CN114729393A - 用于单细胞索引的颜色和条码化珠 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴定来自细胞群的靶细胞的核酸的方法，所述方法包括：‑将来自细胞群的至少一个靶细胞与至少一个颜色编码的组合物分离至一个隔室中，所述颜色编码的组合物包括偶联到寡核苷酸的固体颗粒；‑裂解所述分离的靶细胞；‑将所述裂解的分离的靶细胞的核酸分子与所述颜色编码的组合物的寡核苷酸偶联，以形成第一偶联物；以及，‑确定所述第一偶联物的序列，从而鉴定所述靶细胞；其特征在于，根据所述靶细胞的至少一个预选的物理性质结合所述颜色编码的组合物的至少一个预选的物理性质，选择至少一个靶细胞和至少一个颜色编码的组合物，将其分离至一个隔室中。

Description

用于单细胞索引的颜色和条码化珠

技术领域

本发明涉及一种通过单细胞索引使用颜色编码的组合物鉴定来自细胞群的靶细胞的cDNA、DNA或RNA的方法，其中颜色编码的组合物包括固体颗粒，固体颗粒包括具有不同发射光谱的染料作为附加信息。

背景技术

目前，由于不同研究领域的科学家对揭开组织的细胞异质性感兴趣，因此单细胞测序受到了关注。并且，通过破译给定细胞群的不同亚型的转录组，使单细胞水平上的分析能够有助于更好地了解细胞表型与功能之间的关联。

在过去的几年中，强大的技术进入了市场，实现了高通量规模的单细胞转录组的分析。其中，许多技术是基于将一个单细胞和一个单珠微流体分离至液滴中。在所述液滴中，与珠相结合的珠特异性寡核苷酸在细胞裂解后捕获mRNA，并在逆转录反应后成为细胞特异性条形码。

一些可用技术也可以从细胞群中选择性地分离单细胞，例如对标记细胞的抗体染色和后续分选进行激光检测。

然而，到目前为止，在高通量水平上从异质细胞群中选择性地分离单细胞并将所述单细胞的测序结果分配至不同的细胞类型之一是不可能的。

在不同的技术领域中，众所周知的是，从单细胞中获得的遗传信息可通过将所述细胞偶联到作为条形码的多核苷酸来鉴定。这些方法涉及合成包括此条形码的库，可对此条形码进行测序以鉴定单细胞。

例如，US9388456或US 9695468中公开了使用生物学和必要的硬件来分离细胞。然而，此技术注重的是单个分离的细胞，而不是复杂的细胞混合物中的细胞。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种偶联物，其能够与结合剂可检测的细胞表型相结合来鉴定单细胞的DNA和RNA分子。

因此，本发明的第一目标是提供一种鉴定来自细胞群的靶细胞的核酸的方法，所述方法包括：

-将来自细胞群的至少一个靶细胞与至少一个颜色编码的组合物分离至一个隔室中，所述颜色编码的组合物包括偶联到寡核苷酸的固体颗粒；

-裂解所述分离的靶细胞；

-将所述裂解的分离的靶细胞的核酸分子与所述颜色编码的组合物的寡核苷酸偶联，以形成第一偶联物；以及

-确定所述第一偶联物的序列，从而鉴定所述靶细胞；

其特征在于，

根据所述靶细胞的至少一个预选的物理性质结合所述颜色编码的组合物的至少一个预选的物理性质，选择至少一个靶细胞和至少一个颜色编码的组合物以将其分离至一个隔室中。

提供的所述靶细胞/细胞群与所述颜色编码的组合物用作各种亚群的混合物。所述分离步骤是根据预选的性质选择最好一个靶细胞和一个颜色编码的组合物将其分离至一个隔室中来进行的。

为此，所述靶细胞和所述颜色编码的组合物(珠)的预选的物理性质用于选择和分离特定的细胞亚群以及特定的珠群。例如，如果所述靶细胞的预选的物理性质是存在CD4标记物，并且所述颜色编码的组合物(珠)的预选的物理性质是蓝色，那么所有具有这些性质的细胞和珠都将按照1:1的比例分选至隔室中。具有例如CD5标记物的细胞和红珠将不会被选择/分离。当然，只要使所选性质保持1:1的关系，就可以为细胞和珠二者预选多种物理性质。例如，可以预选5种不同的物理性质使5对细胞和珠优选地按照1:1的比例分选至隔室中。

