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CN114729391A - 用酶介导的放大的多路复用成像 - Google Patents

用酶介导的放大的多路复用成像 Download PDF

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CN114729391A
CN114729391A CN202080081156.0A CN202080081156A CN114729391A CN 114729391 A CN114729391 A CN 114729391A CN 202080081156 A CN202080081156 A CN 202080081156A CN 114729391 A CN114729391 A CN 114729391A
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enzyme
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G.卡尔森
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Akoya Biosciences Inc
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Akoya Biosciences Inc
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Abstract

用于对样品中的分析物进行成像的方法包括使生物样品与结合剂接触，其中结合剂包括与分析物结合的结合部分和第一核苷酸序列，使生物样品与催化剂接触，其中催化剂包括与酶连接的第二核苷酸序列，并且其中第二核苷酸序列与第一核苷酸序列杂交，使生物样品与定位剂接触，其中定位剂包括与酶互补的底物和连接至底物的第三核苷酸序列，以及使生物样品与标记剂接触，其中标记剂包括与光学标记物连接的第四核苷酸序列，其中第四核苷酸序列与第三核苷酸序列杂交。

Description

用酶介导的放大的多路复用成像
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月30日提交的美国临时专利申请号62/908,540的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
在1942年，抗体首次用于组织切片分析，以可视化注入活细菌的小鼠器官活检中的肺炎球菌抗原。从那时起，免疫组织化学已成为临床诊断和基础研究的中流砥柱。
然而，常规的免疫组织化学(IHC)方法不一定能提供足够的信号用于检测，特别是对于弱表达或现有IHC试剂无法有效靶向的免疫靶物。
发明概述
本公开的特点在于用于对生物样品进行免疫组织化学的方法、物质组合物和试剂盒，其中酪酰胺(tyramide)信号放大以增强使用显色或荧光染料对靶物的检测，其中可以在检测后去除染料。多路复用检测(multiplexed detection)可以通过连续的几轮成像以高水平的多路复用(multiplexing)进行，其中每一轮成像可以检测对应于多个靶物的多种染料，并且放大可以用于任何或所有靶物。
在一些实施方案中，方法包括使用TSA方法将寡核苷酸序列酶介导沉积到样品上。因为与每个抗体分子偶联的酶部分可以催化许多寡序列分子沉积到样品上，这些方法实现了放大(即染料分子的量与靶分子的量的比率大于1:1)。可以对多种抗体重复该过程，从而提供多个寡核苷酸序列在样品上的TSA放大沉积。
引入一种或多种用反义寡核苷酸序列标记的染料，并与相应的(即互补的)TSA沉积的寡核苷酸序列杂交并检测该染料，之后可以将寡核苷酸标记的染料去杂交(dehybridize)并从样品中去除。可以任选地进行一轮或多轮额外的检测。
在一些实施方案中，样品与多种一抗一起温育，每种一抗靶向不同的感兴趣的分析物并定位于对应于样品中的靶分析物的位点。每种不同类型的抗体与独特的寡核苷酸序列Si缀合，该序列取自一组N序列S＝{S1,S2...SN}，其中组S是正交的，这意味着给定的Si的反义序列Si’在严格条件下基本上只与Si杂交，而不与任何Sj杂交，其中i≠j。在序列S组的上下文中，“基本上”是指序列Si’与除Si之外的序列Sj的交叉结合的总量小于序列Si’与序列Si的结合量的1％。
封闭和清洗步骤可以在免疫组化抗体温育过程中进行，以最小化温育中的非特异性结合并随后去除多余的抗体。之后可以进行固定步骤，以将一抗更牢固地连接到样品上，并减少在后续步骤中去除它们的可能性。
如辣根过氧化物酶(HRP)的酶与反义序列Si’缀合并应用于样品，其中反义序列Si’通过沿至少第一结合区结合与连接至一抗的相应序列Si杂交。严格或接近严格的条件可以用于最小化与样品中其他序列和/或其他位置的交叉杂交。因为一抗与取自正交组S的不同序列Si缀合，所以很少或没有酶定位于特异性结合其他靶分析物的一抗。
另外，定位剂包括与HRP酶的底物缀合的寡核苷酸序列Sk。在一些优选的实施方案中，底物可以是酪酰胺化合物(即，含酪酰胺的化合物)、含有酪酰胺衍生物的化合物、对羟基-肉桂酸或对羟基-肉桂酸衍生物。合适的酪酰胺衍生物包括但不限于在胺基上有一个或多个(例如两个或更多个、三个或更多个)取代基的酪酰胺部分，如一个或多个烷基、烯基、炔基、羟基、卤化物和/或烷氧基。对羟基肉桂酸的合适衍生物包括但不限于Taofiq etal.,Molecules 22(2):281(2017)中描述的衍生物，其全部内容通过引用并入。
在一些实施方案中，寡核苷酸序列与相关一抗上的相同(k＝i)。在其他实施方案中，不同的序列(k≠i)也不同于缀合至任何其他一抗的序列。
然后应用寡核苷酸标记的酶底物至样品，导致在靶抗体附近通过酪酰胺信号放大使具有序列Sk的寡核苷酸分子酶催化沉积到样品上。进行去杂交步骤，从其相关抗体中释放寡核苷酸缀合的酶(例如，HRP)，并通过一个或多个清洗步骤去除酶。
上述规程对应于一轮放大的寡核苷酸沉积，导致一些数量的序列Sk的寡核苷酸分子在每个一抗附近与样品共价结合。此类分子的平均数量是通过TSA机制获得的放大程度。
可以对多种抗体种类进行放大沉积，导致不同Sk类型的寡核苷酸序列沉积在对应于多种一抗的样品位置。如果只针对样品中的一个靶物进行放大，则TSA放大的寡核苷酸沉积的轮数可以为1；或者，如果需要对标志物子集进行放大，其可以比一抗的数量N少一些数量M；或者如果对所有标志物都寻求放大，其可以是N。
可以通过引入一种或多种寡核苷酸标记的染料进行检测，每种寡核苷酸具有序列Sk’。每个此类寡核苷酸缀合的染料分子通过沿至少第一结合区结合而与具有交配序列Sk的TSA沉积的寡核苷酸序列杂交。可以施加严格或接近严格的条件，连同清洗步骤以去除多余的寡核苷酸缀合的染料分子，以最小化样品中其他位点的染料结合。
如果使用荧光染料，则使用荧光显微镜对样品进行成像，如果使用显色染料，则使用明场显微镜对样品进行成像。这构成了一轮检测。之后，进行去杂化步骤，释放寡核苷酸标记的染料，并且可以通过一个或多个清洗步骤将它们去除。
在一些实施方案中，在每轮检测中，使用多通道荧光显微镜对2种或更多种染料(例如，3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、8种或更多种、10种或更多种或甚至更多染料)进行成像以单独检测每种染料。在某些实施方案中，使用光谱成像和解混合技术对多达6种或更多种染料进行成像。一般来说，单轮可以成像的染料B的数量取决于显微镜的能力和用于解释其图像的分析技术。
可以对复染剂，如DAPI进行一次成像，或在每个成像周期中成像，并且这可用于配准来自连续成像轮的寡核苷酸标记染料的图像，以形成样品的总体多路复用图像，其中来自所有轮的图像是空间共配准的。
因此，可以获得高度多路复用的图像。可以成像的靶物N的总数基于用正交寡核苷酸序列标记的抗体的数量；它不限于可以在单个成像轮中成像的染料B的数量，也不限于基于TSA的寡核苷酸沉积的轮数M。
可以将经由HRP催化的寡核苷酸沉积的放大用途与非放大检测相结合。某些工作流程可以包括一些寡核苷酸标记的抗体，这些抗体与寡核苷酸标记的HRP杂交，经由TSA反应催化多个寡核苷酸在样品上的沉积，并经由与这些沉积的寡核苷酸偶联的寡核苷酸标记的染料进行检测，而其他寡核苷酸标记的抗体通过与寡核苷酸标记的染料杂交来检测。因此，工作流程可以并入放大用于检测一些抗体，而不是其他抗体。
在一些实施方案中，酶，如HRP可以通过其他方式，如间接标记定位于抗体位点以在样品中沉积寡核苷酸。如上所述，一抗可以与样品中的特定靶分析物结合，然后可以引入与结合实体，如与一抗结合的二抗或纳米抗体缀合的酶，从而使酶与一抗间接连接。
例如，可以将针对PDL-1的E1L3N克隆的一抗与样品一起温育以定位于样品中的PDL-1位点；由Leica Power Vision Poly HRP组成的二抗可以定位在一抗位点并催化具有序列Sk的寡核苷酸沉积到与抗体位置相邻的样品上。剥离技术，如用柠檬酸盐抗原修复溶液洗脱可以用于去除一抗和二抗，使沉积的寡核苷酸留在原位。这可以用其他抗体和其他选定的Sk重复，以提供对应于多个靶物的多个寡核苷酸的HRP放大的沉积，这可以使用如前述的寡核苷酸标记的染料来检测。
在每个标记和成像循环中使用的染料可以相同或不同，并且在每个循环中可以使用相同数量或不同数量的染料并成像。目标通常是对所有感兴趣的靶物进行成像，但可以根据分析物、样品和工作流程条件的特定属性选择使用的特定染料以及将它们分组为轮的方式。例如，可以选择在一轮成像中使用相对较短的曝光时间对TSA沉积的寡核苷酸密度高的几个靶物进行成像；并使用相对较短的曝光时间对另一轮成像中TSA沉积的寡核苷酸较少的其他靶物进行成像。以选定的方式对靶物进行分组对实际因素，如曝光时间、图像配准以及对某些工作流程特有的其他因素可能是有益的。
生物样品可以选自由下项组成的组：生物组织、培养的细胞和取自感兴趣的动物受试者的细胞。在一些实施方案中，生物样品包括人来源或小鼠来源的材料。在一些实施方案中，生物样品是新鲜的、冷冻的或固定的。在一些实施方案中，它可以是从福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织块获得的切片或核心。样品可以包括来自组织切片、组织微阵列(TMA)、细胞沉淀物、核心活检、针吸活检或从血液或血清样品获得的细胞的材料。
在一些实施方案中，生物样品在表面，如载玻片、板、孔或膜上固定化。
在一些实施方案中，一抗和/或二抗或抗体片段包含IgG、IgM、单克隆抗体、scFv、纳米抗体、Fab或双抗体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段对样品的元件，如蛋白质或对另一种抗体或抗体片段(例如，用于间接连接的)是特异性的。
在一些实施方案中，与抗体缀合的寡核苷酸序列Si包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，它包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，Si寡核苷酸是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，Si寡核苷酸是10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。
