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CN114686598B - 一种提高细毛羊羊毛同质性的分子育种方法 - Google Patents

一种提高细毛羊羊毛同质性的分子育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高细毛羊羊毛同质性的分子育种方法。本发明提供了一种鉴定绵羊的GTL2‑REs基因型的方法：(1)以供试绵羊的基因组DNA为模板，采用序列1所示引物F1和序列2所示引物R1组成的引物对进行PCR扩增；(2)将产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果显示单一特征带、该绵羊为GTL2‑REs纯合基因型，如果显示两条特征带、该绵羊为GTL2‑REs杂合基因型。本发明还提供了繁育具有同质毛性状的绵羊的方法，包括如下步骤：将GTL2‑REs杂合基因型的母绵羊作为母本，将GTL2‑REs纯合基因型的公绵羊作为父本，获得后代。本发明的方法可用于细毛羊同质毛的培育过程中，为防止幼龄异质毛后代的产生提供了新的分子育种方法。

Description

一种提高细毛羊羊毛同质性的分子育种方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高细毛羊羊毛同质性的分子育种方法，具体来说涉及绵羊GTL2-Mirg一段重复序列的不同基因型在毛用细毛羊羊毛同质性选育中的应用，可用于绵羊育种。
背景技术
细毛羊育种中，羊毛纤维的同质性至关重要。细毛羊的毛囊以次级毛囊为主，也会有少量的初级毛囊，特别是在出生羔羊中，部分羔羊出现明显较多数量的初级毛囊。初级毛囊生出的毛发多为有髓毛，毛质变硬，毛直径变粗，严重影响羊毛的品质。同质毛是毛纺工业对羊毛原料要求的前提，在细毛羊育种中要求被毛首先达到同质，在这个基础上再进一步要求羊毛综合品质的提高。近年来，由于羊毛与羊肉比价变化，肉价的提高促使羊毛的选择强度降低，更严重的是，在细毛羊产区逐渐出现的“倒改”趋势，也就是用本地粗毛公羊与细毛羊杂交，直接影响了后代的羊毛同质性。“倒改”导致优良性状的保持愈加困难，使得本就不能满足国内羊毛精加工的需求的优质细羊毛产量进一步降低，最终导致国内毛纺企业对于高品质羊毛的需求严重依赖进口。
在细毛羊的实际育种过程中，为了提高同质毛羊的比例，人们往往采取淘汰异质毛绵羊个体的选种方法，但实际上这种剔除方式不能达到完全的净化效果，事实上，在美利奴细毛羊品种中也始终没有完全剔除出生羔羊的异质毛型现象。到目前为止，尚未见到定位决定羊毛同质性或异质性的主效基因。因此，也未见利用基因进行该方向选育的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高细毛羊羊毛同质性的分子育种方法，具体来说涉及绵羊GTL2-Mirg一段重复序列的不同基因型在毛用细毛羊羊毛同质性选育中的应用，可用于绵羊育种。
本发明提供了一种鉴定绵羊的GTL2-REs基因型的方法，包括如下步骤：
(1)以供试绵羊的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增；引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子，引物R1为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(2)将步骤(1)得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果显示单一特征带、该绵羊为GTL2-REs纯合基因型，如果显示两条特征带、该绵羊为GTL2-REs杂合基因型。
PCR扩增的反应体系中，引物F1的浓度为0.25mM，引物R1的浓度为0.25mM。PCR扩增的反应体系具体可为：引物F1 0.5μl，引物R1 0.5μl，2×taq PCR Mix 10μl，基因组DNA100ng，双蒸水补足20μl。
PCR扩增的反应程序具体可为：95℃5分钟；95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5min；4℃保存。
所述琼脂糖凝胶电泳具体可为1.5％琼脂糖凝胶电泳。
所述PCR扩增的产物大小为400-600bp。
所述PCR扩增的目标产物大小为400-600bp。
所述PCR扩增的特异性目标产物大小为400-600bp。
相应的，所述特征带位于400-600bp区间内。
本发明还提供了一种繁育具有同质毛性状的绵羊的方法，包括如下步骤：
采用上述方法鉴定绵羊的GTL2-REs基因型；
将GTL2-REs杂合基因型的母绵羊作为母本，获得后代。
所述母本为具有同质毛性状的绵羊。
所述方法中，将GTL2-REs纯合基因型的公绵羊作为父本。
所述父本为具有异质毛性状的绵羊。
本发明还保护一种辅助鉴定绵羊的被毛性状的方法，包括如下步骤：
采用上述方法鉴定绵羊的GTL2-REs基因型；
如果供试绵羊为GTL2-REs纯合基因型，其候选为具有异质毛性状的绵羊；如果供试绵羊为GTL2-REs杂合基因型，其候选为具有同质毛性状的绵羊。
本发明还提供了特异引物对，由引物F1和引物R1组成；引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子，引物R1为序列表的序列2所示的单链DNA分子。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定绵羊的被毛性状中的应用。
本发明还保护所述特异引物对在选育具有同质毛性状的绵羊中的应用。
本发明还保护所述特异引物对在繁育具有同质毛性状的绵羊中的应用。
以上任一所述绵羊为细毛羊。
以上任一所述绵羊为美利奴细毛羊。
以上任一所述绵羊为澳洲美利奴细毛羊。
