CN114699560A - 用于促进缺损性神经再生的双层管状产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于促进缺损性神经再生的双层管状产品。具体地说，本发明涉及一种用于促进缺损性神经再生的双层管状产品，其由管状外层和紧贴于其内壁的管状内层构成，所述管状外层由人体相容生物可降解材料形成，所述管状内层为聚乙二醇形成的水凝胶层。所述人体相容生物可降解材料选自：聚乳酸或其衍生物、明胶及其衍生物、壳聚糖、聚氨酯、聚己内酯、水不溶性纤维素类及其衍生物等。所述聚乳酸衍生物选自：聚乳酸‑聚乙二醇共聚物、乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)、PLGA‑聚乙二醇共聚物、乳酸‑己内酯共聚物(PCLA)、PCLA‑聚乙二醇共聚物。所述管状外层与管状内层的重量比为100∶20～100，所述双层管状产品的管壁的厚度为50‑500μm。本发明双层管状产品呈现说明书所述技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进缺损性神经再生的修复材料，其制备方法，及神经营养因子和致孔剂在制备用于促进缺损性神经再生的修复材料中用途。本发明尤其涉及一种用于促进缺损性神经再生的双层管状产品。
背景技术
周围神经缺损性损伤是一类发生率和致残率较高的常见损伤，自体神经移植是临床最常用的方法，是修复神经缺损的金标准，但可造成供区神经功能的缺失和感觉障碍，易发生创伤性神经瘤，引起局部疼痛，患者往往难以接受，异体神经移植在临床应用较少，主要是免疫排斥反应重，影响再生效果，且来源有限。硅胶管是最早应用于临床的修复神经缺损的人工材料，不能与外界进行物质交换；虽然它能在短时间内显示出神经感觉、运动良好的恢复效果，但它有不能被人体吸收，长期滞留于人体内会压缩神经，影响神经功能，需进行二次手术取出导管的缺陷，限制了临床应用范围。
目前临床修复神经缺损的方法都存在着不可避免的缺陷，例如生物型导管一般取材于患者自身，这样无疑会造成患者供区组织永久性的功能丧失，并且会引发组织供区的炎症，同时，供区材料不足也将是应用中难以克服的问题。因此，研究者将注意力转移到使用人造神经导管，从天然及人工合成的一些生物相容性较好的材料中选取适合的物质制备导管，引导受损神经再生。使用人工合成材料制备导管具有加工方便，可准确控制规格、性质，重复性好的优点，是目前人们研究的方向。将生物降解材料引入周围神经促进其再生的导管，避免了二次手术取出的不便，无疑具有良好的应用前景。几丁质管、几丁糖管是目前研究比较多的可吸收性神经导管。该材料目前存在的问题是脆性较高，当管壁较薄时易碎裂塌陷；如管壁制作过厚，则会延长吸收时间，对再生神经产生局部压迫作用。其他报道的生物可降解合成材料有：聚乳酸、聚乳糖、聚氨酯、脱水交联明胶等。这些材料都具有良好的生物相容性，且可被人体所吸收，在桥接周围神经缺损实验研究方面取得了不同程度的研究进展。
理想的神经导管首先要满足神经细胞生长所需要的基本要求，即(1)导管降解能够和神经恢复同步，且完全降解；(2)良好的组织相容性和无毒性；(3)具有光滑的内表面，避免影响再生神经的生长，并且易于细胞生长和黏附；(4)管壁具有选择透过性，能够从外界组织中吸取营养物质；(5)良好的物理机械性能和柔韧性；(6)易于加工成型。在此前提下，通过动物体内移植实验，观察、测定再生神经功能恢复的程度和神经再生的数目等。
CN 102028974 A(200910177405.1)公开了一种促进缺损性神经再生的修复材料或组合物，其包括与人体相容的生物可降解材料和高分子材料致孔剂，还公开了这种材料或组合物的制备方法，及致孔剂在制备用于促进缺损性神经再生的修复材料中用途；其中与人体相容的生物可降解材料选自聚乳酸或其衍生物，明胶或其衍生物，壳聚糖，聚氨酯，水不溶性纤维素或其衍生物；高分子材料致孔剂选自：包括聚乙二醇400-聚乙二醇30000的聚乙二醇，聚氨基酸，葡聚糖，水溶性纤维素及其衍生物。据信该发明的神经修复材料获得了令人满意的效果。
然而，此类神经修复材料仍然有改进的必要，例如进一步改善神经修复效果。
发明内容
本发明人在研究中发现通过将高分子材料致孔剂加入到生物可降解材料中形成用于缺损性神经再生的修复导管，使修复导管具有良好的半通透性，为缺损性神经提供了优良的再生环境，从而使缺损性神经得以更好的再生。进一步的，本发明人发现，在该半通透性导管的内部镶衬具有亲水凝胶性能的PEG层或称为亲水凝胶层，任选的在该PEG层与半通透性导管层之间涂渍生物活性剂，由此获得的神经再性修复导管呈现优异的生物学性质。本发明基于此类发现而得以完成。
本发明第一方面，涉及一种促进缺损性神经再生的修复材料或组合物，其包括与人体相容的生物可降解材料和高分子材料致孔剂。
本发明第二方面，涉及用于促进缺损性神经再生的单层管状产品，其由修复材料或组合物形成(例如本发明第一方面的修复材料或组合物)，所述修复材料或组合物包括与人体相容的生物可降解材料和高分子材料致孔剂。在本发明中，术语“单层管状产品”，举例讲可以是管状物，如导管。该导管的长度没有特别限定，其可根据具体使用需求而定，管的厚度没特别要求，可为100-1000μm，例如可为100-400μm，管的内径没有特别限制，可为1.0-3.0mm，例如可为1.0-2.0mm。进一步讲，上述导管的管壁存在一些孔，这些孔的孔径没有特别限制，可为0＜孔径＜50μm，优选0＜孔径＜10μm。
本发明第三方面，涉及一种促进缺损性神经再生的修复材料或组合物的制备方法，其包括将与人体相容的生物可降解材料溶于有机溶剂中，然后加入高分子材料致孔剂，超声波分散均匀。
本发明第四方面，涉及用于促进缺损性神经再生的产品的制备方法，其包括将与人体相容的生物可降解材料溶于有机溶剂中，然后加入高分子材料致孔剂，超声波分散均匀；利用适当的模具，采用溶剂挥发法制备所需产品。
进一步的，本发明第五方面提供了一种用于促进缺损性神经再生的双层管状产品，其由管状外层和紧贴于其内壁的管状内层构成，所述管状外层由人体相容生物可降解材料形成，所述管状内层为聚乙二醇形成的水凝胶层。
根据本发明第五方面的双层管状产品，所述人体相容生物可降解材料选自：聚乳酸或其衍生物、明胶及其衍生物、壳聚糖、聚氨酯、聚己内酯、水不溶性纤维素类及其衍生物等。在一个实施方案中，所述聚乳酸衍生物选自：聚乳酸-聚乙二醇共聚物、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、PLGA-聚乙二醇共聚物、乳酸-己内酯共聚物(PCLA)、PCLA-聚乙二醇共聚物。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其中管状外层与管状内层的重量比为100∶20～100，例如为100∶30～100，例如为100∶40～100，例如为100∶50～95
