CN114736919B

CN114736919B - 通过编辑碳酸酐酶基因培育抗旱玉米的方法及其应用

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Publication number: CN114736919B
Application number: CN202011535209.XA
Authority: CN
Inventors: 王瑜; 巩志忠; 杨欣欣
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN114736919A

Abstract

本发明公开了一种培育抗旱玉米的方法，包括敲除目的玉米中碳酸酐酶基因，得到抗旱能力高于所述目的玉米的抗旱玉米。本发明提供的碳酸酐酶基因经CRISPR‑Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下突变体植株生长明显优于对照植株，说明碳酸酐酶基因突变能够显著提高植物抗旱性。本发明实例中采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术获得了抗旱的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明碳酸酐酶基因在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

Description

通过编辑碳酸酐酶基因培育抗旱玉米的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及通过编辑碳酸酐酶基因培育抗旱玉米的方法及其应用。

背景技术

干旱是全球范围内最严重的非生物胁迫之一，干旱胁迫使植物生长发育受阻，植株矮小，作物产量和品质下降，给农业生产带来严重危害，是影响农业生产的世界性难题。因此，寻找参与植物干旱响应的基因，利用转基因过表达或基因编辑等技术突变这些基因，可以为分子育种和种质改良、提高作物抗逆性，提供候选基因资源。通过基因工程的方式进行抗逆新品种培育，可以提高育种效率，缩短杂交和筛选时间，且育种方向确定，是改良作物性状的有效方法之一，对增强作物抵抗生物和非生物逆境的能力，提高作物产量和品质，缓解粮食短缺具有重要意义。

玉米(Zeamays)是三大粮食作物之一，也是重要的饲料作物，属于禾本科玉蜀黍属。随着B73和Mo17等玉米自交系基因组测序的完成，玉米的遗传背景更加清楚。同时，易于遗传转化的自交系不断被测序和开发，使转基因过表达和基因编辑技术的效率大大提高，例如LH244自交系。该自交系转化效率高于目前已知的绝大多数自交系，易于通过转化获得转基因过表达或基因编辑植株，这些为利用分子育种进行遗传性状改良提供了技术支持，对减轻干旱等非生物胁迫造成的玉米减产具有应用价值。

CA(碳酸酐酶)是一种与光合作用密切相关的金属酶，能够高效可逆地催化CO₂与HCO₃ ^-之间的转化，是CO₂浓缩机制的重要组分。生物体内的碳酸酐酶是一个多基因家族，目前依据晶体结构和亚基组成，可将其分为α、β、γ、δ、ε及θ等6个亚家族。高等植物碳酸酐酶的主要功能是参与光合作用，如将衣原体CA基因过表达于烟草后显著提高了转基因植株的光合速率和生物学产量。此外，CA还参与植物呼吸作用、pH调节、氨基酸及脂质的代谢、气孔运动、非生物胁迫等生理过程。如玉米碳酸酐酶突变体植株的气孔导度明显高于野生型，并随着CO₂分压的增加，气孔关闭速度变慢。而气孔的打开与关闭和水分蒸腾速率有着密不可分的联系，因此研究碳酸酐酶CA的作用机制，在植物抗旱中具有重要的应用前景。目前植物中CA家族蛋白的功能研究主要集中在参与光合作用的调节。CA在单子叶作物玉米中参与干旱响应的作用还不十分清楚。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗旱性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种培育抗旱玉米的方法。

本发明所提供的培育抗旱玉米的方法，包括敲除目的玉米中碳酸酐酶基因，得到抗旱能力高于所述目的玉米的抗旱玉米。

上述方法中，所述碳酸酐酶基因，是如下A1-A3中任一的DNA分子：

A1编码区如序列表中序列1或序列2所示的DNA分子；

A2在严格条件下与A1限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

A3来源于玉米且与A1限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

其中，序列表中的序列1由8517个核苷酸组成，序列表序列2为序列表序列1第2572位到第7616位核苷酸，CDS为序列表序列2，编码序列表中的序列3所示的蛋白质。

上述方法中，所述敲除目的玉米中碳酸酐酶基因通过CRISPR/Cas9基因编辑方法实现。

所述CRISPR/Cas9基因编辑方法，其sgRNA的靶序列为序列表序列1第2645-2663位。

本发明还提供培育抗旱玉米的方法在玉米育种中的应用。

本发明还保护上述表达所述sgRNA的载体。

所述表达所述sgRNA的载体在玉米育种中的应用，或在培育抗旱玉米中的应用，或在编辑碳酸酐酶基因中的应用也属于本发明的保护范围。

上述碳酸酐酶基因编码的蛋白质也是本发明保护的范围。

上述蛋白质，是如下a1-a4中任一蛋白质：

a1序列表中序列3所示的蛋白质；

a2将序列表中序列3所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由其衍生的蛋白质；

a3在a1所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

a4来源于玉米且与a1具有98％以上同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质。

上述蛋白质中，序列表中的序列3由452个氨基酸残基组成。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