本发明的发明人发现绵羊GTL2-Mirg基因区域一段重复序列，该重复序列具有多种拷贝形式，其基因型(纯合基因型或杂合基因型)与绵羊的被毛性状有关。进一步的，本发明的发明人发现，具有异质毛性状的美利奴细毛羊为母本的后代全具有异质毛性状，而具有同质毛性状的美利奴细毛羊为母本的后代全具有同质毛性状，即该被毛性状(同质毛性状或异质毛性状)为母本遗传。基于此，本发明开发了一种配种方法，有助于解决由于细毛羊“倒改”导致的羊毛异质化问题，而且对于细毛羊的同质化改良也提供了新的分子育种方案。本发明可以有效提高细毛羊的同质性，可解决在细毛羊育种中淘汰异质毛型个体的问题。
本发明在世界上首次发现绵羊GTL2-Mirg基因区域一段重复序列在不同被毛表型个体中存在基因型差异。进一步首次公开了GTL2-REs基因型在细毛羊毛用性状育种中的应用。本发明的方法可用于细毛羊同质毛的培育过程中，为防止幼龄异质毛后代的产生提供了新的分子育种方法。
附图说明
图1为部分样本的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为同质毛绵羊群体和异质毛绵羊群体中，GTL2-REs纯合基因型和GTL2-REs杂合基因型的比例。
图3为正交试验和反交试验的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所有绵羊，均在羔羊期观察被毛性状，判断为同质毛还是异质毛。实施例2中的受体母羊均为乌珠穆沁羊。
实施例1、绵羊GTL2-REs基因型检测
供试绵羊：滩羊(39只)、小尾寒羊(30只)、乌珠穆沁羊(37只)、滩寒杂羊(38只)、异质毛美利奴羊(13只)、同质毛美利奴羊(60只)、敖汉细毛羊(50只)、甘肃高山细毛羊(88只)。滩寒杂羊为滩羊和小尾寒羊的杂交后代。澳洲美利奴细毛羊的群内后代，部分被毛为异质毛的称为异质毛美利奴羊，剩下的被毛为同质毛的称为同质毛美利奴羊。
1、取供试绵羊的耳组织，提取基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增。
引物F1(序列表的序列1)：5'-GGTGTCTGCTCCTGGATGGT-3'；
引物R1(序列表的序列2)：5'-ATCAGCCAACAGTCAGTTCAGC-3'。
PCR扩增的特异性扩增产物大小为400-600bp。
PCR扩增的反应体系：引物F1 0.5μl，引物R1 0.5μl，2×taq PCR Mix 10μl，基因组DNA 100ng，双蒸水补足20μl。PCR扩增的反应体系中，引物F1的浓度为0.25mM，引物R1的浓度为0.25mM。
PCR扩增的反应程序：95℃5分钟；95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5min；4℃保存。
3、取步骤2得到的扩增产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，如果显示单一特征带、该绵羊为GTL2-REs纯合基因型，如果显示两条特征带、该绵羊为GTL2-REs杂合基因型。特征带位于400-600bp区间。
部分供试绵羊的电泳图见图1(特征带见图中的框图标注)。各个供试绵羊的基因型结果见表1(杂合子即GTL2-REs杂合基因型个体，纯合子即GTL2-REs纯合基因型个体)。异质毛美利奴羊均为GTL2-REs纯合基因型。同质毛美利奴羊中，95％为GTL2-REs杂合基因型，5％为GTL2-REs纯合基因型。
同质毛绵羊群体(由所有供试绵羊中的所有同质毛个体组成)和异质毛绵羊群体(由所有供试绵羊中的所有异质毛个体组成)中，GTL2-REs纯合基因型和GTL2-REs杂合基因型的比例见图2。针对所有样本，具有异质毛表型的绵羊主要为GTL2-REs纯合基因型，具有同质毛表型的绵羊主要为GTL2-REs杂合基因型。
表1
Figure BDA0002864508020000041
实施例2、GTL2-REs不同基因型在细毛羊羊毛同质性育种中的应用
1、反交试验
将实施例1中的1只异质毛美利奴羊母羊(GTL2-REs纯合基因型)作为母本，将实施例1中的1只同质毛美利奴羊公羊(GTL2-REs杂合基因型)作为父本。对母本进行同期发情和超数排卵处理，对父本进行精液人工采集，之后输精给母本，对母本进行冲胚处理，共冲出胚胎6枚。冲出的胚胎移植于5只受体母羊子宫内。45天后进行妊娠检查，5只受体怀孕，移植150天后产出5只羔羊，被毛均为异质毛。
2、正交试验
将实施例1中的1只异质毛美利奴羊公羊(GTL2-REs纯合基因型)作为父本，将实施例1中的7只同质毛美利奴羊母羊(GTL2-REs杂合基因型)作为母本。对母本进行同期发情和超数排卵处理，对父本进行精液人工采集，之后输精给母本，对母本进行冲胚处理，冲出的胚胎71枚，冻存18枚胚胎，剩余53枚冲出的胚胎移植于27只受体母羊子宫内。45天后进行妊娠检查，19只受体怀孕，移植150天后产出26只羊羔，被毛均为同质毛。
正交试验和反交试验方案和结果见图3。结果表明，美利奴细毛羊的异质毛性状只通过母本遗传给后代羔羊，无法通过父本遗传给后代羔羊。将GTL2-REs杂合基因型的绵羊作为母本，将GTL2-REs纯合基因型的绵羊作为父本，可以获得有效降低幼龄异质毛后代的产生，提高群体的羊毛同质性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
                         序列表
<110>  中国农业大学
<120>  一种提高细毛羊羊毛同质性的分子育种方法
<130>  GNCYX203416
<160>  2
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
ggtgtctgct cctggatggt                                              20
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
atcagccaac agtcagttca gc                                           22

