CN114686521A - 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。具体地，本发明提供了一种用于治疗视网膜脱离的重组基因表达载体，所述的表达载体为AAV载体，其中插入有或携带有用于治疗视网膜脱离的治疗基因的表达盒；所述治疗基因包括：编码可用于结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白片段的基因。本发明的重组基因表达载体能显著降低视网膜外核层细胞焦亡、增加小鼠感光细胞的存活率。

Description

一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，涉及一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。

背景技术

视网膜脱离(Retinal Detachemnt，RD)为孔源性视网膜脱离、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等多种视网膜脉络膜疾病的一个共同病理特征。视网膜脱离，即视网膜神经上皮层与RPE及脉络膜复合体分离，临床上主要表现为视力下降，视物遮挡，眼前飘浮物、闪光感，当神经上皮的脱离范围扩大至黄斑区时，患者视力迅速下降。由于RPE及脉络膜复合体等是外层视网膜神经纤维层/光感受器细胞的主要氧气、血液、能量物质来源，又光感受器细胞内氧化代谢活跃，以维持正常视觉化学信号-电信号转化形成视觉功能，因此，当视网膜脱离发生后，光感受器细胞的氧气、能量物质供应中断，引起大量感光细胞迅速死亡，是其引起视力损害的关键性病理基础，而焦亡作为一种高度促炎的细胞死亡形式，在光感受器损伤中起到重要作用。

Gasdermin D是细胞焦亡过程的执行蛋白，焦亡作为一种新进发现的细胞死亡方式，表现出剧烈的细胞爆炸式形态学特征，并伴随有强烈的炎症因子释放及炎症反应。不同于细胞凋亡、细胞自噬等细胞死亡形式，其具有独特的细胞死亡形态学特征及通路机制。在很长一段时间内，其终末效应蛋白未被人们所了解和研究。新近研究发现，一种被称为Gasdermin的功能未知的蛋白家族，在炎症小体激活的前提下被炎性Caspase蛋白剪切完成焦亡过程。活化的Caspase-1蛋白会于GSDMD蛋白的276位点进行剪切，形成的分子量约31kda的Gsdmd氨基段(Gsdmd-N)，GSDMD-N转移并锚定至细胞膜上，形成非选择性离子通道，破坏细胞内外渗透压，促使胞内物质向外界释放，进而完成细胞焦亡过程，与此同时，过表达Gsdmd的碳基端(Gsdmd-C)，可以一定程度上抑制细胞焦亡的发生，达到保护细胞功能的作用。

目前，关于抑制该Gsdmd-N蛋白的方法与其在治疗视网膜脱离光感受器细胞损伤死亡方面的应用，还未见报道。

因此，本领域迫切需要开发一种有效地抑制感光细胞损伤焦亡导致的视网膜脱离的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效地抑制感光细胞损伤焦亡导致的视网膜脱离的方法。

具体地，本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种重组腺相关病毒载体。

本发明的第二个目的是，提供一种所述重组腺相关病毒载体的制备方法。

本发明的第三个目的是，提供一种药物组合物。

本发明的第四个目的是，提供一种所述重组腺相关病毒载体的应用。

本发明的第五个目的是，提供一种治疗视网膜脱离感光细胞焦亡的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

提供一种重组腺相关病毒载体，所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达Gsdmd-C-HA蛋白的基因序列，Gsdmd-C-HA蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

优选地，所述表达Gsdmd-C-HA蛋白的基因序列选自与SEQ ID NO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。

更优选地，所述表达Gsdmd-C-HA蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述增强子/启动子为CMV，选自与SEQ ID NO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。

更优选地，所述增强子/启动子为CMV的序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述的重组腺相关病毒载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQ ID NO:5有至少90％同源性的核苷酸序列。

优选地，所述重组腺相关病毒载体含有CMV增强子/启动子、表达Gsdmd-C-HA的基因序列、β-globin内含子、hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)、L-ITR、R-ITR、Ampicillin抗性基因、f1 ori。

更优选地，所述表达Gsdmd-C-HA蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述L-ITR序列如SEQ ID NO:3所示，所述CMV增强子/启动子序列SEQ ID NO:4所示，所述β-globin内含子序列如SEQ ID NO:5所示，所述hGHpA序列如SEQ ID NO:7所示，所述R-ITR序列如SEQID NO:8所示，所述Ampicillin抗性序列如SEQ ID NO:9所示，所述f1 ori序列如SEQ IDNO:11所示。