根据本发明第五方面的双层管状产品，其管壁的厚度为50-500μm，例如60-400μm。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其管的内径为1.0-4.0mm，例如1.0-3.0mm。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其中形成所述管状内层水凝胶层的聚乙二醇的分子量为2000～10000，例如分子量为2000～8000，例如分子量为2000～5000，例如分子量为2500～4000。在一个实施方案中，形成所述管状内层水凝胶层的聚乙二醇是其丙烯酸酯，例如是聚乙二醇丙烯酸酯，该酯的聚乙二醇部分的分子量如上所述。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备PLA导管：将10～30mg聚乙二醇(分子量1000～3000)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入250～300mg(例如280mg)聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(例如直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成(例如内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的)PLA导管；封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用；
(2)合成PEGDA(聚乙二醇丙烯酸酯)：称取2～5g(例如3g)的PEG(例如分子量为1000～5000)于反应器中，加入20ml甲苯搅拌使PEG完全溶解，密封，通入氮气保护；向其中滴加500～600μl(例如555μl)三乙胺和300～350μl(例如325μl)丙烯酰氯，38℃水浴，搅拌过夜。将反应液过滤，滤液用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶；滤饼(例如在38℃水浴)溶解后，冷却至室温后再用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶两次。将滤饼常温避光干燥(例如24h)，得到白色产物，避光冷冻保存；
(3)制备PEG-PLA神经导管
将步骤(2)制备的0.2～1g(例如0.5g)的PEGDA(PEG分子量1000～5000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.5～2)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1～3)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入步骤(1)制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(其中PLA层与PEG层的重量比为100∶50～95)，即为双层管状产品。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其中在外层的内壁还涂渍有生物活性剂。根据本发明第五方面的双层管状产品，所述生物活性剂涂渍于双层管状物的内层与外层之间。在一个实施方案中，所述的生物活性剂选自：①神经营养素，包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素3等；②神经细胞分裂素，包括睫状神经营养因子、白细胞介素1，3，6等；③成纤维细胞生长因子；④其他神经营养因子如胶质源性神经营养因子、胰岛素样生长因子、白细胞抑制因子，等。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其中在外层的内壁涂渍有生物活性剂，每平方毫米内壁面积涂渍的生物活性剂的量为0.1～50ng，例如0.5～25ng，例如1～20ng，例如1～10ng，例如2～8ng。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其中在外层的内壁还涂渍有生物活性剂，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备PLA导管：将10～30mg聚乙二醇(分子量1000～3000)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入250～300mg(例如280mg)聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(例如直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成(例如内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的)PLA导管；封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用；向PLA导管中加入神经生长因子溶液，挥干溶剂，使每只导管内壁载有100～500ng(例如150～400ng)神经生长因子，得到载药导管；
(2)合成PEGDA(聚乙二醇丙烯酸酯)：称取2～5g(例如3g)的PEG(例如分子量为1000～5000)于反应器中，加入20ml甲苯搅拌使PEG完全溶解，密封，通入氮气保护；向其中滴加500～600μl(例如555μl)三乙胺和300～350μl(例如325μl)丙烯酰氯，38℃水浴，搅拌过夜。将反应液过滤，滤液用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶；滤饼(例如在38℃水浴)溶解后，冷却至室温后再用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶两次。将滤饼常温避光干燥(例如24h)，得到白色产物，避光冷冻保存；
(3)制备PEG-PLA神经导管的制备
