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CN114728871B - 用于减少副产物的微生物和方法 - Google Patents

用于减少副产物的微生物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了微生物有机体，其不需要的副产物(例如丙酮酸‑、CO2‑、TCA‑衍生副产物；乙酸；乙醇；和/或丙氨酸)的产生降低，以增强通过乙酰‑CoA的碳通量，这可以增加乙酰‑CoA衍生化合物(例如1,3‑BDO、MMA和(3R)‑羟基丁基(3R)‑羟基丁酸酯或任何其他乙酰‑CoA衍生化合物)以及由这些化合物中的任何化合物制备的产物的产生。还提供了一种或多种编码可以降低不需要的副产物产生的酶(例如醛脱氢酶、乙酰‑CoA合酶、D‑氨基酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和/或柠檬酸合酶)的外源核酸，和/或基因(例如乙酰乳酸合酶)中发生的一种或多种导致不需要的副产物产生降低的基因衰减。本公开还提供了外源核酸和基因缺失的各种组合。还提供了制备和使用上述微生物有机体、外源基因、基因衰减和组合的方法，包括培养细胞的方法和产生各种产物的方法。

Description

用于减少副产物的微生物和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月30日提交的美国临时专利申请第62/928,183号的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
1.技术领域
本发明大体上涉及经工程改造产生所需产物的有机体、促进所需产物产生的工程酶，更具体而言，涉及能够减少诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸(acetate)和/或乙醇等副产物，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，并由此增加一种或多种乙酰-CoA衍生产物的非天然存在的有机体，乙酰-CoA衍生产物包括但不限于1,3-丁二醇(1,3-BDO)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、3-羟基丁酸(3-HB)、六亚甲基二胺(HMDA)、己内酰胺、己二酸、6-氨基己酸(6-ACA)、甲基丙烯酸(MAA)、脂肪酸甲酯(FAME)及由此衍生的相关产物。
2.背景技术
微生物有机体可用于产生乙酰-CoA衍生化合物，例如1,3-BDO、脂肪酸甲酯(例如，(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯)。这种生产的效价、速率和产率会受到不需要的副产物生成的限制。特别是，诸如丙酮酸副产物、乙酸和/或乙醇等不需要的副产物的生成，会限制可用于生成所需乙酰-CoA衍生产物的乙酰-CoA的量。例如，丙酮酸副产物缬氨酸的生成会限制可用于转化为乙酰-CoA的丙酮酸的量。类似地，从乙酰-CoA生成不需要的乙醇和/或乙酸，会限制可用于转化成所需乙酰-CoA副产物的乙酰-CoA的量。因此，降低诸如丙酮酸副产物、乙酸和/或乙醇等不需要的副产物的产生，可以有助于提高诸如1,3-BDO、MMA和(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯等乙酰-CoA衍生化合物的效价、速率和产率。
1,3-BDO是四碳二醇，传统上由乙炔通过水合产生。然后将所得乙醛转化为3-羟基丁醛，随后将其还原形成1,3-BDO。最近，乙炔已被较便宜的乙烯替代作为乙醛的来源。1,3-BDO通常用作食品调味剂的有机溶剂。它还用作聚氨酯和聚酯树脂的共聚单体，并广泛用作降血糖剂。光学活性1,3-BDO是合成生物活性化合物和液晶的有用原料。1,3-丁二醇的另一个用途是，其脱水得到1,3-丁二烯(Ichikawa et al.Journal of Molecular CatalysisA-Chemical256:106-112(2006)；Ichikawa et al.Journal of Molecular Catalysis A-Chemical231:181-189(2005)，1,3-丁二烯可用于制造合成橡胶(例如轮胎)、乳胶和树脂。乙炔或乙烯对石油基原料的依赖保证了开发1,3-丁二醇和丁二烯的基于可再生原料的路线。
MMA是一种有机化合物，分子式为CH2＝C(CH3)CO2CH3。这种无色液体是甲基丙烯酸的甲酯(MAA)，是产生透明塑料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的单体。甲基丙烯酸甲酯的主要应用是生产聚甲基丙烯酸甲酯丙烯酸塑料。此外，甲基丙烯酸甲酯用于产生用作PVC改性剂的甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯共聚物(MBS)。甲基丙烯酸甲酯聚合物和共聚物用于水性涂料，例如乳胶漆。还用于胶黏剂制剂中。当代应用包括用于保持光线在液晶显示器(LCD)计算机和TV屏幕上均匀分布的平板。甲基丙烯酸甲酯还用于制备解剖器官的腐蚀模型，例如心脏的冠状动脉。
已经证明，摄入含有(R)-3-羟基丁酸衍生物例如(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯的化合物和组合物，可以提高血液中酮体的水平。酮体是脂肪酸被身体代谢为能量时产生的化合物，这反过来又会导致酮体本身被用于能量。已经证明，酮体适合降低个体血浆中循环的游离脂肪酸水平。摄取酮体还可以带来各种临床益处，包括增强身体和认知能力，治疗心血管疾病、糖尿病和治疗线粒体功能障碍病症，以及治疗肌肉疲劳和损伤。然而，直接施用酮体是不切实际且危险的。例如，直接施用任一种(R)-3-羟基丁酸都可以在从胃肠道快速吸收后导致明显的酸中毒。由于潜在有害的钠超载，施用这些化合物的钠盐也是不合适的，这会伴随施用治疗相关量的这些化合物。以寡聚形式施用(R)-3-羟基丁酸衍生物已用于规避这个问题。为了获得理想的治疗益处和其他益处，酮体通常需要以阈值水平存在于个体的血浆中，例如至少1mM(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯。然而，低产率或大规模生产的不切实际阻碍了生产。
因此，需要开发方法来降低诸如丙酮酸副产物、乙酸盐和/或乙醇)等不需要的副产物的产生，以提高效率并有效地产生商业量的诸如1,3-BDO、MMA和(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯等化合物。本发明满足了这些需要并且还提供了相关优点。可以通过本发明的教导产生的其他产物分子包括任何乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于己二酸、己内酰胺、6-氨基己酸(6-ACA)、六亚甲基二胺(HMDA)或甲基丙烯酸(MAA)。
3.发明内容
在一方面，本文提供了副产物减少的非天然存在的微生物有机体，包括具有糖酵解途径和通过乙酰-CoA的碳通量增强的微生物有机体，所述微生物有机体包含以下中的一种或多种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路。
在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶包括乙酰乳酸合酶的缺失。在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶包括非功能性乙酰乳酸合酶。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶是ilvG。在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶降低缬氨酸的生物合成。
在一些实施方案中，乙醛再循环回路包含至少一种外源核酸，其编码选自由醛脱氢酶和乙酰-CoA合酶组成的组的乙醛再循环回路酶。在一些实施方案中，醛脱氢酶是AldB。在一些实施方案中，乙酰-CoA合酶是乙酰-CoA合酶变体。在一些实施方案中，所述至少一种外源核酸是异源核酸。
在某些实施方案中，本公开的非天然存在的微生物有机体的乙酸、乙醇或其组合减少。
在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体在基本上厌氧的培养基中。
在一些实施方案中，本公开的非天然存在的微生物有机体包括1,3-丁二醇(1,3-BDO)途径、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径、3-羟基丁酰-CoA(3HB-CoA)途径、甲基丙烯酸甲酯(MMA)途径、己二酸途径、己内酰胺途径、6-氨基己酸(6-ACA)途径、六亚甲基二胺(HMDA)途径或甲基丙烯酸(MAA)途径。
在一些实施方案中，微生物有机体包含1,3-BDO途径。在具体实施方案中，1,3-BDO途径包含硫解酶；乙酰乙酰-CoA还原酶(CoA依赖性，醛形成)；3-氧代丁醛还原酶(酮还原)；3-羟基丁醛还原酶；乙酰乙酰-CoA还原酶(CoA依赖性，醇形成)；3-氧代丁醛还原酶(醛还原)；4-羟基,2-丁酮还原酶；乙酰乙酰-CoA还原酶(酮还原)；3-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)；和3-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)。
在一些实施方案中，微生物有机体包含(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径。在具体实施方案中，(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径包含硫解酶；(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯形成酶；(3R)-羟基丁酰-CoA:(R)-1,3-丁二醇醇转移酶；(3R)羟基丁基3-氧代丁酸酯形成酶；乙酰乙酰-CoA:(R)-1,3-丁二醇醇转移酶；(3R)-羟基丁基3-氧代丁酸还原酶；(3R)-羟基丁酰基-ACP:(R)-1,3-丁二醇酯合酶和乙酰乙酰基-ACP:(R)-1,3-丁二醇酯合酶。
在一些实施方案中，微生物有机体包含3HB-CoA途径。在具体实施方案中，3HB-CoA途径包含乙酰-CoA硫解酶和3-羟基丁酰-CoA脱氢酶。
在一些实施方案中，微生物有机体包含MMA途径。在具体实施方案中，MMA途径包含：(a)4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、2-羟基异丁酰-CoA脱水酶和甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶；或(b)4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。在一些实施方案中，具有MMA途径的非天然存在的微生物有机体还包括第二MMA途径，其包含：(c)甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶、4-羟基丁酰-CoA变位酶和3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；或(d)4-羟基丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
在一些实施方案中，微生物有机体包含6-ACA途径。在具体实施方案中，6-ACA途径包含2-氨基-7-氧代辛二酸酮酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸氧化还原酶、2-氨基庚二酸脱羧酶、6-氨基己醛氧化还原酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶或2-氨基-7-氧代辛二酸氨基酸脱羧酶。
在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体包含己内酰胺途径。在具体实施方案中，己内酰胺途径包含3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、己二酰-CoA还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶和6-氨基己酰-CoA合酶。
在一些实施方案中，微生物有机体包含己二酸途径。在具体实施方案中，己二酸途径包含3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、己二酰-CoA水解酶、己二酰-CoA连接酶、己二酰-CoA转移酶和磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶。
在一些实施方案中，微生物有机体包含六亚甲基二胺(HMDA)途径。在具体实施方案中，HMDA途径包含3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、己二酰-CoA还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶、6-氨基己酰-CoA合酶、6-氨基己酰-CoA还原酶(醛形成)、HMDA转氨酶和HMDA脱氢酶。
在一些实施方案中，微生物有机体包含MAA途径。在具体实施方案中，MAA途径包含：(a)(i)琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)甲基丙二酰-CoA差向异构酶；(iv)甲基丙二酰-CoA还原酶(醛形成)；(v)甲基丙二酸半醛还原酶；(vi)3-羟基异丁酸脱水酶；(b)(i)琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)甲基丙二酰-CoA还原酶(醛形成)；(iv)甲基丙二酸半醛还原酶；和(v)3-羟基异丁酸脱水酶；或(c)(i)琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)甲基丙二酰-CoA还原酶(醇形成)；和(iv)3-羟基异丁酸脱水酶。
在一些实施方案中，本文提供的非天然存在的微生物是细菌、酵母或真菌。
在另一个方面，本文提供了用于在非天然存在的微生物有机体中增强通过乙酰-CoA的碳通量以增加乙酰-CoA衍生产物产率的方法，该方法包括在产生乙酰-CoA衍生产物的条件下和足够的时间段内培养本公开的非天然存在的微生物有机体。
在一些实施方案中，乙酰-CoA衍生产物选自由1,3-丁二醇(1,3-BDO)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、3R-羟基丁酸-3R-羟基丁酸、3-羟基丁酸(3-HB)、4-羟基-2-丁酮(4OH2B)、六亚甲基二胺(HMDA)、己内酰胺、己二酸、6-氨基己酸(6-ACA)和甲基丙烯酸(MAA)组成的组。
在一些实施方案中，乙酰-CoA衍生产物包含1,3-BDO。在其他实施方案中，乙酰-CoA衍生产物包含MMA。在另一实施方案中，乙酰-CoA衍生产物包含3R-羟基丁酸-3R-羟基丁酸。
4.附图说明
图1A-图1C显示ilvGM缺失菌株(L16410和L16411)在特异性1,3-BDO产生(图1A)、速率(图1B)和产率[c-mol％]方面表现优于对照(L16375)(图1C)，与传氧速率(OTR)无关。
图2A-图2C显示在不同菌株之间缬氨酸产生和1,3-BDO产率之间存在反比关系(图2A)。对于每一培养体积，ilvGM缺失菌株(L16410和L16411)的缬氨酸水平可忽略不计(图2B)，并且1,3-BDO的水平增加(图2C)。
图3显示了示例性1,3-BDO产生途径，涉及通过糖酵解产生丙酮酸、将丙酮酸转化为乙酰-CoA和将乙酰-CoA转化为1,3-BDO。不需要的副产物乙醇(EtOH)和乙酸可以通过ALD和ADH或通过乙酰-CoA水解酶/硫酯酶从乙酰-CoA生成。
图4显示了示例性1,3-BDO产生途径，其包括乙醛再循环回路，该回路通过aldB将乙醛转化为乙酸和/或通过ACS将乙酸转化为乙酰-CoA，然后可以将乙酰-CoA转化为1,3-BDO。
图5显示了对乙醛而不是3-HB醛具有特异性活性的特异性AldB酶。
图6A和图6B显示了分别相对于非ACS*表达菌株L16768和L17787，ACS*的表达分别提高了L16946和L17787菌株中1,3-BDO的产生(图6A)。此外，ACS*表达显著减少了乙酸而不是乙醇形成，表明乙酸再循环与CoA水解酶有效竞争(图6B)。
图7A-图7D显示，总体产物分布证明了相对于非ACS*表达菌株(图7A和图7B)，ACS*的表达显著减少了副产物(图7C)并增加了1,3-BDO产生(图7D)。
图8显示了ACS*和AldB2886B的共表达显著减少了乙酸和乙醇的产生。此外，两种菌株之间的总体碳-2(即乙醇和乙酸)减少相似。
图9A和图9B显示，超表达ACS*和备选AldB候选物(AldB 1139A)的菌株，在有或没有NadK变体(NadK*)的情况下，相对于其各自没有ACS*和AldB超表达的对照菌株，导致1,3-BDO增加(图9A)以及乙醇和乙酸减少(图9B)。
图10显示了示例性1,3-BDO产生途径，涉及通过糖酵解产生丙酮酸，以及将丙酮酸转化为乙酰-CoA或L-丙氨酸。涉及dadX和dadA的丙氨酸再循环回路分别将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，将D-丙氨酸转化为丙酮酸，从而降低不需要的丙氨酸产生。
图11A-图11B显示丙氨酸再循环回路可以在跨多个曝气参数下降低丙氨酸浓度水平。发酵后，相对于没有丙氨酸再循环回路的对照微生物(黑色柱)，表达dadX和dadA(“再循环”；空白柱)的微生物的D-丙氨酸水平、L-丙氨酸水平、总丙氨酸水平和L-丙氨酸/D-丙氨酸之比水平较低(图11A)。整个发酵过程中丙氨酸浓度(mmol/L)的测量还表明，相对于没有丙氨酸再循环回路的对照微生物(黑色虚线)，具有丙氨酸再循环回路的微生物中的丙氨酸水平(灰色实线)较低(图11B)。
图12显示了示例性1,3-BDO产生途径，涉及使用乙酰-CoA作为通过柠檬酸合酶(gltA)转化为1,3-BG或转化为柠檬酸的底物。相对于野生型gltA，柠檬酸合酶变体(gltAR109L，“gltA*”)对NADH的敏感性增加。
图13A和图13B显示表达柠檬酸合酶变体gltA*的微生物(灰色虚线)相对于表达野生型gltA的微生物(黑色实线)具有快速的微需氧转变，如箭头所示(图13A)。相对于表达野生型gltA的微生物(黑色柱)，表达柠檬酸合酶变体gltA*的微生物(灰色柱)的1,3-BDO效价增加(图13B)。
5.具体实施方式
本发明部分涉及降低诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、三羧酸循环(TCA)衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物的工程生物合成途径。示例性产物分子包括但不限于1,3-丁二醇(1,3-BDO)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、4-羟基-2-丁酮(4OH2B)、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，尽管考虑到本文提供的教导和指导，但本领域技术人员应当认识到，任何衍生自乙酰-CoA的产物分子都可以通过副产物的降低而表现出产物生产的增强。本发明提供了具有一种或多种外源基因的非天然存在的微生物有机体，所述外源基因编码可以降低诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物产生的酶和/或一种或多种衰减酶。在一些实施方案中，这些非天然存在的微生物有机体还具有一种或多种编码可催化所需产物产生的酶的外源基因，所需产物例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
在许多工程途径中，基于碳水化合物原料的最大产品产率的实现受到不需要的副产物产生的阻碍。根据一些实施方案，本发明通过以下方式增加乙酰-CoA产物的产率：(i)降低丙酮酸副产物例如缬氨酸的产生以增加丙酮酸向乙酰-CoA的转化，(ii)将不需要的丙酮酸副产物例如丙氨酸再循环回丙酮酸，以增加丙酮酸转化为乙酰-CoA的可利用性，(iii)降低乙酰-CoA进入TCA循环，和/或(iv)将乙酰-CoA副产物例如乙酸和/或乙醇再循环回乙酰-CoA。可以通过本文所述非天然存在的有机体和方法产生的产物，包括例如但不限于1,3-BDO、脂肪酸甲酯(例如MMA)、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
如本文所用，术语“非天然存在的”当用于提及本发明的微生物有机体或微生物时旨在表示，微生物有机体具有至少一种通常在所提及物种(包括所提及物种的野生型菌株)的天然存在的菌株中不存在的基因改变。基因改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物有机体遗传材料的其他功能破坏。此类修饰包括，例如，所提及物种的异源、同源或异源和同源多肽的编码区及其功能片段。其他修饰包括，例如，其中修饰改变基因或操纵子表达的非编码调节区。例如，示例性代谢多肽包括导致代谢因子增加或降低的酶或蛋白质。一种示例性代谢因子包括乙酰-CoA。示例性代谢因子还包括例如1,3-丁二醇(1,3-BDO)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)和/或3-羟基丁酸(3-HB)。其他示例性代谢因子包括例如乙酰乳酸合酶、醛脱氢酶和乙酰-CoA合酶。
如本文所用，术语“微生物的(microbial)”、“微生物有机体”或“微生物(microorganism)”旨在表示作为包括在古生菌、细菌或真核生物域内的微观细胞存在的任何有机体。因此，该术语旨在涵盖具有微观尺寸的原核或真核细胞或有机体，并且包括所有物种的细菌、古生菌和真细菌以及真核微生物，例如酵母和真菌。该术语还包括可以培养而产生生化物质的任何物种的细胞培养物。
如本文所用，术语“副产物”是指在产生所需产物期间产生的不需要的产物。举例来说，如本文所提供的，从丙酮酸产生例如缬氨酸和/或丙氨酸可以视为是期望将丙酮酸转化为乙酰-CoA的副产物。类似地，示例性副产物包括期望将乙酰-CoA转化为1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物时来自乙酰-CoA的乙酸。
如本文所用，短语“碳通量增强”或“碳流增强”旨在表示加强、增加或进一步改善代谢碳通过或到达所需途径、途径产物、中间体或生物衍生化合物的程度或流。强度、增加或改善可以相对于途径产物、中间体或生物衍生化合物的预定基线。例如，与功能性乙酰乳酸合酶相比，使用本文所述衰减的乙酰乳酸合酶可以实现乙酰-CoA产率的增加。类似地，与不存在乙醛再循环回路途径的酶相比，通过表达乙醛再循环回路途径的一种或多种酶，可以实现乙酰-CoA产率的增加。应当理解，由于可以实现乙酰-CoA产率的增加，因此也可以实现较高产率的任何乙酰-CoA衍生化合物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
如本文所用，术语“再循环回路”是指一种或多种将副产物转化回底物，该底物随后可被代谢并重定向为所需产物的反应。例如，本文提供的示例性再循环回路包括乙醛再循环回路，其例如将副产物乙醛转化为乙酰-CoA以降低乙醛并增加所需乙酰-CoA衍生产物的产率，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物。类似地，另一示例性再循环回路包括丙氨酸再循环回路，其例如将副产物丙氨酸转化为丙酮酸，以降低丙氨酸水平并增加从丙酮酸到乙酰-CoA的碳通量，从而增加所需乙酰-CoA衍生产物的产率，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰基-CoA衍生产物。
如本文所用，术语“衰减”或其语法等同旨在表示减弱、减少或降低酶或蛋白质的活性或量。如果衰减导致酶或蛋白质活性或量下降到给定途径、反应或系列反应发挥作用所需的临界水平以下，则该活性或量的衰减可以模拟完全破坏。然而，模拟一个途径、反应或系列反应的完全破坏的酶或蛋白质的活性或量的衰减，仍然足以使不同的途径、反应或系列反应继续发挥作用。例如，内源酶或蛋白质的衰减可能足以模拟本发明对产生缬氨酸的相同酶或蛋白质的完全破坏，但酶或蛋白质的剩余活性或量仍可足以维持其他途径，例如对宿主微生物有机体生存、繁殖或生长至关重要的途径。酶或蛋白质的衰减也可以，以足以增加本发明的因子(例如乙酰-CoA衍生产物)的产率但不一定模拟酶或蛋白质的完全破坏的量，减弱、减少或降低酶或蛋白质的活性或量。
如本文所用，“外源的”意指所提及的分子或所提及的活性被引入宿主微生物有机体中。例如，可以通过将编码核酸引入宿主遗传材料中，例如通过整合到宿主染色体中，或作为非染色体遗传材料，例如质粒，来引入分子。因此，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指将可表达形式的编码核酸引入微生物有机体中。当用于提及生物合成活性时，该术语是指引入宿主参考有机体中的活性。来源可以是例如在引入宿主微生物有机体中后表达所提及的活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源的”是指存在于宿主中的所提及的分子或活性。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，该术语是指微生物有机体所含编码核酸的表达。术语“异源的”是指来源于所提及的物种之外的来源的分子或活性，而“同源的”是指来源于宿主微生物有机体的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源表达可以利用异源或同源编码核酸中的一种或两种。
应当理解，如上所述，当微生物有机体包括一种以上的外源核酸时，所述一种以上的外源核酸是指所提及的编码核酸或生物合成活性。还应理解，如本文所公开的，这类一种以上的外源核酸可以引入宿主微生物有机体中的单独的核酸分子上、多顺反子核酸分子上或其组合，并且仍然视为一种以上的外源核酸。例如，如本文所公开的，微生物有机体经工程改造可以表达两种或更多种编码途径、反应或系列反应所需的所需酶或蛋白质的外源核酸。在将两种编码所需活性的外源核酸引入宿主微生物有机体的情况下，应当理解，这两种外源核酸可以作为单个核酸引入例如在单个质粒上，在单独的质粒上，可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，并且仍然视为两种外源核酸。类似地，应当理解可以以任何期望的组合将多于两种外源核酸引入宿主有机体，例如，在单个质粒上、在单独的质粒上，可以在单个位点或多个位点整合到宿主染色体中，并且仍然视为两种或多种外源核酸，例如三种外源核酸。因此，所提及的外源核酸或生物合成活性的数量，是指编码核酸的数量或生物合成活性的数量，而不是引入宿主有机体中的单独核酸的数量。