在一些实施方案中，Si寡核苷酸不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，Si寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，Si寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，Si寡核苷酸是部分双链的。
在一些实施方案中，所述Si’寡核苷酸的第一结合区与所述第一寡核苷酸Si的至少一部分互补。在一些实施方案中，Si’寡核苷酸的第一结合区是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，Si’寡核苷酸的第一结合区是10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。
在一些实施方案中，Si’寡核苷酸的结合区不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，Si’寡核苷酸的结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，Si’寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，Si’寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。
在一些实施方案中，Si’寡核苷酸是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，第二寡核苷酸在10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。在一些实施方案中，第二寡核苷酸不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，Si’寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，Si’寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，Si’寡核苷酸是部分双链的。
在一些实施方案中，酶是辣根过氧化物酶(HRP)。在一些实施方案中，酶可以是可以模拟HRP的含有氯化血红素的复合物，如血色素。在一些实施方案中，酶可以是大豆过氧化物酶。
在一些实施方案中，与基底材料缀合的寡核苷酸序列Sk包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，Sk包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，Sk寡核苷酸是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，Sk寡核苷酸是10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。
在一些实施方案中，Sk寡核苷酸不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，Sk寡核苷酸包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，Sk寡核苷酸是完全单链的。在一些实施方案中，Sk寡核苷酸是部分双链的。
在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸的结合区与所述第一寡核苷酸Sk的至少一部分互补。在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸的结合区是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸的第一结合区是10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。
在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸的结合区不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，所述Sk’寡核苷酸的结合区包含一个或多个合成核苷酸。在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。
在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。在一些实施方案中，第二寡核苷酸在10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。在一些实施方案中，Sk’寡核苷酸不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，引入一种或多种化合物以控制或改变TSA反应。例如，在美国专利6,372,937和6,828,109以及美国专利申请公开号2017/0226572和2005/0003462中描述了此类化合物和TSA工作流程的实例，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，与寡核苷酸缀合的染料是荧光团、染色剂、量子点或显色化合物。合适的染料包括但不限于R6G、DCC、德州红、FITC、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 750、Cy3、Cy 3.5、Cy5、Cy 5.5、Cy7、香豆素、罗丹明以及荧光和显色种类，它们是这些种类的替代变体。
在一些实施方案中，首先进行所有放大步骤，然后经由与寡核苷酸标记的染料的杂交、成像和必要时去除寡核苷酸标记的染料来进行一轮或多轮检测。在一些实施方案中，使用位于显微镜以外的其他地方的样品进行放大，这可以提高该设备的利用；或者为了使用专门的处理装置，如用于扩放大步骤的自动染色机。在其他实施方案中，用显微镜上的样品进行放大。这实现了完全自动化的工作流程，在整个放大和检测过程中，无需机器人或人工干预即可将样品从一台仪器或处理站移动到另一仪器或处理站。
在其他实施方案中，放大和检测步骤是混合的。在一些实施例中，可以重复本文所述的步骤。
在一个方面，本公开的特点在于用于对生物样品中的分析物进行成像的方法，该方法包括使生物样品与结合剂接触，其中该结合剂的特点在于结合分析物的结合部分和第一核苷酸序列，使生物样品与催化剂接触，其中该催化剂的特点在于与酶连接的第二核苷酸序列，并且其中第二核苷酸序列与第一核苷酸序列杂交，使生物样品与定位剂接触，其中该定位剂的特点在于与酶互补的底物和与底物连接的第三核苷酸序列，使生物样品与标记剂接触，其中该标记剂的特点在于与光学标记物连接的第四核苷酸序列，其中第四核苷酸序列与第三核苷酸序列杂交，并将生物样品暴露在照明光下，检测来自生物样品的发射光，并形成生物样品的图像，其中分析物的位置由光学标记物指示。
在另一个方面，本公开的特点在于用于对生物样品中的多种分析物进行成像的方法，该方法包括(a)使生物样品与结合剂接触，该结合剂的特点在于选择性结合分析物之一的结合部分和第一核苷酸序列，(b)使生物样品与催化剂接触，其中催化剂的特点在于与酶连接的第二核苷酸序列，并且其中第二核苷酸序列与第一核苷酸序列杂交，(c)使生物样品与定位剂接触，其中定位剂的特点在于与酶互补的底物和与底物连接的第三核苷酸序列，以沉积与分析物之一相邻的第三核苷酸序列，重复步骤(a)-(c)以沉积生物样品中N个不同的第三核苷酸序列，使得第三核苷酸序列中的每一个在与分析物中的不同者相邻选择性地定位，使生物样品与M种不同的标记剂接触，其中每种标记剂的特点在于与不同光学标记物连接的第四核苷酸序列，其中第四核苷酸序列仅与第三核苷酸序列之一杂交，并且获得样品的图像，其中分析物之一的位置由光学标记物之一的位置指示。
在进一步的方面，本公开的特点在于用于对生物样品中的分析物进行成像的方法，该方法包括将酶连接到分析物以使酶定位在生物样品中的分析物位置处，使生物样品与定位剂接触，该定位剂的特点在于与酶互补的底物和第一核苷酸序列以将第一核苷酸序列在生物样品中与分析物位置相邻沉积，使生物样品与标记剂接触，该标记剂的特点在于与第一核苷酸序列杂交的第二核苷酸序列和光学标记物，并获得生物样品的图像，其中分析物的位置由光学标记物的位置表示。
任何方法的实施方案可以包括任何以下特点。
结合部分可以包括抗体、抗体片段或抗体类似物。抗体、抗体片段或抗体类似物可以包括选自由下项组成的组的成员：IgG抗体、IgM抗体、单克隆抗体、单链可变片段和双抗体。
第一核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸(例如，至少50个核苷酸)。第一核苷酸序列可以包括DNA片段。第一核苷酸序列可以包括RNA片段。第一核苷酸序列可以包括至少一个合成核苷酸。第一核苷酸序列可以是单链序列。第一核苷酸序列可以是至少部分双链的。
第二核苷酸序列可以与第一核苷酸序列至少80％互补。如本文所用，两个核苷酸序列之间的互补性百分比是指两个序列的结合区之间互补碱基的百分比。为了实现可再现的结合，第二序列可以是与第一序列至少70％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)互补。
第二核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸。第一和第二核苷酸序列可以包括不同数量的核苷酸。
酶可以包括辣根过氧化物酶或其衍生物。酶可以包括模拟辣根过氧化物酶的化合物。化合物可以包括含有氯化血红素的复合物。化合物可以包括血色素。酶可以包括大豆过氧化物酶。
第三核苷酸序列可以与第一核苷酸序列相同。第三核苷酸序列可以与第一核苷酸序列不同。第三核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸(例如，至少50个核苷酸)。第三核苷酸序列可以包括DNA片段。第三核苷酸序列可以包括RNA片段。第三核苷酸序列可以包括至少一个合成核苷酸。第三核苷酸序列可以是单链序列。第三核苷酸序列可以是至少部分双链的。
第四核苷酸序列可以与第三核苷酸序列至少80％互补。第四核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸。第三和第四核苷酸序列可以包括不同数量的核苷酸。
光学标记物可以包括荧光种类。光学标记物可以包括显色染色剂。
生物样品可以是组织样品。组织样品可以是新鲜组织样品、冷冻组织样品或福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织样品。
分析物可以包括蛋白质。分析物可以包括肽或肽片段。
方法可以包括，在将生物样品暴露于照明光之前，使生物样品与复染剂接触，并将生物样品暴露于照明光，检测来自生物样品的发射光，并形成样品的第二图像，该图像显示复染剂在生物样品中的位置。复染剂可以包括DAPI。