将步骤(2)制备的0.2～1g(例如0.5g)的PEGDA(PEG分子量1000～5000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.5～2)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1～3)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入步骤(1)制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(其中PLA层与PEG层的重量比为100∶50～95)，即为载药双层管状产品，亦称为载药PEG-PLA神经导管。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其是照如下方法制备得到的：将聚乙二醇丙烯酸酯用水溶解制成溶液，在过硫酸铵和四甲基乙二胺存在下，将该水溶液添加到本发明第二方面所述的单层管状产品内，洗涤，干燥，灭菌，即得。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其中在外层的内壁涂渍有生物活性剂，该双层管状产品是照如下方法制备得到的：将含有生物活性剂的溶液添加到本发明第二方面所述的单层管状产品内，挥干溶剂使生物活性剂涂渍于该单层管状产品的内壁，得到内壁涂渍有生物活性剂的单层管状产品；将聚乙二醇丙烯酸酯用水溶解制成溶液，在过硫酸铵和四甲基乙二胺存在下，将该水溶液添加到内壁涂渍有生物活性剂的单层管状产品内，洗涤，干燥，灭菌，即得。
根据本发明第五方面的双层管状产品，还可以在其干燥后使用PBS洗涤。
根据本发明第五方面的双层管状产品，其在洗涤干燥并封装后使用γ射线辐射灭菌。
在本发明中，聚乙二醇丙烯酸酯与过硫酸铵的重量比为100∶0.1～3.0，例如100∶0.15～2.0，例如100∶0.2～1.0，例如100∶0.5。
在本发明中，聚乙二醇丙烯酸酯与四甲基乙二胺的重量比为100∶0.2～10，例如100∶0.5～5，例如100∶1～3，例如100∶2。
在本发明中，与人体相容的生物可降解材料选自：聚乳酸或其衍生物、明胶及其衍生物、壳聚糖、聚氨酯、聚己内酯、水不溶性纤维素类及其衍生物等。根据本发明，上述与人体相容的生物可降解产物均可购自市场。聚乳酸衍生物举例讲为：聚乳酸-聚乙二醇共聚物、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、PLGA-聚乙二醇共聚物、乳酸-己内酯共聚物(PCLA)、PCLA-聚乙二醇共聚物。
在本发明中，致孔剂为高分子材料致孔剂，举例讲可为包括聚乙二醇400～聚乙二醇30000的聚乙二醇，聚氨基酸、葡聚糖、聚乙烯醇，水溶性纤维素类及其衍生物。聚乙二醇400～聚乙二醇30000是指平均分子量为400～30000的聚乙二醇。
在本发明中，生物可降解材料与高分子材料致孔剂的重量比为100∶2～20，例如为100∶3～15，例如为100∶4～10。
本发明任一实施方案可以与其它实施方案组合，只要这种组合不会出现矛盾。
周围神经损伤(peripheral nerves，PNI)是指周围神经因急性压迫或创伤而受损，进而导致感觉和运动功能障碍，甚至终生残疾的一种临床疾病，常见体征和症状有麻木、刺痛、搏动、灼热、剧烈疼痛等。目前，自体神经移植仍是临床治疗周围神经损伤的首选方法，同时也是研究其替代治疗措施的“金标准”。但是自体神经来源有限，且存在增加创伤、遗留供区感觉障碍、神经束支对合及匹配不佳等诸多缺点。为了满足大间隙修复的临床需求，解决自体神经移植的限制，基于组织工程的神经引导导管(nerve guidanceconduit，NGC)开始发展起来，该方法通过植入天然、合成或半合成生物材料的NGC来治疗周围神经缺损。聚乳酸(PLA)由于其良好的生物相容性、良好的生物降解性和热塑性加工性能，在神经再生组织工程中的应用引起了人们的极大关注。但其代谢中间产物乳酸在局部堆积会导致局部pH值下降，同时，但其亲水性差，细胞吸附率低，不利于细胞表面黏附，这都不利于神经损伤的修复再生。研究表明：细胞外酸性pH可刺激人巨噬细胞NLRP3炎性小体活化和IL-1β分泌，周围神经损伤常伴随局部酸中毒，缺血和炎症，而局部酸中毒又会进一步促进缺血和炎症的发生，不利于神经损伤修复。聚乙二醇是一种常见的醇类水凝胶材料，在神经再生领域也有广泛应用。用聚乙二醇制备的水凝胶有着良好的亲水性和生物相容性，其分子链含有羟基和醚键，因此能与含羧基、羟基的水溶性分子通过分子间的氢键形成网络结构。聚乙二醇可以用来改善材料的亲水性，增强柔韧性，当聚乙二醇浓度增大时，材料的柔韧性增大，亲水性增强。同时聚乙二醇有稳定蛋白的作用。本研究利用PEG改善PLA导管亲水性能，同时防止PLA中间降解产物乳酸在导管内聚集，从而维持神经再生局部微环境稳定，使其更好地用作神经修复支架。
本发明的目的在于制备用于神经修复及再生的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)改性聚乳酸(poly(lactic acid)，PLA)神经导管支架并进行生物学评价。本发明利用溶剂挥发法制备PLA神经导管支架，用聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)通过化学交联的方式对导管内壁进行改性，电镜观察其微观形貌，利用CCK-8实验检测大鼠神经血旺细胞RSC96在聚乙二醇改性的聚乳酸神经导管预处理培养基中的增殖情况，取SD大鼠30只，随机分为3组：自体神经移植组、PEG-PLA组、单纯PLA组。制作大鼠坐骨神经10mm缺损模型，分别采用自体神经移植、PEG-PLA导管、PLA导管桥接修复。术后行大体观察、术后2周行移植段神经再生速度评价，术后4、8、12周行坐骨神经功能指数测定、术后12周取材，行腓肠肌湿重恢复率测量和组织学检查。结果显示，术后2周通过HE染色和免疫荧光染色观察可见，虽然两组神经再生效果都低于Autograft组，但仍可见PEG-PLA组的神经再生效果优于单纯PLA组。术后12周，与PLA组相比，PEG-PLA组的足趾分离程度明显改善，接近自体神经移植组，但单纯PLA组和PEG-PLA组在第8周和第12周均明显低于自体神经组组(p＜0.05)。腓肠肌肌纤维横截面积和腓肠肌肌肉湿重恢复率呈现令人满意的结果，这些结果表明，聚乙二醇改性聚乳酸神经导管具有良好的组织相容性，能够改善神经修复效果。
附图说明
图1：PEG-PLA神经导管形貌图，A为PEG-PLA神经导管外壁，B为PEG-PLA神经导管内壁。
图2：术后2周，各组移植段再生神经的免疫荧光染色结果。
图3：术后12周PLA组、PEG-PLA组和自体神经移植组的2D和3D足迹。