如本文所用，术语“变体”旨在表示不同于野生型酶的酶形式或样式。示例性变体是酶的突变形式，其中变异酶的氨基酸序列在一个或多个同源氨基酸处不同于氨基酸序列。变体相对于野生型酶可以具有不同的功能或活性。然而，变体不必是突变体，并且可以包括多态性、旁系同源或直系同源。
如本文所用，当用于提及培养条件或生长条件时，术语“基本上厌氧的”是指，氧的量小于液体培养基中溶解氧的饱和量的约10％，认为是该含义。该术语维持在小于约1％的氧气气氛，还包括液体或固体培养基的密封室。
如本文所用，术语“CoA”或“辅酶A”意指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白质部分)，其存在是许多酶(脱辅基酶)形成活性酶系所需的。辅酶A在某些缩合酶中发挥作用，在乙酰基或其他酰基转移中，在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化中，以及在其他乙酰化中起作用。
如本文所用，术语“1,3-丁二醇”或“1,3-BDO”旨在表示具有化学式C4H10O2且分子量为90.12g/mol的丁二醇的四种稳定异构体之一。化合物1,3-丁二醇在本领域中被称为1,3-丁基二醇(1,3-BG)，并且也是通常称为BDO家族化合物的化合物家族的化学中间体或前体。
如本文所用，具有化学式CH2＝C(CH3)CO2CH3且分子量为100.12g/mol的“甲基丙烯酸甲酯”或“MMA”是甲基丙烯酸的甲酯(MAA)。MMA用作生产透明塑料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的单体。
如本文所用，术语“(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯”是指式(I)的化合物：
术语(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯自始至终可与术语(R)-(R)-3-羟基丁基3-羟基丁酸酯、(3R)羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯和(R)-3-羟基丁基(R)-3-羟基丁酸酯交换使用。
如本文所用，术语“基因破坏”或其语法等同旨在表示使编码的基因产物无活性的基因改变。基因改变可以是，例如，整个基因的缺失、转录或翻译所需的调节序列的缺失、导致截短的基因产物的基因部分缺失，或通过使编码的基因产物失活的各种突变策略中的任何一种。一种特别有用的基因破坏方法是完全基因缺失，因为它减少或消除了本发明的非天然存在的微生物中基因回复突变的发生。
本发明的非天然存在的微生物有机体可以含有稳定的基因改变，这是指微生物可以培养超过五代而不丧失改变。通常，稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰，特别是稳定的修饰会持续多于约25代，更特别是，稳定的基因修饰会大于50代，包括无限期。
在基因破坏的情况下，特别有用的稳定基因改变是基因缺失。使用基因缺失来引入稳定的基因改变，对于降低回复突变为基因改变之前的表型的可能性特别有用。例如，可以通过使编码催化一组代谢修饰中的一个或多个反应的酶的基因缺失，来实现生化物质的稳定的生长偶联的产生。可以通过多次缺失进一步增强生化物质的生长偶联产生的稳定性，从而显著降低每次被破坏的活性发生多次补偿性逆转的可能性。
代谢修饰是指从自然发生的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可以针对编码代谢多肽或其功能片段的核酸具有基因修饰。本文公开了示例性代谢修饰。
本领域技术人员将理解，基因改变，包括本文举例说明的代谢修饰，是参照合适的宿主生物例如大肠杆菌(E.coli)及其相应的代谢反应或合适来源有机体针对期望的遗传材料(例如用于所需代谢途径、反应或系列反应的基因)而描述的。然而，鉴于多种有机体的完整基因组测序和基因组学领域的高技术水平，本领域技术人员将能够容易地将本文提供的教导和指导应用于基本上所有其他有机体。例如，可以通过掺入来自不同于所提及物种的物种的相同或类似编码核酸，容易地将本文举例说明的大肠杆菌代谢改变应用于其他物种。这类基因改变包括例如物种的通常的同源基因置换，并且特别是直系同源、旁系同源或非直系同源基因置换。
直系同源基因是一种或多种通过垂直世代相关并且在不同有机体中负责基本相同或同一功能的基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶可以视为环氧化物水解的生物学功能的直系同源基因。例如，当基因共有的序列相似性的量足以表明它们是同源的或通过来自共同祖先的进化相关时，该基因通过垂直世代相关。如果基因共有足量的三维结构，但不一定共有序列相似性，表明它们已经从共同的祖先进化到无法识别一级序列相似性的程度，则它们也可以视为直系同源基因。直系同源的基因可以编码具有约25％至100％氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有的氨基酸相似性小于25％的蛋白质的基因的三维结构也显示出相似性，则该基因也可以视为通过垂直世代产生的。丝氨酸蛋白酶酶家族的成员，包括组织纤溶酶原激活剂和弹性蛋白酶，视为由共同祖先的垂直世代产生的。
直系同源基因包括通过例如进化在结构或总体活性上有所不同的基因或其编码的基因产物。例如，当一个物种编码表现出两种功能的基因产物，而这类功能在第二个物种中被分离成不同的基因时，这三个基因及其相应的产物视为是直系同源基因。对于生化产物的产生，本领域技术人员将理解，选择具有待引入或破坏的代谢活性的直系同源基因，用于构建非天然存在的微生物。表现出可分离活性的直系同源基因的实例是，其中不同的活性已被分离成两个或多个物种之间或单个物种内的不同基因产物。具体实例是将弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解即两种类型的丝氨酸蛋白酶活性分离成不同的分子，作为纤溶酶原激活剂和弹性蛋白酶。第二个实例是支原体5'-3'外切核酸酶和果蝇(Drosophila)DNA聚合酶III活性的分离。来自第一个物种的DNA聚合酶可以视为来自第二个物种的外切核酸酶或聚合酶之一或两者的直系同源基因，反之亦然。
相比之下，旁系同源基因是通过例如复制和进化分歧相关的同源物，并且具有相似或共同但不同一的功能。旁系同源基因可以源自或衍生自例如相同的物种或不同物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以视为旁系同源基因，因为它们代表两种从共同的祖先共同进化而来，在相同物种中催化不同的反应并具有不同功能的不同酶。旁系同源物是来自相同物种的蛋白质，彼此之间具有显著的序列相似性，表明它们是同源的，或者通过来自共同祖先的共同进化而相关。旁系同源蛋白家族组包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶等。
非直系同源基因置换是来自一个物种的、可以替代不同物种中所提及的基因功能的非直系同源基因。替代包括，例如，与不同物种中所提及的功能相比，能够在来源物种中执行基本相同或相似的功能。尽管一般而言，非直系同源基因置换可确定为与编码所提及的功能的已知基因在结构上相关，但结构上较低相关但功能上相似的基因及其相应的基因产物仍将落入本文所用的术语的含义内。功能相似性要求，例如，与编码寻求被替代的功能的基因相比，非直系同源基因产物的活性位点或结合区至少有一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源基因或无关基因。
因此，在鉴别和构建本发明的诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物降低的非天然存在的微生物有机体时，本领域技术人员将理解，如果将本文提供的教导和指导应用于具体物种，则代谢修饰的鉴别可以包括直系同源基因的鉴别和包含或失活。就所提及的微生物中存在编码催化相似或基本相似代谢反应的酶的旁系同源基因和/或非直系同源基因置换而言，本领域技术人员也可以利用这些进化上相关的基因。类似地，对于基因破坏，进化上相关的基因也可以在宿主微生物中加以破坏或缺失，以减少或消除靶向破坏的酶活性的功能冗余。
直系同源基因、旁系同源基因和非直系同源基因置换可以通过本领域技术人员公知的方法确定。例如，检查两条多肽的核酸或氨基酸序列会揭示比较序列之间的序列同一性和相似性。基于这样的相似性，本领域技术人员可以确定相似性是否足够高以指示蛋白质通过从共同祖先进化而相关。本领域技术人员公知的算法，例如Align、BLAST、Clustal W和其他算法，比较和确定原始序列的相似性或同一性，并且还确定序列中可以分配权重或分数的缺口的存在或重要性。此类算法在本领域中也是已知的，并且类似地适用于确定核苷酸序列相似性或同一性。用于确定相关性的足够相似性的参数，是基于用于计算统计相似性的公知方法或在随机多肽中找到相似匹配的机会以及所确定的匹配的重要性来计算的。如果需要，本领域技术人员也可以在视觉上优化两条或更多条序列的计算机比较。预计相关基因产物或蛋白质具有高度相似性，例如，25％至100％的序列同一性。如果扫描足够大的数据库(约5％)，则不相关蛋白质的同一性可以与预期偶然发生的基本相同。5％和24％之间的序列可以代表或不能代表得出所比较的序列是相关的这一结论的足够同源性。可以进行在给定数据集的大小的情况下确定这些匹配的重要性的额外统计分析，以确定这些序列的相关性。
例如，使用BLAST算法确定两条或更多条序列的相关性的示例性参数可以如下所述。简而言之，可以使用BLASTP版本2.0.8(1999年1月5日)和以下参数进行氨基酸序列比对：矩阵(Matrix)：0BLOSUM62；缺口开放：11；缺口延伸：1；x_dropoff:50；预期(expect)：10.0；字长：3；滤器：打开。可以使用BLASTN版本2.0.6(1998年9月16日)和以下参数进行核酸序列比对：匹配：1；错配：-2；缺口：5；缺口延伸：2；x_dropoff：50；预期：10.0；字长：11；滤器：关闭。本领域技术人员将知道可以对上述参数进行哪些修改以增加或降低比较的严格性，例如，确定两条或更多条序列的相关性。
在某些实施方案中，本文提供了副产物减少的非天然存在的微生物有机体，其包括具有糖酵解途径和通过乙酰-CoA的碳通量增强的微生物有机体。在一些实施方案中，微生物有机体包括以下中的一种或多种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路；(c)丙氨酸再循环回路；和(d)柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶。在一些实施方案中，微生物有机体包括乙醛再循环回路。在一些实施方案中，微生物有机体包括丙氨酸再循环回路。在一些实施方案中，微生物有机体包括柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物包括在微需氧条件下，例如通过提高NADH的抑制、增加乙酰-CoA的Km、表达衰减(例如通过柠檬酸合酶(gltA)的缺失、敲低或表达降低)或其任何组合，降低TCA活性的任何柠檬酸合酶变体。
在一些实施方案中，微生物有机体包括以下中的两种或更多种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路；(c)丙氨酸再循环回路；和(d)柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶和乙醛再循环回路。在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶和丙氨酸再循环回路。在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶和柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括乙醛再循环回路和丙氨酸再循环回路。在一些实施方案中，微生物有机体包括乙醛再循环回路和柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括丙氨酸再循环回路和柠檬酸合酶变体。
在一些实施方案中，微生物有机体包括以下中的三种或更多种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路；(c)丙氨酸再循环回路；和(d)柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶、乙醛再循环回路和丙氨酸再循环回路。在一些实施方案中，微生物有机体包括乙醛再循环回路、丙氨酸再循环回路和柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶、丙氨酸再循环回路和柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶、乙醛再循环回路和柠檬酸合酶变体。
在一些实施方案中，微生物有机体包括以下中的每一种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路；(c)丙氨酸再循环回路；和(d)柠檬酸合酶变体。
乙酰乳酸合酶(ALS)(Genbank登录号ACA79829.1和ACA79830.1)(EC：2.2.1.6)，也称为乙酰羟酸合酶(AHAS)，催化支链氨基酸合成途径中的第一个反应。乙酰乳酸合酶处于关键分支点，因为它的反应决定了碳流动通过支链氨基酸的程度。该反应涉及丙酮酸的不可逆脱羧和乙醛部分与第二丙酮酸分子缩合产生2-乙酰乳酸或与2-酮丁酸的分子缩合产生2-乙酰-2-羟基丁酸。然后每种产物在三个分别由酮醇酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶催化的反应中进一步转化，得到缬氨酸和异亮氨酸。对于亮氨酸生物合成，需要四种额外的酶，使用缬氨酸前体2-酮异戊酸作为合成起点。因此，如本文所提供的，可以通过使乙酰乳酸合酶活性衰减来引导碳流远离支链氨基酸的产生，从而增加从丙酮酸到乙酰辅酶的碳流。
在某些有机体中，例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，可以表达三种不同的乙酰乳酸合酶同工酶：AHAS I(由ilvBN基因编码)、AHAS II(由ilvGM基因编码)和AHAS III(由ilvIH基因编码)。然而，由于不同的染色体基因突变，来自大肠杆菌的AHAS II和来自鼠伤寒沙门氏菌的AHAS III可以产生无活性的蛋白质。在大肠杆菌的某些菌株中，例如Crooks(ATCC 8739)、W(ATCC 9637)和B(REL606)，ilvG仍然是完整且有功能的。因此，在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶的衰减涉及表达的一种、两种、三种或尽可能多的不同同工酶衰减。在一些实施方案中，衰减涉及活性形式的乙酰乳酸合酶衰减。在其他实施方案中，乙酰乳酸合酶的衰减涉及所有形式的酶衰减。
在一些实施方案中，微生物有机体包括衰减的乙酰乳酸合酶，其中衰减的乙酰乳酸合酶涉及乙酰乳酸合酶的表达减少。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量包括至少约10％至约90％。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量包括至少约20％至约80％。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量包括至少约30％至约70％。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量包括至少约40％至约60％。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量为约50％减少。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量为约60％减少。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量为约70％减少。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量为约80％减少。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量为约90％减少。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量为约95％减少。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶表达减少的量为约100％减少。
在某些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶包括乙酰乳酸合酶的缺失。如上所述，在表达多种酶形式的有机体中，衰减可以包括表达的一种、两种、三种或尽可能多的不同同工酶衰减。因此，在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶的衰减包括表达的一种、两种、三种或尽可能多的不同同工酶缺失。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶的衰减包括活性形式的乙酰乳酸合酶缺失。在其他实施方案中，乙酰乳酸合酶的衰减涉及所有形式的酶缺失。
在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶包括非功能性乙酰乳酸合酶，例如酶的显性失活形式的表达。如上所述，来自大肠杆菌的AHAS II(由ilvGM基因编码)和来自鼠伤寒沙门氏菌的AHAS III(由ilvIH基因编码)可以包括无活性形式的蛋白质。因此，在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶涉及编码无活性形式的乙酰乳酸合酶的多核苷酸或多肽的表达。
在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶包括ilvGM。在一些实施方案中，衰减的ilvGM涉及活性形式的ilvGM表达减少。在具体实施方案中，衰减的ilvGM涉及活性形式ilvGM的ilvGM缺失。在一些实施方案中，具有衰减的ilvGM的微生物是具有完整ilvG的大肠杆菌菌株。
在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶降低支链氨基酸的生物合成。
在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶降低缬氨酸、异亮氨酸和/或亮氨酸的生物合成。在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶降低缬氨酸的生物合成。在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶降低异亮氨酸的生物合成。在一些实施方案中，衰减的乙酰乳酸合酶降低亮氨酸的生物合成。
在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少40倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少30倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少20倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少15倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少10倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少5倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少4倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少3倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少2倍。在一些实施方案中，具有衰减的乙酰乳酸合酶的非天然存在的微生物有机体将进入缬氨酸的碳通量减少1.5倍。
丙酮酸也可以进行转氨基作用形成丙氨酸。通过两步过程，丙氨酸可以再循环回形成丙酮酸。在第一步中，L-丙氨酸通过丙氨酸消旋酶(EC 5.1.1.1)转化为D-丙氨酸。丙氨酸消旋酶可以是组成型活性的或可诱导的。例如，在大肠杆菌中，dadX负责细胞中的大部分丙氨酸消旋酶活性，并且可由D-丙氨酸或L-丙氨酸诱导(参见例如Wild J,et al.,Mol GenGenet.1985；198(2):315-322)。相比之下，Alr是组成型表达的，但表现出对孵育温度的典型依赖性。在第二步，D-丙氨酸通过D-氨基酸脱氢酶转化为丙酮酸。例如，在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中，dadA由D-丙氨酸生成丙酮酸(参见例如Wild and Klopotowski,Mol GenGenet.1981；181(3):373-378)。
因此，在一些实施方案中，本公开还提供了具有丙氨酸再循环回路的非天然存在的微生物有机体，所述回路包括至少一种编码选自由D-氨基酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶组成的组的丙氨酸再循环回路酶的外源核酸。在一些实施方案中，丙氨酸再循环回路包含至少一种编码D-氨基酸脱氢酶的外源核酸。在一些实施方案中，丙氨酸再循环回路包含至少一种编码丙氨酸消旋酶的外源核酸。在一些实施方案中，丙氨酸再循环回路包含至少一种编码D-氨基酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的外源核酸。在具体实施方案中，D-氨基酸脱氢酶由dadA编码。在一些实施方案中，D-氨基酸脱氢酶来自大肠杆菌菌株K-12substr.MG1655(NP_415707.1)。在某些实施方案中，丙氨酸消旋酶由dadX编码。在某些实施方案中，丙氨酸消旋酶来自细菌(NP_747370.1；WP_010955779.1)。
如本文所提供的，具有丙氨酸再循环回路的非天然存在的微生物有机体能够将从丙酮酸转化为丙氨酸的碳重定向回丙酮酸。因此，在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，具有丙氨酸再循环回路的非天然存在的微生物有机体的丙氨酸浓度减少。在一些实施方案中，丙氨酸浓度减少是L-丙氨酸浓度减少。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，非天然存在的微生物有机体的L-丙氨酸与D-丙氨酸的比率减小。
在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约5％至75％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约10％至60％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约20％至50％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约30％至45％。
在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约5％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约10％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约15％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约20％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约25％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约30％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约35％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约40％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约45％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约50％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约55％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少约60％。在一些实施方案中，与没有丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，丙氨酸浓度减少是丙氨酸浓度减少大于约60％。
如本文所提供的，降低丙酮酸副产物，例如通过降低产生丙氨酸和/或支链氨基酸的碳通量，可以增加通过乙酰-CoA的碳通量并因此增加乙酰-CoA衍生产物的产生，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA、或MAA。因此，在一些实施方案中，乙酰乳酸衰减的微生物的支链氨基酸可以减少，且乙酰-CoA衍生产物的产生可以增加，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些实施方案中，具有丙氨酸再循环回路的微生物的丙氨酸可以减少，且乙酰-CoA衍生产物的产生可以增加，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
在一些实施方案中，丙氨酸和/或一种或多种支链氨基酸产生的减少导致乙酰-CoA衍生产物的产率增加约1至约2.5倍，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些实施方案中，丙氨酸和/或一种或多种支链氨基酸产生的减少导致乙酰-CoA衍生产物的产率增加超过2.5倍，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