生物样品中第四核苷酸序列的量与第一核苷酸序列的量的比率可以大于1(例如，大于5、大于50)。
结合剂可以是第一结合剂，催化剂可以是第一催化剂，定位剂可以是第一定位剂，标记剂可以是第一标记剂，分析物可以是第一分析物，并且结合部分可以是第一结合部分，并且该方法可以包括使生物样品与第二结合剂接触，其中第二结合剂的特点在于与生物样品中的第二分析物结合的第二结合部分和第五核苷酸序列。第二分析物可以与第一分析物不同。第二分析物可以包括蛋白质、肽或肽片段。该方法可以包括使生物样品同时与第一和第二结合剂接触。该方法可以包括使生物样品序贯与第一和第二结合剂接触。
催化剂可以是第一催化剂，酶可以是第一酶，定位剂可以是第一定位剂，底物可以是第一底物，标记剂可以是第一标记剂，以及光学标记物可以是第一光学标记物，并且该方法可以包括使生物样品与第二催化剂接触，其中第二催化剂的特点在于与第二酶连接的第六核苷酸序列，并且其中第六核苷酸序列与第五核苷酸序列杂交，使生物样品与第二结合剂接触，其中第二结合剂的特点在于与第二酶互补的第二底物和与第二底物连接的第七核苷酸序列，并且使生物样品与第二标记剂接触，其中第二标记剂的特点在于与第二光学标记物连接的第八核苷酸序列，其中第八核苷酸序列与第七核苷酸序列杂交。第一和第五核苷酸序列可以相同。第一和第五核苷酸序列可以不同。第二和第六核苷酸序列可以相同或不同。第三和第七核苷酸序列可以不同。第四和第八核苷酸序列可以不同。
第一和第二光学标记物可以不同。第二结合部分可以包括抗体、抗体片段或抗体类似物。抗体、抗体片段或抗体类似物可以包括选自由下项组成的组的成员：IgG抗体、IgM抗体、单克隆抗体、单链可变片段和双抗体。第五核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸。第五核苷酸序列可以包括选自由下项组成的组的至少一个成员：DNA片段和RNA片段。第五核苷酸序列可以包括至少一个合成核苷酸。第五核苷酸序列可以是单链序列。第五核苷酸序列可以是至少部分双链的。
第六核苷酸序列可以与第五核苷酸序列至少80％互补。第六核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸。第五和第六核苷酸序列可以包括不同数量的核苷酸。
第一和第二酶可以不同。第二酶可以包括辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶的衍生物、模拟辣根过氧化物酶的化合物、含有氯化血红素的复合物和血色素。第二酶可以包括大豆过氧化物酶。第七核苷酸序列可以与第五核苷酸序列相同。第七核苷酸序列可以与第五核苷酸序列不同。第七核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸。第七核苷酸序列可以包括选自由下项组成的组的至少一个成员：DNA片段和RNA片段。第七核苷酸序列可以包括至少一个合成核苷酸。第七核苷酸序列可以是单链序列。第七核苷酸序列可以是至少部分双链的。
第八核苷酸序列可以与第七核苷酸序列至少80％互补。第八核苷酸序列可以包括至少5个核苷酸。第七和第八核苷酸序列可以包括不同数量的核苷酸。
第二光学标记物可以包括荧光种类。第二光学标记物可包括显色染色剂。
生物样品中第八核苷酸序列的量与第五核苷酸序列的量的比率可以大于1(例如，大于50)。生物样品中第八核苷酸序列的量与第五核苷酸序列的量的比率与生物样品中第四核苷酸序列的量与第一核苷酸序列的量的比率可以不同。生物样品中第八核苷酸序列的量与第五核苷酸序列的量的比率不大于1。生物样品中第八核苷酸序列的量与第五核苷酸序列的量的比率可以大于1，生物样品中第四核苷酸序列的量与第一核苷酸序列的量的比率可以大于1。
方法可以包括，在使生物样品与第二标记剂接触之前，从生物样品中去除第一标记剂。方法可以包括在使生物样品与第二定位剂接触之前从生物样品中去除第一标记剂。方法可以包括在使生物样品与第二催化剂接触之前从生物样品中去除第一标记剂。方法可以包括在使生物样品与第二结合剂接触之前从生物样品中去除第一标记剂。方法可以包括通过将第四核苷酸序列与第三核苷酸序列去杂交来从生物样品中去除第一标记剂。
生物样品的图像可以是第一图像，并且方法可以包括将生物样品暴露于照明光，检测来自生物样品的发射光，以及形成生物样品的第二图像，其中第二分析物的位置由第二光学标记物指示。当生物样品暴露于照明光以形成生物样品的第二图像时，第一光学标记物可以存在于生物样品中。
方法可以包括在将生物样品暴露于照明光以形成生物样品的第二图像之前从生物样品中去除第一光学标记物。从生物样品中去除第一光学标记物可以包括使第四核苷酸序列与第三核苷酸序列去杂交。
方法可以包括在使生物样品与定位剂接触之后和在使生物样品与标记剂接触之前，使生物样品与第二催化剂接触，其中第二催化剂的特点在于与第二酶连接的第五核苷酸序列，并且其中第五核苷酸序列与第三核苷酸序列杂交，使生物样品与第二定位剂接触，其中第二定位剂的特点在于与第二酶互补的第二底物和与第二底物连接的第六核苷酸序列，其中标记剂的第四核苷酸序列与第六核苷酸序列杂交。第五核苷酸序列和第一核苷酸序列可以相同。第六核苷酸序列和第四核苷酸序列可以相同。第二酶可以选自由下项组成的组：辣根过氧化物酶及其衍生物、含有氯化血红素的复合物、血色素和大豆过氧化物酶。
方法的实施方案还可以包括本文描述的任何其他特点，除非另有明确说明，其包括结合不同实施方案描述的特点的组合。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地指示通过引用并入一样。
附图简述
图1A是显示结合剂与样品结合的示意图，该结合剂包括与第一寡核苷酸缀合的一抗。
图1B是显示催化剂与图1A的结合剂的杂交的示意图。
图1C是显示在图1A的一抗附近的样品中定位剂的酶介导沉积的示意图，该定位剂包括酪酰胺缀合的寡核苷酸。
图1D是显示样品中定位剂群位于图1A的一抗附近的示意图。
图2A是显示定位剂分子沉积在样品中，在与感兴趣的分析物结合的一抗附近的示意图。
图2B是显示系统中标记剂分子与定位剂分子杂交的示意图。
图2C是显示图2B中的标记的样品的成像的示意图。
图2D是显示在经由去杂交去除标记剂后图2B的样品的示意图。
图3是显示用于标记和成像样品以检测多种不同分析物的一组实例步骤的流程图。
图4是用寡核苷酸连接的CD20抗体染色并用位于CD20抗体附近的标记剂标记的组织切片的图像。
图5是去除标记剂后图4的组织切片的图像。
附图中相似的元件用共同的参考符号标记。
发明详述
概述
免疫荧光技术可以用于观察单个样品中的多个抗原靶物，例如可视化或测量给定细胞或组织切片中几种蛋白质、肽或其他含有氨基酸的靶物的表达。这种所谓的多路复用免疫荧光可以以多种方式完成。例如，一种技术涉及使样品与几种直接标记的一抗接触，其中每种一抗可以靶向感兴趣的抗原并且可以与不同的荧光染料缀合。在此类方法中，抗体可以在单个步骤中应用，但是在成像过程中染料可以相互区分，因此抗原靶物的数量——多重化程度——受到可以分辨的染料数量的限制。此外，由于没有放大机制，每个抗原的染料分子数目由染料-抗体缀合决定，且该染料分子数可能相对较低。
间接标记可以用于获得更亮的信号。在该技术中，不同种类的二抗可以与各种一抗结合，且荧光染料可以与二抗结合。这可能提供通过在多个位点的二次结合进行放大的潜力，但它是比直接标记更复杂的方法，因为它可能需要在不同物种中产生每个一抗，或者二抗可能识别来自相同物种的不同抗体。
已经开发了串行染色技术，其中样品可以与靶向第一抗原的单个一抗接触。可以引入与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗并将其定位到一抗位点。酪酰胺信号放大(TSA)可以用于通过由HRP催化的反应在这些位点附近沉积染料分子。TSA反应可以产生相对较高的放大。染料沉积后，一抗和二抗可能会被剥离或变性，但染料保持大部分与样品结合。该过程可以重复多次，并且每次可以使用靶向不同抗原的不同一抗以沉积不同的染料。当染料沉积后，对样品进行成像。
因为它是串行方法，一次只激活一种一抗，因此不存在跨物种反应性问题。这具有很大的实际益处，因为可以选择抗体而无需考虑它们所针对的动物物种。然而，由于染料保持与样品的持久结合，因此多路复用的程度受到在单轮成像中能够可靠相互区分的染料数量的限制。
在一些实施方案中，多种一抗可以与寡聚体缀合。例如，可以使用几种抗体，每种都靶向感兴趣的抗原，其中每种可以缀合到不同的寡聚体。为了不同寡聚体之间的低交叉杂交，可以选择或工程化改造寡聚体序列。样品可与一抗接触，一抗可以根据其类型定位于抗原位点。荧光染料或其他检测部分，如量子点可以与寡聚体序列缀合，这些寡聚体序列与用于各种一抗的序列键合。这些中的一种或多种可以在可以促进检测连接的寡聚体与其抗体连接的对应物杂交的条件下与样品接触。通过这种方式，检测部分可以定位在相关抗体的抗原位点，并且可以对样品进行成像。在本文中，这称为非放大的寡核苷酸介导的检测。此类方法的方面在例如，美国专利9,909,167和10,370,698中描述，其全部内容通过引用并入。
可以通过创造偏爱去杂交的条件和进行清洗步骤来去除检测连接的寡核苷酸链。许多一抗可以在单实验中使用，每一种都有不同的寡核苷酸序列，将相应的检测连接的寡核苷酸分组杂交、成像和去除。在一些工作流程中，成像步骤可能仅区分任何一组中存在的染料数量，而总体测量可以通过重复实现高多路复用水平。
样品标记和成像
本公开的特点在于用于样品标记和成像的方法，其涉及对应于样品中特定靶分析物的信号的酶介导放大。在一些实施方案中，该方法包括使生物样品与缀合至第一寡核苷酸Si的抗体或抗体片段接触；使所述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸Si’的结合区接触；其中第二寡核苷酸Si’的结合区与第一寡核苷酸Si的至少一部分互补，其中第二寡核苷酸Si’与酶缀合；使得酶经由TSA反应介导物质在生物样品上的沉积。该物质本身是第三寡核苷酸Sk，其与第四寡核苷酸Sk’的至少一部分互补，所述第四寡核苷酸Sk’与使用显微镜或类似设备成像的染料缀合。
在此讨论中，Si中的下标i表示第一寡核苷酸序列，以及其与被成像样品中的选定靶物相关的用途。符号Si’表示与Si互补的第二寡核苷酸序列，其能够沿其长度的至少一部分与Si选择性结合。Si来自一组正交序列，这意味着Si’在严格条件下不与j≠i的集合中的任何其他序列Sj杂交。
Sk中的下标k表示寡核苷酸序列及其与被成像样品中的选定靶物有关的用途。符号Sk’表示与Sk互补的寡核苷酸序列，其能够沿其长度的至少一部分与Sk选择性结合。Sk来自一组正交序列，这意味着Sk’在严格条件下不与k≠m的集合中的任何其他序列Sm杂交。
当描述根据本公开的多个靶物的放大检测时，下标和撇号的相同符号用于相关的每个靶物，但是Si和Sk所指的实际序列对于每个靶物是不同的。因此，在具有M个使用放大的不同靶物的多路复用的实验中，每个靶物将具有与由Si表示的寡核苷酸缀合的抗体，但Si所指的实际序列对于每种抗体是不同的。类似地，与该靶物相关的TSA反应沉积了由Sk表示的寡核苷酸序列，但Sk所指的实际序列对于每个靶物是不同的。类似地，与该靶物结合使用的寡核苷酸标记的HRP具有在本文中表示为Si’的序列，但Si’所指的实际序列对于每个靶物是不同的；并且寡核苷酸标记的染料具有表示为Sk’的序列，但Sk’所指的实际序列对于每个靶物是不同的。