图4：术后4、8、12周各组坐骨神经功能指数。
图5：术后12周大鼠腓肠肌大体观及各组腓肠肌中段肌腹横截面Masson染色。
图6：各组大鼠再生神经中段甲苯胺蓝染色(a：自体移植ANG组；b：空管HP组；c：中剂量MD组；d：低剂量LD组；e：高剂量HD组)。
图7：各组大鼠平面步态足印分析图(a：ANG组；b：HP组；c：MD组；d：LD组；e：HD组)。
图8：各组大鼠术侧腓肠肌肌腹横断面有代表性Masson染色(a：ANG组；b：HP组；c：MD组；d：LD组；e：HD组)。
具体实施方式
本发明的各种试验中，统计分析使用SPSS23.0软件进行，计量资料以
表示，计数资料以率和百分比表示，单因素分析采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
实施例1：PLA神经导管的制备
采用溶剂挥发法制备PLA导管。称取20mg聚乙二醇(分子量2000)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入280mg聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的PLA导管。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用。
实施例1a：PLA神经导管的制备
采用溶剂挥发法制备PLA导管。称取24mg聚乙二醇(分子量1000)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入280mg聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的PLA导管。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用。
实施例1b：PLA神经导管的制备
采用溶剂挥发法制备PLA导管。称取28mg聚乙二醇(分子量3000)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入280mg聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的PLA导管。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用。
实施例1c：PLA神经导管的制备
采用溶剂挥发法制备PLA导管。称取11mg聚乙二醇(分子量2500)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入280mg聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的PLA导管。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用。
实施例2：PEGDA(聚乙二醇丙烯酸酯)的合成
PEGDA(亦称聚乙二醇丙烯酸酯)是通过将丙烯酰氯与PEG发生酰氯酯化反应合成的，反应方程式如下：
称取3g的PEG3000于反应器中，加入20ml甲苯搅拌使PEG3000完全溶解，密封，通入氮气保护。向其中滴加555μl三乙胺和325μl丙烯酰氯，38℃水浴，搅拌过夜。将反应液过滤，滤液用50ml的4℃冷乙醚重结晶。滤饼在38℃水浴溶解后，冷却至室温后再用50ml的4℃冷乙醚重结晶两次。将滤饼常温避光干燥24h，得到白色产物，避光冷冻保存。
另外，可以改变PEG的分子量合成其它规格的PEGDA。此外，各种规格的PEGDA还可以从市售途径获得。
实施例3：PEG-PLA神经导管的制备
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量3000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶1)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶2)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入实施例1制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶70)。
实施例3a：PEG-PLA神经导管的制备
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量2000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.25)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入实施例1a制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶84)。
实施例3b：PEG-PLA神经导管的制备
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量4000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶2)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶3)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入实施例1b制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶91)。
实施例3c：PEG-PLA神经导管的制备
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量5000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.5)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1.5)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入实施例1c制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶62)。
在本发明中，提及两种物料的比例时，若未另外说明，均是指重量比。
实施例4：载药PEG-PLA神经导管的制备