此外，可以产生乙酰-CoA衍生产物的微生物也可能具有不需要的副产物，例如直接从乙酰-CoA生成的乙酸和/或乙醇。此类副产物的生成会限制可以转化为诸如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物等所需乙酰-CoA衍生产物的碳流的效率和/或量。然而，如本文所提供的，可以将碳流远离不需要的副产物重定向到期望的乙酰-CoA衍生产物，本公开提供可以通过将不需要的副产物再循环回乙酰-CoA中来增强。在一些实施方案中，可通过乙醛再循环回路实现将诸如乙酸和/或乙醇等不需要的副产物转化回乙酰-CoA。
来自乙酰-CoA的碳流可以通过至少两个示例性反应转化为不需要的副产物，例如乙醇和/或乙酸。在一个示例性反应中，乙酰-CoA通过CoA依赖性醛脱氢酶(ALDH；由ald基因编码)转化为乙醛，然后乙醛通过醇脱氢酶(ADH)转化为乙醇。或者，在另一个示例性反应中，乙酰-CoA可以通过CoA水解酶/硫酯酶转化为乙酸。
如本文所提供的，本公开提供了可以包括至少一种编码乙醛再循环回路酶的外源核酸的乙醛再循环回路。在一些实施方案中，乙醛再循环回路酶选自由醛脱氢酶和乙酰-CoA合酶组成的组。
醛脱氢酶(ALDH)(登录号WP_000183980.1)(EC：1.2.1.3)是催化醛氧化成其相应羧酸的相关酶的多样化组的成员。例如，在大肠杆菌中，已鉴定出十多种醛脱氢酶基因，其中一些醛脱氢酶对某些醛底物具有偏好。例如，如本文所提供的，AldB可以优先将乙醛转化为乙酸，并且几乎没有或没有将3HB-醛转化为3-羟基丁酸的活性。
在一些实施方案中，醛脱氢酶是AldB。在一些实施方案中，内源AldB在微生物有机体中以非常低的水平表达。例如，在使用LC/MS或使用等压标签进行相对和绝对定量(iTRAQ)全局蛋白质组学检测后，内源AldB可能与背景水平无法区分。在一些实施方案中，一种编码乙醛再循环回路酶的外源核酸包括AldB。在某些实施方案中，外源核酸是异源核酸。
如本文所提供的，由醛脱氢酶产生的乙酸可以通过乙酰-CoA合酶进一步转化为乙酰-CoA。乙酰-CoA合酶(登录号WP_000078239.1)(EC：6.2.1.1)催化乙酸与辅酶A的连接产生乙酰-CoA。因此，在一些实施方案中，乙醛再循环回路包括至少一种编码乙酰-CoA合酶的外源核酸。在某些实施方案中，乙酰-CoA合酶是乙酰-CoA合酶变体。在一些实施方案中，乙酰-CoA合酶变体可以是相对于野生型乙酰-CoA合酶对乙酰化较低敏感但保留乙酰-CoA合酶活性的乙酰-CoA合酶。一种示例性乙酰-CoA合酶变体是在641位用脯氨酰残基置换了亮氨酰残基(例如L641P)的突变乙酰-CoA合酶。在某些实施方案中，乙酰-CoA合酶变体是肠沙门氏菌(Salmonella enterica)乙酰-CoA合酶变体。在一些实施方案中，乙醛再循环回路包括一种或多种编码乙酰-CoA合酶和醛脱氢酶二者的外源核酸。在某些实施方案中，至少一种外源核酸是异源核酸。
本公开因此提供了可以减少诸如乙酸和/或乙醇等不需要的副产物产生的乙醛再循环回路。在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体的乙酸、乙醇或其组合减少。在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体的乙酸减少。在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体的乙醇减少。在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体的乙酸和乙醇减少。
通过使用例如乙醛再循环回路降低不需要的乙酰-CoA衍生副产物，例如乙酸和/或乙醇，可以增加乙酰-CoA通过所需乙酰-CoA衍生产物的碳通量，该衍生产物为例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。因此，在一些实施方案中，具有乙醛再循环回路的微生物的乙酸和/或乙醇可以减少，以及乙酰-CoA衍生产物的产生可以增加，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
在一些实施方案中，乙醇和/或乙酸产生的减少导致乙酰-CoA衍生产物的产率增加约1至约2.5倍，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些实施方案中，乙醇和/或乙酸产生的减少导致乙酰-CoA衍生产物的产率增加超过2.5倍，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
乙酰-CoA也可以转化为不需要的三羧酸(TCA)循环(也称为柠檬酸循环或克雷布斯循环)衍生副产物。TCA循环始于将乙酰-CoA与草酰乙酸结合产生柠檬酸的反应。因此，当所需产物是不涉及TCA循环的乙酰-CoA衍生产物时，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，TCA循环可以是产生不需要的副产物的原因。
当乙酰-CoA与草酰乙酸结合形成柠檬酸时，柠檬酸合酶负责该循环第一步中的反应速率。柠檬酸合酶受到NADH的抑制，并且至少一种柠檬酸合酶变体对NADH的敏感性增加。野生型柠檬酸合酶在氨基酸位置109处具有精氨酸(R)，而变体在氨基酸位置109处含有亮氨酸(L)而不是精氨酸(R109L)(参见Stokell,et al.J Biol Chem.2003；278(37):35435-35443)。由于对NADH的敏感性增加，柠檬酸合酶变体的活性低于野生型柠檬酸合酶，因此不会将尽可能多的乙酰-CoA引导到TCA循环中。
因此，在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体包括柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，柠檬酸合酶变体是II型柠檬酸合酶。在一些实施方案中，柠檬酸合酶变体以比野生型柠檬酸合酶大的亲和力结合NADH。在具体实施方案中，柠檬酸合酶变体由gltAR109L编码。
如本文所提供的，与具有野生型柠檬酸合酶的微生物有机体相比，具有柠檬酸合酶变体的非天然存在的微生物有机体的三羧酸循环(TCA)循环衍生副产物减少。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约5％至75％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约10％至60％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物相比，TCA衍生副产物的减少为减少约20％至50％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约30％至45％。
在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约5％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约10％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约15％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约20％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约25％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约30％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生的副产物减少约35％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约40％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约45％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约50％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约55％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少约60％。在一些实施方案中，与没有柠檬酸合酶变体的微生物有机体相比，TCA衍生副产物的减少为减少大于约60％。
在一些实施方案中，TCA衍生副产物产生的减少导致乙酰-CoA衍生产物的产率增加约1至约2.5倍，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些实施方案中，TCA衍生副产物产生的减少导致乙酰-CoA衍生产物的产率增加超过2.5倍，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
在一些实施方案中，微生物有机体包括以下中的两种或更多种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路；(c)丙氨酸再循环回路；和(d)柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括以下中的三种或更多种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路；(c)丙氨酸再循环回路；和(d)柠檬酸合酶变体。在一些实施方案中，微生物有机体包括以下中的每一种：(a)衰减的乙酰乳酸合酶；(b)乙醛再循环回路；(c)丙氨酸再循环回路；和(d)柠檬酸合酶变体。两种或更多种用于减少副产物的机制的组合可以是叠加的，并且允许甚至更多地产生乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些实施方案中，两种或更多种用于减少副产物的机制的组合可以是协同的，并且允许甚至更多地产生乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
如本文所提供的，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其可以进一步包括1,3-丁二醇(1,3-BDO)途径、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径、3-羟丁酰-CoA(3HB-CoA)途径、甲基丙烯酸甲酯(MMA)途径、己二酸途径、己内酰胺途径、6-氨基己酸(6-ACA)途径、六亚甲基二胺(HMDA)途径或甲基丙烯酸(MAA)途径。在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其包括具有以下途径的微生物有机体：1,3-丁二醇(1,3-BDO)途径、甲基丙烯酸甲酯(MMA)途径、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径、氨基酸生物合成途径，3HB-CoA途径、甲基丙烯酸甲酯(MMA)途径、己二酸途径、己内酰胺途径、6-氨基己酸(6-ACA)途径、六亚甲基二胺(HMDA)途径或甲基丙烯酸(MAA)途径。
在某些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其进一步包括1,3-丁二醇(1,3-BDO)途径。在一些实施方案中，1,3-BDO途径包含选自以下的酶：1)乙酰乙酰-CoA还原酶(辅酶A依赖性，醛形成)，2)3-氧代丁醛还原酶(酮还原)，3)3-羟基丁醛还原酶，4)乙酰乙酰-CoA还原酶(辅酶A依赖性，醇形成)，5)3-氧代丁醛还原酶(醛还原)，6)4-羟基2-丁酮还原酶，7)乙酰乙酰-CoA还原酶(酮还原)，8)3-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)，和9)3-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)。在一些实施方案中，1,3-BDO途径包含编码乙酰乙酰-CoA还原酶(phaB)的核酸。在具体实施方案中，乙酰乙酰-CoA还原酶是突变的乙酰乙酰-CoA还原酶。在一些实施方案中，突变的乙酰乙酰-CoA还原酶使用NADH作为底物。可以将任意数量的编码这些酶的核酸进一步引入宿主微生物有机体中，包括一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种，直至全部九种编码这些酶的核酸。在引入一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种或八种外源核酸的情况下，此类核酸可以是另外九种核酸的任何排列。
在某些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其进一步包括(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径。在一些实施方案中，(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：1)(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯形成酶，2)(3R)-羟基丁酰-CoA:(R)-1,3-丁二醇醇转移酶，3)(3R)羟基丁基3-氧代丁酸酯形成酶，4)乙酰乙酰基-CoA:(R)-1,3-丁二醇醇转移酶，5)(3R)-羟基丁基3-氧代丁酸还原酶，6)(3R)-羟基丁酰-ACP:(R)-1,3-丁二醇酯合酶，和7)乙酰乙酰基-ACP:(R)-1,3-丁二醇酯合酶。在一些实施方案中，(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径包含编码乙酰乙酰-CoA还原酶(phaB)的核酸。在具体实施方案中，乙酰乙酰-CoA还原酶是突变的乙酰乙酰-CoA还原酶。在一些实施方案中，突变的乙酰乙酰-CoA还原酶使用NADH作为底物。可以将任意数量的编码这些酶的核酸进一步引入宿主微生物有机体中，包括一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、多达所有八种编码这些酶的核酸。在引入一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种外源核酸的情况下，此类核酸可以是另外八种核酸的任何排列。
在某些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，可以进一步包括MMA途径。在具体实施方案中，MMA途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：(a)4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、2-羟基异丁酰-CoA脱水酶和甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶；或(b)4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。在一些实施方案中，MMA途径进一步包含至少一种编码选自以下的酶的核酸：(c)甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶、4-羟基丁酰-CoA变位酶和3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；或(d)4-羟基丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
在其他实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其可以进一步包括3HB-CoA途径。在具体实施方案中，3HB-CoA途径包含至少一种编码选自乙酰-CoA硫解酶和3-羟基丁酰-CoA脱氢酶中的酶的外源核酸。
在一些实施方案中，NADPH可利用性增加的微生物有机体还可以包括MMA途径。使用微生物产生MMA在本领域中是已知的，如美国专利号9,133,487和9,346,902中所举例说明的，它们各自通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，MMA途径包含随后用甲醇酯化以产生MMA的MAA途径。在具体实施方案中，MMA途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：(a)4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、2-羟基异丁酰-CoA脱水酶和甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶；或(b)4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。在某些实施方案中，MMA途径进一步包含至少一种编码选自第二MMA途径的酶的外源核酸，所述第二MMA途径包含：(c)甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶、4-羟基丁酰-CoA变位酶和3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；或(d)4-羟基丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
在某些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其可以进一步包括6-ACA途径。在具体实施方案中，6-ACA途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：2-氨基-7-氧代辛二酸酮酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸氧化还原酶、2-氨基庚二酸脱羧酶、6-氨基己醛氧化还原酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶或2-氨基-7-氧代辛二酸氨基酸脱羧酶。在其他实施方案中，6-ACA途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：3-氧代-6-氨基己酰-CoA硫解酶；3-氧代-6-氨基己酰-CoA还原酶；3-羟基-6-氨基己酰-CoA脱水酶；6-氨基己-2-烯酰-CoA还原酶；和6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶、6-氨基己酰-CoA合酶或6-氨基己酰-CoA水解酶。
在其他实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其可以进一步包括己内酰胺途径。在具体实施方案中，己内酰胺途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、己二酰-CoA还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶和6-氨基己酰-CoA合酶。
在某些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其可以进一步包括己二酸途径。在具体实施方案中，己二酸途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、己二酰-CoA水解酶、己二酰-CoA连接酶、己二酰-CoA转移酶和磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶。
在其他实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生的副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其可以进一步包括六亚甲基二胺(HMDA)途径。在具体实施方案中，HMDA途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、己二酰-CoA还原酶(醛形成)、6-氨基己酸转氨酶，6-氨基己酸脱氢酶，6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶、6-氨基己酰-CoA合酶、6-氨基己酰-CoA还原酶(醛形成)、HMDA转氨酶和HMDA脱氢酶。在其他实施方案中，HMDA途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶或6-氨基己酰-CoA合酶；6-氨基己酰-CoA还原酶(醛形成)；和六亚甲基二胺转氨酶或六亚甲基二胺脱氢酶。
在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，其可以进一步包括MAA途径。在具体实施方案中，MAA途径包含至少一种编码选自以下的酶的外源核酸：(1)(i)琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)甲基丙二酰-CoA差向异构酶；(iv)甲基丙二酰-CoA还原酶(醛形成)；(v)甲基丙二酸半醛还原酶；和(vi)3-羟基异丁酸脱水酶；(2)(i)琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)甲基丙二酰-CoA还原酶(醛形成)；(iv)甲基丙二酸半醛还原酶；和(v)3-羟基异丁酸脱水酶；或(3)(i)琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii)甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)甲基丙二酰-CoA还原酶(醇形成)；和(iv)3-羟基异丁酸脱水酶。
在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，可以进一步包括1,3-丁二醇途径。在一些实施方案中，1,3-丁二醇途径包括至少一种编码将底物转化产物的酶或蛋白质的外源核酸，所述底物转化产物选自：葡萄糖转化为丙酮酸，丙酮酸转化为乙酰-CoA，乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，乙酰乙酰-CoA转化为3-羟基丁酰-CoA，3-羟基丁酰-CoA转化为3-羟基丁醛，以及3-羟基丁醛转化为1,3-BDO。
在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，可以进一步包括(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径。在一些实施方案中，(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径包括至少一种编码将底物转化产物的酶或蛋白质的外源核酸，所述底物转化产物选自由以下组成的组：(R)-1,3-丁二醇和(3R)-羟基丁酸转化为(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，(R)-1,3-丁二醇和(3R)-羟基丁酰-CoA转化为(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，(R)-1,3-丁二醇和(3R)-羟基丁基-ACP转化为(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，(R)-1,3-丁二醇和乙酰乙酸转化为(3R)-羟基丁基3-氧代丁酸酯，(R)-1,3-丁二醇和乙酰乙酰-CoA转化为(3R)-羟基丁基3-氧代丁酸酯，(R)-1,3-丁二醇和乙酰乙酰基-ACP转化为(3R)-羟基丁基3-氧代丁酸酯，(3R)-羟基丁基3-氧代丁酸酯转化为(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，乙酰-CoA转化为丙二酰-CoA，丙二酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA，乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸，乙酰乙酰-CoA转化为(3S)-羟基丁酰-CoA，(3S)-羟基丁酰-CoA转化为(3R)-羟基丁酰-CoA，(3R)-羟基丁酰-CoA转化为(3R)-羟基丁酸，(3R)-羟基丁酰-CoA转化为(3R)-羟基丁醛，(3R)-羟基丁酸转化为(3R)-羟基丁醛，(3R)-羟基丁醛转化为(R)-1,3-丁二醇，丙二酰-ACP转化为乙酰乙酰-ACP，乙酰乙酰-ACP转化为乙酰乙酰-CoA，乙酰乙酰-ACP转化为(3R)-羟基丁酰-ACP，(3R)-羟基丁酰-ACP转化为(3R)-羟基丁酰-CoA，(3R)-羟基丁酰-ACP转化为(3R)-羟基丁酸，(3R)-羟基丁酰-ACP转化为(3R)-羟基丁醛，以及(3R)-羟基丁酰-ACP转化为(R)-1,3-丁二醇。本领域技术人员应当理解，这些仅是示例性的，并且本文公开的任何底物产物对，其适合产生所需产物并且其适当活性可用于将底物转化为产物，都可以容易地由本领域技术人员基于本文的教导来确定。因此，本发明提供了含有至少一种编码酶或蛋白质的外源核酸的非天然存在的微生物有机体，其中酶或蛋白质转化(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径的底物和产物，例如如作为U.S.2016-0108442A1公开的美国申请号14/893,510中公开的那些，该申请通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体，其诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，还可以包括MMA途径。在一些实施方案中，MMA途径包括至少一种编码将底物转化为产物的酶或蛋白质的外源核酸，所述底物转化产物选自由以下组成的组：4-HB-CoA转化为巴豆酰-CoA和3HIB-CoA，巴豆酰-CoA转化为3HB-CoA，3HIB-CoA转化为MAA-CoA或甲基-3HIB，以及MAA-CoA或甲基-3HIB转化为MMA。在另一实施方案中，本发明提供了具有MMA途径的非天然存在的微生物有机体，其中非天然存在的微生物有机体包含至少一种编码将底物转化为产物的酶或蛋白质的外源核酸，所述底物转化为产物选自由以下组成的组：4HB-CoA转化为巴豆酰-CoA，巴豆酰-CoA转化为(3R)-HB-CoA或(3S)-HB-CoA，(3R)-HB-CoA或(3S)-HB-CoA转化为2-HIB-CoA，2-HIB-CoA转化为MAA-CoA或2HIB-Me，以及MAA-CoA或2HIB-Me转化为MMA。在又一个实施方案中，本发明提供了具有1,3-BDO途径的非天然存在的微生物有机体，其中非天然存在的微生物有机体包含至少一种编码将底物转化为产物的酶或蛋白质的外源核酸，所述底物转化为产物选自由以下组成的组：4HB-CoA转化为巴豆酰-CoA，巴豆酰-CoA转化为(3R)-HB-CoA或(3S)-HB-CoA，(3R)-HB-CoA或(3S)-HB-CoA转化为(3R)-或(3S)-1,3BDO。