与上述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明提供的与蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码上述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，B1)所述的核酸分子为如下A1-A3中任一的DNA分子：

A1编码区如序列表中序列1或序列2所示的DNA分子；

8、本发明还保护Y1-Y3中任一的应用：

Y1上述蛋白质或上述生物材料在调控植物抗旱性中的应用。

Y2降低上述蛋白质活性或含量的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用；

Y3抑制编码上述碳酸酐酶基因表达的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用。

上述应用中，Y2或Y3所述物质为CRISPR/Cas9系统；

所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：

1)sgRNA，所述sgRNA的靶点为序列1第2645-2663；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

本发明还提供上述CRISPR/Cas9系统。

本发明提供的碳酸酐酶基因经CRISPR-Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下突变体植株生长明显优于对照植株，说明碳酸酐酶基因突变能够显著提高植物抗旱性。本发明实例中采用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了抗旱植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明碳酸酐酶基因在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

本发明构建的CRISPR-Cas9基因编辑技术突变碳酸酐酶基因的突变体植物的抗旱能力显著提高，在干旱条件下，其叶片萎蔫程度相较于野生型不明显，叶片相对含水量更高。本发明提供的抗旱植物选育方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强，显著缩短了抗旱育种的周期，提高了抗旱育种的效率。

附图说明

图1为玉米ZmCA1CRISPR-Cas9突变位点突变位点。

图2为野生型玉米(对照)和突变株系干旱处理后植株生长情况照片。其中，WT为野生型玉米，0860-1为T2代ZmCA1 CRISPR-Cas9突变株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Takara公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。

玉米生态型为B73，记载在如下文献中：Zhang et al.The genetic architectureof nodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018.。

以下实施例中所用转录本为T01，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。

农杆菌菌株是EHA105。

CRISPR/Cas9载体pBUE411，记载在如下文献中：Xing HL,Dong L,Wang ZP,ZhangHY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327；A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1

一、基因的获得

为研究植物抗旱的分子机制，我们利用CRISPR/Cas9技术从玉米(Zea mays L.)基因组中定向突变了ZmCA1。

玉米ZmCA1基因由8517个核苷酸(核苷酸序列如序列表序列1所示)组成。T02转录本的读码框为序列1第2572位到第7616位核苷酸，CDS为序列表序列2，编码序列表序列3所示的蛋白质。该基因由15个外显子组成，其中编码外显子13个，T02转录本读码框第1位到第141位核苷酸，第523位到第587位核苷酸，第716位到第764位核苷酸，第1594位到第1710位核苷酸，第1811位到第1950位核苷酸，第2096位到第2201位核苷酸，第2332位到第2463位核苷酸，第3326位到第3387位核苷酸，第3562位到第3610位核苷酸，第4236位到第4352位核苷酸，第4447位到第4586位核苷酸，第4721位到第4826位核苷酸，第4911位到第5045位核苷酸，其余为其内含子序列。基因来源于玉米自交系B73。由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本发明保护范围内。

二、构建编辑ZmCA1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体

选取ZmCA1基因中CCTCGTCACTCCTTCAGAA(序列1第2645-2663位)作为该基因的靶点，设计包含靶点信息的引物CA1-ID-1f和CA1-ID-1r:

CA1-ID-1f：GGCGTTCTGAAGGAGTGACGAGG(下划线指示的序列与CA1-ID-1r中下划线指示的序列反向互补)；

CA1-ID-1r：AAACCCTCGTCACTCCTTCAGAA(下划线指示的序列与CA1-ID-1f中下划线指示的序列反向互补)。

载体构建方法：

(1)退火

合成引物，稀释后进行退火，得到带粘性末端的双链DNA片段gRNA，具体为：

将引物CA1-ID-1f和CA1-ID-1r退火获得带粘性末端的双链DNA片段gRNA。

(2)pBUE411载体(该载体含有3×FLAG-NLS-zCas9-NLS表达系统和用于插入靶序列的gRNA支架)用BsaI(NEB)酶切，得到酶切后的pBUE411。