取实施例1制备的内径1.5mm、长14mm的PLA神经导管，向其中加入神经生长因子溶液，挥干溶剂，使每只导管内壁分别载有150、300、450ng神经生长因子，得到载药导管；接着，
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量3000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶1)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶2)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入上述载药导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用，得载药PEG-PLA神经导管(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶71)。
在本发明中，使用到本实施例所得载药PEG-PLA神经导管进行测试时，如未另外说明，均是指每只导管内壁载有300ng神经生长因子的神经导管。
在本发明中，APS是过硫酸铵，TEMED是四甲基乙二胺。
实施例4a：载药PEG-PLA神经导管的制备
取实施例1a制备的内径1.5mm、长14mm的PLA神经导管，向其中加入神经生长因子溶液，挥干溶剂，使每只导管内壁分别载有150、300、450ng神经生长因子，得到载药导管；接着，
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量2000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.25)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入上述载药导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用，得载药PEG-PLA神经导管(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶85)。
实施例4b：载药PEG-PLA神经导管的制备
取实施例1b制备的内径1.5mm、长14mm的PLA神经导管，向其中加入神经生长因子溶液，挥干溶剂，使每只导管内壁分别载有150、300、450ng神经生长因子，得到载药导管；接着，
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量4000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100kl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶2)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶3)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入上述载药导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用，得载药PEG-PLA神经导管(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶90)。
实施例4c：载药PEG-PLA神经导管的制备
取实施例1c制备的内径1.5mm、长14mm的PLA神经导管，向其中加入神经生长因子溶液，挥干溶剂，使每只导管内壁分别载有150、300、450ng神经生长因子，得到载药导管；接着，
称取参照实施例2方法制备的0.5g的PEGDA(PEG分子量5000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.5)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1.5)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入上述载药导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布。PBS洗3次，每次5min。干燥24h。封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用，得载药PEG-PLA神经导管(本实施例中，依据投料计算，PLA层与PEG层的重量比为100∶60)。
实施例11：神经导管的扫描电镜观察
将实施例3和实施例4制得的神经导管喷金后，采用SU-8200型扫描电子显微镜，5kv下对导管的形貌和微结构进行观察。扫描电镜照片显示，不论是否添加生物活性剂，新制备的PEG-PLA神经导管外壁质地紧密，无微孔(图1A，实施例3神经导管的典型图)；而其内壁有质地酥松，有具有取向性的排列整齐的纹路(图1B，实施例3神经导管的典型图)。
实施例12：神经导管材料对RSC96细胞增殖的影响
(1)培养基DMEM预处理：
将实施例1之单纯PLA神经导管、实施例3a之PEG-PLA神经导管、实施例4a之载药(300ng)PEG-PLA神经导管分别放入含有体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、体积分数5％CO2的培养箱中培养48h，弃去导管，得到预处理的DMEM培养基。
(2)细胞毒性评价
将经步骤(1)预处理DMEM培养基分别培养RSC96细胞1、3、5天后加入CCK-8，再孵育1h后450nm波长下测定吸光度值。以未处理的DMEM培养基为对照组。设1天、3天、5天三个时间点，每组每个时间点5个复孔，另需每组每个时间点3个复孔作为空白对照，密封96孔板60Co消毒备用。将RSC96细胞在15ml离心管中吹打均匀，利用细胞计数板计数细胞，常温离心1000rpm/min×5min，弃上清，根据细胞计数结果加适量细胞培养液重悬细胞配制成2.5×105/ml的RSC96细胞悬液，取消毒好的96孔板，按200μl/孔接种雪旺细胞，空白复孔加200μl/孔RSC96细胞培养液，于恒温培养箱中5％CO2、37℃孵育。于各个时间点，向各组复孔中加入20μl/孔的CCK-8溶液，继续在恒温培养箱中5％CO2、37℃孵育1h。取出96孔板置于微量孔板分光光度计中，测定各孔在450nm处的吸光度值，结果见表1。
表1、神经导管材料对RSC96细胞增殖的影响(n＝5)
