct ttgatcctaa ttcgcaaaat 600

tacttcgggc gaaatcacca tactcatcgc cttccccctc cacacgaact ctcgtcccgt 660

atcgaagagg cacgcacttc cgcaaaactc ctctcccaag tcgtacaatc tacacctcct 720

tccgaacttc ttgctaatga acttatccgc gaatttgctg atcgttgtca atctgcaagc 780

agaagtgtac aagcgtacat ggtttcagaa aatccagcac cggacaatga taccatggaa 840

accttaattg agaccaatga acaattaagt aaagctatga atcaacatca aagagcagtg 900

ctacatgcgc ggaaactcat ggggcttggg aatggagata gtactcctcc ggcaggaaca 960

agctcgggat ttacaccacc acctggtccg ccacccaacc aagtttcaaa acctgtccca 1020

agtaatggta agagatcagt gccaccgatt cctccaccag gagatatcgc gcctatggat 1080

gacgaggacg atgaacgaaa tcctttcagt gacccagagc caaactcatc aaggagacca 1140

ccattcccat ctgatgcgcc accgaaaacg actgctcagt tcaatgatac tcttggtgtc 1200

gaaccatatc accctggatt caaagaaacc aagagctatg tcggaaggca agatagtagt 1260

ataggcaatg tcacaatgca tgctgcagtt aatgagcagt tatcagatga tgaggacgac 1320

gagccaagat actcagtagc tcagggtaag caacctgtct atcgatacta g 1371

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Ala Met Lys Asn Met Gly Met Asn Arg Met Leu Gly Ser Leu

1 5 10 15

Lys Arg Ser Lys Asp Ser Asn Glu Glu Thr Gly Asp Pro Gln His Asp

20 25 30

Thr Pro Glu Ala Asn Ala Ala Arg Asn Ile Arg Ser Phe Cys Glu Ser

35 40 45

Gly Gly Pro Asn Gly Ser Gly Glu Glu Val Gly Tyr Leu Pro Ala Ile

50 55 60

Val Glu Ala Ala Glu Ser Ser Pro Gly Ala Ala Lys Glu Cys Ala Tyr

65 70 75 80

His Ile Arg Lys Phe Leu Ser Lys Asp Asn His Ser Lys Ala Tyr Val

85 90 95

Gln Tyr Asn Ala Ile Met Leu Ile Arg Ile Leu Thr Asp Asn Pro Gly

100 105 110

Met Thr Phe Thr Arg Asn Ile Asp Ala Lys Phe Val Gln Thr Val Lys

115 120 125

Glu Leu Leu Arg Thr Gly Arg Asp Pro Ser Val Lys Gln Ile Leu Met

130 135 140

Glu Thr Leu Ile Thr Phe Thr Arg Asp Lys Ala Asn Asp Glu Thr Leu

145 150 155 160

Ala Pro Leu Ile Glu Met Trp Lys Lys Glu Gln Glu Lys Met Met Lys

165 170 175

Val Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Thr Leu Ile Ala Pro

180 185 190

Pro Phe Asp Pro Asn Ser Gln Asn Tyr Phe Gly Arg Asn His His Thr

195 200 205

His Arg Leu Pro Pro Pro His Glu Leu Ser Ser Arg Ile Glu Glu Ala

210 215 220

Arg Thr Ser Ala Lys Leu Leu Ser Gln Val Val Gln Ser Thr Pro Pro

225 230 235 240

Ser Glu Leu Leu Ala Asn Glu Leu Ile Arg Glu Phe Ala Asp Arg Cys

245 250 255

Gln Ser Ala Ser Arg Ser Val Gln Ala Tyr Met Val Ser Glu Asn Pro

260 265 270

Ala Pro Asp Asn Asp Thr Met Glu Thr Leu Ile Glu Thr Asn Glu Gln

275 280 285

Leu Ser Lys Ala Met Asn Gln His Gln Arg Ala Val Leu His Ala Arg

290 295 300

Lys Leu Met Gly Leu Gly Asn Gly Asp Ser Thr Pro Pro Ala Gly Thr

305 310 315 320

Ser Ser Gly Phe Thr Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro Asn Gln Val Ser