表1为酶切体系

(3)连接

针对ZmCA1基因的重组CRISPR载体：

将步骤(1)的带粘性末端的双链DNA片段gRNA、步骤(2)得到的酶切后pBUE411连接，得到连接产物，即为重组CRISPR载体pBCXUN-ZmCA1 CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA。sgRNA识别区的编码序列为序列1第2645-2663位。

上述连接体系如表2所示：

表2为连接体系

(4)鉴定

取5μl步骤(3)得到的连接产物转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆。

针对转入ZmCA1基因的重组CRISPR载体的单克隆，PCR鉴定所需引物为OsU3-FD3和TaU3-RD。挑选阳性克隆(得到831bp的克隆为阳性)，提取质粒送去测序。

测序引物均采用OsU3-FD3和TaU3-RD：

OsU3-FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC

TaU3-RD:CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC

测序结果显示，获得重组CRISPR载体pBCXUN-ZmCA1 CRISPR-Cas9(该载体针对ZmCA1基因，表达sgRNA，sgRNA识别区的编码序列为序列1第2645-2663位)。

三、CRISPR/Cas9基因编辑植株的构建和鉴定

1、ZmCA1基因编辑植株的构建和鉴定

将构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体pBCXUN-ZmCA1 CRISPR-Cas9通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆，命名为EHA105/pBCXUN-ZmCA1CRISPR-Cas9。

将鉴定正确的农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmCA1 CRISPR-Cas9单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD₆₀₀在0.8-1.0之间。

将重组菌EHA105/pBCXUN-ZmCA1 CRISPR-Cas9采用农杆菌介导法转入硬秆自交系B73(以下也称为野生型玉米)，B73的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转化苗。构建方法参考：Zhang et al.The genetic architectureofnodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018。

提取T0代转化苗的DNA作为模板进行PCR扩增并测序，以B73玉米为对照。

扩增所需引物为CA1-CRISPR-F和CA1-CRISPR-R，得到345bp为阳性。

CA1-CRISPR-F:ATGAGCAGCTGCCTCTGC；

CA1-CRISPR-R:CGATGTTGCGGACGGTGAATG。

测序引物为CA1-CRISPR-F。测序结果如图1所示，可以看出，与野生型玉米B73(下面序列)相比，T0代转化苗(上面序列)中ZmCA1基因中有突变造成移码(突变为序列1第2651位1bp缺失)，导致蛋白序列改变，蛋白功能被破坏。

将含有该突变形式的转化苗命名为阳性ZmCA1基因T0代CRISPR-Cas9突变玉米。

阳性ZmCA1基因T0代CRISPR-Cas9突变玉米经过自交去掉Cas9，培育获得ZmCA1基因T2代CRISPR-Cas9突变玉米，得到ZmCA1基因编辑的株系命名为0860-1。

四、ZmCA1基因CRISPR-Cas9突变玉米旱处理表型检测

1、在装有110g营养土的小盆中播种T2代ZmCA1基因突变株系0860-1、野生型玉米B73(WT)种子各3盆，每盆播种4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，出苗后将长势不齐一株苗去掉，每盆留3株苗，在托盘里加入1L水，吸满后将水倒掉，持续不浇水14天(干旱处理)。观察对照和转基因植株旱处理表型。

图2显示ZmAE1 CRISPR突变的植株0860-1生长状况均强于对照，叶片萎蔫程度低于对照，说明转基因植株比对照抗旱。

统计干旱处理14天后，各株系的存活率(将表现为能正常生长植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)，可以看出，T2代CRISPR-Cas9突变玉米干旱处理后，0860-1的存活率为78.5％，野生型玉米干旱处理后的存活率为49％。

因此，抑制ZmCA1蛋白表达或者敲除ZmCA1基因能够提高玉米耐旱性。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 通过编辑碳酸酐酶基因培育抗旱玉米的方法及其应用