如表中结果所示，与未处理的DMEM培养基培养的RSC96细胞(对照组)相比，PLA神经导管预处理组和PEG-PLA神经导管预处理组的细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05)，表明PLA和PEG-PLA神经导管不影响RSC96细胞的正常增殖，而载药导管不但显著(P＜0.01或P＜0.05)优于PLA导管和PEG-PLA导管，甚至比对照组更优。
实施例13：术后早期移植段神经组织学评价
(1)动物实验方法
大鼠30只随机均分为3组：
A组采用自体神经反接的方法桥接坐骨神经缺损，作为阳性对照组；
B组采用实施例3的PEG-PLA导管桥接坐骨神经缺损；
C组采用实施例1的PLA导管桥接坐骨神经缺损。
称量SD大鼠体重，按照3mL/kg剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉。角膜反射确定麻醉可靠后于大鼠右后肢备皮，常规消毒铺巾。取右后肢后外侧纵行切口，长约2.5cm，逐层切开皮肤、皮下、肌层，暴露坐骨神经，直尺测量下切除7mm坐骨神经，以8-0带针缝合线分别在坐骨神经近、远端桥接缝合移植物，其中A组是将切除的坐骨神经调转180°缝合。确认桥接物缝合可靠，0.9％氯化钠注射液冲洗术区，止血充分后以3-0手术缝合线逐层缝合肌层和皮肤，碘伏消毒切口后等待麻醉苏醒。麻醉苏醒后按分组分笼饲养于自动供应食水、12小时光照/黑暗循环条件的塑料鼠笼中。
(2)术后早期移植段神经组织学分析评价
术后第2周每组随机选取5只大鼠腹腔注射过量水合氯醛处死，充分暴露并完整切取移植段再生神经。切取的移植段再生神经行10μm厚纵行冰冻切片，冰冻丙酮固定15min，PBS洗三遍，每次5min，然后置于含10％山羊血清的PBS中，在室温条件下阻断非特异性抗原2小时。切片用鼠抗NF200单克隆抗体(与PBS按1∶800稀释)和兔抗P0多克隆抗体(与PBS按1∶200稀释)作为一抗在4℃湿盒中孵育过夜。第二天，去除多余一抗，切片用PBS洗三遍，每遍5min，然后用山羊抗小鼠IgG/Alexa
488(与PBS按1∶200稀释)和山羊抗兔IgG/Alexa
594(与PBS按1∶200稀释)作为二抗在常温避光条件下孵育1小时。去除多余二抗后，PBS洗三遍，每遍5min，切片再用DAPI工作液常温避光条件下孵育5min，蒸馏水清洗后水性封片剂封片。同时切片也用HE染色试剂盒进行HE染色。切片首先进苏木素染色液10min，过水，分化液分化1min，蒸馏水洗15min，进伊红染液浸染1min，蒸馏水洗5min，常规脱水、透明、中性树胶封片。用于观察有无炎症细胞浸润及神经纤维再生情况。
术后2周通过HE染色和免疫荧光染色观察移植段再生神经纤维的生长速度。大体观察可见各组神经移植物与周围组织均无明显瘢痕粘连。HE染色未见大片炎症细胞浸润发生。免疫荧光染色可见NF200阳性的再生神经纤维被标记为绿色荧光，P0阳性的再生髓鞘被标记为红色荧光。虽然两组神经再生效果都低于Autograft组，但仍可见PEG-PLA组的神经再生效果优于单纯PLA组。表明聚乙二醇改性聚乳酸神经导管改善了单纯PLA导管的神经修复效果(图2)。
(3)运动功能恢复评价
术后第4、8和12周(每组5只大鼠)中，使用CatWalk步态分析系统对大鼠进行运动功能恢复评价。将大鼠放在走道板上，让其向前走。当脚趾接触踩踏表面时，将显示实时运动图像和3D足迹。从每组的足迹中测量脚趾的长度和宽度以及静态坐骨神经指数(SFI)。SFI＝0表示运动功能正常，SFI＝100表示运动功能完全损伤。
术后12周，与PLA组相比，PEG-PLA组的足趾分离程度明显改善，接近自体神经移植组(图3)。三维足迹显示，各组手术侧足趾(右侧)与地面的接触面积均较正常侧(左侧)减小。用坐骨神经功能指数(sciatic functional index，SFI)评价大鼠坐骨神经功能恢复情况。行走轨迹分析结果如图3所示。所有组术后4周SFI均接近-100，表明术后神经功能恶化。4周后，随着神经再生的进行，SFI开始增加。各组坐骨神经功能指数在第4周无明显差异，但单纯PLA组和PEG-PLA组在第8周和第12周均明显低于自体神经组组，且有统计学意义(p＜0.05)。而单纯PLA组SFI均值第8周和第12周低于PEG-PLA组，但差异无统计学意义(p＞0.05)。
(4)腓肠肌湿重分析和组织学评价
术后12周，各组大鼠腹腔注射过量10％水合氯醛处死，取材各组大鼠双侧腓肠肌、立即称重以术侧腓肠肌与正常侧腓肠肌湿重的比值进行标准化，所得数据用于计算腓肠肌湿重恢复率(gastrocnemius muscle wet weightratio)。然后取腓肠肌肌腹4％多聚甲醛固定2h，石蜡包埋并行腓肠肌肌腹横断面10μm厚石蜡切片。切片常规脱蜡复水，以改良Masson染色试剂盒进行染色常规脱水、透明、封片。每组随机选取5个视野，测量腓肠肌纤维平均横截面积(average cross-sectional area of gastrocnemius muscle fibers)。
腓肠肌肌肉湿重恢复率方面，各组术侧与健侧腓肠肌大体观对比图(图5，A～C)可见，单纯PLA组和PEG-PLA组术侧肌肉萎缩严重，与健侧差距明显，PEG-PLA组术侧与健侧间的差距较为接近Autograft组。数据统计显示各组腓肠肌肌肉湿重恢复率依高低排序为：Autograft组(55.38％±8.92％)，PEG-PLA组(35.82％±7.32％)，PLA组(21.49％±6.08％)，各组之间均具有统计学差异(p＜0.05)，见图5G。
腓肠肌组织学及肌纤维横截面积方面，比较各组术侧腓肠肌肌腹中段横截面Masson染色可见PLA组术侧腓肠肌肌纤维纤细，排列不规则，横截面积明显小于其他两组；PEG-PLA组和Autograft组腓肠肌肌纤维形态排列较为规整，但PEG-PLA组横截面积小于Autograft组横截面积(图5，D～F)。数据统计显示各组腓肠肌肌纤维横截面积依高低排序为：Autograft组(1417.21±368.16μm2)，PEG-PLA组(781.64±62.92μm2)，PLA组(308.42±138.72μm2)，各组之间均具有统计学差异(图5H)。
另外，参照上述实施例13的方法，对实施例4所得载药神经导管进行试验，结果显示各项指标的效果比实施例3的神经导管显著更优。
实施例14：大鼠坐骨神经修复(神经缺损10mm)药效学评价
动物模型：Sprague-Dawley(SD)大鼠，健康雄性8周龄，体重约250-300g。
以实施例4a所得三种载药剂量的载药PEG-PLA神经导管为试验组，并以空管即实施例3a所得未载药PEG-PLA神经导管作为阴性对照组；每组6只动物，分成以下几组：