所述靶细胞的预选的物理性质可以选自形状、尺寸、粒度、细胞器组合物、离子组合物、糖组合物、脂质组合物和蛋白质组合物。

如果将蛋白质组合物用作预选的物理性质，则通过荧光染色法标记至少一个细胞内或细胞外蛋白质。术语蛋白质组合物是指蛋白质表达和转译后修饰。

所述颜色编码的组合物的预选的物理性质由所述固体颗粒限定，并且可以选自尺寸、粒度、电荷、磁矩、一种或多种颜色和至少一种颜色的一种或多种强度。

附图说明

图1a示出了固体颗粒的发射光谱，所述固体颗粒包括两种具有不同发射光谱和浓度的染料，用于区分39种不同的固体颗粒。术语“MACSPlex B1”和“MACSPlex B2”是指两种具有不同发射光谱的染料的不同浓度。图1b示出了所产生的固体颗粒的选择。

图2示出了用于鉴定39种不同的珠群并将其与靶细胞群相结合的示例性的门控方案。

具体实施方式

目标部分

使用本发明方法检测的目标部分可以在任何生物样本上，如组织切片、细胞团、悬浮细胞或粘附细胞。

颜色编码的组合物

颜色编码的组合物包括偶联到寡核苷酸的固体颗粒。

根据本发明方法的第一变体，颜色编码的组合物具有根据通式(Ia)或(Ib)之一的组合物，

X-(P-C-B-BR)_n(Ia)

X-(P-B-C-BR)_n(Ib)

其中

X为固体颗粒，

P(PCR处理)：包括4至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

C(颜色特异性条形码)：包括1至8个核苷酸残基的寡核苷酸；

B(珠特异性条形码)：包括8至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

BR(结合区)：包括3至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

n：整数≥1，并且

其中P、C、B和BR通过相同或不同的寡核苷酸单元作为间隔区而相互结合，每个间隔区包括0至30个核苷酸残基。

根据本发明方法的另一变体，颜色编码的组合物具有根据通式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIe)或(IIf)之一的组合物，

X-(P-C-B-U-BR)_n(IIa)

X-(P-C-U-B-BR)_n(IIb)

X-(P-B-C-U-BR)_n(IIc)

X-(P-B-U-C-BR)_n(IId)

X-(P-U-B-C-BR)_n(IIe)

X-(P-U-C-B-BR)_n(IIf),

其中

X为固体颗粒，

P(PCR处理)：包括4至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

C(颜色特异性条形码)：包括1至8个核苷酸残基的寡核苷酸；

B(珠特异性条形码)：包括8至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

BR(结合区)：包括3至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

U(唯一分子标识符)：包括5至15个核苷酸残基的寡核苷酸；

n：整数≥1，并且

其中P、C、B、U和BR通过相同或不同的寡核苷酸单元作为间隔区而相互结合，每个间隔区包括0至30个核苷酸残基。

条形码部分

在本申请中，寡核苷酸C(颜色特异性条形码)、B(珠特异性条形码)和U(唯一分子标识符)被称为“条形码(barcode)”的原因是可以通过它们独特的序列来鉴定单个靶标。

携带条形码的部分C、B和U可以包括相同或不同的寡核苷酸序列，其各自具有公开数目的核苷酸残基。优选天然存在的胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)作为核苷酸残基。通过随机聚合这些单元，可以获得具有不同序列的寡核苷酸库。例如，随机产生包括10个核苷酸残基的寡核苷酸库将有4¹⁰＝1048576个成员。

寡核苷酸序列P(PCR处理)、C(颜色特异性条形码)、B(珠特异性条形码)、U(唯一分子标识符)和BR(结合区)直接或通过其他寡核苷酸单元作为间隔单元而相互结合。间隔单元可以是相同或不同的寡核苷酸，每个寡核苷酸包括0至30个核苷酸残基。优选地，间隔单元是非特异性寡核苷酸。