<130> GNCSY203237

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8517

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 1

tctccgccct tgtctgggcg ttacggcagg caagccccct cgttttcttc tgctcgcgtt 60

ctccttccat gtccacatct cctgtgccac cgcacgcaag gtgccaacgc tccctcgccg 120

cagtagcatc gcgtccacac aaactgcacc tccactagat acggcggtga tccggcgaga 180

gagcgcgaca cgcacaggcc agctagcgtt tctccgacgc cgcgcgtttc atcatttccc 240

gcttcccctg cccccggccg cgcgcgcgcg cccgtgtggt ccagaccagg acgcgcgcgg 300

atgtgcatcc ggcgcgcgcc cgtcggccac acggtgccgc cgcgcgttat cccgagccct 360

gtcctgtcct gtcctgttcc atctcgcgcg cgaggggggg aggggagggc agcgagtggc 420

gcgctggcgg atgaggcgcc gagtggcccg catccaccgg cgcaggcgag ccgcacgacg 480

ccgccgcgct cgcggaccgc cgccgccaca catgcgcacc cccggcccgc ggggctgtaa 540

cggccttgtc gccacgcgtg cgccccgtgt gtataaggag gcagcgcgta cagggggcac 600

gataagcggc actcgcacga tcaatgtaca cattgcccgt ccgcgccacc acatccagca 660

tcgtcgccag cctcgccacc cccgcgccgt cctcctcctc cggctccggc tccggccgcc 720

ccaggcccag gctcatccgg aacgcccccg tcttcgccgc ccccgccacc gtcgtggtac 780

gtacgtgcgt acggagtacg acaattaatg catgcatggc tcactgcaca gcgagcacat 840

catgcactgt acagcatgca tgtcctcgtt tctatatatt ctatccacgt acgccttcgc 900

ttcatccagc tctaataacc aagtactgac tagtcggcac tactgacgac cttgctgttt 960

tgggcacgaa atgcactcat gcaaccaaaa gtccttgctc ccattatcta ggaggacacg 1020

accaagcatg caggatattc tggaaaccca atcaaaatcc gactgtaata taagtataat 1080

gcacatccca agaagacgcc actcttagct tcatcttaaa ttcccttaaa tttagctata 1140

tatcatttat ataacatcaa aacaggcgta ctatcaaaaa tatatttcat ggtacgtaaa 1200

tatggcacac tacactgtac ataaattttt gtttgaatta attctttctg tcaaatctat 1260

aatcaaattc aaggcagttt gatatatacg ttagatctat atataatgca tctatttctg 1320

acggagggaa tagctagtga tgatgatagt aatttagatc attttcccat cagctagtag 1380

ctaccgacga catacgcatg tcagccatct ccaatagaat attcccgaag ggaggtgttt 1440

ccaaaaagat gacggccaac gatagtgcta gtttgaaggc aactactacg tatatatcct 1500

ttcagtataa cagaattcca cccagaaaaa aaaagtctcg agttgaatga aagaggagta 1560

gtgacgtcga gcgcgcgtga aataaagtat atggctggct ttttcctaaa gcgataagac 1620

cagtttatgc agtggggtca tggacatgtg tagtgatagc taataatcgt ccgcgtcttt 1680

tggcttttga gttccgtttg atccatgacg catatatatc caggcagttg aataaccgac 1740

gaccatcaaa taaaaggcgc cactactagt ggccatcgac gtcagtttaa cctttctatg 1800

tatgcatgtg taacttccca tgatttcctg cgtcgcgtta ttttgctttg tttcaccgtc 1860

ggacgacgaa gtcttttaga tagcaataag gaactatatc taagtgctag tttgggaacc 1920

tcgttttccc acgagatttt cattttccta aggtaaatta gttcattttt ttttgaaaat 1980

aagaatcttt tgaaaaagat gtaattatca aactagtcct aacagagaga tttttgaggg 2040

gggagaaaaa aaaggaagtt cttctgcatt cttttttgga ggaacaaaaa atttgcctct 2100

gcatactgaa tcagagggga tgggctttat ttcgtgttgg ctggttgatt gatgattgga 2160

tgagctccag taagtttgga agagaacagg gcacggtccc gacggttggt acgggtgaag 2220

aaagggagtg atttaattta tcgccccaac cacaaccacc catcgatcta tagttgcaga 2280

agaactcgct aatcctgtcc acaaaagccg cactcacgca ctcatccgcc actgatttta 2340

tttccccccc cccccctgtg ggcgcgcgcg cgtgctgcgt ggtggtacta ctacctgttt 2400

gtctcactga cacagttgcg cgcgtcatca tgttgctagt aaacgggacg gcgggcagct 2460

gaggagtcaa acgagagaga tcgagagaaa gaaagggagg gcatccacca gccgccggcg 2520