存在用于设计或选择一组正交且与天然存在的寡核苷酸序列选择性结合的可能性低的序列{S1，S2...SN}的技术。参见例如美国专利号10,370,698，其中列出了满足这些条件的互补序列的实例组。
生物样品可以与两个或更多(例如，3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、8个或更多、10个或更多、12个或更多、15个或更多、20个或更多、30个或更多、40或更多、50或更多、60或更多、80或更多或甚至更多)抗体、抗体片段或其组合。样品可以与所有抗体或抗体片段的混合物，或抗体总数的多个子集的组合接触。除了从使用单个此类温育获得的时间节省和简化之外，它还可以改善对样品中共同定位的靶物的检测。不希望受理论束缚，单个混合温育似乎减少或消除了与样品上相邻或重叠的靶物结合的抗体之间的系统干扰。
与抗体温育相关的抗原修复、封闭和清洗步骤可以按照正常的免疫组织化学实践进行。特定步骤、使用的化合物、时间、温度和作用顺序可以根据将成像的靶物进行优化，以获得良好的灵敏性、定位、选择性或其他感兴趣的标准。
一种或多种抗体、抗体片段或其组合中的每一种都与该抗体或抗体片段所特有的第一寡核苷酸Si缀合。在使抗体或抗体片段与样品接触后，第一寡核苷酸可以与第二寡核苷酸Si’接触。例如，第一寡核苷酸可以与第二寡核苷酸杂交，如通过互补碱基配对。每个第一寡核苷酸Si可以对应于独特的第二寡核苷酸Si’。如前所述，这可以经由涉及一组正交序列{S1,S2...SN}的条形码系统来实现。
在一些情况下，第一寡核苷酸Si与抗体或片段间接偶联，例如经由额外的接头寡核苷酸。其他间接偶联方法包括结合与第二抗体、纳米抗体或特异性靶向一抗的其他实体偶联的第一寡核苷酸Si，从而将一抗间接连接至第一寡核苷酸。
每个第二寡核苷酸Si’与能够介导可检测物质在生物样品上沉积的酶缀合。在一些优选的实施方案中，第二寡核苷酸Si’可以与辣根过氧化物酶(HRP)酶缀合。在其他实施方案中，第二寡核苷酸Si’与包含数个HRP分子的聚合物缀合。在一些实施方案中，酶可以是可以模拟HRP的含有氯化血红素的复合物，如血色素。在一些实施方案中，酶可以是大豆过氧化物酶。在一些情况下，第二寡核苷酸与酶间接偶联，例如经由额外的接头寡核苷酸或点击化学系统。
可以采用严格或接近严格的条件来确保在靶抗体上除了预期的Si条形码之外的位点很少或不发生结合。也可以应用其他寡核苷酸序列，它们没有相关酶并且不与预期的结合靶物Si选择性结合，以进一步降低酶与样品的非特异性结合的可能性。
对应于寡核苷酸标记的酶的过量催化剂分子可以通过清洗从样品中去除，之后酶仅定位或主要定位在相关的一抗附近。
使用TSA反应以在样品上沉积寡核苷酸Sk。寡核苷酸序列Sk与底物缀合，该底物可以是酪酰胺化合物或对羟基肉桂酸或由HRP催化以根据TSA机制结合样品的另一种底物。寡核苷酸序列Sk和底物材料之间的偶联可以是间接的，例如经由额外的接头寡核苷酸或通过另一种机制。
将包括具有序列Sk的寡核苷酸标记的酶底物的定位剂引入样品，同时具有序列Si’的寡核苷酸连接的酶通过杂交结合到具有序列Si的寡核苷酸连接的抗体上。这导致寡核苷酸序列Sk名义上仅在对应于该抗体的位置处沉积。
如上所述，定位剂的沉积导致与特定靶分析物相关的成像信号的放大。在本讨论中，放大因子用α表示，并描述了每个定位于样品靶位点的抗体分子在样品上沉积的具有寡核苷酸序列Sk的分子的数量。由于可以标记序列Sk的沉积的寡核苷酸的每一个以产生成像信号(例如，荧光信号或对应于光吸收、透射或反射的信号)，因此序列Sk的此类寡核苷酸的数量相对于每个靶分析物分子对应于放大因子或放大程度为α。
因为每个靶分析物分子都用与序列Si的单个寡核苷酸分子连接的一抗标记，所以放大因子α有效地对应于样品中序列Sk的寡核苷酸的量或浓度与样品中序列Si的寡核苷酸的量或浓度的比率。量或浓度的比率(即，放大因子)可以是1.1或更多(例如，1.5或更多、2.0或更多、3.0或更多、4.0或更多、5.0或更多、7.0或更多、10.0或更多、20.0或更多、30.0或更多、40.0或更多、50.0或更多、60.0或更多、70.0或更多、80.0或更多、90.0或更多、100.0或更多、200.0或更多、500.0或更多、1000或更多、5000或更多、10000或更多或甚至更多)。可以调整放大因子α以平衡多个抗体之间的信号水平；达到期望的染色模式；或基于正在进行的测定的其他目的。
酶介导的放大过程可以通过调节定位剂中寡核苷酸标记的酶底物的浓度；反应时间；反应温度；以及寡核苷酸缀合的酶底物的替换或补充来控制。它也可以通过添加化合物如无机盐或有机增强化合物如美国专利6,372,937中描述的化合物来修饰，其全部内容通过引用并入。通过分别进行与每种靶分析物相关的定位剂的酶介导沉积，可以针对每种靶分析物分别调整放大程度。
在一些条件下，TSA反应导致酶底物分子二聚化，而不是沉积在样品上。当酶分子或寡核苷酸标记的酶底物分子的密度太高时，就会发生这种情况。减少这些因子之一或两者都可以减少二聚化的影响并产生更高水平的沉积。例如，可以降低寡核苷酸标记的酶底物的浓度；或使用非聚合物HRP酶代替聚合物HRP酶。
可以依次对每个抗体进行沉积循环，使用寡核苷酸连接的酶(例如，HRP)，其具有对应于与序列Si的寡核苷酸连接的抗体的寡核苷酸序列Si’，将寡核苷酸序列Sk沉积在样品上。对于寻求放大检测的每种抗体重复此操作，其中每种类型的抗体与具有不同序列Si的不同寡核苷酸连接。
在一些实施方案中，具有针对给定抗体沉积的序列Sk的寡核苷酸与缀合至该抗体的序列Si相同。在此类实施方案中，沉积步骤的结果是将多个寡核苷酸分子结合到与抗体相邻的样品上，其具有与缀合至该抗体的寡核苷酸序列相同的序列。
在某些实施方案中，针对给定抗体沉积的序列Sk与缀合至该抗体的序列Si不同。在此类实施方案中，沉积步骤的作用是将多个寡核苷酸分子结合到与抗体相邻的样品上，其具有与缀合至该抗体的寡核苷酸序列不同的序列。
使用与寡核苷酸序列Sk’缀合的染料分子检测沉积在样品上的寡核苷酸序列Sk，所述寡核苷酸序列Sk’沿其长度的至少一部分与Sk选择性杂交。
检测包括引入包括寡核苷酸标记的染料分子的标记剂；提供严格或接近严格的杂交条件，在该条件下，与染料分子缀合的寡核苷酸序列Sk’选择性地与具有沉积在样品上或与抗体缀合的序列Sk的寡核苷酸杂交；去除未杂交的寡核苷酸标记的染料分子；任选地使用复染剂，如DAPI；使用显微镜对样品进行成像以形成染料分子的图像；并且任选地，通过去杂交和清洗步骤去除寡核苷酸标记的染料分子。
总之，在样品上存在互补定位剂的位点结合寡核苷酸标记的染料分子、应用复染剂、对样品进行成像和去除染料分子的步骤形成一个检测循环。
如上所述，本文所述的某些方法的重要方面是可以进行靶分析物的放大检测，然后从样品中去除产生在样品成像期间观察到的信号的标记剂。因此，样品标记、成像和任选地标记去除的多个循环可以连续进行。由于每个循环使用的染料可以经由去杂交和清洗步骤去除，因此它们不会干扰后续循环中的标记成像。总体而言，通过连续的标记和检测循环可以实现高度的多路复用以检测N个靶分析物，其中在每个循环中使用较少数量的染料B或甚至单一染料(B＝1)。
通常，可以使用本文所述的方法检测的靶分析物的数量N，N为1或更多(例如，2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、8或更多、10或更多、12或更多、15或更多、20或更多、25或更多、30或更多、35或更多、40或更多、45或更多、50或更多或甚至更多)。
在单个成像步骤中检测到的染料B的数量可以是1或更多，(例如，2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、8或更多、10或更多、15或更多、20或更多、30或更多、40或更多、50或更多、70或更多或甚至更多)。
可以沉积在样品中以检测靶分析物的不同类型的标记剂的数量M可以是1或更多(例如，2或更多、3或更多、4或更多、5或更多、6或更多、8或更多、10或更多、12或更多、15或更多、20或更多、25或更多、30或更多、35或更多、40或更多、45或更多、50或更多或甚至更多)。在一些实施方案中，M小于或等于N。
在一些实施方案中，对每个将成像的靶物进行包括寡核苷酸的定位剂的放大沉积。在某些实施方案中，包括寡核苷酸的定位剂的放大沉积仅针对单靶物，或针对将成像的N个靶物的子集进行。
当进行放大时，可以在靶物的定位剂沉积后的任何时间点进行靶分析物的检测。可以在沉积步骤和检测步骤之间交替，并且在一些实施方案中，可以进行一个或多个沉积步骤以引入与不同靶分析物相关的一种或多种不同类型的定位剂，并且可以进行一个或多个检测步骤以标记和检测定位剂，然后进行进一步的沉积和检测循环。
在一些实施方案中，在进行任何检测步骤(例如，标记剂的引入和样品的成像)之前，可以将所有感兴趣的靶分析物的定位剂沉积在样品中。可以使用特定的专用仪器，如自动染色器、具有染色腔室的微流体系统和其他系统来沉积定位剂。此类系统自动分配试剂，并在无需用户干预的情况下控制温度、处理时间和流动速率。此类系统的一个优点是样品不会在染色设备和成像站之间重复循环。例如，在美国专利申请号16/902,215和美国专利6,735,531和7,226,788中描述了用于在本文中应用试剂和方法的合适系统，其每篇的全部内容通过引用并入本文。
一次可以检测一种分析物，但也可以一次检测2、3、4、5、6甚至更多种的分析物，以及与样品中的区域非特异性结合的一种或多种复染剂(例如，一种或多种组织复染剂、一种或多种核复染剂)。一次引入并杂交不同的标记剂，每个标记剂都有寡核苷酸标记的染料分子，并且由于标记剂的核苷酸序列Sk’是正交的，如前所述，每个染料分子定位于相应的抗体，该抗体仅与靶分析物(或等效地，在样品中有具有序列Sk的寡核苷酸的其相关的TSA沉积的定位剂)中的一个结合。选择染料的数量、选择的染料和成像过程，以确保与每种染料相关联的信号，因此每种靶分析物可以在所得的图像中彼此区分开来。
将本文描述的方法与其他串行多路复用方法进行比较是有指导意义的。称为顺序免疫过氧化物酶标记和擦除的方法(SIMPLE,G.Glass,J.Papin,J Mandell,J.HistochemCytochem 2009Oct；57(10):899:905)涉及使用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)的IHC串行轮；对这种染色进行成像，然后用酒精溶解。每个IHC轮提供单一标志物的视图，并且需要封闭、一抗温育、清洗、二抗温育、进一步清洗和染色；然后对样品进行成像，在水、乙醇、水、高锰酸钾的3种稀释物和水中清洗。每个标志物的这些步骤的总时间接近3小时，因此进行12重测定将需要36小时的样品处理，其不包括对样品进行12次成像所花费的时间。
US 7,729,125中描述了多路复用的成像方法，其中使用11种免疫标志物和DAPI对正常前列腺样品进行成像。它包括2轮双通道间接IHC，然后是7轮直接标记的IHC，在每轮染色之间使用NaOH溶液擦除染料，然后在PBS中清洗。每轮间接IHC需要约2小时，每轮直接IHC需要约1小时，并且擦除步骤各自需要超过15分钟。四个标志物经由二抗进行了信号放大，七轮没有提供放大。总体而言，总共需要14小时的样品处理，不包括对样品进行9次成像所花费的时间。
