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CN114703237A - 基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法 - Google Patents

基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法 Download PDF

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CN114703237A
CN114703237A CN202210235851.9A CN202210235851A CN114703237A CN 114703237 A CN114703237 A CN 114703237A CN 202210235851 A CN202210235851 A CN 202210235851A CN 114703237 A CN114703237 A CN 114703237A
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straw
acid
fermentation
treatment
base composite
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CN202210235851.9A
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王勇
霍凯
张俊郁
赵素娟
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Hebei University of Science and Technology
Original Assignee
Hebei University of Science and Technology
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Abstract

本发明适用于秸秆发酵技术领域，公开了一种基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法。该方法是经秸秆前处理、秸秆渣酸碱复合预处理、秸秆汁水解、发酵及固液分离等步骤，制备活菌饲料及L‑乳酸，实现秸秆基质全利用。本发明对秸秆基质中固液相分别处理，通过酸碱复合处理中和料液，显著节约水资源，同时中间产物在发酵过程用作补料剂充分利用，发酵产物经固液分离分别用于制备活菌饲料及L‑乳酸，提高秸秆基质利用率。

Description

基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法
技术领域
本发明属于秸秆发酵技术领域，涉及一种秸秆发酵利用方法，具体地说是基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法。
背景技术
目前，随着农林废弃物资源化利用产业的发展壮大，充分利用秸秆这一农业废弃物来丰富饲料资源或作为生物化工原料来源，对改善我国资源供需矛盾有着重要的现实意义。
作为饲料主体的粮食相对不足，是制约当前畜牧业发展的主要因素之一，而将秸秆用于饲料制备是我国民间素有的养畜传统，通常利用秸秆作粗饲料，但粗饲料具有消化率低，适口性差，采食量不高以及营养物质不平衡等缺点，不能满足畜禽的饲用需要，尤其，秸秆利用率较低，仍存在资源浪费。
农业废弃秸秆的基本组成为木质纤维素，其中含量丰富的纤维素和半纤维素经酶解主要生成葡萄糖和木糖，再经发酵生成L-乳酸，也是一种秸秆发酵利用的有效方法。L-乳酸作为一种重要的生物化工原料，在食品、医药、保健、现代农业和日用化工等领域中也有广泛应用。秸秆发酵制备L-乳酸过程中，需对秸秆进行酸或碱预处理及抑制物脱除，抑制物脱除方法包括生物脱除、水洗脱除、过碱化处理、吸附过滤等。抑制物脱除可以除去预处理过程产生的对后续糖化和发酵有负效影响的木质纤维素降解产物及残留的酸或碱等。在抑制物脱除过程中，受生产条件限制，现阶段水洗脱除仍是最常用方法，该方法采用大量水对预处理产物清洗，产生大量废水，导致处理成本高和资源浪费。同时，生物脱除、过碱化处理及吸附过滤存在技术成熟度低、底物利用率低，需要引入复杂的过滤分离设备等问题，带来更高的生产成本。
在公开号为CN109134230B的名为“一种由木糖、葡萄糖、木聚糖、微晶纤维素及玉米秸秆催化转化制备D-构型过量的乳酸的方法”的中国专利申请中，公开了利用玉米秸秆制备乳酸的方法，但存在原料组分复杂、秸秆利用率低的问题；在公开号为CN112725386A的名为“一种同步糖化发酵生产L-乳酸的方法”的中国专利申请中，以氢氧化钠碱溶液去处理秸秆纤维质，虽然提高了秸秆利用率，增加L-乳酸的产率，但处理过程消耗了大量水资源，不利于节水且增加成本。