ataagagggg aggagagaga ggccagagaa gaggaggaga agaagaagaa aatgagcagc 2580

tgcctctgcc ttccgaaaaa aaaggagggg ccagcgaagg agaagccgtc cacagatacc 2640

cccacctcgt cactccttca gaaccagaag ccctcccaac ctccacctcc tccctccaag 2700

gcttcctcca aggtccgtcc cctcctcctc ctcctcatct tcctctctca ccttcagcac 2760

catcctccac acagcagcac gcgcgcagca atctcaccgt tttcttttcc tccattgcca 2820

tcagtagcta gccacactgc atgcattcag cttccgcttt ctccctgtgt agcgagcgct 2880

gtgccggccg gtgcagagaa gatccctgct cccccccccc cccccccccc ctaattagat 2940

cacctttgtg catttttttc cttgtgttgt ggtccgtcgg caagtaggcc aaaattgcat 3000

catgggccat ggcccctcct ctttctacta cctcgtcatg ctgcagcacg atcatgaatg 3060

acccgacgat gtatctggct gttgacattg cagggcatgg accccaccgt cgagcgcttg 3120

aagagcgggt tccagaagtt caagaccgag gtctatgagt aagtcacctg agctgtttgt 3180

tctctgcagc acccgcgttt ggtttctatt tccttttttg tttgtttgtg aattcagtga 3240

gctccgactc cgactgatca tgtgctccgc tgatctttgt tcgcagcaag aagccggagc 3300

tgttcgagcc tctcaagtcc ggccagagcc ccagggtatg cgctgctaat gtttttttat 3360

atatattttg ttgtgtgtct atagcgactc cggccaactg ggccaaaaga ttgagtagta 3420

ctagttgctc gttcctatta ctagctctgt agctcatcac cattgctgct gcaacaccct 3480

gccgcacctg cactattcag catccaccct gtctcccctg gaccaaagct gcaaggggaa 3540

ccatgcagat aatactaggt gtgtattatc agcattccat ggctaatgtg tggtccaggc 3600

gtccagcact gtccctcgcc ccacctcacg ggatcctgtc gtcatcgtga gtagttggct 3660

tggacgtgtc cccttcccct ctcgcacccc ttgcaaaaaa gttaggtgca taaatgttgg 3720

gcctgttgcc ggtcctcgag gaaatatgct acactacaga tgtcccaatt tttgtggaag 3780

atatggcagc agcatcacgc ctcctgatga tgcccggaac ggaaatgttc ttgctattgg 3840

ccgccagcag ggaatataat gggataaaga tagaccagcg tgctagagag ccacacggaa 3900

accagagcgc gcgtagagca tcctcgtcgc aactaatact agtacttaca gagccagagg 3960

aggagggtca aatcgaaact caatcaaaag cttgccgcct ttttggggcg ccagaaatct 4020

tccactgatg agatgaccag ggccgatgat ctgcttacct gcttatcgat aagagccatg 4080

ggaaaccgat cgaacttggt tttgcgtacg tgctcctccc tcttttcacc gacctgacgg 4140

tgactgattt cccctccgct gcagtacatg gtgttcgcct gctccgactc ccgcgtgtgc 4200

ccgtcggtga cactgggcct gcagcccggc gaggcattca ccgtccgcaa catcgcctcc 4260

atggtcccac cctacgacaa ggtacgtacg tacgagcaaa caccgatcga cgcatgcaac 4320

ggtggtatca gccacactaa tattactcac acggtcgtct tccgttttgg ccaaactgca 4380

gatcaagtac gccggcaccg ggtccgccat cgagtacgcc gtgtgcgcgc tcaaggtgca 4440

ggtcatcgtg gtcattggcc acagctgctg cggtggcatc agggcgctcc tctccctcaa 4500

ggacggcgcg cccgacaact tgtaagcagt agtcatcgta aaatgcgtat aaaaaatata 4560

tatagcagtt ttatttagag agagagaaaa aaattagaac cccgtgtagt gtaacctgct 4620

cagcgtgttg tctgtcgttg gtttaaatct ggccatgtat atccagccac ttcgtggagg 4680

actgggtcag gatcggcagc cctgccaaga acaaggtgaa gaaagagcac gcatcggtgc 4740

cgttcgatga ccagtgctcc atcctggaga aggtacgtaa cgtaaacgca cgcacacaca 4800

ccgaccgtat gaataatgga ttatatatta ttggtttcgc tcatcaacga acaaattcaa 4860

ggatcatcat cgacctttaa ttgtgtgtgt gtgtttctgc aggaggccgt gaacgtgtcg 4920

ctccagaacc tcaagagcta ccccttcgtc aaggaagggc tggccggcgg gacgctcaag 4980

ctggttggcg cccactacga cttcgtcaaa gggcagttcg tcacatggga gcctgtaggg 5040

gtccacgcgc acagctcttc ttttagagca actccaatag attagccaaa ttttttattc 5100