本文所述的方法可以用对所有一抗的单个温育步骤进行。放大的TSA沉积可以针对需要放大的每种靶分析物单独进行，每个靶分析物需要约30分钟，其包括杂交、清洗、TSA沉积、清洗和去杂交。每个循环可以对四个种类或更多种类进行检测；例如，使用4种染料(例如，从Akoya Biosciences,Inc.,Menlo Park,CA获得的染料Opal 520、Opal 570、Opal620、Opal 690)以及DAPI复染剂，并且可以使用Vectra Polaris仪器(可从AkoyaBiosciences,Inc.获得)进行成像。每轮检测所需的时间为约30分钟，其包括约10分钟的成像时间。不包括初级温育，本实例的总样品处理时间当放大4个种类时为3个半小时或当放大12个种类时为7个半小时。
这种比较阐释了本文所述方法的几个有益方面，其包括选择使用用所有一抗的混合物进行单个温育；能够用放大对大量N个靶物进行成像；对一些靶物使用放大而不对其他靶物使用放大的选项；能够在需要的地方对标志物进行高放大；在单轮检测中标记和成像多个靶物B的能力；和总体高速。
在使用荧光染料分子的实施方案中，可以使用荧光显微镜进行成像。这可以使用广域落射荧光方法完成或也可以使用技术，如共焦成像、超分辨率成像、多光谱成像、双光子显微镜或全内反射显微镜完成。用于获得图像的成像系统可以包括直立和/或倒置显微镜、数字幻灯片扫描仪或定制设备。
在使用显色染料分子的实施方案中，可以使用明场显微镜进行成像。这可以使用白光源和透射光光学器件来完成或可以使用技术，如激光扫描、窄带成像或多光谱成像完成。
在某些实施方案中，可以对一种或多种靶分析物中的每一种进行串行放大循环。例如，与寡核苷酸序列Si缀合的一抗由与Si’缀合的寡核苷酸标记的酶，如HRP接触。将具有序列Sk的寡核苷酸标记的酶底物引入样品中，并且具有序列Sk的寡核苷酸分子通过TSA机制沉积在样品上，放大因子为α1，其由与一抗相关的酶催化。
任选地经由去杂交以从样品中去除具有序列Si’的寡核苷酸标记的酶，并且使样品与缀合至序列Sk’的寡核苷酸的寡核苷酸标记的酶(如HRP)接触。接着，将具有序列Sk的寡核苷酸标记的酶底物应用于样品，与序列Sk’的寡核苷酸杂交，并通过TSA机制将序列Sk的寡核苷酸分子沉积在样品上，放大因子为α2(其中放大因子α2对应于序列Sk的寡核苷酸分子的量或浓度相对于序列Sk’的寡核苷酸分子的量或浓度)。如果这些酶没有从样品中去除，沉积由与序列Sk的寡核苷酸缀合的酶催化，以及与序列Si’的寡核苷酸缀合的酶。总体而言，两个沉积步骤实现了(α1xα2)的放大。
串行放大的沉积轮可以用于实现比单个沉积步骤中实际更高的总体放大和/或精细控制放大程度。尽管前述实例描述了用于放大与单个靶分析物相关的信号的两个沉积步骤，但更一般地，可以进行任何数量(例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、10个或更多个或甚至更多个)的沉积步骤，每个步骤涉及引入具有寡核苷酸缀合酶的催化剂和具有互补寡核苷酸的定位剂。特别是，对于弱表达的靶分析物，多个沉积步骤可能有利于检测。进一步，对于每个靶分析物可以独立选择沉积步骤的数量，可以在相同数量或不同数量的放大沉积步骤后检测任意两种靶分析物。
在一些实施方案中，对给定的靶分析物进行一个或多个放大循环或步骤，并针对该靶分析物进行检测。任选地，(例如，基于对应于靶分析物的测量的成像信号)做出是否需要进一步放大的决定。在至少一些实施方案中，然后针对该靶分析物进行用于放大的一个或多个进一步的沉积循环或步骤，并且再次进行检测。这提供了具有不同放大水平的样品的两个或更多个图像。如上所述，特定靶分析物的图像数量可以是一个或更多个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、10或更多个或甚至更多个)。
在一些实施方案中，上述差异放大方法用于对具有广泛可变表达的样品进行成像，其中在成像之前最佳放大是未知的。在其他实施方案中，该方法用于在第一图像中对样品中的强表达区进行成像，并且在第二图像中对相同样品的更弱表达区进行成像。在某些实施方案中，两个图像中信号水平的比较提供了第二放大因子α2的评估。任选地，由靶物表达中具有高动态范围的的第一和第二图像组装图像。
生物样品可以是新鲜的、冷冻的或固定的。生物样品可以是动物来源的，如来自人、小鼠、大鼠、牛、猪、羊、猴或兔。
生物样品可以在表面上固定化。在一些实施方案中，表面可以是载玻片、板、孔、膜或薄膜。可以使用醛、醇、氧化剂、汞、苦味酸盐或HOPE固定剂来固定生物样品。生物样品可以可替代地使用热固定来固定。固定可以经由浸入或灌注来实现。生物样品可以是新鲜的或冷冻的。在一些优选的实施方案中，样品包含福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。
在一些实施方案中，在接触生物样品后，抗体或抗体片段可以与生物样品的元件结合。抗体或抗体片段可以与生物样品的元件可逆或不可逆地结合。
抗体或抗体片段可以包含IgG、IgM、多克隆抗体、单克隆抗体、scFv、纳米抗体、Fab或双抗体。抗体或抗体片段可以对样品的元件如蛋白质具有特异性。从可用候选物中选择特定抗体是根据给定实验的需要进行的，并且可以基于因素，如成本、针对该靶物的可用抗体、针对该靶物的每种候选抗体的特异性、背景(非特异性)结合量以及免疫组织化学设计中使用的其他因素。这些可能有利于选择一个克隆而不是另一个，或单克隆而不是多克隆(反之亦然)。
对于一些克隆，当抗体与寡核苷酸Si缀合时，这些特性发生变化。因此，抗体应通过常规IHC技术测试以形成对其行为的初步评估，然后在与用于本公开的寡核苷酸序列缀合后检查，以确保其性能在缀合后保持可接受。
实例工作流程
本文所述的方法可以在多种不同的工作流程中实施。图1A-1D和2A-2D是阐释方法的一个实例实现的示意图。在图1A中，使样品102与包括结合部分104的结合剂接触，该结合部分104与样品102中的分析物101结合。结合部分104与具有序列Si的第一寡核苷酸连接。合适的结合部分104包括本文所述的任何结合部分，其特异性结合样品102中的靶感兴趣的分析物，如抗体和抗体片段。
在图1B中，使样品102与包括第二寡核苷酸108的催化剂接触，该第二寡核苷酸108具有与酶110连接的互补序列Si’。如本文所讨论的，合适的酶包括HRP、大豆过氧化物酶和模拟这些过氧化物酶的功能催化特性的其他种类。第二寡核苷酸108选择性地与第一寡核苷酸106杂交，使得催化剂选择性地定位在样品102中靶分析物101的位置。
在图1C中，使样品102与定位剂接触，该定位剂包括与酶110互补的底物112。底物112与具有序列Sk的第三寡核苷酸连接。合适的底物包括但不限于本文所述的酪酰胺和酪酰胺衍生物、对羟基肉桂酸及其衍生物。酶110和底物112之间的催化反应将多个定位剂分子沉积在样品中靠近分析物101的位置。
在图1D中，催化剂已经经由去杂化和清洗从样品102中去除。如所示，沉积的定位剂分子保留在样品中，因为它们与样品共价结合。
图2A显示了如图1D中的样品102的相同视图。在图2B中，包括具有与光学标记物118连接的序列Sk’的第四寡核苷酸116的标记剂与样品接触。第三和第四寡核苷酸114和116的序列是互补的，并且第四寡核苷酸116与第三寡核苷酸114杂交，将标记剂定位在样品102中的分析物101附近。因为多个定位剂分子针对每个分析物分子101沉积在样品中，所以放大与分析物101相关的测量信号。
在图2C中，照明光120入射在样品102上，并且光学标记物118产生发射光(例如，通过发射荧光，或通过吸收一些照明光)。检测发射光以形成样品102的图像，其中来自光学标记物118的发射光指示分析物101的位置。
在图2D中，标记剂分子已经通过去杂交和清洗从样品102中任选地去除。如前所述，可以进行额外的沉积和/或检测循环以识别样品102中的额外靶分析物。
图3是显示对应于本文描述的用于检测样品中的分析物的方法的一种实施方式的一系列实例步骤的流程图。在第一步骤302中，将样品与多种不同类型的结合剂一起温育。每种不同类型的结合剂包括对特定靶分析物特异的结合部分，以及具有与结合部分相关的序列的第一核苷酸。
接下来，在步骤304a中，使样品与催化剂接触，该催化剂包括与第二寡核苷酸连接的酶。第二寡核苷酸的序列仅与来自步骤302的不同第一寡核苷酸中的一个互补，并选择性地与该第一寡核苷酸杂交，从而将催化剂定位在样品中。然后，在步骤306a中，使样品与定位剂接触，该定位剂包括与第三寡核苷酸连接的酶底物。酶和底物之间的催化反应将定位剂分子沉积在样品中特定靶分析物的附近。
对于样品中的N种不同靶分析物中的每一种，步骤304a和306a重复N次(如步骤304n和306n，其中n＝b…N)。在步骤304n中引入的每种不同类型的催化剂选择性地与对样品中的不同靶分析物特异的不同一种结合剂杂交。在步骤306n中引入的每种不同类型的定位剂沉积在与步骤304n中的催化剂选择性结合的靶分析物附近，并且具有在不同类型定位剂的序列中唯一的第三寡核苷酸序列。
接下来在步骤308a中，一组一种或多种不同类型的标记剂——其中每种类型具有第四寡核苷酸，其序列与定位剂的仅一种类型互补——接触样品。每种不同类型的标记剂与其互补的定位剂杂交，并具有光学标记物。在步骤310a中，获得样品的图像，其显示来自标记剂的不同光学标记物中的每一个的贡献。由于标记剂通过与互补定位剂杂交而定位，每种标记剂的光学标记物指示样品中存在不同的一种靶分析物。
对于P个不同的标记剂组，步骤308a和310a重复P次(如步骤308p和310p，其中p＝a…P)。在一些实施方案中，例如，每组P标记剂仅包括单一标记剂。在某些实施方案中，每组P标记剂包括多于一种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、八种、10种或甚至多于10种)标记剂，在步骤310p中获得的图像中检测每种标记剂。需要注意的是，在每个步骤310p中检测到的标记剂的数量可以相同或不同。
在将所有标记剂引入样品并获得所有样品图像后，图3所示的规程终止。
寡核苷酸
寡核苷酸是包括多个核苷酸(例如，可以连接至少其中一些以形成链)的分子。本文所述的寡核苷酸可以包含核糖核酸。本文所述的寡核苷酸可以包含脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，寡核苷酸可以是任何序列，其包括用户指定的序列。
有时，寡核苷酸可以由G、A、T和C或能够与互补核苷酸可靠碱基配对的碱基组成。7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、2-脱氮-2-硫代-鸟苷、2-硫代-7-脱氮-鸟苷、2-硫代-腺嘌呤、2-硫代-7-脱氮-腺嘌呤、异鸟嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、5,6-二氢尿苷、5,6-二氢胸腺嘧啶、黄嘌呤、7-脱氮-黄嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮-黄嘌呤、2,6-二氨基-7-脱氮嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿苷、5-丙炔基-胞苷、2-硫代-胸腺嘧啶或2-硫代-尿苷是此类碱基的实例，尽管许多其他碱基是已知的。寡核苷酸可以是LNA、PNA、UNA或例如吗啉代低聚物。本文使用的寡核苷酸可以含有天然或非天然核苷酸或键联。