因此，开发一种基质全利用的秸秆发酵利用方法，在节水和秸秆基质高效利用的同时，用于生产L-乳酸及实现农业废弃物秸秆的高效饲料化利用。
发明内容
本发明的目的，是提供一种基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，将秸秆粉碎、固液分离后对固、液分别处理，通过酸碱处理料液中和，实现免除水洗，同时中间产物在发酵过程充分利用，经渣液分离，用于制备活菌饲料和L-乳酸，达到节水且提高秸秆利用率的目的。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，包括依次进行的以下步骤：
S1.秸秆前处理
将新鲜秸秆压榨，固液分离；
取固相，烘干粉碎，得秸秆渣；
取液相，除蛋白质，得秸秆汁；
S2.秸秆渣酸碱复合预处理
将14-18wt％的秸秆渣经酸处理，得酸预处理悬浊液，备用；
将其余秸秆渣经碱处理，所得碱预处理悬浊液进行固液分离，得碱处理液和碱处理渣；
S3.秸秆汁水解
将秸秆汁在pH为2.0条件下进行酸处理后经碱中和，使pH至7.0，得秸秆汁水解液；
S4.发酵
按酸预处理悬浊液和碱处理渣重量体积比为1L:1.2kg混匀，得发酵底物；
将发酵底物与发酵组合物混匀，以秸秆汁水解液和氢氧化钙悬浊液作补料剂，补料分批发酵，得发酵液；
其中，发酵组合物是由质量体积比为30-35g:250-270mL:1g的具木糖代谢产 L-乳酸的凝结芽孢杆菌、纤维素酶及木聚糖酶组成，发酵组合物中木聚糖酶和秸秆的质量比为1:1000；
具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌的初始菌体密度为8-12g/L；
纤维素酶的用量为22-26FPU/g秸秆；
木聚糖酶的用量为90-110U/g秸秆；
发酵时间为58-62h；
S5.渣液分离
取发酵液经渣液分离，得湿渣和底液；
取湿渣经中温干燥，得活菌饲料；
取底液经纯化，得L-乳酸。
其中，优选地，所述秸秆为采摘后的新鲜秸秆。
补料剂在补料分批发酵过程中根据需要自动泵入，秸秆汁水解液用于补充碳源，氢氧化钙悬浊液用于调节酸碱度。
其中，所述具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌为可代谢利用木糖产生L-乳酸的凝结芽孢杆菌类细菌，还可利用凝结芽孢杆菌菌株Bacillus coagulans NL01等，其培养方法已在文献食品科学.,2014,35(01),125-129.中公开，由南京林业大学生物化工研究所保存。
作为本发明的第一种限定，步骤S1中，
所述秸秆烘干的温度为75-85℃。
作为本发明的第二种限定，步骤S2中，
所述酸处理是向秸秆渣中加入8-12倍重量的稀硫酸，在120-140℃静置55-65min；所述稀硫酸的质量分数为1.8-2.2％。
作为本发明的进一步限定，步骤S2中，
所述碱处理是向秸秆渣加入8-12倍重量的氢氧化钠溶液，115-120℃静置75-85min；所述氢氧化钠溶液的质量分数为1.8-2.2％。
作为本发明的第三种限定，步骤S3中，
所述酸处理是向秸秆汁加入硫酸溶液，在80-100℃静置55-65min，使pH为2.0，得酸处理汁；所述碱中和是向酸处理汁加入氢氧化钠，使pH至7.0，得秸秆汁水解液。
作为本发明的第四种限定，步骤S4中，
氢氧化钙悬浊液是由质量比为4-6:100的氢氧化钙粉和秸秆渣碱处理液组成的；
作为本发明的另一种限定，所述发酵的条件是厌氧环境，温度为48-52℃，pH 为5.0-6.5，搅拌转速为240-280rmp；
所述渣液分离为离心或板框过滤；所述中温干燥的温度为65-75℃。
作为本发明的进一步限定，所述具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌为嗜热凝结芽孢杆菌LA2104。
作为本发明的再进一步限定，所述具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌是经好氧培养所得。
作为本发明的再进一步限定，所述秸秆包括高粱秸秆或玉米秸秆。
优选地，所述秸秆为Sorghum bicolor(L.)Moench、Zea mays L.或Sorghumdochna (Forssk.)Snowden经果实及种子采摘后的新鲜秸秆。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