在优选实施例中，一个或多个间隔单元包括0(零)个核苷酸残基，即，寡核苷酸P(PCR处理)、C(颜色特异性条形码)、B(珠特异性条形码)、U(唯一分子标识符)和BR(结合区)直接相互结合。

寡核苷酸P(PCR处理)可以包括4至30个核苷酸残基，并且用作用于后续扩增反应的引物的结合区。

寡核苷酸C(颜色特异性条形码)可以包括1至8个核苷酸残基，其可以鉴定细胞或细胞类型。

寡核苷酸B(珠特异性条形码)可以包括8至30个核苷酸残基，并且用作可以将测序信息分配至源细胞的细胞特异性条形码。

寡核苷酸U(唯一分子标识符)可以包括5至15个核苷酸残基，并且用作靶细胞中每个单核酸分子的标识符。

寡核苷酸BR(结合区)可以包括3至30个核苷酸残基，并且用作靶细胞感兴趣的核酸分子的结合区。

用于产生寡核苷酸及其库的技术以及用于扩增被分离的寡核苷酸来获得更大量的寡核苷酸的技术均是本领域技术人员所熟知的。US 9388465中总结了这些技术。

固体颗粒

术语“固体颗粒”是指在通常用于细胞处理的水性系统中不能或不易溶解的任何材料。该术语不一定指特定硬度或组成或材料。

本发明中所使用的固体颗粒X可以由任何材料制造而成，只要在水性系统中的溶解性低至使颗粒在使用本发明的方法期间保持是可观察的或可检测的。例如，固体颗粒X可以包括聚苯乙烯、葡聚糖，二者可选地用反应性基团进行化学修饰，以结合染料或寡核苷酸作为间隔单元或PCR处理的P。合适的反应性基团例如是氨基或羧基。

可用于本发明的固体颗粒可以使用本领域技术人员熟知的或如文献中描述的方法制备。例如，固体颗粒可以通过在室温(US 6514295 B1)或高温(US 7507588B2)下在包含染料的有机溶剂混合物中溶胀颗粒以将染料掺入预成型的聚合物珠粒中来制备。另一种方法涉及相平衡由于加水而发生变动以迫使疏水染料进入聚合物相(US 6964747 B2)。固体颗粒X珠也可以通过聚合包括染料标记单体的单体混合物(美国化学学会杂志2004，126，21，6562-6563)或在通过聚合形成颗粒期间对疏水染料进行物理截留(US 5073498)来制备。

图1示出了一种基于双色珠的示例性布局，其中，B1和B2表示能够使用流式细胞仪区分的两种颜色。

在本发明的另一实施例中，固体颗粒可以包括通过磁力、静电相互作用或化学键连接的多个(如5至50个)亚单元，其中化学键可以是共价的或非共价的。这些亚单元可以在液滴形成时彼此释放，例如通过化学或酶促裂解。

固体颗粒的尺寸不太重要，可以在1至200μm之间。

优选地，固体颗粒X包括至少两种具有不同发射光谱且发射最大值之差至少为10nm的染料，更优选地包括至少两种具有不同发射光谱且发射最大值之差至少为20nm的染料。虽然数量增多的不同的染料提高了信息的质量和数量，但在实际使用中，2至10种不同的染料已足够。在仅使用浓度作为选择标准的情况下，1种染料便足够了。

优选地，染料的浓度和发射最大值之差通过可区分至少30种、优选至少50种不同固体颗粒的方式来选择。

可用的染料例如是：基于蛋白质的染料，如藻胆蛋白；聚合物染料，如聚芴；有机小分子染料，如呫吨，比如荧光素，或若丹明、花青素、恶嗪、香豆素、吖啶、恶二唑、芘、吡咯甲烷；或金属有机复合物染料，如Ru、Eu、Pt复合物。除了单分子实体，荧光蛋白群或有机小分子染料以及纳米粒子(如量子点、上转换纳米粒子、金纳米粒子、染色聚合物纳米粒子)也能够用作荧光部分。