优选地，所述的重组腺相关病毒载体序列含有SEQ ID NO:10。

更优选地，所述的重组腺相关病毒载体序列如SEQ ID NO:12所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种如上任一所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

1)构建重组质粒AAV_Gsdmd-C-HA，主要元件包括CMV增强子/启动子及Gsdmd-C-HA基因序列；

2)将含有AAV外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_Gsdmd-C-HA质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体；

3)将上述重组腺相关病毒载体经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化；

4)之后用pH＝8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集；

5)收集的液体通过浓缩器后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩，用DNase I消化掉浓缩液中病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度；

6)最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80℃储存。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗视网膜脱离感光细胞损伤焦亡的药物组合物，所述的药物组合物含有如上任一所述的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体，所述的药物组合物表达Gsdmd-C-HA蛋白。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的腺相关病毒载体在制备治疗视网膜脱离感光细胞损伤焦亡的药物中的应用。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗视网膜脱离感光细胞损伤焦亡的方法，将如上任一所述的腺相关病毒载体给予需要治疗的个体。

优选地，给药方法为眼内注射。

更优选地，所述的眼内注射为视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

在本发明的第一方面，提供了一种用于治疗视网膜脱离的重组基因表达载体，所述的表达载体为AAV载体，其中所述的腺相关病毒(AAV)载体中，插入有或携带有用于治疗视网膜脱离的治疗基因的表达盒；

其中，所述治疗基因包括：编码可用于结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白片段的基因；其中，Gsdmd蛋白的N端结构域为Gsdmd蛋白的氨基酸序列的第1位至第276位的结构域，所述第1位和第276位是对应于如SEQ ID NO:13所示序列的第1位和第276位。

在另一优选例中，所述治疗视网膜脱离是治疗感光细胞损伤焦亡导致的视网膜脱离。

在另一优选例中，所述可用于结合Gsdmd蛋白的N端结构域的蛋白片段为Gsdmd蛋白的C端结构域片段。

在另一优选例中，所述Gsdmd蛋白的C端结构域片段包括对应于如SEQ ID NO:13所示序列的第277至484位(较佳地，第275至484位；更佳地，第276至484位)的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述Gsdmd蛋白的C端结构域片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在另一优选例中，用于结合Gsdmd蛋白的N端结构域的蛋白片段中还包括蛋白标签序列。

在另一优选例中，所述蛋白标签选自下组：HA标签、His标签、GST标签、c-Myc标签、Flag标签、mCherry标签、Avi标签，或其组合。

在另一优选例中，所述蛋白标签为HA标签。

在另一优选例中，所述用于结合Gsdmd蛋白的N端结构域的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，所述的腺相关病毒选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV2-AAV3、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAVHSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV clone 32/83、AAVShH10、AAV2(Y->F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、AAVr3.45、AAV2或AAV5。

在另一优选例中，所述腺相关病毒为AAV2。

在另一优选例中，所述腺相关病毒为单链AAV2。

在另一优选例中，所述重组基因表达载体包含以下元件：治疗基因表达盒、分别位于所述表达盒两侧的反向末端重复序列(TR)、抗性基因、F1 ori序列。

在另一优选例中，所述治疗基因表达盒包含以下元件：增强子/启动子、治疗基因序列、hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)、β-globin内含子。

在另一优选例中，所述分别位于所述表达盒两侧的反向末端重复序列(TR)包括L-ITR和R-ITR。

在另一优选例中，所述增强子/启动子是CMV增强子/启动子。

在另一优选例中，所述治疗基因的序列如SEQ ID NO:1所示，或是与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述CMV增强子/启动子的序列如SEQ ID NO:4所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述β-globin内含子的序列如SEQ ID NO:5所示，或与是其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述hGHpA的序列如SEQ ID NO:7所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述L-ITR的序列如SEQ ID NO:3所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述R-ITR的序列如SEQ ID NO:8所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述抗性基因为抗氨苄西林(Ampicillin)基因，其序列如SEQID NO:9所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述F1 ori的序列如SEQ ID NO:11所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述重组基因表达载体含有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述重组基因表达载体的序列如SEQ ID NO:12所示。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，包括：