自体组(autologous nerve grafts，ANG组，阳性对照组)、
空管组(hollow pipe，HP组，阴性对照组)、
低剂量组(low dose，LD组，150ng)、
中剂量组(middle dose，MD组，300ng)、
高剂量组(high dose，HD组，450ng)。
参照实施例13的方法进行操作。
(1)再生神经组织学评价
术后第12周，电生理检测后的各组大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠处死。充分暴露并完整切取移植段再生神经。切取的移植段再生神经中点经4％多聚甲醛固定后，行石蜡切片，以甲苯胺蓝染色液染色，显微镜观察切片结果并拍照采图。同时切片也用HE染色试剂盒进行免疫荧光染色。判断神经组织再生生长情况和周围组织的炎性反应情况。
结果：术后12周甲苯胺蓝染色(图6)显示ANG组再生神经数量多，排列均匀，神经纤维直径明显大于HP组、LD组；HP组、LD组再生神经纤维呈现出小而不均匀的状态，且结缔组织较少；MD组和HD组神经数量较多，排列均匀，且结缔组织相对较多，密度低于ANG组；ANG组神经再生情况最好，MD组和HD组次之，但优于HP组和LD组。术后12周各组大鼠移植段再生神经中点横切面的免疫荧光染色结果显示(未提供图示)，NF200阳性为再生神经纤维，标记为绿色荧光；S100阳性为施万细胞，标记为红色荧光。ANG组的神经纤维再生多，且有髓神经纤维较多，施万细胞的数量恢复快；HP组不论神经纤维和施万细胞再生均较差；LD组、MD组、HD组神经纤维和施万细胞的再生情况好于HP组，但差于ANG组，其中MD组不论是有髓神经纤维还是施万细胞再生情况，都是这三个含药导管组中最好的。
(2)神经功能恢复评价
术后第12周，使用CatWalk XT 10.6小动物步态分析仪对大鼠进行步态分析，评价其运动功能恢复情况。如果大鼠在5秒内通过被摄像机镜头覆盖的区域，并且速度变异率低于50％，该步态可以被记录。每组各个时间点至少有5只大鼠步行过程符合分析要求。所有获得的步态数据都是使用Catwalk分析软件分析处理，过程中手动定义大鼠四肢(LH＝左后肢，RH＝右后肢，LF＝左前肢，RF＝右前肢)，由软件系统记录步行过程。
结果：术后大体观察发现，术后3个月大鼠可以正常行走，成交叉步态，无明显行走不便，个别术侧动物脚趾出现溃疡。根据平面步态足印分析(图7)，与HP组、LD组相比，MD组和HD组的足趾分离程度明显改善，接近ANG组。额外的结果显示，MD组和HD组的足印压力、地面的接触面积和时间、重心后移恢复程度、足趾间距和足印长度都更接近ANG组，并且显著优于LD组和HP组。
(3)肌肉组织学评价
术后第12周，各组大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠处死。切取双侧腓肠肌并立即称重，计算术侧腓肠肌与正常侧腓肠肌湿重的比值，即为腓肠肌湿重恢复率。所得数据由SPSS26.0统计分析软件处理，均以x±s表示，组间采取One-way ANOVA分析，两两比较采取Dunnett-t和SNK-q检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。然后取腓肠肌肌腹4％多聚甲醛固定2h，石蜡包埋并行腓肠肌肌腹横断面石蜡切片，以Masson染色试剂盒进行染色，显微镜观察切片结果并拍照采图。
结果：术后第12周，各组大鼠双侧腓肠肌肌肉湿重恢复率的统计结果可见肌肉萎缩，ANG组(58.62±10.84％)的腓肠肌肌肉湿重恢复率显著(P＜0.01)高于HP组(20.48±7.95％)、LD组(21.28±9.01％)，高于(P＜0.05)MD组(36.50±11.23％)、HD组(39.61±8.79％)(P＜0.05)，而HP组亦明显(P＜0.05)低于MD组。术后第12周各组术侧腓肠肌肌腹横断面有代表性Masson染色结果显示了各组肌纤维情况(图8所示)，HP组和LD组术侧肌纤维相对纤细，呈现出不规则排列，大量蓝染胶原纤维存在于红染肌纤维间，横截面积相对较小，MD组和HD组显示肌纤维呈现出规整排列，横截面积与ANG组相当。
聚乳酸是目前周围神经组织工程应用最广泛的一种可生物降解材料。它是由乳酸直接缩聚或乳酸二聚体丙交酯开环聚合而形成的线性热塑性高分子，具有良好的机械性能和生物降解性，但其亲水性差，细胞吸附率低，不利于细胞表面黏附；同时聚乳酸的代谢中间产物--乳酸在局部堆积，导致局部pH值下降，进而影响神经修复和再生。聚乙二醇是一种常见的醇类水凝胶材料，用聚乙二醇制备的水凝胶在有着良好的亲水性和生物相容性。
用聚乙二醇改性PLA神经导管，一方面改善PLA神经导管的亲水性，提高PLA的生物相容性，有利于细胞表面黏附，另一方面，PEG水凝胶减少了PLA的降解中间产物乳酸与神经再生微环境的接触，维持了神经再生微环境的稳定，进而改善了PLA神经导管的神经修复效果。
因此本研究通过利用溶剂挥发法制备PLA神经导管支架，并用聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)通过化学交联的方式在导管内壁形成PEG水凝胶，构建聚乙二醇改性聚乳酸神经导管(PEG-PLA)，并对其进行生物学评价，进而评估其神经修复效果。
本发明的结果表明，PEG-PLA神经导管内壁结构疏松，有具有取向性的排列整齐的纹路，具有良好的生物相容性，用于桥接缺损的大鼠坐骨神经，受坐骨神经支配的腓肠肌恢复在形态学检测和组织学评价等方面均优于单纯PLA导管组，差异有统计学意义(P＜0.05)，但与自体神经移植相比还有一定差距。
综上所述，PEG-PLA神经导管具有良好的组织相容性，能够有效地改善神经的修复效果，促进大鼠坐骨神经再生，是一种较为理想的神经导管。
Claims (10)
1.一种用于促进缺损性神经再生的双层管状产品，其由管状外层和紧贴于其内壁的管状内层构成，所述管状外层由人体相容生物可降解材料形成，所述管状内层为聚乙二醇形成的水凝胶层。
2.根据权利要求1的双层管状产品，所述人体相容生物可降解材料选自：聚乳酸或其衍生物、明胶及其衍生物、壳聚糖、聚氨酯、聚己内酯、水不溶性纤维素类及其衍生物等。
3.根据权利要求2的双层管状产品，所述聚乳酸衍生物选自：聚乳酸-聚乙二醇共聚物、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、PLGA-聚乙二醇共聚物、乳酸-己内酯共聚物(PCLA)、PCLA-聚乙二醇共聚物。
4.根据权利要求1的双层管状产品，其中：