本发明的方法

在本方法的进一步实施例中，待鉴定的靶细胞的核酸是单链的，并且其中获得了核酸分子的互补链并与颜色编码的组合物的BR单元偶联，从而形成第二偶联物，对第二偶联物进行测序，进而鉴定靶细胞。

单链的核酸例如是在样本制备步骤中附在靶细胞上的RNA、变性DNA或核酸分子。后者的一个例子是用于标记靶细胞的抗体-寡核苷酸偶联物。

术语“确定第一/第二偶联物的序列”涉及核酸测序领域中已知的任何方法并且可以包括扩增步骤和/或生成库。在任何情况下都可以通过获得偶联物的序列来鉴定靶细胞。

将核酸链与颜色编码的组合物的BR单元偶联并进行后续测序的必要技术并不与本发明特别相关，并且是本领域技术人员所熟知的。

根据本发明方法的一个变体，通过将至少一个靶细胞和至少一个颜色编码的组合物放入一个被与水不混溶的流体包围的水性液滴中，将来自细胞群的该至少一个靶细胞与该至少一个颜色编码的组合物分离至一个隔室中。

进一步地，可以为属于相同细胞类型或表型的靶细胞或与相同抗体/分析物相结合的细胞提供具有相同固体颗粒X的颜色编码的组合物。

在本发明的方法中，颜色编码的组合物可具有至少两种不同的固体颗粒X，从而为至少两种不同的细胞类型提供具有不同的固体颗粒X的颜色编码的组合物。

可以通过对偶联物的C(颜色特异性条形码)进行测序来鉴定靶细胞的细胞类型。在进一步的变体中，在将来自细胞群的至少一个靶细胞与根据本发明的至少一个颜色编码的组合物分离至一个隔室中之前，通过荧光染色法确定靶细胞的细胞类型。

本方法的用途

本发明的方法可用于研究、诊断和细胞疗法中的各种应用。本发明的方法尤其适用于鉴定来自细胞群的靶细胞的核酸。分析物可用于鉴定和测量生物标记物或治疗靶点。

示例

以下是根据本发明方法的假设过程。将来自细胞群的至少一个靶细胞与至少一个颜色编码的组合物分离至一个隔室中的过程步骤应在MACSQuant Tyto机器(可从德国美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec BV&Co.KG)获得，以下称为“Tyto”)上进行。该机器在一次性试剂盒中配备有MEMS阀。该一次性试剂盒能够将至少一个靶细胞和至少一个颜色编码的组合物放入一个被与水不混溶的流体包围的水性液滴。PCT/US19/27577中描述了这种阀/试剂盒。

案例1：通过单细胞测序分析血液中不同的免疫细胞亚群中的基因表达

过程步骤

1.提供细胞群，比如制备血液样本(例如，Ficoll、RBC裂解等)；

2.使用CD45-VB、CD56-FITC、CD3-PE、CD19-APC、PI(用于排除死细胞)给细胞群染色；

3.将已染色的样本与多种珠混合；

4.将样本/珠混合物、油和裂解缓冲液装入试剂盒中，所有这些都分别放入单独的隔室中；

5.启动样本分析和基于手动分散的总珠群门控；

6.Tyto自动限定39种荧光珠群；

7.启动样本分析，以设置所需细胞群的分选门，如下：

A.基于尺寸(散射)参数的细胞门控用以区分细胞和5μm珠

B.细胞群1为细胞门/活力门/CD45+/CD56-/CD3-/CD19+(B细胞)→设置“分选门1”

C.细胞群2为细胞门/活力门/CD45+/CD56-/CD3+/CD19-(T细胞)→设置“分选门2”

D.细胞群3为细胞门/活力门/CD45+/CD56+/CD3-/CD19-(NK细胞)→设置“分选门3”