(i)如本发明第一方面所述的重组基因表达载体；

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70-99wt％。

在另一优选例中，所述药物组合物是液态剂型的。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂或滴剂。

在另一优选例中，所述药物组合物是用于眼内注射的注射剂型。

在另一优选例中，所述的眼内注射为视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

在另一优选例中，所述药物组合物是用于滴入眼内的滴剂。

在另一优选例中，所述载体选自下组：水、BBS(Balanced SaltSolution)磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油、山梨醇，或其组合。

在另一优选例中，所述载体中还可包含：润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、稳定剂，或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为滴剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：透明质酸钠、蒸馏水。

在另一优选例中，所述的药物组合物在治疗视网膜脱离的应用中，可单独使用，或联合使用。

在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其他治疗视网膜脱离的药物联合使用。

在另一优选例中，所述的其他治疗视网膜脱离的药物包括：灵杞黄斑颗粒、地苓网膜颗粒，或其组合。

在本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的重组基因表达载体的用途，用于制备一制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于治疗视网膜脱离。

在另一优选例中，所述制剂或药物组合物用于治疗感光细胞损伤焦亡所导致的视网膜脱离患者。

在本发明的第四方面，提供了一种治疗视网膜脱离的方法，其特征在于，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的重组基因表达载体或如本发明第三方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述施用的方式为眼内注射。

在另一优选例中，所述施用的方式为视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

在另一优选例中，所述施用剂量为1×10¹⁰-1×10¹⁴个重组基因表达载体所形成的病毒颗粒。

在本发明的第五方面，提供了一种制备本如本发明第一方面所述的基因表达载体的方法，包括步骤：将用于治疗视网膜脱离的治疗基因的表达盒连入AAV载体，从而获得如本发明第一方面所述的基因表达载体。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)构建重组质粒AAV_Gsdmd-C-HA，主要元件包括CMV增强子/启动子及Gsdmd-C-HA基因序列；

(ii)将含有AAV外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_Gsdmd-C-HA质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体；

(iii)将上述重组腺相关病毒载体经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化；

(iv)之后用pH＝8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集；

(v)收集的液体通过浓缩器后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩，用DNase I消化掉浓缩液中病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度；和

(vi)用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80℃储存。

在本发明的第六方面，提供了一种药盒，包括：

(i)第一容器，以及位于第一容器中活性成分(a)，所述的活性成分(a)是如本发明第一方面所述的重组基因表达载体或如本发明第三方面所述的药物组合物；

(ii)任选的第二容器，以及位于第二容器中的活性成分(b)，所述的活性成分(b)是其他治疗视网膜脱离的药物或其活性成分；和

(iii)任选的第三容器，以及位于第三容器中的注射器。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了给予活性成分(a)和(b)从而治疗视网膜脱离的说明。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述注射器是注射用给药器，优选地为注射针。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同的容器，优选地，所述活性成分(a)以一次给药量的剂量位于所述注射器中。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是病毒载体AAV_Gsdmd-C-HA的特征图谱及各元件的起止位点。

图2是Brown-Norway大鼠视网膜下注射AAV_Gsdmd-C-HA三周后视网膜切片，免疫荧光染色图。

图3是Brown-Norway大鼠视网膜下注射AAV_Gsdmd-C-HA或AAV-GFP，3周后，在视网膜下注射HA造成视网膜脱离，视网膜脱离1天后视网膜的PI染色图。

图4是Brown-Norway大鼠视网膜下注射AAV_Gsdmd-C-HA或AAV-GFP，3周后，在视网膜下注射粘弹剂造成视网膜脱离，视网膜脱离1天后视网膜的PI染色图，图示为其PI染色后进行焦亡细胞计数和存活率分析结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种能够有效地抑制感光细胞损伤焦亡的重组基因表达载体。具体地，本发明对人Gsdmd-C-HA基因序列进行了优化，选择了合适的载体和相关元件，构建了重组腺相关病毒载体构建Gsdmd-C-HA。动物实验表明，AAV_Gsdmd-C-HA在大鼠光感受器细胞内的感染效果优异，且在细胞核内稳定表达，是一种稳定的重组腺相关病毒载体，能显著降低视网膜外核层细胞焦亡、增加小鼠感光细胞的存活率。在此基础上完成了本发明。