在另外的实施方案中，本发明提供了具有甲基丙烯酸途径的非天然存在的微生物有机体，其中非天然存在的微生物有机体包含至少一种编码将底物转化为产物的酶或蛋白质的外源核酸，所述底物转化为产物选自由以下组成的组：乙酰-CoA和丙酮酸转化为柠苹酸，柠苹酸转化为柠康酸，以及柠康酸转化为甲基丙烯酸；乙酰-CoA和丙酮酸转化为柠苹酰-CoA，柠苹酰-CoA转化为柠苹酸，柠苹酸转化为柠康酸，以及柠康酸转化为甲基丙烯酸；乌头酸转化为衣康酸，衣康酸转化为衣康酰-CoA，衣康酰基-CoA转化为柠苹酰-CoA，柠苹酰-CoA转化为柠苹酸，柠苹酸转化为中康酸，中康酸转化为甲基丙烯酸等，例如本文所述的反应。本领域技术人员将理解，这些仅是示例性的，并且本文公开的任何底物产物对，其适合产生所需产物并且其适当活性可用于将底物转化为产物，都可以容易地由本领域技术人员基于本文的教导来确定。因此，本发明提供了含有至少一种编码酶或蛋白质的外源核酸的非天然存在的微生物有机体，其中酶或蛋白质转化甲基丙烯酸途径(例如本文所述途径)的底物和产物。另外提供了甲基丙烯酸途径，其包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、巴豆酸酶、4-羟基丁酰-CoA脱水酶(或巴豆酰-CoA水合酶，4-羟基)、4-羟基丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA合成酶或3-羟基异丁酰-CoA水解酶或3-羟基异丁酰-CoA转移酶和3-羟基异丁酸脱水酶。还提供了甲基丙烯酸途径，其包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA还原酶、巴豆酸酶、4-羟基丁酰-CoA脱水酶、4-羟基丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA脱水酶和甲基丙烯酰-CoA合成酶或甲基丙烯酰-CoA水解酶或甲基丙烯酰-CoA转移酶。MAA的产生在本领域中是已知的，并且可以见于例如作为美国2013-0065279A1公开的美国申请号13/436,811中，该申请通过引用整体并入本文。
在另外的实施方案中，本发明提供了具有己内酰胺途径的非天然存在的微生物有机体，其中非天然存在的微生物有机体包含至少一种编码将底物转化为产物的酶或蛋白质的外源核酸，所述底物转化为产物选自由以下组成的组：己二酰-CoA转化为己二酸，己二酰-CoA转化为己二酸半醛，己二酸转化为己二酸半醛，己二酸半醛转化为6-羟基己酸，6-羟基己酸转化为6-羟基己酰-CoA，6-羟基己酸转化为6-羟基己酰磷酸，6-羟基己酸转化为己内酯，6-羟基己酰-CoA转化为6-羟基己酰磷酸，6-羟基己酰磷酸转化为己内酯，6-羟基己酰-CoA转化为己内酯，4-羟基丁酰-CoA转化为3-氧代-6-羟基己酰-CoA，3-氧代-6-羟基己酰-CoA转化为3,6-二羟基己酰-CoA，3,6-二羟基己酰-CoA转化为6-羟基己-2-烯酰-CoA，6-羟基己-2-烯酰-CoA转化为6-羟基己酰-CoA，6-羟基己酰-CoA转化为6-羟基己酸，环己酮转化为己内酯，己二酸半醛转化为环己烷-1,2-二酮，环己烷-1,2-二酮转化为2-羟基环己酮，2-羟基环己酮转化为环己烷-1,2-二醇，环己烷-1,2-二醇转化为环己酮，庚二酰-CoA转化为2-酮环己酮-1-羧基-CoA，2-酮环己酮-1-羧基-CoA转化为2-酮环己烷-1-羧酸，2-酮环己烷-1-羧酸转化为环己酮，环己酮转化为环己肟，以及环己肟转化为己内酰胺。本领域技术人员将理解，这些仅是示例性的，并且本文公开的任何底物产物对，其适合产生所需产物并且其适当活性可用于将底物转化为产物，都可以容易地确定由本领域技术人员基于本文的教导来确定。因此，本发明提供了含有至少一种编码酶或蛋白质的外源核酸的非天然存在的微生物有机体，其中酶或蛋白质转化己内酰胺途径的底物和产物。
在一些实施方案中，本文提供的非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，可以进一步包括己二酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：琥珀酰-CoA和乙酰-CoA转化为3-氧代己二酰-CoA；3-氧代己二酰-CoA转化为3-羟基己二酰-CoA；3-羟基己二酰-CoA转化为5-羧基-2-戊烯酰-CoA；5-羧基-2-戊烯酰-CoA转化为己二酰-CoA；己二酰-CoA转化为己二酸(参见例如WO2012/177721，其通过引用整体并入本文)。此外，非天然存在的微生物有机体可以具有己二酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：琥珀酰-CoA和乙酰-CoA转化为3-氧代己二酰-CoA；3-氧代己二酸-CoA转化为3-氧代己二酸；3-氧代己二酸转化为3-羟基己二酸；3-羟基己二酸转化为六-2-烯二酸(本文也称为5-羧基-2-戊烯酸)；六-2-烯二酸转化为己二酸。此外，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：己二酰-CoA转化为己二酸半醛；和己二酸半醛转化为6-氨基己酸。此外，非天然存在的微生物有机体可以具有己内酰胺途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：己二酰-CoA转化为己二酸半醛；己二酸半醛转化为6-氨基己酸；和6-氨基己酸转化为己内酰胺。此外，非天然存在的微生物有机体可以具有己二酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：α-酮己二酸转化为α-酮己二酰-CoA；α-酮己二酰-CoA转化为2-羟基己二酰-CoA；2-羟基己二酰-CoA转化为5-羧基-2-戊烯酰-CoA；5-羧基-2-戊烯酰-CoA转化为己二酰-CoA；以及己二酸-CoA转化为己二酸。此外，非天然存在的微生物有机体可以具有己二酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：α-酮己二酸转化为2-羟基己二酸；2-羟基己二酸转化为2-羟基己二酰-CoA；2-羟基己二酰-CoA转化为5-羧基-2-戊烯酰-CoA；5-羧基-2-戊烯酰-CoA转化为己二酰-CoA；以及己二酰-CoA转化为己二酸。
另外，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酰-CoA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：4-氨基丁酰-CoA和乙酰-CoA转化为3-氧代-6-氨基己酰-CoA；3-氧代-6-氨基己酰-CoA转化为3-羟基-6-氨基己酰-CoA；3-羟基-6-氨基己酰-CoA转化为6-氨基己-2-烯酰-CoA；6-氨基己-2-烯酰-CoA转化为6-氨基己酰-CoA。这种途径的其他底物和产物可以包括6-氨基己酰-CoA转化为6-氨基己酸；6-氨基己酰-CoA转化为己内酰胺；或6-氨基己酰-CoA转化为6-氨基己酸半醛，以及6-氨基己酸半醛转化为六亚甲基二胺。非天然存在的微生物有机体还可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：4-氨基丁酰-CoA和乙酰-CoA转化为3-氧代-6-氨基己酰-CoA；3-氧代-6-氨基己酰-CoA转化为3-氧代-6-氨基己酸；3-氧代-6-氨基己酸转化为3-羟基-6-氨基己酸；3-羟基-6-氨基己酸转化为6-氨基己-2-烯酸；以及6-氨基己-2-烯酸转化为6-氨基己酸。这种途径的其他底物和产物可以包括6-氨基己酸转化为己内酰胺或6-氨基己酸转化为6-氨基己酰-CoA，6-氨基己酰-CoA转化为6-氨基己酸半醛，以及6-氨基己酸半醛转化为六亚甲基二胺。
此外，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和琥珀酸半醛转化为4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸(HODH)转化为2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)：2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)转化为2-氧代庚烷-1,7-二酸(2-OHD)；2-氧代庚烷-1,7-二酸(2-OHD)转化为己二酸半醛；以及己二酸半醛转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和琥珀酸半醛转化为4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸(HODH)转化为2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)；2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)转化为6-氧代己-4-烯酸(6-OHE)；6-氧代己-4-烯酸(6-OHE)转化为己二酸半醛；以及己二酸半醛转化转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和琥珀酸半醛转化为4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸(HODH)转化为2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)；2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)转化为2-氨基庚-4-烯-1,7-二酸(2-AHE)；2-氨基庚-4-烯-1,7-二酸(2-AHE)转化为2-氨基庚烷-1,7-二酸(2-AHD)；以及2-氨基庚烷-1,7-二酸(2-AHD)转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和琥珀酸半醛转化为4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸(HODH)转化为2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)；2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)转化为2-氧代庚烷-1,7-二酸(2-OHD)；2-氧代庚烷-1,7-二酸(2-OHD)转化为2-氨基庚烷-1,7-二酸(2-AHD)；以及2-氨基庚烷-1,7-二酸(2-AHD)转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和琥珀酸半醛转化为4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸(HODH)转化为3-羟基己二酰-CoA；3-羟基己二酰-CoA转化为2,3-脱氢己二酰-CoA；2,3-脱氢己二酰-CoA转化为己二酰-CoA；己二酰-CoA转化为己二酸半醛；以及己二酸半醛转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和琥珀酸半醛转化为4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸(HODH)转化为2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)；2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)转化为2,3-脱氢己二酰(dehydroadipyl)-CoA；2,3-脱氢己二酰-CoA转化为己二酰-CoA；己二酰-CoA转化为己二酸半醛；以及己二酸半醛转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和琥珀酸半醛转化为4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸；4-羟基-2-氧代庚烷-1,7-二酸(HODH)转化为2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)；2-氧代庚-4-烯-1,7-二酸(OHED)转化为2-氧代庚烷-1,7-二酸(2-OHD)；2-氧代庚烷-1,7-二酸(2-OHD)转化为己二酰-CoA；己二酰-CoA转化为己二酸半醛；以及己二酸半醛转化为6-氨基己酸。
此外，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：谷氨酸转化为谷氨酰-CoA；谷氨酰-CoA转化为3-氧代-6-氨基-庚二酰-CoA；3-氧代-6-氨基-庚二酰-CoA转化为3-羟基-6-氨基-庚二酰-CoA；3-羟基-6-氨基-庚二酰-CoA转化为6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-CoA；6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-CoA转化为6-氨基庚二酰-CoA；6-氨基庚二酰-CoA转化为2-氨基庚二酸；以及2-氨基庚二酸转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为2-氨基庚二酸；以及2-氨基庚二酸转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：高赖氨酸转化为6-氨基己酰胺；和6-氨基己酰胺转化为6-氨基己酸。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：己二酸转化为己二酸半醛；己二酸转化为己二酰磷酸；以及己二酰磷酸转化为己二酸半醛。
此外，非天然存在的微生物有机体可以具有6-氨基己酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：2-氨基-7-氧代辛二酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为6-氨基己醛；6-氨基己醛转化为6-氨基己酸；2-氨基-7-氧代辛二酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为6-氨基己醛；2-氨基-7-氧代庚酸转化为2-氨基庚二酸；以及2-氨基庚二酸转化为6-氨基己酸。非天然存在的微生物有机体还可以具有2-氨基-7-氧代辛二酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：谷氨酸-5-半醛转化为2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸；2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸转化为2-氨基-5-烯-7-氧代辛二酸；以及2-氨基-5-烯-7-氧代辛二酸转化为2-氨基-7-氧代辛二酸。
此外，非天然存在的微生物有机体可以具有六亚甲基二胺(HMDA)途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为[(6-氨基己酰基))氧基]膦酸(6-AHOP)；[(6-氨基己酰基)氧基]膦酸(6-AHOP)转化为6-氨基己酸半醛；以及6-氨基己酸半醛转化转化为六亚甲基二胺。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为[(6-氨基己酰基)氧基]膦酸(6-AHOP)；[(6-氨基己酰基)氧基]膦酸(6-AHOP)转化为6-氨基己酰-CoA；6-氨基己酰-CoA转化为6-氨基己酸半醛；以及6-氨基己酸半醛转化为六亚甲基二胺。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为6-氨基己酰-CoA；6-氨基己酰酰辅A转化为6-氨基己酸半醛；以及6-氨基己酸半醛转化为六亚甲基二胺。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸转化为[(6-乙酰氨基己酰基)氧基]膦酸(6-AAHOP)；[(6-乙酰氨基己酰基)氧基]膦酸(6-AAHOP)转化为6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛转化为6-乙酰氨基己胺；以及6-乙酰氨基己胺转化为六亚甲基二胺。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸转化为6-乙酰氨基己酰-CoA；6-乙酰氨基己酰-CoA转化为6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛转化为6-乙酰氨基己胺；以及6-乙酰氨基己胺转化为六亚甲基二胺。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸转化为[(6-乙酰氨基己酰基)氧基]膦酸(6-AAHOP)；[(6-乙酰氨基己酰基)氧基]膦酸(6-AAHOP)转化为6-乙酰氨基己酰-CoA；6-乙酰氨基己酰-CoA转化为6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛转化为6-乙酰氨基己胺；以及6-乙酰氨基己胺转化为六亚甲基二胺。
此外，非天然存在的微生物有机体可以具有六亚甲基二胺(HMDA)途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：谷氨酸转化为谷氨酰-CoA；谷氨酰-CoA转化为3-氧代-6-氨基-庚二酰-CoA；3-氧代-6-氨基-庚二酰-CoA转化为3-羟基-6-氨基-庚二酰-CoA；3-羟基-6-氨基-庚二酰-CoA转化为6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-CoA；6-氨基-7-羧基-庚-2-烯酰-CoA转化为6-氨基庚二酰-CoA；6-氨基庚二酰-CoA转化为2-氨基-7-氧代庚酸；-氨基-7-氧代庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛转化为3-氧代-7-氨基庚酸；3-氧代-7-氨基庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为5-氧代庚二酰膦酸；5-氧代庚二酰膦酸转化为3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛转化为3-氧代-7-氨基庚酸；3-氧代-7-氨基庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸，以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为5-氧代庚二酰-CoA；5-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛转化为3-氧代-7-氨基庚酸；3-氧代-7-氨基庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为5-氧代庚二酰-CoA；5-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代-1-羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为5-氧代庚二酰膦酸；5-氧代庚二酰膦酸转化为3-氧代-1羧基庚醛；3-氧代-1-羧基庚醛转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7氧代庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为5-氨基庚二酰膦酸；5-氨基庚二酰膦酸转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨转化为酸HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为5-氨基庚二酰-CoA；5-氨基庚二酰-CoA转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为5-氨基庚二酰-CoA；5-氨基庚二酰-CoA转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为5-氨基庚二酰膦酸；5-氨基庚二酰膦酸转化为3-氨基-7-氧代庚酸；3-氨基-7-氧代庚酸转化为3,7-二氨基庚酸；3,7-二氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为2-氨基庚二酸；2-氨基庚二酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为2-氨基庚二酸；2-氨基庚二酸转化为6-氨基庚二酰膦酸；6-氨基庚二酰膦酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：戊二酰-CoA转化为3-氧代庚二酰-CoA；3-氧代庚二酰-CoA转化为3-氧代庚二酸；3-氧代庚二酸转化为3-氨基庚二酸；3-氨基庚二酸转化为2-氨基庚二酸；2-氨基庚二酸转化为6-氨基庚二酰-CoA；6-氨基庚二酰-CoA转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和4-氨基丁醛转化为2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸；2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸转化为2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸；2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸转化为2-氧代-7-氨基庚酸；2-氧代-7-氨基庚酸转化为高赖氨酸；以及高赖氨酸转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：丙酮酸和4-氨基丁醛转化为2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸；2-氧代-4-羟基7-氨基庚酸转化为2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸；2-氧代-7-氨基庚-3-烯酸转化为2-氧代-7-氨基庚酸；2-氧代-7-氨基庚酸转化为6-氨基己醛；以及6-氨基己醛转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为6-氨基己酸半醛；和6-氨基己酸半醛转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：6-氨基己酸转化为6-乙酰氨基己酸；6-乙酰氨基己酸转化为6-乙酰氨基己醛；6-乙酰氨基己醛转化为6-乙酰氨基己胺；6-乙酰氨基己胺转化为HMDA。或者，非天然存在的微生物有机体可以具有HMDA途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：2-氨基-7-氧代辛二酸转化为2-氨基-7-氧代庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为6-氨基己醛；6-氨基己醛转化为HMDA；2-氨基-7-氧代辛二酸转化为2-氧代-7-氨基庚酸；2-氨基-7-氧代庚酸转化为高赖氨酸；高赖氨酸转化为HMDA；2-氧代-7-氨基庚酸转化为高赖氨酸；2-氧代-7-氨基庚酸转化为6-氨基己醛；2-氨基-7-氧代辛二酸转化为2,7-二氨基辛二酸；以及2,7-二氨基辛二酸转化为高赖氨酸。非天然存在的微生物有机体可以进一步具有2-氨基-7-氧代辛二酸途径，其中微生物有机体含有至少一种编码将底物转化为产物的多肽的外源核酸，所述底物转化为产物选自：谷氨酸-5-半醛转化为2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸；2-氨基-5-羟基-7-氧代辛二酸转化为2-氨基-5-烯-7-氧代辛二酸；以及2-氨基-5-烯-7-氧代辛二酸转化为2-氨基-7-氧代辛二酸。
本领域技术人员将理解，这些仅仅是示例性的，并且本文公开的任何底物-产物对，其适合产生所需的乙酰-CoA衍生产物并且其适当活性可用于将底物转化为产物，都可以容易地由本领域技术人员基于本文的教导来确定。
还理解的是，本文公开的外源核酸的表达可以由各种启动子调节，例如内源启动子、组成型启动子或诱导型启动子。给定所需的表达水平和持续时间，本领域普通技术人员会理解使用哪种类型的启动子。例如，如果所需的表达水平是内源水平，普通技术人员会理解可以使用内源启动子来控制外源核酸的表达。此外，如果希望表达是例如暂时的或在发酵过程中的特定点，则可以使用内源启动子来控制外源核酸的表达。然而，如果希望表达是例如恒定和稳健的，则可以使用组成型启动子来控制外源核酸的表达。因此，在一些实施方案中，编码酶的外源核酸受内源启动子、组成型启动子或诱导型启动子调节。
虽然本文大体上描述为诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少以增强通过乙酰-CoA的碳通量的微生物有机体，但理解的是，本发明另外提供了包含至少一种编码酶的外源核酸的非天然存在的微生物有机体，该酶以足够的量表达以增加所需乙酰-CoA衍生产物产生的可用性，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，以及从中衍生的中间体。
因此，理解的是，本发明在一些实施方案中另外提供了包括以下生物合成途径的中间体的非天然存在的微生物有机体：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA生物合成途径，其中该途径含有至少一种作用于乙酰-CoA衍生产物的酶，并且该途径酶以足以产生以下途径的中间体的量表达：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA途径。因此，除了含有产生1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或氨基酸的以下生物合成途径的微生物有机体之外：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA生物合成途径，本发明还提供了非天然存在的微生物有机体，其中微生物有机体产生乙酰-CoA衍生产物的中间体，例如以下生物合成途径的中间体：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于，4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA生物合成途径。