(1)本发明基于酸碱中和，将秸秆纤维质酸预处理悬浊液和碱处理渣混匀作为发酵底物，同样利用酸碱中和避免水洗脱过程，同时，秸秆汁水解液还作补料剂起到补充发酵所需葡萄糖和果糖，即碳源和其它营养物质的作用，实现秸秆基质的全利用；
(2)本发明在发酵过程中，补料剂采用氢氧化钙悬浊液，用作辅助中和剂，调节发酵液pH；发酵后残渣中所含乳酸钙及蛋白可作为动物钙质及蛋白的补充剂，所含的活性乳酸菌体可改善动物肠道微环境，维持动物体内有益菌群平衡，促进动物健康生长；此外，L-乳酸钙作为酸度调节剂，可以维持发酵残渣适宜的pH，加之经过乳酸菌发酵后的秸秆残渣具有乳酸菌特有的芳香味，有利于改善饲料适口性；
(3)本发明的方法能够节约用水，且实现秸秆高效充分利用，中间产物再利用，降低生产成本，提高L-乳酸得率；
本发明节约用水、成本低、可工业化生产，显著提高产物转化率，适用于利用秸秆发酵生产活菌饲料及L-乳酸；本发明可应用于秸秆发酵利用技术领域，对于农业废弃物资源化利用有重要意义。
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。
附图说明
图1为实施例12中发酵pH条件验证实验结果图；
图2为实施例12中辅助中和剂选择实验结果图，图2(a)为a组实验结果；图 2(b)为b组实验结果。
图3为实施例12中湿渣中温干燥的温度选择实验结果图；
具体实施方式
实施例1一种基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法
(一)材料及好氧培养
材料：新鲜甜高粱Sorghum bicolor(L.)Moench秸秆、酵母浸粉、玉米浆粉、菌种来源与文献RSC Adv.,2021,9,22336.一致；纤维素酶来源于承德天丰生物工程有限公司；木聚糖酶来源于宁夏和氏璧生物技术有限公司；所采用的其他化学品均为市售试剂级产品；嗜热凝结芽孢杆菌LA2104即B.coagulans LA2104作为B.coagulans LA1507衍生驯化株，接种及培养方法与文献RSC Adv.,2016,6,35771-35777.一致，在50℃条件下，以33％(w/w)Ca(OH)2为中和剂，维持pH 6.5，采用2vvm曝气，搅拌速度为400rpm，好氧培养得到活性菌体备用。
(二)一种基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，按照如下步骤顺序依次进行：
S1.甜高粱秸秆前处理
将10kg经果实及种子采摘后留下的新鲜甜高粱秸秆压榨处理，使固液分离；取所有固相，在80℃下烘干，研磨粉碎至粒度为850μm，得2.2kg甜高粱秸秆渣；取液相，加热煮沸5min，静置待蛋白质析出，除蛋白质，得6.5L甜高粱秸秆汁；
经检测，甜高粱秸秆渣含葡聚糖39.44％、木聚糖20.16％、阿拉伯聚糖2.25％和木质素18.46％。
S2.秸秆渣酸碱复合预处理
①酸碱溶液配制：
稀酸：取63g的98％以上浓硫酸、2.8L水，配制质量分数为2.2％的稀硫酸；
稀碱：取378g NaOH、17L水，配制质量分数为2.2％的氢氧化钠溶液。
②酸处理：
向14.3wt％的甜高粱秸秆渣(即314.5g)加入2.8L稀硫酸，在130℃静置60min，得酸预处理悬浊液；
其中，稀硫酸的重量为甜高粱秸秆渣重量的8.9倍。
③碱处理：
向其余的1.88kg甜高粱秸秆渣(甜高粱秸秆渣总重量的85.7％)加入17L氢氧化钠溶液，在118℃静置80min，得碱预处理悬浊液；
其中，氢氧化钠溶液的重量为甜高粱秸秆渣重量的9倍。
④过滤悬浊液：
将碱预处理悬浊液过滤，使固液分离，得碱处理液和碱处理渣；
S3.秸秆汁水解
向秸秆汁加入硫酸，使pH为2.0，在90℃静置60min，得酸处理汁；
向酸处理汁加入固体氢氧化钠，调节pH至7.0，得甜高粱秸秆汁水解液。
S4.发酵
(i)按酸预处理悬浊液和碱处理渣重量体积比为1L:1.2kg搅拌混匀，使之发生中和反应，得发酵底物，备用；
(ii)将发酵底物与72g经好氧培养的嗜热凝结芽孢杆菌LA2104菌体、557mL纤维素酶及2.2g木聚糖酶投入50L发酵罐(SGM-50S，常州三高生物技术工程设备有限公司)，采用开放式同步糖化补料分批发酵，搅拌速度为260rpm，厌氧环境，温度为50℃，自动补入甜高粱秸秆汁水解液与氢氧化钙悬浊液，调节pH为6.0，发酵 60h，得发酵液，发酵结束后测定发酵液中L-乳酸产量、时空产率和得率。
其中，发酵组合物由质量体积比为33g:253mL:1g的嗜热凝结芽孢杆菌LA2104菌体、纤维素酶及木聚糖酶组成，发酵组合物中木聚糖酶和秸秆的质量比为 1:1000；
将发酵组合物各组分的质量体积比标记为比例1；
嗜热凝结芽孢杆菌LA2104菌体的初始菌体密度为10g/L；