tatattctca tttagctagc cgtttagcta taattcactc tctaaattac gattaattcc 5160

aacagactag ccaaattaga ctggtaggtc ccacatgtca ttctcacctt gccttcttcc 5220

ctatgtccca cgcgcctatg ctacaccgtc ctgcctccac tccggctgag gacaaaggct 5280

atgggaggac cggatagcta gcgtagggaa ttagtcatat ttggctagcg gagggggttg 5340

tttaccgagt tggatagcga gagaaggatt tgaagagact gttggatcca atttttactc 5400

caattttatt atttttagct agtcaatttg ttttacataa gctcttggag ttgctcttac 5460

cttttttttt caattgctat attgacgaca tcacgtccgt cgtcttgcat ttgcacatag 5520

ctagcgcact ccagatccca attcccaaca tcatccggcc agcccccttt aatttatctc 5580

ccttgtttgc catcgcaatt tctttctctc cccttagctt gttgacatgc atgggaggat 5640

atcaggagac gaagaaaaga gcagagcagc gcctttgccc tcccatagat tcccacgcac 5700

ctcgtcactc cttgagaacc agaagcccac ccacccggtc cagtgtggcc aaaagttgca 5760

tcacgccccc ttcattctct cgctctctct atacccccct catgctgcat ctatcaccgt 5820

accatcacga gcatgcaagt tagtctttcc gggcatggcg aactgaccga cgattttctt 5880

gttgctggtc ctgcagcccc aggacgccat cgagcgcttg acgagcgggt tccagcagtt 5940

caaggtcaat gtctatgagt aagtcacccc tctactactc agagctggct gttgttttct 6000

gcagcaccgg cgtttggttt agccgtttca gtttcaaacg tttcatttgt atcgggaatt 6060

ctgatatagc ttcgactgat cctatattat tcctgtgcta gtacgtttga tttttttttc 6120

ttcatttcac agcaagaagc cggagctttt cgggcctctc aagtccggcc aggcccccaa 6180

ggtatgcgct attgcctact agcctatact ccattcttat tcttctgaac caaatgcatg 6240

cgccccgcgc gcgtgctaat tgctaaccca tgtgctgcca tatatgctaa gctggcgaga 6300

cttgcatttg cttggtaaat tattgagatg ccgccgtccc tatataggct cacttcctag 6360

tatatagaac ctggcgtgcc agaatattgc aagtaaccaa gtacagagtt tattgttttt 6420

ctttatgggt gttctgagtt ggcatctatc ccatgcgcat gattatttca tgcatgcgtt 6480

catgctttta gcgggttcta ctagttttgt tatccataaa aattaccata ttttaaaact 6540

tcttttgaaa aaaaaaatta tatgtatcct tgtgaaagtc gacattagac ctagtatatc 6600

ggcgtagtct acgctaccga cataacacgt atcggcgcca tatagatcaa ggagctcagc 6660

catgatatat atatatacta attggatgac ctgtggggat ggcattgtcg ctgcatagct 6720

aacaaccgcg ggaaccggcc tgattttttg tgctccttct ttttgcctga cctgacatga 6780

cagtgatttt gctatgctgc atgcagtaca tggtgttcgc ttgctccgac tcccgtgtgt 6840

gcccatcggt gaccctgggc ctgcagcccg gcgaggcctt caccgttcgc aacatagccg 6900

ccatggtccc aggctacgac aaggtatata tacacactga cgattgtgaa caacgcaatg 6960

gtctcaattt ctactcacac ggccggccgc ggcctctcgt tttcgtgtcg actgcagacc 7020

aagtacaccg gcatcgggtc cgccatcgag tacgctgtgt gcgctctcaa ggtggaggtc 7080

ctcgtggtca ttggccatag ctgctgcggt ggcatcaggg cgctcctctc cctccaggac 7140

ggcgcacctg acaccttgta agtcgcgaca gtaaaatata tacaagtttc atttagatat 7200

aaaaaactat ttgcgcttat ttatgtcatg catgattttg atcctctcta taccatgttg 7260

tgtgttggtt tggtgtggtg tacgtacgca gccacttcgt cgaggactgg gttaagatcg 7320

gcttcattgc caagatgaag gtaaagaaag agcacgcctc ggtgccgttc gatgaccagt 7380

gctccattct cgagaaggta tgttgtacat tcgtcgagca gttactgttg catgaataga 7440

ttggtttttg ctcaccaaaa ggacctctat tgtttctgca ggaggccgtg aacgtgtccc 7500

tggagaacct caagacctac cccttcgtca aggaagggct tgcaaatggg accctcaagc 7560

tgatcggcgc ccactacgac tttgtctcag gagagttcct cacatggaaa aagtgaaaaa 7620

ctagggctac ggcaattcta ccggcccgcc gactcctgca tcatcataaa tatatatact 7680

atactatact actacgtacc taccgatatg cacccgagca atgtgaatgc gtcgagtact 7740