在本文中，抗体、抗体片段或另一分析物靶向部分可以缀合至第一寡核苷酸以形成结合剂，使得抗体、抗体片段或其它分析物靶向部分的至少一部分可以接触生物样品的分析物。然后第一寡核苷酸可以与第二寡核苷酸的结合区杂交，其中第二寡核苷酸与能够介导另一分子沉积在生物样品上的酶缀合。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含多个核糖核酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含多个脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸可以包含一个或多个合成核苷酸。合成核苷酸的实例可以包括RNA类似物或DNA类似物。一些合成核苷酸可以包含人工核酸，其可以包含肽核酸、吗啉代和锁核酸、二醇核酸或苏糖核酸。
第一寡核苷酸可以具有适合特定工作流程的给定长度。在一些实施方案中，可以选择较长的寡核苷酸。在一些实施方案中，可以选择较短的寡核苷酸。影响寡核苷酸长度选择的因素可以包括，例如解链温度、二级结构、亲和力、特异性、选择性、成本和/或可能序列的组合数量。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸可以是5-30之间、5-25之间、5-20之间、10-20之间、10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸可以不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸可以是完全单链的。在一些实施方案中，第一寡核苷酸可以是部分双链的。在一些实施方案中，部分双链区可位于核苷酸的3’末端、核苷酸的5’末端或核苷酸的5’末端和3’末端之间。在一些实施方案中，可以存在多于一个的双链区。一些第一寡核苷酸可以具有二级结构，使得单链的折叠和/或其与自身的互补性可以产生一个或多个包含单链的双链区。
与酶缀合以形成催化剂的第二寡核苷酸可以在第二寡核苷酸的结合区与第一寡核苷酸杂交。这种相互作用可以经由碱基配对发生。
第二寡核苷酸的结合区可以至少部分地与第一寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，结合区可以与第一寡核苷酸的3’末端互补。在一些实施方案中，第一结合区可以与第一寡核苷酸的5’末端互补。在一些实施方案中，第一结合区可以与第一寡核苷酸的3’末端和5’末端之间的区互补。在一些实施方案中，结合区可以与整个第一寡核苷酸互补。在一些实施方案中，结合区可以与小于100％的第一寡核苷酸互补，如前所述。
在一些实施方案中，第二寡核苷酸可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个核苷酸长。
在一些实施方案中，第二寡核苷酸可以是5-30之间、5-25之间、5-20之间、10-20之间、10-30之间、10-50之间、10-70之间、10-100之间、20-50之间、20-70之间、20-100之间、30-50之间、30-70之间、30-100之间、40-70之间、40-100之间、50-70之间、50-100之间、60-70之间、60-80之间、60-90之间或60-100之间个核苷酸长。
在一些实施方案中，第二寡核苷酸可以不超过5、不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、不超过85、不超过90、不超过95或不超过100个核苷酸长。
在一些实施方案中，第二寡核苷酸可以是完全单链的。在一些实施方案中，第一寡核苷酸可以是部分双链的。在一些实施方案中，部分双链区可以位于核苷酸的3’末端、核苷酸的5’末端或核苷酸的5’末端和3’末端之间。在一些实施方案中，可以存在多于一个的双链区。一些第二寡核苷酸可以具有二级结构，使得单链的折叠和/或其与自身的互补性可以产生一个或多个包含单链的双链区。在一些实施方案中，第二寡核苷酸可以包含多于一种寡核苷酸。
具有序列Sk的第三寡核苷酸与酶底物缀合以形成适合于TSA放大的定位剂，如酪酰胺化合物、对羟基肉桂酸或如前所述的这些的衍生物。缀合可以是间接的，例如经由额外的接头寡核苷酸、经由二抗或纳米抗体或之前讨论的任何其他机制。
具有序列Sk’的第四寡核苷酸与光学标记物缀合以形成标记剂。缀合可以是间接的，例如经由额外的接头寡核苷酸，或通过其他机制。通常，光学标记物是染料分子，并且可以是荧光部分、显色部分，或更一般地，当暴露于照明光时产生可检测信号的任何其他类型的部分。
光学标记物可以是荧光染料分子或部分，如Alexa 488、Alexa 514、Alexa 568、Alexa 547、Alexa 750、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、德州红、香豆素、DyLight染料、Atto染料或其他染料。在一些实施方案中，染料分子或部分可以包括一个或多个量子点。在某些实施方案中，染料分子或部分可以包括一种或多种显色种类。
第四寡核苷酸可以在第四寡核苷酸的结合区与第三寡核苷酸杂交。这种相互作用可以经由碱基配对发生。
第四寡核苷酸的结合区可以与第三寡核苷酸的至少一部分互补。在一些实施方案中，结合区可以与第三寡核苷酸的3’末端互补。在一些实施方案中，结合区可以与第三寡核苷酸的5’末端互补。在一些实施方案中，结合区可以与第三寡核苷酸的3’末端和5’末端之间的区互补。在一些实施方案中，结合区可以与整个第三寡核苷酸互补。在一些实施方案中，结合区可以与小于100％的第三寡核苷酸互补。
在本文所述的方法中，样品与一种或多种结合剂接触，所述一种或多种结合剂包括与有具有序列Si的第一寡核苷酸的寡核苷酸缀合的结合部分。如上所述，合适的结合部分包括抗体、抗体片段和选择性结合蛋白质、标志物、肽、肽片段和作为样品中的靶分析物的其他含氨基酸种类的其他部分。用于通过将结合部分与寡核苷酸缀合来制备合适的结合剂的方法描述于，例如美国专利5,391,723和Dennler et al.Antibodies 4:197-224(2015)和Kozlov et al.,Biopolymers 73:621(2004),每篇的全部内容通过引用并入本文。
使样品还与一种或多种催化剂接触，该一种或多种催化剂包括与具有序列Si’的第二寡核苷酸连接的酶。通过将酶与寡核苷酸连接来制备合适的催化剂的方法描述于，例如van Gijlswijk et al.,Cytogenet.Cell Genet.75:258-262(1996)，其全部内容通过引用并入本文。
使样品进一步与一种或多种定位剂接触，该一种或多种定位剂包括与具有序列Sk的第三寡核苷酸连接的酶底物。用于通过将酶底物与寡核苷酸连接来制备合适的定位剂的方法描述于，例如Spicer et al.,Chem.Rev.118(16):7702-7743(2018)、Winkler,Ther.Deliv.4(7):791-809(2013)和van Gijlswijk et al.,Histochemie 113(3):175-180(2000)，每篇的全部内容通过引用并入本文。
使样品还与一种或多种定位剂接触，该一种或多种定位剂包括与序列Sk’的寡核苷酸连接的光学标记物(例如荧光或显色部分)。用于制备合适标记剂的方法描述于，例如，Wood et al.,“Fluorescence Labeling of Nucleic Acids”,Encylcopedia ofBiophysics(2013),Hwang,Molecules 23(1):124(2018)和Taskova et al.,BioconjugateChem.30(12):3007-3012(2019)，每一篇的全部内容通过引用并入本文。
处理试剂和条件
与第一寡核苷酸(结合剂)缀合的抗体、抗体片段或其他分析物靶向部分可以在第一缓冲液中递送至样品。第一缓冲液可以包括PBS、PBS-T、TBS、TBS-T水、盐水或Kreb缓冲液并且可以包括封闭材料。在一些实施方案中，封闭材料可以包含BSA、酪蛋白、经剪切的鲑鱼精子DNA、其他寡核苷酸组分、大鼠IgG和/或小鼠IgG。
寡核苷酸缀合的酶分子(催化剂)可以在第二缓冲液中递送至样品。在一些实施方案中，第二缓冲液可以包含PBS、PBS-T、TBS、TBS-T水、盐水或Kreb缓冲液。
寡核苷酸缀合的酶底物(定位剂)和寡核苷酸缀合的染料分子(标记剂)可以在第一或第二缓冲液中递送至样品。
在一些实施方案中，第一缓冲液可以与第二缓冲液基本相同。
在一些实施方案中，与第一寡核苷酸缀合的抗体可以在与第二寡核苷酸相同的缓冲液中，该缓冲液可以是第一替代缓冲液。在一些实施方案中，第一替代缓冲液可以包含PBS、PBS-T、TBS、TBS-T水、盐水或Kreb缓冲液。
在一些实施方案中，样品经受促进杂交的缓冲液并且可以包括DNA组分、蛋白质组分、浓度为5％、10％、15％或20％的离液试剂和去污剂溶液。
在一些实施方案中，使样品经受促进去杂交的缓冲液，并且可以包括离液试剂如DMSO和浓度为60％、70％、80％或90％的甲酰胺。
可以从样品中去除寡核苷酸连接的酶分子(例如，催化剂)，例如通过直接或间接与酶缀合的寡核苷酸和抗体组分之间的去杂交。在一些实施方案中，可以使用离液试剂例如DMSO或甲酰胺进行这种去杂交。因此，去杂交步骤可以从样品表面去除定向酶活性，这可以实现后续轮的杂交和酶催化的寡核苷酸沉积，而不会受到非靶向部分的信号污染。
可以从样品表面去除寡核苷酸连接的染料分子(例如，标记剂)，例如通过直接或间接与染料缀合的寡核苷酸和TSA沉积的寡核苷酸组分之间的去杂交。在一些实施方案中，可以使用离液试剂例如DMSO或甲酰胺进行这种去杂化。因此，去杂交步骤可以从样品表面去除染料，这可以实现后续轮的检测，而不会受到这一轮染料的信号污染。
在这种类型的一些优选实施方案中，一抗的至少一些可以用于识别细胞类型或身份，并且一抗的至少一些指示细胞活性、表达或信号传导状态。
组合物和试剂盒
可以组合本文所述的任何试剂、分子和其他物质以形成组合物，递送所述组合物至生物样品以用于进行所述各种方法的一个或多个步骤。通过引用并入的任何文件中描述的试剂、分子和其他物质也可以存在于组合物中。
包括任何组合物的试剂盒还可以包括用于进行本文所述的任何方法步骤的说明。此类试剂盒可以包括由一种或多种材料，如纸、金属和塑料形成的外壳或包装。外壳可以以多种形式实现，包括一个或多个管状容器如小瓶、泡罩包装和其他密封容器。说明书可以放置在试剂盒外壳内、附在试剂盒外壳上或随附在试剂盒外壳上。
成像系统和方法
可以使用多种不同的成像系统来获得本文所述的图像。可以使用某些商业系统，如Vectra Polaris系统(可从Akoya Biosciences,Inc.获得)。可以使用的成像系统的各个方面描述于，例如，在美国专利7,155,55、7,019,777、9,107,624和PCT专利申请公开号WO2005/040769中，其中每一个的全部内容通过引用并入此文。