纤维素酶的用量为22FPU/g秸秆；
木聚糖酶的用量为90U/g秸秆；
氢氧化钙悬浊液作为辅助中和剂，是由质量比为1:25(即4:100)的氢氧化钙干粉和碱处理液组成的。
(iii)测定结果：在开放批次SSF中，L-乳酸产量、时空产率和得率分别达到93 g/L，1.52g/L/h和97.86％。10kg甜高粱茎共生产2731.5g/L乳酸。与文献RSC Adv., 2016,6,35771–35777.中的传统工艺相比节约了82.15％的用水量。
S5.渣液分离
取发酵液经渣液分离，得湿渣和底液；
取湿渣经中温干燥，得活菌饲料；
取底液经纯化，得L-乳酸。
取发酵液，经2884g，15min条件下的离心方式渣液分离，得含活菌体及L-乳酸钙的湿渣1250g；
去上述湿渣经65℃中温干燥，得活菌饲料682g，经检测，活菌负载量为2.96×107CFU/g。
实施例2-11基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法
实施例2-11分别为一种基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其工艺步骤与实施例1相似，不同之处仅在于相关参数不同，具体见表1及表2，其它部分工艺参数与实施例1相同。
表1实施例2-6基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法工艺参数表
Figure 1
Figure BDA0003542123160000101
表2实施例7-11基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法工艺参数表
Figure BDA0003542123160000102
Figure BDA0003542123160000111
实施例12参数选择及效果验证实验
采用实施例1的方法制备实验原料验证本发明的方法中参数选择是否合理，对本发明方法进行效果验证实验。
一)发酵pH条件验证
1)实验方法：保持不同pH水平，测定不同pH条件下葡萄糖、木糖产量及总糖得率变化，从而选择合适的发酵pH条件。
2)实验结果：
结果如图1所示，图1中，▲代表糖得率、白色柱代表木糖浓度、灰色柱代表葡萄糖浓度。当pH超过6.0时，糖得率和浓度明显下降，在pH 5.0处得到达最高糖得率99.7％，产量为葡萄糖113g/L和木糖44.3g/L。
结果表明，发酵过程选择pH 6.0不仅能够保持合适的发酵菌生长和L-乳酸生物合成的pH值，且有着高糖得率和糖浓度，促进L-乳酸的生物合成。
二)辅助中和剂选择
1)实验方法：分a、b两组选择不同的辅助中和剂方案，分别进行补料-批次发酵实验，检测发酵过程中葡萄糖、木糖、果糖和L-乳酸的含量变化。
a组与实施例1的方法基本相同，不同之处仅在于，在自动补入甜高粱秸秆汁水解液(即补料)之前，采用碱处理液作为中和剂；在自动补入甜高粱秸秆汁水解液(即补料)之后，采用氢氧化钙干基作为中和剂。结果如图2(a)所示；
b组按照实施例1的方法进行实验，即，整个发酵过程采用的辅助中和剂为氢氧化钙与碱处理液的混合悬浊液。结果如图2(b)所示；
2)实验结果：
结果如图2所示，图中●代表L-乳酸含量、■代表葡萄糖含量、▲代表木糖含量、▼代表果糖含量；在自动补入甜高粱秸秆汁水解液，即补料之后，L-乳酸含量显著增加；但图2(a)和图2(b)中，碳源在发酵过程中的消耗速度及L-乳酸产量与时空产率明显不同。
结果表明，发酵过程选择氢氧化钙悬浊液能够最终得到L-乳酸浓度为93g/L，产物产率为97.86％，时空产率达到1.52g/L/h，在8h(31g/L)和16h(18g/L)处检测到葡萄糖和木糖的最大浓度，在24h处添加甜高粱汁水解液作为底物。残糖浓度上，葡萄糖、木糖和果糖浓度分别为0.2g/L，0.3g/L和0.1g/L，表明碳源的有效利用。
而在a组中，干基氢氧化钙粉在发酵罐中混合不完全，引起部分发酵微环境下过酸或过碱，限制了L-乳酸的生物合成，L-乳酸的产量为80g/L，产物得率为87.32％，时空产率为1.32g/L/h。对比两组结果，表明采用本发明的方法，以氢氧化钙悬浊液作辅助中和剂，能显著提高L-乳酸产量、时空产率和得率。
三)湿渣中温干燥的温度选择
1)实验方法：在不同温度条件下将发酵后经渣液分离所得湿渣充分干燥至恒重，测定不同温度条件下所得活菌饲料中活菌含量，从而选择合适的干燥温度条件。
2)实验结果：