示例性的门控结果如图2所示。

8.Tyto自动将每个分选门与荧光珠群组合(例如，“分类门1”+“珠群X”、“分类门2”+“珠群Y”......)，配对信息需要可供下游分析使用。示例如下：

→细胞群1＝“分选门1”与绿珠配对(珠门/绿群门)

→细胞群2＝“分选门2”与红珠配对(珠门/红群门)

→细胞群3＝“分选门3”与蓝珠配对(珠门/蓝群门)

9.分选开始，Tyto将每个细胞群中的5000个细胞与对应的珠群配对(如第8条所示)，每个细胞-珠对被封装在油包水的液滴中；细胞是第一分选事件，珠是第二事件，以优化回收率；

10.记录QC参数：封装细胞的数量、每个细胞群的事件、正确匹配的频率(液滴中的1个细胞和1个正确的珠)、漏掉的靶细胞、更多待定；

11.通过与裂解缓冲液混合使细胞在液滴中自动裂解，释放的mRNA被珠上的寡核苷酸捕获，液滴稳定；

12.移除试剂盒并在37℃下培育2小时，以进行逆转录，得到与珠特异性条形码连接的cDNA；

13.用清洁剂裂解油包水的液滴；

14.对批量条码化的DNA进行扩增和测序；

15.根据条形码比对序列信息：

→显示特定随机条形码的每个序列都来自某一个特定的细胞

→另外，每个寡核苷酸都包含特定于一个珠群的短条形码。因此，除了可知道哪些序列来自某一个特定的细胞外，序列信息还将告知这个特定的细胞与哪个珠群/颜色配对，从而可以限定它最初属于哪个细胞群。例如，由于序列属于红珠，特定的细胞是细胞门/活力门/CD45+/CD56-/CD3+/CD19-T细胞。

案例2：通过单细胞测序分析不同的TIL亚群中的T细胞受体(TCR)库

过程步骤：

1.制备肿瘤组织的样本(基于GentleMACS的组织离解、过滤和洗涤)；

2.使用CD3-VB、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-APC、PI(用于排除死细胞)给来自#1的样本染色；

3.将已染色的样本与多种珠混合；

4.将样本或珠混合物、油和裂解缓冲液装入试剂盒中，所有这些都分别放入单独的隔室中；

5.启动样本分析和基于手动分散的总珠群门控；

6.Tyto自动限定39种荧光珠群；

7.启动样本分析，以设置所需细胞群的分选门：

8.A.基于尺寸(散射)参数的细胞门控，以区分细胞和5μm珠；

9.B.细胞群1为细胞门/活力门/CD3+/CD4-/CD8+/CD25-(效应T细胞)→设置“分选门1”；

10.C.细胞群2为细胞门/活力门/CD3+/CD4+/CD8-/CD25-(辅助T细胞)→设置“分选门2”；

11.D.细胞群3为细胞门/活力门/CD3+/CD4+/CD8-/CD25+(调节T细胞)→设置“分选门3”；

12.Tyto自动将每个分选门与荧光珠群组合(例如，“分类门1”+“珠群X”、“分类门2”+“珠群Y”......)，配对信息需要可供客户下游分析使用。示例如下：

13.→细胞群1＝“分选门1”与绿珠配对(珠门/绿群门)；

→细胞群2＝“分选门2”与红珠配对(珠门/红群门)；

→细胞群3＝“分选门3”与蓝珠配对(珠门/蓝群门)；

14.分选开始，Tyto将每个细胞群中的10000个细胞与对应的珠群配对(如第8条所示)，每个细胞-珠对被封装在油包水的液滴中；细胞是第一分选事件，珠是第二事件，以优化回收率；