为了获得本文所述的样品的图像，将样品暴露于来自成像系统的光源的照明光。使用成像系统的检测器(例如，成像检测器如CCD阵列)以通过检测响应于照明光从样品发射的光来获得样品的图像。发射光可以是荧光发射、透射过样品的照明光、从样品反射的照明光或这些的任何组合。检测器的独立元件测量发射的光，形成生物样品的二维图像。因为发射光对应于样品中标记剂所在的位置，所以分析物的位置由标记剂的光学标记物指示。
如本文所述，使用类似的方法以获得应用于样品的复染剂的图像。由于复染剂与样品结构非特异性结合，复染剂图像通常不指示特定分析物的位置，而是提供有关样品结构、特点和形态的更一般信息。
实施例
为了评估上述方法，从福尔马林固定、石蜡包埋的人扁桃体块上切下5微米厚的组织切片。将切片脱蜡、水合，并用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复。然后按照抗体随附的染色说明，用从Akoya Biosciences,Inc.(Menlo Park,CA)获得的CD20(L20)抗体对样品进行染色。根据制造商的说明，将用于染色的CD20抗体与寡核苷酸(序列BX015，从AkoyaBiosciences,Inc.获得)预缀合。
染色后，将组织切片固定在多聚甲醛、冰冷的甲醇和
Figure BDA0003656400010000311
固定试剂(从AkoyaBiosciences,Inc.获得)中，然后清洗。用1x
Figure BDA0003656400010000312
测定缓冲液(从AkoyaBiosciences,Inc.获得)中的20％二甲亚砜(DMSO)平衡组织切片10分钟。
平衡后，将组织切片与5μL的20μM辣根过氧化物酶(HRP)缀合的寡核苷酸溶液杂交。HRP缀合的寡核苷酸具有与BX015序列互补的核苷酸序列。杂交后，组织切片用
Figure BDA0003656400010000313
测定缓冲液清洗3次。
由具有序列BX006的DNA寡核苷酸(从Akoya Biosciences，Inc.获得)组成的试剂与序列5’末端的C10羧基接头处的酪酰胺部分缀合。然后将组织样品与1x
Figure BDA0003656400010000314
缓冲液中的试剂接触并使其反应10分钟。
在反应后，根据从Akoya Biosciences,Inc.获得(例如互联网地址www.akoyabio.com/support/reagents/)的
Figure BDA0003656400010000315
用户手册中描述的
Figure BDA0003656400010000316
透明组织方案，从组织切片中将HRP缀合的寡核苷酸去杂交。
在准备成像时，在
Figure BDA0003656400010000317
杂交缓冲液中用
Figure BDA0003656400010000318
报告试剂Cy5-RX006(可从Akoya Biosciences,Inc.获得)温育组织切片。使用Keyence显微镜对组织切片进行成像。
图4显示了组织切片的图像。在组织切片中，较亮的区对应于CD20定位的酪酰胺缀合的寡核苷酸序列(即BX006序列)。
成像后，使用
Figure BDA0003656400010000321
透明组织方案将报告试剂从组织切片中去杂交。去除了报告试剂的组织切片的另一图像显示在图5中。该图像阐释了对应于CD20定位的酪酰胺缀合寡核苷酸序列的信号强度缺乏，表明在去杂交过程中报告试剂几乎完全去除。
其他实施方案
尽管在本文中已经显示和描述了本公开的某些实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅作为实例提供。对于本领域的技术人员来说，许多变化、改变和替换将是显而易见的。应当理解，本文具体描述的实施方案的各种替代都在本公开的范围内。

Claims (99)

1.对生物样品中的分析物进行成像的方法，所述方法包括：
使所述生物样品与结合剂接触，其中所述结合剂包含与所述分析物结合的结合部分和第一核苷酸序列；
使所述生物样品与催化剂接触，其中所述催化剂包含与酶连接的第二核苷酸序列，并且其中所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列杂交；
使所述生物样品与定位剂接触，其中所述定位剂包含与所述酶互补的底物和与所述底物连接的第三核苷酸序列；
使所述生物样品与标记剂接触，其中所述标记剂包含与光学标记物连接的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列与所述第三核苷酸序列杂交；和
将所述生物样品暴露于照明光，检测来自所述生物样品的发射光，并形成所述生物样品的图像，其中所述分析物的位置由所述光学标记物指示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合部分包含抗体、抗体片段或抗体类似物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体、抗体片段或抗体类似物包含选自由下项组成的组的成员：IgG抗体、IgM抗体、单克隆抗体、单链可变片段和双抗体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含至少50个核苷酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含DNA片段。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含RNA片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包含至少一个合成核苷酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列是单链序列。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列是至少部分双链的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列至少80％互补。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二核苷酸序列包含不同数量的核苷酸。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶包含辣根过氧化物酶或其衍生物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶包含模拟辣根过氧化物酶的化合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述化合物包含含有氯化血红素(hemin)的复合物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述化合物包括血色素(hematin)。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶包含大豆过氧化物酶。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列与所述第一核苷酸序列相同。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列与所述第一核苷酸序列不同。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列包含至少50个核苷酸。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列包含DNA片段。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列包含RNA片段。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列包含至少一个合成核苷酸。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列是单链序列。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三核苷酸序列是至少部分双链的。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述第四核苷酸序列与所述第三核苷酸序列至少80％互补。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述第四核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三和第四核苷酸序列包含不同数量的核苷酸。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学标记物包含荧光种类。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学标记物包含显色染色剂。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是新鲜组织样品、冷冻组织样品或福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织样品。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包含蛋白质。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包含肽或肽片段。
37.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括，在将所述生物样品暴露于照明光之前：
使所述生物样品与复染剂接触；和
将所述生物样品暴露于照明光，检测来自所述生物样品的发射光，并形成所述样品的第二图像，所述图像显示所述生物样品中所述复染剂的位置。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述复染剂包含DAPI。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品中所述第四核苷酸序列的量与所述第一核苷酸序列的量的比率大于1。
40.根据权利要求1所述的方法，其中所述比率大于5。
41.根据权利要求1所述的方法，其中所述比率大于50。
42.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合剂是第一结合剂，所述催化剂是第一催化剂，所述定位剂是第一定位剂，所述标记剂是第一标记剂，所述分析物是第一分析物，并且所述结合部分是第一结合部分，所述方法进一步包括使所述生物样品与第二结合剂接触，其中所述第二结合剂包含与所述生物样品中的第二分析物结合的第二结合部分和第五核苷酸序列。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二分析物与所述第一分析物不同。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第二分析物包含蛋白质、肽或肽片段。