本发明的治疗基因

如本文所用，术语“治疗基因”是指本发明中提供的用于治疗视网膜脱离的重组基因表达载体中的治疗基因，其编码的蛋白可结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白或其片段。

如本文所用，术语“本发明治疗基因编码的蛋白”、“本发明重组蛋白”、“融合蛋白”可互换使用，均是指前述可结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白或其片段。

在本发明的一个实施方式中，所述可用于结合Gsdmd蛋白的N端结构域的蛋白片段为Gsdmd蛋白的C端结构域片段。优选地，所述Gsdmd蛋白的C端结构域片段包括对应于如SEQID NO:13所示序列的第277至484位(较佳地，第275至484位；更佳地，第276至484位)的氨基酸序列。更加优选地，所述Gsdmd蛋白的C端结构域片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

用于结合Gsdmd蛋白的N端结构域的蛋白片段中还包括蛋白标签序列。在一个实施方式中，所述蛋白标签选自下组：HA标签、His标签、GST标签、c-Myc标签、Flag标签、mCherry标签、Avi标签，或其组合。优选地，所述蛋白标签为HA标签。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述用于结合Gsdmd蛋白的N端结构域的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因是部分人源的，但是来源于其它类似的物种(尤其是哺乳动物)的、与本发明的治疗基因编码的蛋白序列(优选地，序列如SEQ IDNO:2所示)具有一定同源性(保守性)的氨基酸序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它物种(尤其是哺乳动物)中分离得到该序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。治疗基因序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

编码融合蛋白的多核苷酸包括:只编码融合蛋白的编码序列；融合蛋白的编码序列和各种附加编码序列；融合蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码融合蛋白的多核苷酸”或“本发明治疗基因”可以是包括编码所述融合蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多苷或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的融合蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酞胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明融合蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明融合蛋白序列中。

本发明涉及一种用于治疗治疗视网膜脱离的治疗基因，在本发明的一个优选例中，所述治疗基因所编码的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明治疗基因所编码的融合蛋白能够有效结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白片段，从而抑制感光细胞损伤焦亡导致的视网膜脱离。

本发明还包括与本发明的SEQ ID NO:2所示序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。

所述“相同或相似功能”主要是指：“有效结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白片段，从而抑制感光细胞损伤焦亡导致的视网膜脱离”的功能。

本发明的融合蛋白可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的融合蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的融合蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的融合蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有本发明融合蛋白的活性的其他多肽片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的融合蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明中，所述的融合蛋白变体是如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，经过若干个(通常为1-10个，较佳地1-8个，更佳地1-4个，最佳地1-2个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内，更佳地为3个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或N末端添加一个或数个(如1-3个)氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括所要求保护的蛋白的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO:2差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述列举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。

重组基因治疗载体

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)家族的一个成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得AAV成为用于基因转移的有吸引力的工具。

重组腺相关病毒(rAAV)仍然存在一些不足，如重组病毒不稳定，病毒滴度低，接纳治疗基因的容量仍然有限(一般仅能插入的外源性基因片段最大约2000碱基对(bp)，否则rAAV的稳定性将被破坏)。因此，需要设计合理的重组腺相关病毒(rAAV)载体，以满足实际应用的需要。

在本发明中，提供了一种用于治疗视网膜脱离的重组基因表达载体，本发明所述的表达载体为AAV载体，其中，所述的腺相关病毒(AAV)载体中，插入有或携带有用于治疗视网膜脱离的治疗基因的表达盒；其中所述治疗基因包括：编码可用于结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白片段的基因；其中，Gsdmd蛋白的N端结构域为Gsdmd蛋白的氨基酸序列的第1位至第276位的结构域，所述第1位和第276位是对应于如SEQ ID NO:13所示序列的第1位和第276位。

优选地，所述治疗视网膜脱离是治疗感光细胞损伤焦亡导致的视网膜脱离。

此外，本发明所述的重组基因表达载体包含以下元件：治疗基因表达盒、分别位于所述表达盒两侧的反向末端重复序列(TR)、抗性基因、F1 ori序列。其中，所述治疗基因表达盒包含以下元件：增强子/启动子、治疗基因序列、hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)、β-globin内含子。