325 330 335

Lys Pro Val Pro Ser Asn Gly Lys Arg Ser Val Pro Pro Ile Pro Pro

340 345 350

Pro Gly Asp Ile Ala Pro Met Asp Asp Glu Asp Asp Glu Arg Asn Pro

355 360 365

Phe Ser Asp Pro Glu Pro Asn Ser Ser Arg Arg Pro Pro Phe Pro Ser

370 375 380

Asp Ala Pro Pro Lys Thr Thr Ala Gln Phe Asn Asp Thr Leu Gly Val

385 390 395 400

Glu Pro Tyr His Pro Gly Phe Lys Glu Thr Lys Ser Tyr Val Gly Arg

405 410 415

Gln Asp Ser Ser Ile Gly Asn Val Thr Met His Ala Ala Val Asn Glu

420 425 430

Gln Leu Ser Asp Asp Glu Asp Asp Glu Pro Arg Tyr Ser Val Ala Gln

435 440 445

Gly Lys Gln Pro Val Tyr Arg Tyr

450 455

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttcaggctc tcttgaagaa 20

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacctccact agctccagcc aagccatatt cttcatggct 40

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atagagtaga tgccgaccgc gggttatcgt caatgcttca tccc 44

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgctgatgc tgtgagttca 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcttggctg gagctagtgg aggtc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacccgcggt cggcatctac tctat 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ataccgtgat cttgagggga a 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggaaggta aggctgctaa g 21

<210> 12

<211> 1445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taaaatgcgg tggcggccgc tctagaacta gtggatcccc cgggctgcag gaattcgata 60

tcaagctttg gaggtcaaca catcaatgcc tattttggtt tagtcgtcca ggcggtgagc 120

acaaaatttg tgtcgtttga caagatggtt catttaggca actggtcaga tcagccccac 180

ttgtagcagt agcggcggcg ctcgaagtgt gactcttatt agcagacagg aacgaggaca 240

ttattatcat ctgctgcttg gtgcacgata acttggtgcg tttgtcaagc aaggtaagtg 300

gacgacccgg tcataccttc ttaagttcgc ccttcctccc tttatttcag attcaatctg 360

acttacctat tctacccaag catccaaatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc 420

gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc 480

gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat 540

agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg 600

ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gagttcagcg agagcctgac ctattgcatc 660

tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt 720

ctccagccgg tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc 780

gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata 840

tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt 900

gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc 960

cggcacctcg tgcatgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata 1020

acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 1080

atcctcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg 1140

aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgc ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt 1200

gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt 1260

cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc 1320

agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga 1380

cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtaggt cgacctcgag ggtcccgatc 1440

agtat 1445

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttgaatttga ctgaccatgg a 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agggggaagg cgatgagta 19

Claims

1.一种BcTol1基因靶向剂在抑制植物病原菌中的应用，其特征在于，所述BcTol1基因靶向剂包括化合物5664-0417、化合物6623-1943中的至少一种；

所述化合物5664-0417的化学结构式为：

；所述化合物6623-1943的化学结构式为：/>

；所述植物病原菌选自灰葡萄孢、稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BcTol1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述BcTol1基因的敲除突变体具有抑制灰葡萄孢的致病力的作用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BcTol1基因靶向剂能够与BcTol1基因表达的BcTol1蛋白结合，从而起到靶向BcTol1基因的作用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物5664-0417 与BcTol1蛋白的K76、R83、D120和K122形成疏水结构；所述化合物6623-1943与BcTol1蛋白的D120形成氢键，与K76、R83和K122形成疏水结构。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BcTol1基因靶向剂的使用方法为：当植物生长至长出叶片时，将 BcTol1基因靶向剂调配至使用浓度，给予植物整株喷施的处理。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述BcTol1基因靶向剂的使用浓度为10 µM~100 µM。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括绿豆、水稻、小麦、番茄。