15.记录QC参数：封装细胞的数量、每个细胞群的事件、正确匹配的频率(液滴中的1个细胞和1个正确的珠)、漏掉的靶细胞、更多待定；

16.通过与裂解缓冲液混合使细胞在液滴中自动裂解，释放的mRNA被珠上的寡核苷酸捕获，液滴稳定；

17.移除试剂盒并在37℃下培育2小时以进行逆转录，得到与珠特异性条形码连接的cDNA；

18.用清洁剂裂解油包水的液滴；

19.对批量条码化的DNA进行扩增和测序；

20.根据条形码比对序列信息：

→显示特定随机条形码的每个TCR序列都来自某一个特定的细胞；

→另外，每个寡核苷酸都包含特定于一个珠群的短条形码。因此，除了可知道哪些序列来自某一个特定的细胞外，序列信息还将告知这个特定的细胞与哪个珠群/颜色配对，从而可以限定它最初属于哪个细胞群。例如，由于序列属于绿珠，具有特定TCR的特定的细胞是细胞门/活力门/CD3+/CD4-/CD8+/CD25-效应T细胞。

Claims (9)

1.一种鉴定来自细胞群的靶细胞的核酸的方法，该方法包括：

-将来自所述细胞群的至少一个靶细胞与至少一个颜色编码的组合物分离至一个隔室中，所述颜色编码的组合物包括偶联到寡核苷酸的固体颗粒；

-裂解所述分离的靶细胞；

-将所述裂解的分离的靶细胞的核酸分子与所述颜色编码的组合物的寡核苷酸偶联，以形成第一偶联物；以及

-确定所述第一偶联物的序列，从而鉴定所述靶细胞；

其特征在于，

根据所述靶细胞的至少一个预选的物理性质结合所述颜色编码的组合物的至少一个预选的物理性质，选择至少一个靶细胞和至少一个颜色编码的组合物，将其分离至一个隔室中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞的预选的物理性质选自形状、尺寸、粒度、细胞器组合物、离子组合物、糖组合物、脂质组合物和蛋白质组合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将蛋白质组合物用作预选的物理性质，其中通过荧光染色法标记至少一个细胞内蛋白质或细胞外蛋白质。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述颜色编码的组合物的预选的物理性质由所述固体颗粒限定，并且选自尺寸、粒度、电荷、磁矩、一种或多种颜色和至少一种颜色的一种或多种强度。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述颜色编码的组合物具有根据通式(Ia)或(Ib)之一的组合物，

X-(P-C-B-BR)_n (Ia)

X-(P-B-C-BR)_n (Ib)

其中

X为固体颗粒，

P(PCR处理)：包括4至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

C(颜色特异性条形码)：包括1至8个核苷酸残基的寡核苷酸；

B(珠特异性条形码)：包括8至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

BR(结合区)：包括3至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

n：整数≥1，并且

其中P、C、B和BR通过相同或不同的寡核苷酸单元作为间隔区而相互结合，每个间隔区包括0至30个核苷酸残基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述颜色编码的组合物具有根据通式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIe)或(IIf)之一的组合物，

X-(P-C-B-U-BR)_n (IIa)

X-(P-C-U-B-BR)_n (IIb)

X-(P-B-C-U-BR)_n (IIc)

X-(P-B-U-C-BR)_n (IId)

X-(P-U-B-C-BR)_n (IIe)

X-(P-U-C-B-BR)_n (IIf),

其中

X为固体颗粒，

P(PCR处理)：包括4至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

C(颜色特异性条形码)：包括1至8个核苷酸残基的寡核苷酸；

B(珠特异性条形码)：包括8至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

BR(结合区)：包括3至30个核苷酸残基的寡核苷酸；

U(唯一分子标识符)：包括5至15个核苷酸残基的寡核苷酸；

n：整数≥1，并且

其中P、C、B、U和BR通过相同或不同的寡核苷酸单元作为间隔区而相互结合，每个间隔区包括0至30个核苷酸残基。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，通过将至少一个靶细胞和至少一个颜色编码的组合物放入一个被与水不混溶的流体包围的水性液滴中，将来自所述细胞群的至少一个靶细胞与至少一个颜色编码的组合物分离至一个隔室中。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶细胞的用于选择的物理性质通过对所述偶联物的C(颜色特异性条形码)进行测序来鉴定。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，待鉴定的靶细胞的核酸是单链的，并且其中获得了所述核酸分子的互补链并与所述颜色编码的组合物的BR单元偶联，从而形成第二偶联物，对所述第二偶联物进行测序，进而鉴定所述靶细胞。

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