atatatctgt tttctgcatc tacatatata taccggatca atcgcccaat gtgaatgtaa 7800

taagcaatat cattttctac cacttttcat tcctaacgct gagcttttta tgtactatat 7860

cttatatgat gaataataat atgaccgcct tgtgatctaa agacatcagc tatatttttt 7920

tcacaatatt attacgaaga gcttcttagc tttgttaatt accattagcg gatctagaaa 7980

cgaccgaggg gcaaaagaat aggactttct tgggaagcca gtaaagcaag aggtgctaaa 8040

cacagggata aaagaaccca tataagcaac taagaagata actaaaataa tattcctatg 8100

gattacctac ctaggaaaaa gtcttgagat ctctggagtt tccaaattag acctataagg 8160

ttaaaattca tacttaccaa atacttatag atctaacaaa caatgctcaa ttcaaagtgc 8220

ttaattaaac aatatataat taattataga aaatacctaa taatagctct tgataactaa 8280

ataatcaaat atttcttcac aatttcaaac tacctgggcc ggtgtcctcc attgtagata 8340

tgcctataat cattgtgtag atactgatca agggtctcct acccttatat tatataagcc 8400

aaggagaggg ttacaaaata tatgatcagc tagcatatgc attttctatt tggttacatg 8460

agaagtacaa taaaatcatc catctgtatc cttagcccga tgccttgtgc tgcacag 8517

<210> 2

<211> 1359

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 2

atgagcagct gcctctgcct tccgaaaaaa aaggaggggc cagcgaagga gaagccgtcc 60

acagataccc ccacctcgtc actccttcag aaccagaagc cctcccaacc tccacctcct 120

ccctccaagg cttcctccaa gggcatggac cccaccgtcg agcgcttgaa gagcgggttc 180

cagaagttca agaccgaggt ctatgacaag aagccggagc tgttcgagcc tctcaagtcc 240

ggccagagcc ccaggtacat ggtgttcgcc tgctccgact cccgcgtgtg cccgtcggtg 300

acactgggcc tgcagcccgg cgaggcattc accgtccgca acatcgcctc catggtccca 360

ccctacgaca agatcaagta cgccggcacc gggtccgcca tcgagtacgc cgtgtgcgcg 420

ctcaaggtgc aggtcatcgt ggtcattggc cacagctgct gcggtggcat cagggcgctc 480

ctctccctca aggacggcgc gcccgacaac ttccacttcg tggaggactg ggtcaggatc 540

ggcagccctg ccaagaacaa ggtgaagaaa gagcacgcat cggtgccgtt cgatgaccag 600

tgctccatcc tggagaagga ggccgtgaac gtgtcgctcc agaacctcaa gagctacccc 660

ttcgtcaagg aagggctggc cggcgggacg ctcaagctgg ttggcgccca ctacgacttc 720

gtcaaagggc agttcgtcac atgggagcct ccccaggacg ccatcgagcg cttgacgagc 780

gggttccagc agttcaaggt caatgtctat gacaagaagc cggagctttt cgggcctctc 840

aagtccggcc aggcccccaa gtacatggtg ttcgcttgct ccgactcccg tgtgtgccca 900

tcggtgaccc tgggcctgca gcccggcgag gccttcaccg ttcgcaacat agccgccatg 960

gtcccaggct acgacaagac caagtacacc ggcatcgggt ccgccatcga gtacgctgtg 1020

tgcgctctca aggtggaggt cctcgtggtc attggccata gctgctgcgg tggcatcagg 1080

gcgctcctct ccctccagga cggcgcacct gacaccttcc acttcgtcga ggactgggtt 1140

aagatcggct tcattgccaa gatgaaggta aagaaagagc acgcctcggt gccgttcgat 1200

gaccagtgct ccattctcga gaaggaggcc gtgaacgtgt ccctggagaa cctcaagacc 1260

taccccttcg tcaaggaagg gcttgcaaat gggaccctca agctgatcgg cgcccactac 1320

gactttgtct caggagagtt cctcacatgg aaaaagtga 1359

<210> 3

<211> 452

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 3

Met Ser Ser Cys Leu Cys Leu Pro Lys Lys Lys Glu Gly Pro Ala Lys

1 5 10 15

Glu Lys Pro Ser Thr Asp Thr Pro Thr Ser Ser Leu Leu Gln Asn Gln

20 25 30

Lys Pro Ser Gln Pro Pro Pro Pro Pro Ser Lys Ala Ser Ser Lys Gly

35 40 45

Met Asp Pro Thr Val Glu Arg Leu Lys Ser Gly Phe Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Thr Glu Val Tyr Asp Lys Lys Pro Glu Leu Phe Glu Pro Leu Lys Ser