结果如图3所示，随着烘干温度的升高，活菌负载量逐渐下降，过高的温度会引起菌体部分失活。虽然在50℃和60℃条件下，能够保证高的活菌负载量(3.12×107 CFU/g和3.05×107CFU/g)，但是较低的温度会使得烘干时间大幅延长，不利于高效生产。在65-75℃范围内，活菌负载量相对稳定，且处于较高水平(2.93-2.96×107 CFU/g)。当温度高于80℃，发现活菌负载量随温度的升高显著下降，当干燥温度为100℃时，活菌负载量下降为0.32×107CFU/g。通过对比不同干燥温度下所得饲料的活菌负载量，本发明采用中温干燥温度范围为65-75℃。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims (10)

1. 一种基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，它包括依次进行的以下步骤：
S1. 秸秆前处理
将秸秆压榨处理，固液分离；
取固相，烘干粉碎，得秸秆渣；
取液相，除蛋白质，得秸秆汁；
S2. 秸秆渣酸碱复合预处理
将14-18 wt %的秸秆渣经酸处理，得酸预处理悬浊液，备用；
将其余秸秆渣经碱处理，所得碱预处理悬浊液进行固液分离，得碱处理液和碱处理渣；
S3. 秸秆汁水解
将秸秆汁在pH为2.0条件下进行酸处理后经碱中和，使pH至7.0，得秸秆汁水解液；
S4. 发酵
按酸预处理悬浊液和碱处理渣重量体积比为1L: 1.2kg混匀，得发酵底物；
将发酵底物与发酵组合物混匀，以秸秆汁水解液和氢氧化钙悬浊液作补料剂，补料分批发酵，得发酵液；
其中，发酵组合物是由质量体积比为30-35 g : 250-270 mL : 1 g的具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌、纤维素酶及木聚糖酶组成，发酵组合物中木聚糖酶和秸秆的质量比为1:1000；
具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌的初始菌体密度为8-12 g/L；
纤维素酶的用量为22-26 FPU/g秸秆；
木聚糖酶的用量为90-110 U/g秸秆；
发酵时间为58-62 h；
S5. 渣液分离
取发酵液经渣液分离，得湿渣和底液；
取湿渣经中温干燥，得活菌饲料；
取底液经纯化，得L-乳酸。
2. 根据权利要求1所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，所述烘干的温度为75-85 oC。
3.根据权利要求1所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，步骤S2中，
所述酸处理是向秸秆渣中加入8-12倍重量的稀硫酸，在120-140 oC静置55-65 min；
所述稀硫酸的质量分数为1.8-2.2%。
4.根据权利要求3所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，步骤S2中，
所述碱处理是向秸秆渣加入8-12倍重量的氢氧化钠溶液，在115-120 oC静置75-85min；
所述氢氧化钠溶液的质量分数为1.8-2.2%。
5.根据权利要求1所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，步骤S3中，
所述酸处理是向秸秆汁加入硫酸溶液，在80-100 oC静置55-65 min，使pH为2.0，得酸处理汁；
所述碱中和是向酸处理汁加入氢氧化钠，使pH至7.0，得秸秆汁水解液。
6. 根据权利要求1所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，步骤S4中，氢氧化钙悬浊液是由质量比为4-6 : 100的氢氧化钙和碱处理液组成的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，
所述发酵的条件是厌氧环境，温度为48-52 oC，pH为5.0-6.5，搅拌转速为240-280 rmp；
所述渣液分离为离心或板框过滤；所述中温干燥的温度为65-75 oC。
8.根据权利要求7所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，所述具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌为嗜热凝结芽孢杆菌LA2104。
9.根据权利要求7或8所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，所述具木糖代谢产L-乳酸的凝结芽孢杆菌是经好氧培养所得。
10.根据权利要求9所述的基于酸碱复合处理及基质全利用的秸秆发酵利用方法，其特征在于，所述秸秆包括高粱秸秆或玉米秸秆。
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