理解的是，本文所公开的任何途径，其在全文有描述并通过引用整体并入，若需要，可被诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少、以增强通过乙酰-CoA的碳通量的非天然存在的微生物有机体利用，从而生成进一步产生(如所期望的)任何途径中间体或衍生自乙酰-CoA的产物的非天然存在的微生物有机体。如本文所公开的，这种产生中间体的微生物有机体可以与另一种表达下游途径酶的微生物组合使用，以产生所需产物。然而，理解的是，非天然存在的微生物有机体，其产生乙酰-CoA衍生产物的中间体，例如以下生物合成途径的中间体：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA生物合成途径，其可用于产生作为所需产物的中间体。
大体上针对减少代谢反应、反应物或其产物的副产物，或具体针对一种或多种编码酶或蛋白质的核酸或基因，本文描述了本发明，所述酶与所提及的代谢反应、反应物或产物相关或催化所提及的代谢反应、反应物或产物，所述蛋白质与所提及的代谢反应、反应物或产物相关。除非本文另有明确说明，否则本领域技术人员将理解，提及反应也构成提及反应的反应物和产物。类似地，除非本文另有明确说明，否则提及反应物或产物也提及反应，并且提及任何这些代谢成分也提及编码酶或蛋白质的一种基因或多种基因，所述酶催化所提及的反应、反应物或产物，所述蛋白质与所提及的反应、反应物或产物相关。同样，鉴于代谢生物化学、酶学和基因组学等众所周知的领域，本文提及基因或编码核酸也构成提及相应编码的酶及其催化的反应或与反应相关的蛋白质以及反应的反应物和反应产物。
本发明的非天然存在的微生物有机体可以通过以下方式产生：引入编码乙醛再循环回路的一种或多种酶或蛋白质的可表达核酸和/或使乙酰乳酸合酶衰减，以减少副产物，例如丙酮酸副产物(例如，丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，以及由此衍生的相关产物。此外，在一些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物有机体可以通过进一步引入一种或多种参与例如以下中一种或多种的酶或蛋白质来产生：1,3-丁二醇(1,3-BDO)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯生物或任何其他乙酰-CoA衍生产物的生物合成途径。
取决于选择用于生物合成的宿主微生物有机体，可以表达用于将乙酰-CoA转化为所需产物的某些或全部特定生物合成途径的核酸，所述产物为例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。例如，如果所选宿主缺乏所需生物合成途径的一种或多种酶或蛋白质，则将用于缺乏的酶或蛋白质的可表达核酸引入宿主，用于随后的外源表达。或者，如果所选宿主表现出某些途径基因的内源表达，但缺乏其他途径基因，则需要用于缺乏的酶或蛋白质的编码核酸，以实现以下的生物合成：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。因此，本发明的非天然存在的微生物有机体可以通过引入外源酶或蛋白质活性以获得所需生物合成途径来产生，或者所需生物合成途径可以通过引入一种或多种外源酶或蛋白质活性来获得，所述一种或多种外源酶或蛋白质活性与一种或多种内源酶或蛋白质一起产生所需产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
宿主微生物有机体可以选自以及所述非天然存在的微生物有机体可以产生自例如适用于发酵过程的细菌、酵母、真菌或任何多种其他微生物。示例性的细菌包括选自以下的物种：大肠杆菌(E.coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。示例性酵母或真菌包括选自以下中的物种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、无根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizobus oryzae)等。大肠杆菌是特别有用的宿主有机体，因为它是适合基因工程的充分表征的微生物有机体。其他特别有用的宿主有机体包括酵母，例如酿酒酵母。理解的是，任何合适的微生物宿主有机体都可用于引入代谢和/或基因修饰，以产生所需产物。
取决于利用乙酰-CoA产生所需产物的生物合成途径，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，以及所选宿主微生物有机体的成分，本发明的非天然存在的微生物有机体可以包括至少一种外源表达的1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物途径编码核酸，以及多达所有用于一种或多种1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径的编码核酸。例如，1,3-BDO、MMA或(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯生物合成，可以通过相应编码核酸的外源表达在缺乏途径酶或蛋白质的宿主中建立。在缺乏1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物途径的所有酶或蛋白质的宿主中，可以包括该途径中所有酶或蛋白质的外源表达，尽管理解的是即使宿主含有至少一种途径酶或蛋白质，也可以表达途径的所有酶或蛋白质。例如，用于产生1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或任何其他乙酰-CoA衍生产物的途径中所有酶或蛋白质的外源表达，可以包括在表达乙醛再循环回路的一种或多种酶或蛋白质和/或具有衰减的乙酰乳酸合酶的宿主中，以减少副产物，例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇。
鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，以可表达形式引入的编码核酸的数量应至少平行于副产物减少的所选宿主微生物有机体的途径缺陷。例如，本发明的非天然存在的微生物有机体可以具有一种或两种编码构成本文公开的乙醛再循环回路途径的酶或蛋白质的核酸，用于减少副产物，例如乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量。通过乙酰-CoA的碳通量增强可以由此增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体还可以包括促进或优化乙酰-CoA衍生产物生物合成或赋予宿主微生物有机体其他有用功能的其他基因修饰，所述乙酰-CoA衍生产物例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物。一种这样的其他功能可以包括例如增强以下中一种或多种的合成：乙酰-CoA衍生产物途径前体，例如1,3-BDO前体(例如3HB-CoA)、MMA前体(例如MAA-CoA)、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯前体(例如乙酰乙酰-CoA)的前体，或任何其他乙酰-CoA衍生产物的前体。
因此，本发明的副产物减少的非天然存在的微生物有机体可以具有一种或两种编码构成本文公开的乙醛再循回路途径的酶或蛋白质的核酸。在一些实施方案中，本发明的副产物减少的非天然存在的微生物有机体还可以具有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种多达所有编码构成本文公开的反应生物合成途径的酶或蛋白质的核酸。在一些实施方案中，非天然存在的微生物有机体还可以包括促进或优化乙酰-CoA衍生产物生物合成或赋予宿主微生物有机体其他有用功能的其他基因修饰，所述乙酰-CoA衍生产物例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物。例如，一种这样的其他功能可以包括例如增强一种或多种1,3-BDO途径前体例如3HB-CoA的合成。
通常，选择宿主微生物有机体，以使其产生乙酰-CoA依赖性途径的前体，或者作为天然产生的分子，或者作为工程产物，所述工程产物提供所需前体的从头产生或增加宿主微生物有机体自然产生的前体的产生。例如，丙酮酸是在大肠杆菌等宿主有机体中自然产生的。如本文所公开的，可以对宿主有机体进行工程改造以增加前体的产生。此外，经工程改造产生所需前体的微生物有机体可以用作宿主有机体，并经进一步工程改造而表达用于增加乙酰-CoA衍生产物的途径酶或蛋白质，所述乙酰-CoA衍生产物例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
在一些实施方案中，由含有合成乙酰-CoA衍生产物(例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA)酶促能力的宿主生成本发明的诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少的非天然存在的微生物有机体。在该具体实施方案中，其可以用于增加乙酰-CoA衍生产物途径产物的合成或积累，以例如驱动1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物途径反应趋向分别产生1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物的方向。增加的合成或积累可以通过例如超表达编码参与产生乙酰-CoA衍生产物途径的酶或蛋白质的核酸来实现。
本文公开的酶或蛋白质(能够降低副产物，例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于，4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA)的超表达可以例如通过一种或多种内源基因的外源表达或通过一种或多种异源基因的外源表达而发生。因此，天然存在的有机体可以容易地产生为本发明的非天然存在的微生物有机体，其通过超表达一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种或八种(取决于途径中酶的数量)即多达所有编码本文公开的可以减少副产物以及增加例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径酶或蛋白质的核酸，例如减少诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。此外，非天然存在的有机体可以通过导致本文公开的酶活性增加的内源基因诱变生成，本文公开的酶活性增加可以降低副产物以及增加例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物。
在特别有用的实施方案中，使用编码核酸的外源表达。外源表达赋予为宿主和应用定制表达元件和/或调节元件的能力，以实现由用户控制的所需表达水平。然而，内源表达也可用于其他实施方案，例如通过去除负调节效应物或当与诱导型启动子或其他调节元件连接时诱导基因的启动子。因此，可以通过提供适当的诱导剂来上调具有天然存在的诱导型启动子的内源基因，或者可以对内源基因的调节区进行工程改造以掺入诱导型调节元件，从而允许在所需的时间调节内源基因表达的增加。类似地，可包括诱导型启动子，作为引入非天然存在的微生物有机体的外源基因的调节元件。
理解的是，在本发明的方法中，可以将任一种或多种外源核酸引入微生物有机体中，以产生本发明的非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如，丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量。可以引入核酸以赋予例如微生物有机体具有衰减的乙酰乳酸合酶和/或乙醛再循环回路。在一些实施方案中，副产物减少的微生物有机体还可以包括经引入赋予例如微生物有机体具有生物合成途径的核酸，所述生物合成途径用于产生1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。或者，可以引入编码核酸以产生具有生物合成能力的中间微生物有机体，以催化一些所需的反应以赋予1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物的生物合成能力。例如，非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，其可以包含至少两种编码所需酶或蛋白质的外源核酸，例如以下的组合：衰减的乙酰乳酸合酶和乙酰-CoA合酶；和衰减的乙酰乳酸合酶和醛脱氢酶；衰减的乙酰乳酸合酶和醛脱氢酶；醛脱氢酶和乙酰-CoA合酶等。因此，理解的是，生物合成途径的两种或更多种酶或蛋白质的任何组合，都可以包括在本发明的非天然存在的微生物有机体中。类似地，理解的是，生物合成途径的所有三种酶或蛋白质都可以包括在本发明的非天然存在的微生物有机体中，例如，衰减的乙酰乳酸合酶、乙酰-CoA合酶和醛脱氢酶。
除了例如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或本文所述任何其他乙酰-CoA衍生产物的生物合成之外，本发明的非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如，丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的降低，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，和本发明的用于降低这类副产物的方法，也可以相互之间以及与本领域公知的其他微生物有机体和方法以各种组合使用，以通过其他途径实现产物生物合成。例如，一种在非天然存在的微生物有机体中产生例如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或任何其他乙酰-CoA衍生产物的替代方案，所述微生物有机体具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的降低，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，而不是使用例如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物生产者，是通过添加另一种微生物有机体进行的，所述另一种微生物有机体能够将例如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径中间体分别转化为例如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物。
一种这样的程序包括例如产生1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径中间体的微生物有机体的发酵。然后，可以使用1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径中间体，作为第二非天然存在的微生物有机体的底物，该微生物有机体将1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径中间体分别转化为1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物。可以将1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径中间体直接添加到第二非天然存在的微生物有机体的另一种培养物中，或可以通过例如细胞分离，耗尽1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径中间体生产者原始培养物中的这些微生物有机体，以及利用向发酵液中随后添加第二非天然存在的微生物有机体，来产生最终产物而无需中间纯化步骤。
在其他实施方案中，本文公开的非天然存在的微生物有机体，其诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，和本发明的用于减少此类副产物的方法，可以组装在多种子途径中，以实现以下的生物合成：例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在这些实施方案中，可以将本发明的所需产物的生物合成途径分离到不同的微生物有机体中，并且可以共培养不同的微生物有机体以产生最终产物。在这类生物合成方案中，一种微生物有机体的产物是第二微生物有机体的底物，直到合成最终产物。例如，1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或任何其他乙酰-CoA衍生产物的生物合成，可以通过构建含有将一种途径中间体转化为另一种途径中间体或产物的生物合成途径的微生物来完成，并且可以将一种或多种通过乙酰-CoA衍生途径将一种途径中间体转化为另一种途径中间体或产物的微生物有机体构建为具有减少的副产物，例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物。或者，产生所需的乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA、1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或氨基酸，也可以由一种或多种通过乙酰-CoA的碳通量增强的微生物有机体，通过在同一容器中使用两种有机体进行共培养或共发酵来以生物合成的方式产生，其中第一种微生物有机体产生诸如1,3-BDO中间体等中间体，而第二种微生物有机体将该中间体转化为1,3-BDO。
鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员应当理解，对于本发明的非天然存在的微生物有机体和方法连同其他微生物有机体、具有子途径的其他微生物有机体的共培养物以及本领域公知的其他化学程序和/或生化程序的组合，存在产生以下产物的各种组合和排列：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
类似地，本领域技术人员理解，可以基于所需特征来选择宿主有机体，用于引入一种或多种基因破坏来增加以下的产生：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。因此，理解的是，如果要将基因修饰引入宿主有机体以破坏基因，则可以类似地破坏催化相似但不相同的代谢反应的任何同源基因、直系同源基因或旁系同源基因，以确保所需代谢反应被充分破坏。因为在不同有机体的代谢网络之间存在某些差异，因此本领域技术人员将理解，在给定有机体中被破坏的实际基因可能在有机体之间有所不同。然而，鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，本发明的方法可以应用于任何合适的宿主微生物，以鉴定在感兴趣的物种中构建有机体所需的同源代谢改变，所述同源代谢改变将增加1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物的生物合成。在具体实施方案中，增加的产生偶联例如1,3-BDO、MMA或(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯的生物合成，并且如果需要并如本文所公开的，可以强制性地使例如1,3-BDO、MMA或(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯的产生偶联到有机体生长。
乙醛再循环回路或使用乙酰-CoA作为底物的途径酶或蛋白质的编码核酸的来源可以包括例如编码的基因产物能够催化所提及的反应的任何物种。此类物种包括原核生物和真核生物，包括但不限于细菌，包括古细菌和真细菌，以及真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人类。此类来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌，以及本文公开的或可用作相应基因来源有机体的其他示例性物种。此类来源的示例性物种包括，例如大肠杆菌、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrrogans)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、玫瑰弯曲菌(Roseiflexus sp.)RS-1、聚集绿屈挠菌(Chloroflexus aggregans)、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxydans)、梭菌(Clostrdia species)，包括克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)G3、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)，梭杆菌(Fusobacterium)物种，包括具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、褐鼠(Rattus norvegicus)、智人(Homo sapiens)，酵母属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，曲霉属(Apsergillus)物种，包括土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)，玉米赤霉(Gibberella zeae)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)，分枝杆菌属(Mycobacterium)物种，包括耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)，包括鸟分枝杆菌副结核亚种(subsp.pratuberculosis)，海洋专性放线菌(Salinispora arenicola)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种，包括假单胞菌CF600(Pseudomonas sp.CF600)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，罗尔斯顿菌属(Ralstonia)物种，包括真养罗尔斯顿菌(Ralstonia eutropha)、真养罗尔斯顿菌JMP134、真养罗尔斯顿菌H16、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种，包括甲醇芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，戊糖片球菌(Pedicoccus pentosaceus)、绿屈挠菌属(Chlorofexus)物种，包括橙色绿屈挠菌、聚集绿屈挠菌，类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、詹氏甲烷球菌、问号钩端螺旋体、麦芽假丝酵母菌(Candida maltosa)、沙门氏菌属(Salmonella)物种，包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovarTyphimurium)，希瓦氏菌属(Shewanella)物种，包括奥奈达希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)、希瓦氏菌MR-4(Shewanella sp.MR-4)，粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、巴氏真杆菌(Eubacteriumbarkeri)、毛细拟杆菌(Bacteroides capillosus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、闪烁古生球菌、死海盐杆菌(Haloarcula marismortui)、嗜气热棒菌菌株str.IM2(Pyrobaculum aerophilum str.IM2)、根瘤菌属(Rhizobium)物种，包括豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，以及本文公开的或可用作相应基因的来源生物的其他示例性物种。然而，现在已有超过550个物种的完整基因组序列(其中一半以上可在公共数据库例如NCBI中获得)是可获得的，包括395个微生物基因组和各种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，鉴定编码降低诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物以增强通过乙酰-CoA的碳通量所需活性的基因，以及针对相关或远亲物种中的一种或多种基因，鉴定编码1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA或其他乙酰-CoA衍生物生物合成活性的基因，包括例如已知基因的同源基因、直系同源基因、旁系同源基因和非直系同源基因置换，以及有机体之间基因改变的交换，在本领域中是常规的和众所周知的。因此，本文参考特定有机体例如大肠杆菌描述的代谢改变，其允许诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，可以很容易应用于其他微生物，包括原核生物和真核生物。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员应当知道，在一种有机体中举例说明的代谢改变可以同样应用于其他有机体。