其中，所述分别位于所述表达盒两侧的反向末端重复序列(TR)包括L-ITR和R-ITR。并且，所述增强子/启动子是CMV增强子/启动子。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述治疗基因的序列如SEQ ID NO:1所示，或是与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述CMV增强子/启动子的序列如SEQ ID NO:4所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述β-globin内含子的序列如SEQ ID NO:5所示，或与是其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述hGHpA的序列如SEQ ID NO:7所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述L-ITR的序列如SEQ ID NO:3所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述R-ITR的序列如SEQ ID NO:8所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述抗性基因为抗氨苄西林(Ampicillin)基因，其序列如SEQID NO:9所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述F1 ori的序列如SEQ ID NO:11所示，或是与其具有至少90％(优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式中，所述重组基因表达载体含有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

在一个更加优选的实施方式中，，所述重组基因表达载体的序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体，根据本发明，病毒表达载体是腺相关病毒(AAV)载体，诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAVHSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV clone 32/83、AAVShH10、AAV2(Y->F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、AAVr3.45、AAV2或AAV5，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。

在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2或5载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV2载体。

本发明的AAV载体为单链AAV，可根据标准技术生产重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷-10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。

在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。

能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。

在一个优选的实施方式中，用于人的AAV的合适剂量在约1×10¹⁰-1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内。

基因治疗载体可以是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。

药物组合物及药盒

如本文所用，术语“包括”包括了“含有”、“基本上由……构成”和“由……构成”。

如本文所用，术语“基本上由……构成”指在药物组合物中，除了含有有效活性成分或辅助成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。

术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，即这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明；在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、BBS(BalancedSaltSolution)磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。

另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂等。

在本发明的实施方式中，所述药物组合物是液态剂型的；优选地为注射剂或滴剂。

在一个实施方式中，所述药物组合物是用于眼内注射的注射剂型；例如，所述的眼内注射为视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。在一个实施方式中，所述药物组合物是用于滴入眼内的滴剂。

本发明的药物组合物在治疗视网膜脱离的应用中，可单独使用，或联合使用。所述的联合使用包括：与其他治疗视网膜脱离的药物联合使用。其中，所述的其他治疗视网膜脱离的药物包括：灵杞黄斑颗粒、地苓网膜颗粒，或其组合。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的Gsdmd-C-HA基因序列是进行优化后的序列，具有合适的载体和相关元件，以高效地表达Gsdmd-C-HA。

(2)本发明的AAV_Gsdmd-C-HA在大鼠光感受器细胞内的感染效果优异，且在细胞核内稳定表达，是一种稳定的重组腺相关病毒载体，能显著降低视网膜外核层细胞焦亡、增加小鼠感光细胞的存活率。

(3)本发明的重组基因表达载体可用于制备治疗视网膜脱离感光细胞损伤凋亡的焦亡，具有广泛的市场前景。

(4)本发明的焦亡抑制蛋白Gsdmd-C-HA,可在视网膜脱离后的感光细胞死亡高峰期一天时发挥抑制作用，及时挽救受损的视网膜组织。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：重组腺相关病毒载体的构建和分离纯化

基因序列

SEQ ID NO:1所示的是Gsdmd-C-HA核苷酸序列；

SEQ ID NO:2所示的是Gsdmd-C-HA氨基酸序列；

SEQ ID NO:3所示的是Left ITR核苷酸序列；

SEQ ID NO:4所示的是CMV序列；

SEQ ID NO:5所示的是humanβ-globin内含子序列；

SEQ ID NO:6所示的是MCS核苷酸序列；

SEQ ID NO:7所示的是hGHpA核苷酸序列；

SEQ ID NO:8所示的是Right ITR序列；

SEQ ID NO:9所示的是Ampicillin抗性序列；

SEQ ID NO:10所示的是全核苷酸序列；

SEQ ID NO:11所示的是f1 ori序列；

SEQ ID NO:12所示的是重组序列。

质粒AAV_Gsdmd-C-HA的构建、特征图谱及各元件的起止位点如图1所示，主要元件包括CMV增强子/启动子(SEQ ID NO:4)及Gsdmd-C-HA序列(SEQ ID NO:1)，CMV增强子可以增强转入基因的表达，目的基因之后紧接着是hGHpA(SEQ ID NO:7)，表达盒两侧是反向末端重复序列(TR)，即病毒载体包括L-ITR(SEQ ID NO:3)，R-ITR(SEQ ID NO:8)，病毒载体还包括Ampicillin抗性基因序列(SEQ ID NO:9)和f1 ori序列(SEQ ID NO:11)。