45.根据权利要求42所述的方法，其包括使所述生物样品同时与所述第一和第二结合剂接触。
46.根据权利要求42所述的方法，其包括使所述生物样品序贯与所述第一和第二结合剂接触。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述催化剂是第一催化剂，所述酶是第一酶，所述定位剂是第一定位剂，所述底物是第一底物，所述标记剂是第一标记剂，并且所述光学标记物为第一光学标记物，所述方法进一步包括：
使所述生物样品与第二催化剂接触，其中所述第二催化剂包含与第二酶连接的第六核苷酸序列，并且其中所述第六核苷酸序列与所述第五核苷酸序列杂交；
使所述生物样品与第二结合剂接触，其中所述第二结合剂包含与所述第二酶互补的第二底物和与所述第二底物连接的第七核苷酸序列；和
使所述生物样品与第二标记剂接触，其中所述第二标记剂包含与第二光学标记物连接的第八核苷酸序列，其中所述第八核苷酸序列与所述第七核苷酸序列杂交。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一和第五核苷酸序列是相同的。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一和第五核苷酸序列是不同的。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二和第六核苷酸序列是相同的。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二和第六核苷酸序列是不同的。
52.根据权利要求47所述的方法，其中所述第三和第七核苷酸序列是不同的。
53.根据权利要求47所述的方法，其中所述第四和第八核苷酸序列是不同的。
54.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一和第二光学标记物是不同的。
55.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二结合部分包含抗体、抗体片段或抗体类似物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗体、抗体片段或抗体类似物包含选自由下项组成的组的成员：IgG抗体、IgM抗体、单克隆抗体、单链可变片段和双抗体。
57.根据权利要求42所述的方法，其中所述第五核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
58.根据权利要求42所述的方法，其中所述第五核苷酸序列包含选自由下项组成的组的至少一个成员：DNA片段和RNA片段。
59.根据权利要求42所述的方法，其中所述第五核苷酸序列包含至少一个合成核苷酸。
60.根据权利要求42所述的方法，其中所述第五核苷酸序列是单链序列。
61.根据权利要求42所述的方法，其中所述第五核苷酸序列是至少部分双链的。
62.根据权利要求47所述的方法，其中所述第六核苷酸序列与所述第五核苷酸序列至少80％互补。
63.根据权利要求47所述的方法，其中所述第六核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
64.根据权利要求47所述的方法，其中所述第五和第六核苷酸序列包含不同数量的核苷酸。
65.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一和第二酶是不同的。
66.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二酶包含辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶的衍生物、模拟辣根过氧化物酶的化合物、含有氯化血红素的复合物和血色素。
67.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二酶包含大豆过氧化物酶。
68.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七核苷酸序列与所述第五核苷酸序列相同。
69.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七核苷酸序列与所述第五核苷酸序列不同。
70.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
71.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七核苷酸序列包含选自由下项组成的组的至少一个成员：DNA片段和RNA片段。
72.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七核苷酸序列包含至少一个合成核苷酸。
73.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七核苷酸序列是单链序列。
74.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七核苷酸序列是至少部分双链的。
75.根据权利要求47所述的方法，其中所述第八核苷酸序列与所述第七核苷酸序列至少80％互补。
76.根据权利要求47所述的方法，其中所述第八核苷酸序列包含至少5个核苷酸。
77.根据权利要求47所述的方法，其中所述第七和第八核苷酸序列包含不同数量的核苷酸。
78.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二光学标记物包含荧光种类。
79.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二光学标记物包含显色染色剂。
80.根据权利要求47所述的方法，其中所述生物样品中所述第八核苷酸序列的量与所述第五核苷酸序列的量的比率大于1。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述比率大于50。
82.根据权利要求47所述的方法，其中所述生物样品中所述第八核苷酸序列的量与所述第五核苷酸序列的量的比率与所述生物样品中所述第四核苷酸序列的量与所述第一核苷酸序列的量的比率不同。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述生物样品中所述第八核苷酸序列的量与所述第五核苷酸序列的量的比率不大于1。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述生物样品中所述第八核苷酸序列的量与所述第五核苷酸序列的量的比率大于1，并且所述生物样品中所述第四核苷酸序列的量与所述第一核苷酸序列的量的比率大于1。
85.根据权利要求47所述的方法，其进一步包括在使所述生物样品与所述第二标记剂接触之前，从所述生物样品中去除所述第一标记剂。
86.根据权利要求85所述的方法，其包括在使所述生物样品与所述第二定位剂接触之前，从所述生物样品中去除所述第一标记剂。
87.根据权利要求85所述的方法，其包括在使所述生物样品与所述第二催化剂接触之前，从所述生物样品中去除所述第一标记剂。
88.根据权利要求85所述的方法，其包括在使所述生物样品与所述第二结合剂接触之前，从所述生物样品中去除所述第一标记剂。
89.根据权利要求85所述的方法，其进一步包括通过将所述第四核苷酸序列与所述第三核苷酸序列去杂交来从所述生物样品中去除所述第一标记剂。
90.根据权利要求47所述的方法，其中所述生物样品的图像是第一图像，所述方法进一步包括将所述生物样品暴露于照明光，检测来自所述生物样品的发射光，以及形成所述生物样品的第二图像，其中所述第二分析物的位置由所述第二光学标记物指示。
91.根据权利要求90所述的方法，其中当将所述生物样品暴露于所述照明光以形成所述生物样品的所述第二图像时，所述第一光学标记物存在于所述生物样品中。
92.根据权利要求90所述的方法，其进一步包括在将所述生物样品暴露于所述照明光以形成所述生物样品的所述第二图像之前，从所述生物样品去除所述第一光学标记物。
93.根据权利要求92所述的方法，其中从所述生物样品中去除所述第一光学标记物包括使所述第四核苷酸序列与所述第三核苷酸序列去杂交。
94.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在使所述生物样品与所述定位剂接触之后并且在使所述生物样品与所述标记剂接触之前：
使所述生物样品与第二催化剂接触，其中所述第二催化剂包含与第二酶连接的第五核苷酸序列，并且其中所述第五核苷酸序列与所述第三核苷酸序列杂交；和
使所述生物样品与第二定位剂接触，其中所述第二定位剂包含与所述第二酶互补的第二底物和与所述第二底物连接的第六核苷酸序列，
其中所述标记剂的所述第四核苷酸序列与所述第六核苷酸序列杂交。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述第五核苷酸序列与所述第一核苷酸序列相同。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述第六核苷酸序列与所述第四核苷酸序列相同。
97.根据权利要求94所述的方法，其中所述第二酶选自由下项组成的组：辣根过氧化物酶及其衍生物、含有氯化血红素的复合物、血色素和大豆过氧化物酶。
98.用于对生物样品中的多种分析物进行成像的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与结合剂接触，所述结合剂包含与所述分析物之一选择性结合的结合部分和第一核苷酸序列；
(b)使所述生物样品与催化剂接触，其中所述催化剂包含与酶连接的第二核苷酸序列，并且其中所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列杂交；
(c)使所述生物样品与定位剂接触，其中所述定位剂包含与所述酶互补的底物和与所述底物连接的第三核苷酸序列，以沉积与所述分析物之一相邻的所述第三核苷酸序列；
重复步骤(a)-(c)以在所述生物样品中沉积N个不同的第三核苷酸序列，使得所述第三核苷酸序列中的每一个在与所述分析物中的不同者相邻选择性定位；
使所述生物样品与M种不同的标记剂接触，其中每种标记剂包含与不同光学标记物连接的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列仅与所述第三核苷酸序列之一杂交；和
获得所述样品的图像，其中所述分析物之一的位置由所述光学标记物之一的位置指示。
99.用于对生物样品中的分析物进行成像的方法，所述方法包括：
将酶与所述分析物连接，使得所述酶定位在所述生物样品中所述分析物的位置处；
使所述生物样品与定位剂接触，所述定位剂包含与所述酶互补的底物和第一核苷酸序列，以将所述第一核苷酸序列在所述生物样品中与所述分析物相邻沉积；
使所述生物样品与标记剂接触，所述标记剂包含与所述第一核苷酸序列杂交的第二核苷酸序列和光学标记物；和
获得所述生物样品的图像，其中所述分析物的位置由所述光学标记物的位置表示。
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