所述管状外层与管状内层的重量比为100∶20～100，例如为100∶30～100，例如为100∶40～100，例如为100∶50～95；
所述双层管状产品的管壁的厚度为50-500μm，例如100-400μm；或者
所述双层管状产品的管的内径为1.0-4.0mm，例如1.0-3.0mm。
5.根据权利要求1的双层管状产品，其中形成所述管状内层水凝胶层的聚乙二醇的分子量为2000～10000，例如分子量为2000～8000，例如分子量为2000～5000，例如分子量为2500～4000；或者，形成所述管状内层水凝胶层的聚乙二醇是其丙烯酸酯，例如是聚乙二醇丙烯酸酯，该酯的聚乙二醇部分的分子量如上所述。
6.根据权利要求1的双层管状产品，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备PLA导管：将10～30mg聚乙二醇(分子量1000～3000)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入250～300mg(例如280mg)聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(例如直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成(例如内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的)PLA导管；封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用；
(2)合成PEGDA(聚乙二醇丙烯酸酯)：称取2～5g(例如3g)的PEG(例如分子量为1000～5000)于反应器中，加入20ml甲苯搅拌使PEG完全溶解，密封，通入氮气保护；向其中滴加500～600μl(例如555μl)三乙胺和300～350μl(例如325μl)丙烯酰氯，38℃水浴，搅拌过夜；将反应液过滤，滤液用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶；滤饼(例如在38℃水浴)溶解后，冷却至室温后再用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶两次；将滤饼常温避光干燥(例如24h)，得到白色产物，避光冷冻保存；
(3)制备PEG-PLA神经导管的制备
将步骤(2)制备的0.2～1g(例如0.5g)的PEGDA(PEG分子量1000～5000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.25～2)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1～3)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入步骤(1)制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布；PBS洗3次，每次5min；干燥24h；封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(其中PLA层与PEG层的重量比为100∶50～95)，即为双层管状产品。
7.根据权利要求1的双层管状产品，其中在外层的内壁还涂渍有生物活性剂；例如，所述生物活性剂涂渍于双层管状物的内层与外层之间。
8.根据权利要求1的双层管状产品，所述的生物活性剂选自：①神经营养素，包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素3等；②神经细胞分裂素，包括睫状神经营养因子、白细胞介素1，3，6等；③成纤维细胞生长因子；④其他神经营养因子如胶质源性神经营养因子、胰岛素样生长因子、白细胞抑制因子。
9.根据权利要求1的双层管状产品，其中在外层的内壁涂渍有生物活性剂，每平方毫米内壁面积涂渍的生物活性剂的量为0.1～50ng，例如0.5～25ng，例如1～20ng，例如1～10ng，例如2～8ng。
10.根据权利要求1的双层管状产品，其中在外层的内壁还涂渍有生物活性剂，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)制备PLA导管：将10～30mg聚乙二醇(分子量1000～3000)溶于1ml二氯甲烷中，搅拌使分散均匀，后加入250～300mg(例如280mg)聚乳酸，搅拌使分散均匀，将不锈钢模具(例如直径1.5mm、长80mm)垂直浸入溶液中后提出，室温放置，待溶剂挥发后，将其从模具上取出，制备成(例如内径1.5mm、壁厚0.2mm、长14mm的)PLA导管；封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用；向PLA导管中加入神经生长因子溶液，挥干溶剂，使每只导管内壁载有100～500ng(例如150～450ng)神经生长因子，得到载药导管；
(2)合成PEGDA(聚乙二醇丙烯酸酯)：称取2～5g(例如3g)的PEG(例如分子量为1000～5000)于反应器中，加入20ml甲苯搅拌使PEG完全溶解，密封，通入氮气保护；向其中滴加500～600μl(例如555μl)三乙胺和300～350μl(例如325μl)丙烯酰氯，38℃水浴，搅拌过夜；将反应液过滤，滤液用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶；滤饼(例如在38℃水浴)溶解后，冷却至室温后再用(例如50ml的4℃冷)乙醚重结晶两次；将滤饼常温避光干燥(例如24h)，得到白色产物，避光冷冻保存；
(3)制备PEG-PLA神经导管
将步骤(2)制备的0.2～1g(例如0.5g)的PEGDA(PEG分子量1000～5000)溶于1ml纯净水中，待完全溶解后，再向其中加入100μl的APS溶液(PEGDA∶过硫酸铵＝100∶0.25～2)和50μl的TEMED溶液(pH7.4，PEGDA∶四甲基乙二胺＝100∶1～3)，反应30s，用移液枪将尚未完全交凝的溶液垂直注入步骤(1)制备的PLA导管，旋转PLA导管，使溶液在管壁均匀分布；PBS洗3次，每次5min；干燥24h；封装后经γ射线辐射灭菌，4℃保存备用(其中PLA层与PEG层的重量比为100∶50～95)，即为载药双层管状产品，亦称为载药PEG-PLA神经导管。
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