Claims (2)

1.一种繁育具有同质毛性状的绵羊的方法，包括如下步骤：
(1)以供试绵羊的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增；引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子，引物R1为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(2)将步骤(1)得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果显示单一特征带，该绵羊为GTL2-REs纯合基因型，如果显示两条特征带，该绵羊为GTL2-REs杂合基因型；所述特征带位于400-600bp区间内；
(3)将GTL2-REs杂合基因型且具有同质毛性状的母绵羊作为母本，将GTL2-REs纯合基因型且具有异质毛性状的公绵羊作为父本，获得后代；
所述绵羊为美利奴细毛羊。
2.一种辅助鉴定绵羊的同质毛性状和异质毛性状的方法，包括如下步骤：
(1)以供试绵羊的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增；引物F1为序列表的序列1所示的单链DNA分子，引物R1为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(2)将步骤(1)得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果显示单一特征带，该绵羊为GTL2-REs纯合基因型，如果显示两条特征带，该绵羊为GTL2-REs杂合基因型；所述特征带位于400-600bp区间内；
(3)如果供试绵羊为GTL2-REs纯合基因型，其候选为具有异质毛性状的绵羊；如果供试绵羊为GTL2-REs杂合基因型，其候选为具有同质毛性状的绵羊；
所述绵羊为美利奴细毛羊。
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