65 70 75 80

Gly Gln Ser Pro Arg Tyr Met Val Phe Ala Cys Ser Asp Ser Arg Val

85 90 95

Cys Pro Ser Val Thr Leu Gly Leu Gln Pro Gly Glu Ala Phe Thr Val

100 105 110

Arg Asn Ile Ala Ser Met Val Pro Pro Tyr Asp Lys Ile Lys Tyr Ala

115 120 125

Gly Thr Gly Ser Ala Ile Glu Tyr Ala Val Cys Ala Leu Lys Val Gln

130 135 140

Val Ile Val Val Ile Gly His Ser Cys Cys Gly Gly Ile Arg Ala Leu

145 150 155 160

Leu Ser Leu Lys Asp Gly Ala Pro Asp Asn Phe His Phe Val Glu Asp

165 170 175

Trp Val Arg Ile Gly Ser Pro Ala Lys Asn Lys Val Lys Lys Glu His

180 185 190

Ala Ser Val Pro Phe Asp Asp Gln Cys Ser Ile Leu Glu Lys Glu Ala

195 200 205

Val Asn Val Ser Leu Gln Asn Leu Lys Ser Tyr Pro Phe Val Lys Glu

210 215 220

Gly Leu Ala Gly Gly Thr Leu Lys Leu Val Gly Ala His Tyr Asp Phe

225 230 235 240

Val Lys Gly Gln Phe Val Thr Trp Glu Pro Pro Gln Asp Ala Ile Glu

245 250 255

Arg Leu Thr Ser Gly Phe Gln Gln Phe Lys Val Asn Val Tyr Asp Lys

260 265 270

Lys Pro Glu Leu Phe Gly Pro Leu Lys Ser Gly Gln Ala Pro Lys Tyr

275 280 285

Met Val Phe Ala Cys Ser Asp Ser Arg Val Cys Pro Ser Val Thr Leu

290 295 300

Gly Leu Gln Pro Gly Glu Ala Phe Thr Val Arg Asn Ile Ala Ala Met

305 310 315 320

Val Pro Gly Tyr Asp Lys Thr Lys Tyr Thr Gly Ile Gly Ser Ala Ile

325 330 335

Glu Tyr Ala Val Cys Ala Leu Lys Val Glu Val Leu Val Val Ile Gly

340 345 350

His Ser Cys Cys Gly Gly Ile Arg Ala Leu Leu Ser Leu Gln Asp Gly

355 360 365

Ala Pro Asp Thr Phe His Phe Val Glu Asp Trp Val Lys Ile Gly Phe

370 375 380

Ile Ala Lys Met Lys Val Lys Lys Glu His Ala Ser Val Pro Phe Asp

385 390 395 400

Asp Gln Cys Ser Ile Leu Glu Lys Glu Ala Val Asn Val Ser Leu Glu

405 410 415

Asn Leu Lys Thr Tyr Pro Phe Val Lys Glu Gly Leu Ala Asn Gly Thr

420 425 430

Leu Lys Leu Ile Gly Ala His Tyr Asp Phe Val Ser Gly Glu Phe Leu

435 440 445

Thr Trp Lys Lys

450

Claims

1.一种培育抗旱玉米的方法，其特征在于，包括敲除目的玉米中碳酸酐酶基因，得到抗旱能力高于所述目的玉米的抗旱玉米；

所述碳酸酐酶基因序列如SEQ ID No.1所示；

所述敲除目的玉米中碳酸酐酶基因通过CRISPR/Cas9基因编辑方法实现；所述CRISPR/Cas9基因编辑方法，其sgRNA的靶序列为序列表SEQ ID No.1第2645-2663位，包含靶序列信息的引物为CA1-ID-1f和CA1-ID-1r:

CA1-ID-1f：GGCGTTCTGAAGGAGTGACGAGG；

CA1-ID-1r：AAACCCTCGTCACTCCTTCAGAA。

2.权利要求1所述的培育抗旱玉米的方法在玉米育种中的应用。