在一些情况下，例如当用于产生1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA的替代生物合成途径存在于不相关的物种中时，1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA的生物合成可以通过例如外源表达来自不相关物种的一种或多种催化类似但不同代谢反应的直系同源基因而被赋予宿主物种，以代替所提及的反应。由于不同有机体存在代谢网络之间的某些差异，本领域技术人员将理解，不同有机体之间的实际基因使用可能不同。然而，鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，使用本文举例说明的那些的同源代谢改变，本发明的教导和方法可以应用于所有微生物有机体，以在感兴趣的物种中构建微生物有机体，所述微生物有机体将合成1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
可以通过本领域公知的重组和检测方法进行用于构建非天然存在的有机体和测试其表达水平的方法，所述有机体的诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量。此类方法可以见于例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学试验汇编),John Wiley andSons,Baltimore,MD(1999)。
可以使用本领域公知的技术，包括但不限于缀合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化，将参与减少副产物途径的外源核酸序列稳定或瞬时引入宿主细胞，所述副产物为例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，所述副产物被减少以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。对于在大肠杆菌或其他原核细胞中的外源表达，真核核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码靶向信号，例如N末端线粒体或其他靶向信号，如果需要的话，这些可以在转化到原核宿主细胞之前被去除。例如，线粒体前导序列的去除导致大肠杆菌中的表达增加(Hoffmeister et al.,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于在酵母或其他真核细胞中的外源表达，基因可以在胞质溶胶中表达，无需添加前导序列，或者可以通过添加合适的靶向序列，例如适合宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号，靶向线粒体或其他细胞器或者靶向分泌。因此，理解的是，可以将去除或包括靶向序列的核酸序列的适当修饰并入外源核酸序列中，以赋予期望的特性。此外，可以用本领域公知的技术对基因进行密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。
可以构建一种或多种表达载体以包括一种或多种可操作地连接于在宿主有机体中起作用的表达控制序列的外源核酸，每种外源核酸都编码以足以降低副产物以增强通过乙酰-CoA的碳通量的量表达的酶，所述副产物为丙酮酸副产物、乙酸和/或乙醇，如本文所举例说明的。在一些实施方案中，可以进一步构建一种或多种表达载体，以包括一种或多种可操作地连接于在宿主有机体中起作用的表达控制序列的外源核酸，每种外源核酸都编码以足以增加乙酰-CoA衍生产物产生的量表达的酶，例如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA，或其他乙酰-CoA衍生产物生物合成途径编码核酸，如本文所举例说明的。适用于本发明的微生物宿主有机体的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，包括可用于稳定整合到宿主染色体中的可操作性的载体和选择序列或标志。此外，表达载体可以包括一种或多种选择性标志基因和适当的表达控制序列。还可以包括选择性标志基因，例如，提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷或提供不在培养基中的关键养分。表达控制序列可以包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共表达两种或更多种外源编码核酸时，可以将两种核酸插入到例如单个表达载体或单独的表达载体中。对于单个载体表达，编码核酸可以可操作地连接于一种共同的表达控制序列或连接于不同的表达控制序列，例如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。可以使用本领域公知的方法来确认参与代谢或合成途径的外源核酸序列的转化。此类方法包括例如核酸分析，例如mRNA的RNA印迹或聚合酶链反应(PCR)扩增，或用于基因产物表达的免疫印迹，或用于测试引入的核酸序列或其相应基因产物表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员理解，外源核酸以足以产生所需产物的量表达，并且进一步理解，可以使用本领域公知和本文公开的方法优化表达水平以获得足够的表达。
可以使用公知的方法进行适合的纯化和/或测定，以测试副产物的产生，例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇、乙酰-CoA，或乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。可以为每个要测试的工程菌株培养合适的重复，例如一式三份培养物。例如，可以监测工程生产宿主中的产物和副产物形成。可以通过诸如HPLC(高效液色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱)和LC-MS(液相色谱-质谱)等方法或其他合适的分析方法，使用本领域公知的常规程序，分析最终产物和中间体以及其他有机化合物。发酵液中产物的释放也可以用培养上清液进行测试。可以通过HPLC，使用例如用于葡萄糖和醇的折光率检测器以及用于有机酸的UV检测器(Lin et al.,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))，或本领域公知的其他合适的测定和检测方法，对副产物和残留葡萄糖进行定量。也可以使用本领域公知的方法测定来自外源DNA序列的个体酶或蛋白质活性。
乙酰-CoA衍生化合物，例如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯、MMA，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA的产生可以使用本领域公知的多种方法与培养物中的其他成分分离。此类分离方法包括例如提取程序以及包括连续液-液提取、全蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、提取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱和超滤的方法。所有上述方法在本领域中都是公知的。
本文所述的任何非天然存在的微生物有机体，其具有减少的副产物诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，都可以经培养产生和/或分泌本发明的生物合成乙酰-CoA衍生产物。例如，可以培养乙酰-CoA衍生产物生产者，以便以生物合成的方式产生所需的乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
为了产生所需的乙酰-CoA衍生产物，将重组菌株培养在具有碳源和其他必需养分的培养基中。有时需要并且可能非常需要在发酵罐中保持厌氧条件以减少整个过程的成本。例如，可以通过首先用氮气吹扫培养基，然后用隔膜和压接盖(crimp-cap)密封烧瓶来获得这类条件。对于在厌氧条件下未观察到生长的菌株，可以通过在隔膜上打一个小孔来进行有限通气，应用微需氧或基本厌氧条件。示例性厌氧条件已经先前已有描述，并且在本领域中是众所周知的。例如，示例性需氧和厌氧条件描述于在2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。如本文所公开的，发酵可以以分批、补料分批或连续的方式进行。
根据将培养基维持在所需pH的需要，可以通过添加碱(例如NaOH或其他碱)或酸，将培养基的pH维持在所需pH，特别是中性pH，例如约pH 7。生长速率可以通过使用分光光度计(600nm)测量光密度来确定，而葡萄糖摄取率可以通过监测碳源随时间的消耗来测定。
生长培养基可以包括例如可以向非天然存在的微生物提供碳源的任何碳水化合物源。这类来源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉。碳水化合物的其他来源包括例如可再生原料和生物质。可以在本发明方法中用作原料的生物质的示例性类型包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木质素原料或原料部分。此类生物质原料含有例如可用作碳源的碳水化合物底物，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，除以上举例说明的之外的可再生原料和生物质，也可用于培养本发明的诸如丙酮酸副产物(例如，丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少的微生物有机体，用于产生乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
除了诸如以上举例说明的那些可再生原料之外，本发明的微生物有机体也可以经修饰在作为碳源的合成气上生长，所述微生物有机体具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的降低，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于，4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在该具体实施方案中，一种或多种蛋白质或酶在产生乙酰-CoA衍生产物的有机体中表达，以提供用于利用合成气或其他气态碳源的代谢途径。
合成气(Synthesis gas)，也称为合成气(syngas)或生产气，是煤和含碳材料(例如生物质材料，包括农作物和残留物)气化的主要产物。合成气主要是H2和CO的混合物，可以从任何有机原料的气化中获得，包括但不限于煤、煤油、天然气、生物质和废弃有机物。气化通常在高燃料与氧气的比率下进行。虽然主要是H2和CO，但合成气也可以包含少量的CO2和其他气体。因此，合成气提供了具有成本效益的气态碳源，例如CO，已经额外的CO2。
Wood-Ljungdahl途径催化CO和H2转化为乙酰-CoA和其他产物，例如乙酸。能够利用CO和合成气的有机体通常还具有通过Wood-Ljungdahl途径所包含的相同的基本酶组和转化、利用CO2和CO2/H2混合物的能力。早在揭示CO也可以被相同的有机体使用并且涉及相同的途径之前，就已认识到微生物将CO2以H2依赖性方式转化为乙酸。已证明，许多产乙酸菌在CO2存在下生长并产生诸如乙酸等化合物，只要氢存在以提供必要的还原当量即可(参见例如Drake,Acetogenesis,pp.3-60Chapman and Hall,New York,(1994))。这可以通过以下等式来概括：
2CO2+4H2+n ADP+n Pi→CH3COOH+2H2O+n ATP
因此，拥有Wood-Ljungdahl途径的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2混合物来生产乙酰-CoA和其他所需产物。
Wood-Ljungdahl途径在本领域中是众所周知的，并且由12个反应组成，这些反应可以分成两个分支：(1)甲基分支和(2)羰基分支。甲基分支将合成气转化为甲基四氢叶酸(甲基-THF)，而羰基分支将甲基-THF转化为乙酰-CoA。甲基分支中的反应由以下酶或蛋白质依次催化：铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸脱氢酶、甲酰基四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸环化脱水酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。羰基分支中的反应由以下酶或蛋白质按依次催化：甲基四氢叶酸:类咕啉蛋白甲基转移酶(例如AcsE)、类咕啉铁硫蛋白、镍蛋白组装蛋白(例如AcsF)、铁氧还蛋白、乙酰基-CoA合酶、一氧化碳脱氢酶和镍蛋白组装蛋白(例如CooC)。遵循本文提供的用于以下的教导和指导：引入足够数量的编码核酸以减少产生不需要的副产物，例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，本领域技术人员将理解，对于引入至少编码宿主有机体中不存在的Wood-Ljungdahl酶或蛋白质的核酸，也可以进行同样的工程设计。因此，将一种或多种编码核酸引入本发明的微生物有机体使得修饰的有机体含有完整的Wood-Ljungdahl途径，会赋予合成气利用能力。
此外，还原性(反向)三羧酸循环被用于和/或氢化酶活性也可被用于将CO、CO2和/或H2转化为乙酰-CoA和其他产物，例如乙酸。能够通过还原性TCA途径固定碳的有机体可以利用下述酶中的一种或多种：ATP柠檬酸裂合酶、柠檬酸裂合酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶和氢化酶。具体而言，通过一氧化碳脱氢酶和氢化酶从CO和/或H2中提取的还原当量用于通过还原性TCA循环将CO2固定为乙酰-CoA或乙酸。乙酸可以通过诸如乙酰-CoA转移酶、乙酸激酶/磷酸转乙酰酶和乙酰-CoA合成酶等酶转化为乙酰-CoA。乙酰-CoA可以通过丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和糖异生的酶转化为例如乙酰-CoA衍生产物的前体，例如以下的前体：1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸。遵循本文提供的教导和指导引入足够数量的编码核酸，以生成例如1,3-BDO途径、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径、MMA途径或任何其他在其途径中利用乙酰-CoA作为底物的生物合成途径，本领域技术人员将理解，对于引入至少编码宿主有机体中不存在的还原性TCA途径酶或蛋白质的核酸，也可以进行同样的工程设计。因此，将一种或多种编码核酸引入本发明的微生物有机体使得修饰的有机体含有完整的还原性TCA途径，会赋予合成气利用能力。
因此，鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，可以产生在碳水化合物等碳源上生长时分泌本发明的生物合成化合物的非天然存在的微生物有机体，其具有诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等不需要的副产物减少，以增强通过乙酰-CoA的碳通量。此类化合物包括例如乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，以及其中的任何中间代谢物。所需要的只是改造一种或多种所需的酶或蛋白质活性以实现所需化合物或中间体的生物合成，包括例如包含一些或所有乙酰-CoA衍生产物生物合成途径。因此，本发明提供了非天然存在的微生物有机体，当在碳水化合物或其他碳源上生长时其产生和/或分泌乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，并且当在碳水化合物或其他碳源上生长时其产生和/或分泌乙酰-CoA衍生产物途径中的任何中间代谢物。本发明的产生乙酰-CoA衍生产物的微生物有机体可以从中间体开始合成。
在一些实施方案中，使用本文举例说明的本领域公知的方法构建本发明的非天然存在的微生物有机体，以便以足以减少诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的量外源表达至少一种编码酶或蛋白质的核酸，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，并由此增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在其他实施方案中，使用本文所举例说明的本领域公知的方法构建本发明的非天然存在的微生物有机体，以便以足以减少诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的量衰减酶或蛋白质的活性，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，并由此增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。
理解的是，在足以产生乙酰-CoA衍生产物的条件下培养本发明的微生物有机体，所述乙酰-CoA衍生产物例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。遵循本文提供的教导和指导，本发明的非天然存在的微生物有机体可以实现乙酰-CoA衍生产物的生物合成，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，导致细胞内浓度为约0.1-200mM或更高。通常，诸如1,3-BDO、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或MMA等乙酰-CoA衍生产物的细胞内浓度为约30-300mM，特别是约50-200mM，更具体而言，约70-150mM，包括约70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM或更高。也可以由本发明的非天然存在的微生物有机体实现这些示例性范围之间和高于其中每一个的细胞内浓度。
在一些实施方案中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性厌氧条件先前已有描述，并且在本领域中是众所周知的。用于发酵过程的示例性厌氧条件在本文中进行了描述，并且描述于例如2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。这些条件中的任何一个都可以与非天然存在的微生物有机体以及本领域公知的其他厌氧条件一起使用。在这类厌氧或基本厌氧条件下，乙酰-CoA衍生产物例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不包括限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，可以在5-10mM或更高的细胞内浓度以及本文举例说明的所有其他浓度下合成所需的乙酰-CoA衍生产物。理解的是，即使上述描述是指细胞内浓度，产生乙酰-CoA衍生产物的微生物有机体也可以在细胞内产生乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，和/或将产物分泌到培养基中。
除了本文公开的培养和发酵条件之外，用于实现例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物生物合成的生长条件，可以包括在培养条件中添加渗透保护剂。在某些实施方案中，在存在渗透保护剂的情况下，可以如本文所述维持、培养或发酵本发明的非天然存在的微生物有机体。简而言之，渗透保护剂是指充当渗透剂(osmolyte)并帮助本文所述的微生物有机体幸免于渗透胁迫的化合物。渗透保护剂包括但不限于甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖。此类的非限制性实例是甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基巯基丙酸(dimethylslfonioproprionate)、3-二甲基磺基-2-甲基丙酸酯、哌可酸、二甲基硫代乙酸(dimethylsulfonioacetate)、胆碱、L-肉碱和四氢嘧啶。一方面，渗透保护剂是甘氨酸甜菜碱。本领域普通技术人员理解，适合保护本文所述微生物有机体免受渗透胁迫的渗透保护剂的量和类型，将取决于所使用的微生物有机体。培养条件中渗透保护剂的量可以是，例如不超过约0.1mM、不超过约0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过超过约2.5mM，不超过约3.0mM，不超过约5.0mM，不超过约7.0mM，不超过约10mM，不超过约50mM，不超过约100mM或不超过约500mM。
培养条件可以包括例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所述，可以在厌氧或基本上厌氧的培养条件下获得本发明生物合成产物的特别有用的产率。
如本文所述，实现例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物生物合成的一种示例性生长条件，包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，可以在厌氧或基本厌氧条件下维持、培养或发酵本发明的非天然存在的微生物有机体。简而言之，厌氧条件是指没有氧的环境。基本上厌氧条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵，使得培养基中的溶氧浓度保持在饱和度的0％和10％之间。基本厌氧条件还包括在密封室内的液体培养基或固体琼脂上使细胞生长或休眠，该密封室保持氧气低于1％的气氛。例如，可以通过用N2/CO2混合物或其他合适的一种或多种非氧气体吹扫培养物来维持氧的百分比。
本文所述的培养条件可以按比例放大和连续生长，用于制造例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物。示例性生长程序包括例如补料分批发酵和分批分离、补料分批发酵和连续分离或连续发酵连续分离。所有这些方法在本领域中都是众所周知的。发酵程序特别适用于商业量的例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物的生物合成生产。通常并且与非连续培养程序一样，连续和/或接近连续生产例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，会包括在足以维持和/或几乎维持指数阶段生长的养分和培养基中，培养本发明的产生1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物的非天然存在的有机体。在这类条件下的连续培养可以包括例如生长1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。此外，连续培养可以包括1周、2、3、4或5周或更多周以及长达数月的更长时间段。或者，如果适合特定应用，可以将本发明的有机体培养数小时。应当理解，连续和/或近连续培养条件还可以包括这些示例性时间段之间的所有时间间隔。还应当理解，培养本发明的微生物有机体的时间是产生足够量的用于所需目的的产物的足够时间段。
发酵程序在本领域中是众所周知的。简而言之，发酵以生物合成产生例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，可以用于例如补料分批发酵和分批分离、补料分批发酵和连续分离、或连续发酵和连续分离中。分批和连续发酵程序的实例在本领域中是众所周知的。
上述发酵程序使用本发明的1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物生产者，连续产生大量1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，除此之外，如果需要的话，还可以使1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰基-CoA衍生产物生产者例如同时进行化学合成程序，以将产物转化为其他化合物，或者可以将产物与发酵培养物分离并依次进行化学转化，以将产物转化为其他化合物。
为了产生更好的生产者，可以利用代谢建模来优化生长条件。建模还可以用于设计额外优化途径利用的基因敲除(参见，例如，美国专利公开US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654和US2004/0009466，以及美国专利号7,127,379)。建模分析允许可靠地预测对细胞生长将新陈代谢转变为更有效地产生1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸或任何其他乙酰-CoA衍生产物的影响。
一种用于鉴别和设计有利于所需产物生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架(Burgard et al.,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。OptKnock是一种代谢建模和模拟程序，它提出导致基因稳定的微生物过度产生靶产物的基因缺失或破坏策略。具体来说，该框架检查微生物的完整代谢和/或生化网络，以提出迫使所需生化物质变为细胞生长的必需副产物的基因操作。通过战略性地放置的基因缺失或其他功能性基因破坏，将生化产生与细胞生长相偶联，在生物反应器中长时间后，对工程菌株施加的生长选择压力导致性能改善，这是强制性生长偶联生化生产的结果。最后，当构建基因缺失时，设计菌株恢复其野生型状态的可能性可以忽略不计，因为OptKnock选择的基因将从基因组中完全去除。因此，该计算方法可用于鉴别导致所需产物生物合成的替代途径，或与非天然存在的微生物有机体结合使用以进一步优化所需产物的生物合成。
简而言之，OptKnock是本文用来指代用于模拟细胞代谢的计算方法和系统的术语。OptKnock程序涉及将特定约束纳入通量平衡分析(FBA)模型的模型和方法框架。这些约束包括，例如定性动力学信息、定性调节信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock还例如通过收紧通过通量平衡模型得出的通量边界，然后在存在基因添加或缺失的情况下探测代谢网络的性能限制，计算各种代谢问题的解决方案。OptKnock计算框架允许构建允许有效查询代谢网络性能限制的模型公式，并提供解决由此产生的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢建模和模拟方法描述于例如2002年1月10日提交的美国公开2002/0168654、2002年1月10日提交的国际专利号PCT/US02/00660和2007年8月10日提交的美国专利号2009/0047719中，上述专利文献通过引用整体并入。
另一种用于鉴别和设计有利于产物的生物合成产生的代谢改变的计算方法是称为的代谢建模和模拟系统。这种计算方法和系统描述于例如2002年6月14日提交的美国公开2003/0233218和2003年6月13日提交的国际专利申请号PCT/US03/18838中。是一种计算系统，可用于在计算机上产生网络模型，并通过生物系统的化学反应模拟质量、能量或电荷的流动，以定义含有系统中化学反应的任何和所有可能功能的方案空间，从而确定生物系统允许的活动范围。这种方法称为基于约束的建模，因为方案空间由约束定义，例如所包含反应的已知化学计量以及与通过反应的最大通量相关的反应热力学和容量约束。可以询问由这些约束定义的空间，以确定生物系统或其生化成分的表型能力和行为。
这些计算方法与生物现实是一致的，因为生物系统是灵活的并且可以通过许多不同的方式达到相同的结果。生物系统是通过进化机制设计的，进化机制受到所有生命系统必须面对的基本约束的限制。因此，基于约束的建模策略包含了这些一般现实。此外，通过收紧约束不断对网络模型施加进一步限制的能力导致方案空间尺寸减小，从而提高了可以预测的生理性能或表型的精度。
鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将能够应用用于代谢建模和模拟的各种计算框架来设计和实施所需化合物在宿主微生物有机体中的生物合成。这类代谢建模和模拟方法包括，例如上文以和OptKnock举例说明的计算系统。为了说明本发明，本文参考用于建模和模拟的OptKnock计算框架描述了一些方法。本领域技术人员应当知道如何使用OptKnock将代谢改变的鉴别、设计和实施应用于本领域公知的任何此类其他代谢建模和模拟计算框架和方法。
上述方法会提供一组代谢反应来破坏。消除组内的每个反应或代谢修饰可能导致所需产物作为有机体生长阶段的必需产物。因为反应是已知的，所以双级OptKnock问题的方案也会提供一种或多种编码一种或多种催化反应组内每个反应的酶的相关基因。鉴别一组反应及其编码参与每个反应的酶的相应基因，通常是自动化过程，通过将反应与具有酶和编码基因之间的关系的反应数据库相关联来完成。
一旦鉴别，通过使至少一种编码该组内每个代谢反应的基因受到功能性破坏，在靶细胞或有机体中实施为了实现所需产物产生而要破坏的一组反应。实现反应组功能破坏的一种特别有用的方式是，使每个编码基因缺失。然而，在某些情况下，通过其他基因畸变，包括例如突变、调节区(例如调节因子的启动子或顺式结合位点)的缺失，或通过在多个位置中任一个位置处截短编码序列，来破坏反应可能是有益的。后面这些畸变，导致基因组总缺失较少，可能是有用的，例如，当需要快速评估产物的偶联时或当基因回复突变不太可能发生时。
为了鉴别上述双级OptKnock问题的其他生产性方案，该方案导致将破坏的其他反应组或可引起生物合成的代谢修饰，所述生物合成包括所需产物的生长偶联生物合成，可以实施称为整数切割(integer cut)的优化方法。该方法通过迭代求解上面举例说明的OptKnock问题继续进行，并在每次迭代中加入称为整数切割的其他约束。整数切割约束有效地阻止了求解程序选择在强制性地将产物生物合成与生长偶联的任何先前迭代中鉴别的完全相同的反应组。例如，如果先前鉴别的偶的生长偶联的代谢修饰指定反应1、2和3，用于进行破坏，则以下约束约束防止在后续方案中同时考虑相同的反应。整数切割方法在本领域中是公知的并且可以见于描述于例如Burgard et al.,Biotechnol.Prog.17:791-797(2001)。与本文描述的所有方法一样，参考它们与用于代谢建模和模拟的OptKnock计算框架的联合使用，在迭代计算分析中减少冗余的整数切割方法也可以与本领域公知的其他计算框架一起应用，包括例如
本文举例说明的方法允许构建以生物合成方式产生所需产物的细胞和有机体，包括将靶生化产物的产生与经工程改造含有鉴别的基因改变的细胞或有机体的生长强制性偶联。因此，本文所述的计算方法允许鉴别和实施通过选自OptKnock或的计算机方法鉴别的代谢修饰。该组代谢修饰可以包括例如添加一种或多种生物合成途径酶和/或一种或多种代谢反应的功能性破坏，包括例如通过基因缺失造成的破坏。
如上文所讨论的，OptKnock方法论的开发是在突变微生物网络在经历长时间的生长选择时可以向其计算预测的最大生长表型进化这一前提下进行的。换句话说，该方法利用了有机体在选择压力下自我优化的能力。OptKnock框架允许详尽枚举基因缺失组合，这些组合基于网络化学计量强制生化产生和细胞生长之间的偶联。最佳基因/反应敲除的鉴别需要双级优化问题的方案，所述方案选择活性反应组，使所得网络的最佳生长方案过量产生感兴趣的生化物质(Burgard et al.,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。
可以使用大肠杆菌代谢的计算机化学计量模型来鉴别代谢途径的必需基因，如先前举例说明和描述于例如美国专利公开US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654和US 2004/0009466，以及美国专利号7,127,379中。如本文所公开的，OptKnock数学框架可用于查明导致所需产物生长偶联产生的基因缺失。此外，双级OptKnock问题的方案仅提供一组缺失。为了列举所有有意义的方案，即所有导致生长偶联生产形成的敲除组，可以实施称为整数切割的优化技术。如上所讨论的，这需要迭代解决OptKnock问题，并在每次迭代中加入称为整数切割的其他约束。
如本文所提供的，本发明还提供具有降低副产物产生的基因改变(例如基因破坏)的非天然存在的微生物有机体，所述副产物例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物有机体包括乙酰乳酸合酶缺失。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶缺失包括ilvG缺失。
鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，为了引入代谢改变，例如酶促反应的破坏，有必要破坏一种或多种参与反应的酶的催化活性。或者，代谢改变可以包括酶活性或最大活性所必需的调节蛋白或辅因子表达的破坏。破坏可以通过多种方法发生，包括例如编码基因缺失或在一种或多种编码基因序列中掺入基因改变。靶向破坏的编码基因可以是一种、一些或全部编码参与催化活性的酶的基因。例如，当单一酶参与靶向催化活性时，破坏可以通过降低或消除编码基因产物的催化活性的基因改变来进行。类似地，当单一酶是多聚体，包括异聚体时，破坏可以通过降低或破坏编码基因产物的一个或所有亚基的功能的基因改变来进行。活性的破坏可以通过以下方式实现：丧失形成活性复合体所需的一个或多个亚基的结合活性，破坏多聚复合体的催化亚基，或两者。也可以靶向多聚体蛋白缔合和活性的其他功能，以破坏本发明的代谢反应。这样的其他功能对于本领域技术人员来说是众所周知的。类似地，可以通过破坏修饰和/或激活靶酶的蛋白质或酶的表达，例如，将脱辅基酶转化为全酶所需的分子，来降低或消除靶酶活性。此外，可以根据本发明破坏单一多肽或多聚复合体的一些或全部功能，以降低或消除一种或多种参与本发明的反应或代谢修饰的酶的催化活性。类似地，可以破坏一些或所有参与本发明的反应或代谢修饰的酶，只要靶向反应得以减少或消除即可。
鉴于本文提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，可以通过减少或消除由共同基因和/或由该基因的一种或多种表现出相似或基本相同活性的直系同源基因编码的反应，来破坏酶促反应。共同基因和所有直系同源基因的减少，可以导致靶向反应的任何催化活性完全消除。然而，共同基因或一种或多种直系同源基因的破坏可以导致靶向反应催化活性的减少足以促进生长与产物生物合成的偶联。本文举例说明了编码多种代谢修饰的催化活性的共同基因以及它们的直系同源基因。本领域技术人员将理解，可以在本发明的方法中实施对一些或所有编码靶向代谢反应的酶的基因的破坏，并将其并入本发明的非天然存在的微生物有机体中，以实现诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物的生产降低，以增强通过乙酰-CoA的碳通量。
在一些实施方案中，可以基于所需产物的生长偶联形成使用微需氧设计。为了检验这一点，可以通过以网络中可行的不同生物质形成率首先最大化然后最小化产物产量，为每种策略构建生产锥(production cone)。如果突变网络的所有可能表型的最右边边界是一个点，这意味着在网络中可能存在最大生物质形成率下，唯一的产品最佳产率。在其他情况下，可行表型的最右边边界是垂直线，表明在最大生物质点，网络可以制备计算范围内的任何量的产物，包括垂直线最底点处的最低量。此类设计的优先级较低。
在一些实施方案中，基因破坏可以包括完全基因缺失。在一些实施方案中，破坏基因的其他方法包括，例如，通过省略或添加寡核苷酸或通过使基因无法操作的突变进行移码。然而，本领域技术人员将认识到基因缺失的优点，因为它赋予非天然存在的有机体稳定性，防止回复到未发生基因破坏的亲本表型性。特别是，基因破坏选自本文公开的基因组。
一旦计算预测了用于破坏的基因组，以减少副产物，例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，则可以构建、进化和测试菌株。通过本领域公知的方法将基因破坏，包括基因缺失，引入宿主有机体。如本文所公开的，特别有用的基因破坏方法是通过同源重组进行。
可以通过测量生长率、底物摄取率和/或产物/副产物分泌率来表征工程菌株。培养物可以生长并用作在指数生长期间进行测量的新鲜分批培养物的接种体。可以通过使用分光光度计(A600)测量光密度来测定生长率。培养上清液中葡萄糖和其他有机酸副产物的浓度，如本文所公开的，可以通过诸如HPLC、GC-MS等公知方法或其他众所周知的适合分析所需产物的分析方法来测定，并用于计算摄取率和分泌率。
含有基因破坏的菌株可能会表现出次优的生长率，直到它们的代谢网络已经适应了它们缺失的功能。为了帮助进行这种适应，可以对菌株进行自适应进化。通过对菌株进行自适应进化，细胞生长率成为主要的选择压力，突变细胞被迫重新分配它们的代谢通量以提高它们的生长率。最近已经证明了几种E.coli突变体的这种新陈代谢重编程，这些突变体已经在各种底物上进行了自适应进化以达到通过计算机模型先验预测的生长率(Fongand Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004))。自适应进化带来的生长改善伴随着提高的[INSERT PRODUCT(插入产品)]生产率。通常在平行运行的复制品中对菌株进行自适应进化，以解释宿主有机体可能表现出的进化模式差异(Fong and Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004)；Fong et al.,J.Bacteriol.185:6400-6408(2003)；Ibarra et al.,Nature 420:186-189(2002))，所述差异可能潜在地导致一种菌株具有优于其他菌株的生产质量。进化可以运行一段时间，通常为2-6周，具体取决于所获得的生长改善率。一般来说，一旦获得稳定的表型，就会停止进化。
在自适应进化过程之后，通过测量生长率、底物吸收率和产物/副产物分泌率再次表征新菌株。通过对实际生长和产量以及代谢建模的生产包络一起作图，将这些结果与理论预测进行比较。选择最成功的设计/进化组合以进一步探讨，并在实验室规模的分批和连续发酵中表征。本文公开的方法(例如OptKnock方法)背后的生长偶联生化产生概念也应当导致产生遗传上稳定的过度生产者。因此，将培养物以连续模式维持较长时间，例如一个月或更长时间，以评估长期稳定性。可以定期取样以确保保持产率和生产力。
自适应进化是一种强大的技术，可用于提高突变或工程微生物菌株或在非自然环境条件下生长的野生型菌株的生长率。它对于通过OptKnock等方法设计的菌株特别有用，这可导致生长偶联产物形成。因此，向最佳生长菌株的进化也将间接优化生产。通过基因敲除和自适应进化创造了大肠杆菌K-12MG1655的独特菌株(Fong and Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004))。在这项工作中，通过在达到稳定期之前将分批培养物连续传代到新鲜培养基中，将所有自适应进化培养物都保持在长期指数生长，从而使生长率作为主要选择压力。构建敲除菌株，并使其在补充有不同碳底物(对于每个敲除菌株，四种碳底物)的基本培养基上进化。进化培养物一式两份或一式三份进行，总共得到50个进化敲除菌株。将进化培养物保持指数生长，直到达到稳定的生长率。在所检查的50个案例的38个中预测敲除菌株的进化后生长率时，计算预测是准确的(在10％以内)。此外，OptKnock设计与自适应进化的组合导致了乳酸生产菌株的改善。(Fong et al.,Biotechnol.Bioeng.91:643-648(2005))。类似的方法可以应用于本文公开的菌株并应用于各种宿主菌株。
有许多已开发的技术可用于进行自适应进化。本文公开了示例性方法。在一些实施方案中，本发明的诸如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇等副产物减少的非天然存在的有机体的优化，包括利用自适应进化技术来增强通过乙酰-CoA的碳通量，并由此增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA，以增加生产菌株的产量和/或稳定性。
系列培养涉及将小量生长培养物重复转移到含有新鲜生长培养基的大得多的容器中。当培养的有机体在新容器中生长到饱和时，重复该过程。在文献(Lenski andTravisano,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6808-6814(1994))中在实验中该方法已用于实现最长的持续培养的演示，所述实验清楚地证明了繁殖率在数年内的不断改善。通常，培养物的转移通常在指数期进行，因此每天精确计算转移量以在接下来的24小时内保持指数生长。手动连续稀释成本低且易于平行化。
在连续培养中，恒化器中细胞的生长代表了极端的稀释情况，其中保留了非常高比例的细胞群。随着培养物的生长和饱和，一小部分生长的培养物被新鲜培养基替代，从而使培养物在接近其最大种群规模的情况下持续生长。恒化器已用于证明繁殖率的短期快速改善(Dykhuizen，Methods Enzymol.613-631(1993))。这些设备的潜在有用性得到了认可，但由于无意选择了抗稀释(静态)变体，传统的恒化器无法维持长时间对提高的繁殖率的选择。这些变体能够通过粘附到恒化器表面来抵抗稀释，并且通过这样做，在竞争中胜过粘附性较低的个体，包括那些具有较高繁殖率的个体，从而排除了设备的预期目的(Chao andRamsdell,J.Gen.Microbiol 20:132-138(1985))。一种克服这一缺点的可能方法是，实施具有两个生长室的设备，该设备，如前所述(Marliere and Mutzel,U.S.Patent No.6,686,194)，定期经历瞬时杀菌阶段。
EvolugatorTM是由Evolugate,LLC(Gainesville,FL)开发的连续培养设备，与传统进化技术相比，它表现出显著的时间和精力节省(de Crecy et al.,.Appl.Microbiol.Biotechnol.77:489-496(2007))。在达到稳定期之前，通过将分批培养物系列传代到新鲜培养基中，使细胞保持在长时间的指数生长。通过自动化光密度测量和液体处理，EvolugatorTM可以使用大培养提及以高速率进行系列转移，从而在细胞适应度进化中接近恒化器的效率。例如，缺乏翻译元件(translation apparatus)成分并严重阻碍生长的不动杆菌(Acinetobacter)ADP1突变体在200代中进化到野生型生长率的80％。然而，与将细胞保持在单个容器中的恒化器相比，该机器通过在一卷管子的细分区域中从一个“反应器”移动到下一个“反应器”来运行，从而消除了对壁生长的任何选择。传输体积可调，通常设置为约50％。该设备的缺点是大且昂贵，因此并行运行大量进化是不切实际的。此外，气体添加没有得到很好的调节，并且当前的设备配置未维持严格的厌氧条件。然而，这是自适应性进化生产菌株的替代方法。
如本文所公开的，可以将编码所需酶活性的核酸引入到宿主有机体中，所述酶降低不需要的副产物，例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以增强通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不包括限于，4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。在一些情况下，可能需要修饰降低不需要的副产物或蛋白质的酶或蛋白质的活性，以增加通过乙酰-CoA的碳通量，从而增加乙酰-CoA衍生产物，例如1,3-BDO、MMA、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯，或任何其他乙酰-CoA衍生产物，包括但不限于4OH2B、3HB、己二酸、己内酰胺、6-ACA、HMDA或MAA。例如，可以将增加蛋白质或酶活性的已知突变引入编码核酸分子中。另外，可以应用优化方法来增加酶或蛋白质的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调节剂的活性。
一种这样的优化方法是定向进化。定向进化是一种强大的方法，它涉及引入靶向具体基因的突变，以改善和/或改变酶的特性。改善和/或改变的酶可以通过开发和实施敏感的高通量筛选试验来鉴别，该试验允许自动筛选许多酶变体(例如，>104)。通常进行迭代轮次的诱变和筛选，以提供具有优化特性的酶。还开发了有助于鉴别诱变基因区的计算算法，并且该算法可以显著减少需要生成和筛选的酶变体的数量。已经开发了许多有效创建不同变体文库的定向进化技术(有关综述，请参见Hibbert et al.,Biomol.Eng 22:11-19(2005)；Huisman and Lalonde,In Biocatalysis in the pharmaceutical andbiotechnology industries pgs.717-742(2007),Patel(ed.),CRC Press；Otten andQuax.Biomol.Eng 22:1-9(2005)；和Sen et al.,Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007))，并且这些方法已成功应用于改善许多酶类的广泛特性。已通过定向进化技术改善和/或改变的酶特性包括，例如：选择性/特异性，用于转化非天然底物；温度稳定性，用于稳健的高温处理；pH稳定性，用于较低或较高pH条件下进行生物加工；底物或产物耐受性，从而可以实现高产物效价；结合(Km)，包括扩大底物结合以包括非天然底物；抑制(Ki)，以去除产物、底物或关键中间体的抑制；活性(kcat)，以增加酶促反应速率，从而达到所需的通量；表达水平，以增加蛋白质产率和整体通路通量；氧气稳定性，用于在有氧条件下运行空气敏感酶；和厌氧活性，用于在没有氧气的情况下运行需氧酶。
已经开发了许多示例性方法用于基因的诱变和多样化以靶向具体酶的所需特性。这样的方法是本领域技术人员公知的。这些方法中的任何一种都可以用于改变和/或优化降低不需要的副产物的酶或蛋白质的活性，所述副产物为例如丙酮酸副产物(例如丙氨酸和/或缬氨酸)、TCA衍生副产物、乙酸和/或乙醇，以于增强通过乙酰-CoA的碳通量。此类方法包括但不限于EpPCR，其通过降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度引入随机点突变(Pritchard et al.,J Theor.Biol.234:497-509(2005))；易错滚环扩增(epRCA)，与epPCR相似，不同之处在于使用完整的环状质粒作为模板，并使用在最后2个核苷酸上具有外切核酸酶抗性硫代磷酸酯键的随机6-mer扩增质粒，然后转化到细胞中，质粒在细胞内以串联重复再环化(Fujii et al.,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；和Fujii et al.,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))；DNA或家族改组，其通常涉及用核酸酶(例如Dnase I或EndoV)消化两种或多种变异基因，以生成随机片段池，这些片段在DNA聚合酶存在下通过退火和延伸循环重新组装，以创建嵌合基因文库(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751(1994)；和Stemmer,Nature 370:389-391(1994))；交错延伸(StaggeredExtension,StEP)，其需要模板引发，然后重复循环2步PCR，变性和非常短的退火/延伸持续时间(短至5秒)(Zhao et al.,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))；随机引发重组(Random Priming Recombination,RPR)，其中随机序列引物用于生成许多与模板不同片段互补的短DNA片段(Shao et al.,Nucleic Acids Res 26:681-683(1998))。
其他方法包括异源双链重组(Heteroduplex Recombination)，其中线性质粒DNA用于形成通过错配修复而修复的异源双链(Volkov et al,Nucleic Acids Res.27:e18(1999)；和Volkov et al.,Methods Enzymol.328:456-463(2000))；过渡模板随机嵌合生成(Random Chimeragenesis on Transient Templates,RACHITT)，其采用单链DNA(ssDNA)的Dnase I片段化和尺寸分级(Coco et al.,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))；截短模板重组延伸(Recombined Extension on Truncated template,RETT)，其需要在存在用作模板池的单向ssDNA片段的情况下从引物进行单向生长链的模板转换(Lee et al.,J.Molec.Catalysis 26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因改组(DegenerateOligonucleotide Gene Shuffling,DOGS)，其中简并引物用于控制分子之间的重组(Bergquist and Gibbs,Methods Mol.Biol 352:191-204(2007)；Bergquist et al.,Biomol.Eng 22:63-72(2005)；Gibbs et al.,Gene 271:13-20(2001))；用于创建杂合酶的增量截短(Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzyme,ITCHY)，其创建了一个组合文库，其中感兴趣的基因或基因片段缺失1个碱基对(Ostermeier et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:3562-3567(1999)；和Ostermeier et al.,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))；用于产生杂合酶的硫代增量截短(Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzyme,THIO-ITCHY)，其与ITCHY相似，不同之处在于硫代磷酸酯dNTP用于生成截短(Lutz et al.,Nucleic AcidsRes 29:E16(2001))；SCRATCHY，其结合了两种重组基因的方法，即ITCHY和DNA改组(Lutzet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:11248-11253(2001))；随机漂移诱变(Random DriftMutagenesis,RNDM)，其中通过epPCR产生突变，随后筛选/选择那些保留可用活性的突变(Bergquist et al.,Biomol.Eng.22:63-72(2005))；序列饱和诱变(Sequence SaturationMutagenesis,SeSaM)，其是随机诱变方法，使用硫代磷酸酯核苷酸的随机掺入和切割生成随机长度片段池，其用作模板，以在肌苷等“通用”碱基的存在下进行延伸，以及含肌苷补体的复制产生随机碱基掺入，因此产生诱变(Wong et al.,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong et al.,Nucleic Acids Res.32:e26(2004)；和Wong et al.,Anal.Biochem.341:187-189(2005))；合成改组，其使用经设计编码“靶标中所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸，并允许改组后代具有非常高的多样性(Ness et al.,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002))；核苷酸交换和切除技术(Nucleotide Exchange and Excision Technology,NexT)，其利用dUTP掺入组合，然后用尿嘧啶DNA糖基化酶处理，然后用哌啶处理来进行终点DNA片段化(Muller et al.,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。
进一步的方法包括序列同源性非依赖性蛋白质重组(Sequence Homology-Independent Protein Recombination,SHIPREC)，其中使用接头促进两个远缘相关或不相关基因之间的融合，并在两个基因之间产生一系列嵌合体，从而产生单交换杂合体文库(Sieber et al.,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))；基因位点饱和诱变TM(Gene SiteSaturation MutagenesisTM)(GSSMTM)，其中起始材料包括超螺旋双链DNA(dsDNA)质粒，该质粒含有插入片段和在所需突变位点简并的两个引物(Kretz et al.,MethodsEnzymol.388:3-11(2004))；组合盒诱变(Combinatorial Cassette Mutagenesis,CCM)，其涉及使用短寡核苷酸盒来替换具有大量可能的氨基酸序列改变的有限区域(Reidhaar-Olson et al.Methods Enzymol.208:564-586(1991)；和Reidhaar-Olson et al.Science241:53-57(1988))；组合多重盒式诱变(Combinatorial Multiple CassetteMutagenesis,CMCM)，其本质上与CCM相似，并以高突变率使用epPCR来鉴别热点和热点区，然后通过CMCM延伸以覆盖蛋白质序列空间的定义区域(Reetz et al.,Angew.Chem.Int.EdEngl.40:3589-3591(2001))；突变株技术，其中条件性ts突变质粒利用编码DNA聚合酶III突变亚基的mutD5基因，在选择过程中允许以随机和自然突变频率增加20至4000-X，并在不需要选择时阻止有害突变的积累(Selifonova et al.,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))；Low et al.,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996))。
其他示例性方法包括精确诱变(Look-Through Mutagenesis,LTM)，其是评估和优化所选氨基酸的组合突变的多维诱变方法(Rajpal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:8466-8471(2005))；基因重组装(Gene Reassembly)，其是DNA改组方法，可以一次应用于多种基因或创建单个基因的大型嵌合体(多个突变)文库(Verenium Corporation提供的Tunable GeneReassemblyTM(TGRTM)Technology)；计算机蛋白质设计自动化(in SilicoProtein Design Automation,PDA)，其是优化算法，可锚定具有特定折叠的结构明确的蛋白质骨架，并搜索可以稳定折叠和整体蛋白质能量的氨基酸取代序列空间，并且通常对于具有已知三维结构的蛋白质最有效工作(Hayes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:15926-15931(2002))；和迭代饱和诱变(Iterative Saturation Mutagenesis,ISM)，其涉及使用结构/功能知识来选择改善酶的可能位点，使用例如Stratagene QuikChange(Stratagene；San Diego CA)等诱变方法在所选位点进行饱和诱变，筛选/选择所需特性，并且使用改善的克隆，在另一个位点重新开始，并继续重复，直到实现所需的活性(Reetzet al.,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；和Reetz et al.,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006))。任何上述诱变方法都可以单独或以任何组合使用。此外，如本文所述，定向进化方法中的任何一种或组合都可以与自适应进化技术结合使用。
6.实施例
实施例I
乙酰乳酸合酶的衰减提高了,3-丁二醇(1,3-BDO)的效价、速率和产率
以下实施例表明缬氨酸生物合成酶乙酰乳酸合酶(ilvG)的衰减提高了1,3-丁二醇(1,3-BDO)的效价、速率和产率。培养表达nadK和pntAB的大肠杆菌菌株L16375和表达nadK和pntAB并具有ilvGM操纵子缺失的大肠杆菌菌株L16410和L16411，并测量1,3-BDO的产生。
使用标准技术在2.5mL、2.0mL或1.5mL培养基中以每分钟300标准立方厘米(sccm)的流速在100％空气下培养三种不同的细菌菌株(L16410、L16411和L16375)，功率为48WP。将培养物在400rpm下孵育24小时，起始OD为0.4。
表1
菌株 详情
L16375 ECh-10481(ECh-10437p108-pntAB-p115-nadK)
L16410 ECh-10488(ECh-10452,ΔilvGM,p115-nadK-pntAB)
L16411 ECh-10489(ECh-10481,ΔilvGM,p108-pntAB-p115-nadK)
结果表明，在特异性1,3-BDO产生(图1A)、速率(图1B)和产率[c-mol％](图1C)方面，ilvGM缺失菌株(L16410和L16411)的表现好于对照(L16375)，与传氧速率(OTR)无关。此外，多种细菌菌株中缬氨酸水平与1,3-BDO水平的比较表明，缬氨酸产生与1,3-BDO产率之间存在反比关系(图2A)。与这些结果一致，对于每个培养体积，ilvGM缺失菌株(L16410和L16411)的缬氨酸水平可忽略不计(图2B)，并且1,3-BDO水平增加(图2C)。具体而言，缬氨酸的减少转化为1,3-BDO产率增加约1.0-2.5[c-mol％](图2C)。
总的来说，这些结果表明缬氨酸生物合成酶的衰减降低了缬氨酸水平，这转化为1,3-BDO产率增加。
实施例II
对乙醛而非R-3-羟基丁醛具有特异性活性的醛脱氢酶在乙醛再循环回路中的用 途
以下实施例证明，对乙醛具有特异性的醛脱氢酶可用于乙醛再循环回路中以减少乙酰-CoA副产物乙酸和/或乙醇的水平。如图3所示，产生1,3-BDO的示例性途径涉及硫解酶(例如THL)、乙酰乙酰-CoA还原酶(例如PhaB)、CoA依赖性醛脱氢酶(例如ALD)和醇脱氢酶(例如ADH)。然而，乙酰-CoA也可以通过ALD转化为乙醛，乙醛可以通过ADH转化为乙醇，这限制了可用于产生1,3-BDO的乙酰-CoA的量。为了减少乙醇和乙醛副产物，本发明人设计了外源再循环回路，该回路可通过醛脱氢酶(例如AldB)将乙醛转化为乙酸，并通过乙酰-CoA合酶(例如，ACS)将乙酸转化回乙酰-CoA。然而，如图4所示，某些醛脱氢酶可以作用于3HB-醛以及乙醛。
为了鉴别对乙醛具有选择性的醛脱氢酶，使用三种不同的醛底物测量所选AldB候选物的裂解物活性：乙醛(AcAld)和R-3-羟基丁醛(R-3HBuAld)，以测量醛的选择性。
结果表明，可以鉴别出对乙醛而不是对3-HB醛具有特异性活性的特异性AldB酶(图5)。
实施例III
在乙醛再循环回路中包括乙酰-CoA合成酶变体增加了1,3-BDO的产生
以下实施例证明，乙醛再循环回路中乙酰-CoA合酶变体的表达增加了1,3-BDO的产生。在三种不同Ald表达菌株背景中分析了乙酰-CoA合酶变体(ACS*)的添加：L16768(仅Ald)、L16933(Ald+pntAB和NadK)和L17786(带有NadK变体的Ald)。
表2：
Ald ACS* NadK*
L16768 714UC
L16946 714UC X
L16933 714AIX
L17662 714AIX X
L17786 714AIX X
L17787 714AIX X X
比较途径产物和碳-3:碳-2节点之间的碳分布表明，相对于L16768和L17787菌株，ACS*的表达分别改善了L16946和L17787菌株中1,3-BDO的产生(图6A)。此外，ACS*表达显著减少了乙酸，但没有减少乙醇的形成，这表明乙酸再循环与CoA水解酶有效竞争(图6B)。与碳分布一致，总体产物分布证明，相对于不表达ACS*的菌株(图7A)和(图7B)，ACS*的表达显著减少了副产物(图7C)并增加了1,3-BDO的产生(图7D)。
总之，这些结果证明，乙酰-CoA合酶变体(ACS*)的外源表达可以通过特异性减少乙酸水平来降低副产物的产生并增加1,3-BDO的产生。
实施例IV
在乙醛再循环回路中包括乙酰-CoA合成酶变体增加了1,3-BDO的产生
以下实施例证明，乙酰-CoA合酶变体和醛脱氢酶的共表达作为乙醛再循环回路的一部分在不同菌株背景中可以降低乙酸和乙醇副产物水平，并增加1,3-BDO的产生。
在两种不同的Ald表达菌株背景中测试了ACS*和AldB 2886B表达的影响。比较具有或不具有ACS*和AldB2886B共表达的菌株证明，ACS*和AldB表达显著减少了乙酸和乙醇的产生(图8)。此外，两种菌株之间的总体碳2(即乙醇和乙酸)减少相似。
表3:
Ald ACS* AldB
L16768 714UC
L16948 714UC X p115-2886B(质粒)
L16933 714AIX
L17663 714AIX X p108-2886B(质粒)
使用不同的AldB候选物AldB 1139A(图9A和图9B)获得了类似的结果。比较超表达ACS*和可替代的AldB候选物(AldB 1139A)的菌株，在有或没有NadK变体(NadK*)的情况下，相对于其各自没有ACS*和AldB超表达的对照菌株，导致1,3-BDO增加(图9A)和乙醇和乙酸降低(图9B)。
表4:
Ald ACS* AldB NadK*
L16933 X
L17674 X X X
L17786 X X
L17892 X X X X
实施例V
包括丙氨酸再循环回路减少丙氨酸
以下实施例证明，D-氨基酸脱氢酶(dadA)和丙氨酸消旋酶(dadX)的共表达作为丙氨酸再循环回路的一部分降低了丙氨酸副产物水平，并增加了示例性乙酰-CoA衍生产物1,3-BDO的水平。
当碳从丙酮酸转到丙氨酸代谢时，从丙酮酸到乙酰-CoA的碳通量会受到限制。为了测试不需要的丙氨酸副产物是否可以再循环回丙酮酸，在大肠杆菌中超表达编码D-氨基酸脱氢酶(dadA)和丙氨酸消旋酶(dadX)的核酸，从而创建丙氨酸再循环回路(图10)。发酵后，比较了具有D-氨基酸脱氢酶(dadA)和丙氨酸消旋酶(dadX)的有机体与没有D-氨基酸脱氢酶(dadA)和丙氨酸消旋酶(dadX)的对照有机体之间的丙氨酸浓度。结果表明，D-氨基酸脱氢酶(dadA)和丙氨酸消旋酶(dadX)的超表达在发酵过程结束时使丙氨酸浓度显著减少了约43％(图11B、图11C和表5)。因此，D-氨基酸脱氢酶(dadA)和丙氨酸消旋酶(dadX)的外源表达可以生成可以减少有机体内丙氨酸水平的丙氨酸再循环回路。
表5:
D-Ala L-Ala 总Ala L-Ala/D-Ala之比
对照 2.34 6.09 8.43 2.60
dadA+dadX 1.91 3.76 5.67 1.97
对L-和D-形式的丙氨酸的分析表明，丙氨酸再循环回路减少L-丙氨酸部分的程度比减少D-丙氨酸部分的程度大(图11B和表5)。与减少的L-丙氨酸部分一致，L-丙氨酸/D-丙氨酸之比在表达丙氨酸再循环回路的有机体中也减小(图11B和表5)。
重要的是，在多个曝气参数中检测到表达丙氨酸再循环回路的有机体中丙氨酸浓度减少，而不影响其他产物，包括丙酮酸或1,3BG(图11A)。
综上所述，这些结果证明，丙氨酸再循环回路，涉及D-氨基酸脱氢酶(dadA)和丙氨酸消旋酶(dadX)的共表达，能够减少不需要的副产物丙氨酸。
实施例VI
柠檬酸合酶变体降低了TCA循环衍生副产物并增加了1,3-BDO
以下实施例证明，柠檬酸合酶变体的表达降低了不需要的三羧酸(TCA)循环衍生副产物，并增加了示例性乙酰-CoA衍生产物1,3-BDO的水平。
柠檬酸合酶是通过转化乙酰-CoA和草酰乙酸形成柠檬酸来催化TCA的第一步的酶，并且是将碳通量从乙酰-CoA拉向诸如1,3-BDO、脂肪酸甲酯或其他延长链产物等其他产物的关键酶(图12)。因此，柠檬酸合酶产生不需要的TCA循环衍生副产物。
柠檬酸合酶可以被NADH强烈且特异性地抑制，据报道，柠檬酸合酶变体(gltAR109L)对NADH的敏感性增加(参见Stokell et al.,J.Biol.Chem,2003；278(37):35435-35443)。因此，为了测试抑制柠檬酸合酶是否可以降低不需要的三羧酸(TCA)循环衍生副产物并增加1,3-BDO的产生，在大肠杆菌中表达外源gltA R109L。
在超表达柠檬酸合酶变体(gltA R109L)后对示例性乙酰-CoA衍生产物1,3-BDO的测量揭示，柠檬酸合酶变体增加了1,3-BDO的效价(图13B)。此外，在表达柠檬酸合酶变体(gltA R109L)的微生物中产生了较低的TCA循环衍生副产物。值得注意的是，表达柠檬酸合酶变体(gltA R109L)的微生物也具有快速的微需氧转变(图13A)。
总之，这些结果证明，柠檬酸合酶变体能够减少不需要的TCA循环衍生副产物的产生，并增加乙酰-CoA衍生产物(例如1,3-BDO)的效价。
在本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容，包括GenBank和GI号公开，据此通过引用并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属的现有技术。尽管已经参考上文提供的实例描述了本发明，但是应当理解可以在不背离本发明的精神的情况下进行各种修改。

Claims (48)

1.副产物减少的非天然存在的微生物有机体，包括具有糖酵解途径和增加的通过乙酰-CoA的碳通量的微生物有机体，所述微生物有机体包含以下中的一种或多种：
(a) 衰减的乙酰乳酸合酶；
(b) 外源乙醛再循环回路；
(c) 外源丙氨酸再循环回路；和
(d) 柠檬酸合酶变体，所述柠檬酸合酶变体包括与野生型柠檬酸合酶相比增加的对NADH的敏感性，
其中所述外源乙醛再循环回路包括编码醛脱氢酶和乙酰-CoA合酶的至少一种外源核酸，
其中所述外源丙氨酸再循环回路包含编码至少D-氨基酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的丙氨酸循环回路酶的至少一种外源核酸，并且
其中所述副产物减少是包含(a)至(d)中的所述一种或多种的所述微生物有机体的结果。
2.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述衰减的乙酰乳酸合酶包括表达减少的乙酰乳酸合酶。
3.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述衰减的乙酰乳酸合酶包括乙酰乳酸合酶的缺失。
4.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述衰减的乙酰乳酸合酶包括非功能性乙酰乳酸合酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述乙酰乳酸合酶是ilvG。
6.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中与具有野生型乙酰乳酸合酶的微生物有机体相比，所述衰减的乙酰乳酸合酶降低缬氨酸的生物合成。
7.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述醛脱氢酶由aldB编码。
8.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述乙酰-CoA合酶是乙酰-CoA合酶变体。
9.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中编码醛脱氢酶或乙酰-CoA合酶的所述至少一种外源核酸是异源核酸。
10.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述非天然存在的微生物有机体具有减少的乙酸、乙醇或其组合。
11.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中编码D-氨基酸脱氢酶或丙氨酸消旋酶的所述至少一种外源核酸是异源核酸。
12.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述D-氨基酸脱氢酶由dadA编码。
13.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述丙氨酸消旋酶由dadX编码。
14.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中与没有所述外源丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，所述非天然存在的微生物有机体具有减少的丙氨酸浓度。
15.根据权利要求14所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述减少的丙氨酸浓度是减少的L-丙氨酸浓度。
16.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中与没有所述外源丙氨酸再循环回路的微生物有机体相比，所述非天然存在的微生物有机体具有减小的L-丙氨酸与D-丙氨酸之比。
17.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述柠檬酸合酶变体是II型柠檬酸合酶。
18.根据权利要求17所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述柠檬酸合酶变体以比野生型柠檬酸合酶大的亲和力结合NADH。
19.根据权利要求17或18所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述柠檬酸合酶变体包含至少一种外源核酸，其由gltA R109L编码。
20.根据权利要求19所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
21.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中与具有野生型柠檬酸合酶的微生物有机体相比，所述非天然存在的微生物有机体具有减少的三羧酸循环(TCA)循环衍生副产物和/或增加的乙酰-CoA衍生产物。
22.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述非天然存在的微生物有机体在基本上厌氧的培养基中。
23.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，进一步包含1,3-丁二醇(1,3-BDO)途径、(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径、3-羟基丁酰-辅酶A (3HB-CoA)途径、甲基丙烯酸甲酯(MMA)途径、己二酸途径、己内酰胺途径、6-氨基己酸(6-ACA)途径、六亚甲基二胺(HMDA)途径或甲基丙烯酸(MAA)途径。
24.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物包含1,3-BDO途径。
25.根据权利要求24所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述1,3-BDO途径包含硫解酶；CoA依赖性、醛形成性的乙酰乙酰-CoA还原酶；酮还原性的3-氧代丁醛还原酶；3-羟基丁醛还原酶； CoA依赖性、醇形成性的乙酰乙酰-CoA还原酶；醛还原性的3-氧代丁醛还原酶；4-羟基,2-丁酮还原酶；酮还原性的乙酰乙酰-CoA还原酶；醛形成性的3-羟基丁酰-CoA还原酶；和醇形成性的3-羟基丁酰-CoA还原酶。
26.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径。
27.根据权利要求26所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯途径包含硫解酶；(3R)-羟基丁基(3R)-羟基丁酸酯形成酶；(3R)-羟基丁酰-CoA:(R)-1,3-丁二醇醇转移酶；(3R)羟基丁基3-氧代丁酸酯形成酶；乙酰乙酰-CoA:(R)-1,3-丁二醇醇转移酶；(3R)-羟基丁基3-氧代丁酸还原酶；(3R)-羟基丁酰基-ACP:(R)-1,3-丁二醇酯合酶和乙酰乙酰基-ACP:(R)-1,3-丁二醇酯合酶。
28.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含3HB-CoA途径。
29.根据权利要求28所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述3HB-CoA途径包括乙酰-CoA硫解酶和3-羟基丁酰-CoA脱氢酶。
30.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含MMA途径。
31.根据权利要求30所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述MMA途径包含：
(a) 4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、2-羟基异丁酰-CoA脱水酶和甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶；或
(b) 4-羟基丁酰-CoA脱水酶、巴豆酸酶、2-羟基异丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和2-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
32.根据权利要求31所述的非天然存在的微生物有机体，进一步包含第二MMA途径，其包含：
(c) 甲基丙烯酸(MAA)-CoA:甲醇转移酶、4-羟基丁酰-CoA变位酶和3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；或
(d) 4-羟基丁酰-CoA变位酶、3-羟基异丁酰-CoA:甲醇转移酶和3-羟基异丁酸甲酯脱水酶。
33.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含6-ACA途径。
34.根据权利要求33所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述6-ACA途径包含2-氨基-7-氧代辛二酸酮酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶、2-氨基-7-氧代庚酸氧化还原酶、2-氨基庚二酸脱羧酶、6-氨基己醛氧化还原酶、2-氨基-7-氧代庚酸脱羧酶或2-氨基-7-氧代辛二酸氨基酸脱羧酶。
35.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含己内酰胺途径。
36.根据权利要求35所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述己内酰胺途径包含3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、醛形成性的己二酰-CoA还原酶、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶和6-氨基己酰-CoA合酶。
37.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含己二酸途径。
38.根据权利要求37的非天然存在的微生物有机体，其中所述己二酸途径包含3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、己二酰-CoA水解酶、己二酰-CoA连接酶、己二酰-CoA转移酶和磷酸己二酰转移酶/己二酸激酶。
39.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含六亚甲基二胺(HMDA)途径。
40.根据权利要求39所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述六亚甲基二胺(HMDA)途径包含3-氧代己二酰-CoA硫解酶、3-氧代己二酰-CoA还原酶、3-羟基己二酰-CoA脱水酶、5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶、醛形成性的己二酰-CoA还原酶、6-氨基己酸转氨酶、6-氨基己酸脱氢酶、6-氨基己酰-CoA/酰基-CoA转移酶、6-氨基己酰-CoA合酶、醛形成性的6-氨基己酰-CoA还原酶、HMDA转氨酶和HMDA脱氢酶。
41.根据权利要求23所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体包含MAA途径。
42.根据权利要求41所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述MAA途径包含：
(a) (i) 琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii) 甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)甲基丙二酰-CoA差向异构酶；(iv) 醛形成性的甲基丙二酰-CoA还原酶；(v) 甲基丙二酸半醛还原酶；和(vi) 3-羟基异丁酸脱水酶；
(b) (i) 琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii) 甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)醛形成性的甲基丙二酰-CoA还原酶；(iv) 甲基丙二酸半醛还原酶；和(v) 3-羟基异丁酸脱水酶；或
(c) (i) 琥珀酰-CoA转移酶、连接酶或合成酶；(ii) 甲基丙二酰-CoA变位酶；(iii)醇形成性的甲基丙二酰-CoA还原酶；和(iv) 3-羟基异丁酸脱水酶。
43.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物有机体，其中所述微生物有机体是细菌的种。
44.在非天然存在的微生物中增强通过乙酰-CoA的碳通量以增加乙酰-CoA衍生产物产率的方法，所述方法包括在产生乙酰-CoA衍生产物的条件下和持续足够的时间段内培养权利要求1-43中任一项所述的非天然存在的微生物有机体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述乙酰-CoA衍生产物选自由以下组成的组：1,3-丁二醇(1,3-BDO)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、3R-羟基丁酸-3R-羟基丁酸、3-羟基丁酸(3-HB)、4-羟基-2-丁酮(4OH2B)、六亚甲基二胺(HMDA)、己内酰胺、己二酸、6-氨基己酸(6-ACA)和甲基丙烯酸(MAA)。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述乙酰-CoA衍生产物包括1,3-BDO。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述乙酰-CoA衍生产物包括MMA。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述乙酰-CoA衍生产物包括3R-羟基丁酸-3R-羟基丁酸。
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