病毒载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_Gsdmd-C-HA质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体；经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化，使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)；之后用pH8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集；收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩；再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度；最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80℃储存。

实施例2：重组腺相关病毒载体对视网膜脱离模型小鼠的治疗

2.1实验材料

2.1.1实验动物

正常Brown-Norway雄性大鼠购自北京维通利华实验动物有限责任公司，光照周期为12h光照-12h黑暗，自由采食，自由饮水，所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。

2.1.2实验试剂及耗材

生理盐水(浙江天瑞药业有限公司)，一次性注射针头(美国Becton Dickinsonand Company公司)，HA抗体(Cell signaling technology)，PI(Sigma Aldrich公司)，二抗山羊抗兔IgG(JacksonImmuno)，山羊血清(Sigma)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(Sigma)，多聚甲醛(Sigma)。

2.1.3实验仪器

眼科实验手术显微镜(日本Nikon公司)；眼科显微器械(苏州明仁医疗器械有限公司)；微量进样器(美国Hamilton公司)；共聚焦显微镜(德国徕卡公司)。

2.2大鼠视网膜脱离模型的构建

托吡卡胺眼药水扩瞳大鼠右眼两次，每次间隔10min，腹腔注射麻醉大鼠；向麻醉后的大鼠角膜滴加表面麻醉滴眼液，将大鼠置于显微操作镜下；剪开颞侧结膜，于角巩缘后方3mm处34G针头巩膜穿刺，形成全层巩膜切口，镜下直视见到针尖斜面完全进入玻璃体腔后退出针头；连接于微量注射器的玻璃针针头通过巩膜切口进入玻璃体腔，直视下缓慢进入视网膜下腔，微微推动注射器，观察到神经上皮与色素上皮层轻度脱离后，直视下确认针头位于视网膜下，而非脉络膜下或玻腔内，向网膜下缓慢注射0.05ml透明质酸钠，见灰白色视网膜进一步隆起，形成3-4个视网膜隆起。显微镜下观察视网膜脱离已形成，高度及范围超过全视网膜的80％，向巩膜切口处滴加生物组织胶水封闭，最后典必殊眼膏涂于大鼠术眼角膜表面。恒温加热垫上复苏大鼠至麻醉苏醒。

2.3处理方法

2.3.1视网膜下注射

使用34G针头，于视网膜边缘、角膜巩膜交界靠后处进针穿刺，当针头前端进入视网膜下时，进行注射，注射时需注意进针角度和深度，注意避免损伤晶体或其他眼内组织。

2.3.2组织处理

动物先经由PBS进行全身灌注，后继续用4％多聚甲醛(PFA)灌注，灌注速度为5mL/分钟。眼球及视神经取出后在4％PFA溶液中浸泡约2小时。组织染色前需在0.1M PBS中4℃储存；组织冰冻切片前需在30％蔗糖溶液中浸泡过夜。

2.4表达Gsdmd-HA蛋白的腺相关病毒感染及检测

造模成功的大鼠视网膜下注射AAV_Gsdmd-C-HA两周后，据前述组织处理方法进行眼球的前处理，后使用显微镊夹住眼球底部向上提起，用剪刀剪断眼球周围的结膜和肌肉组织，保持眼球组织完整，剪去角膜、虹膜和晶状体做成眼杯，在30％蔗糖溶液中浸泡过夜，制作10μm厚组织切片。

免疫荧光染色：选取视网膜，在20％山羊血清溶液中封闭1h，后一抗孵育过夜，抗体HA，PBS清洗三次，每次10min，后二抗孵育1h，PBS清洗三次，每次10min后封片；使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照。

结果：

大鼠注射AAV_Gsdmd-C-HA两周后，进行视网膜切片免疫荧光染色，可见大量AAV_Gsdmd-C-HA，且定位在细胞膜表达，环绕DAPI，显示AAV_Gsdmd-C-HA的感染效果优异(图2)。

2.5感光细胞焦亡率检测

8周龄大鼠单侧眼视网膜下注射AAV_Gsdmd-C-HA(实验组)、AAV_GFP(对照组)，3周后制作视网膜脱离模型，视网膜脱离3天后，据上述组织处理方法处理眼球及视网膜，进行免疫荧光染色，使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照，每个眼球选取5个视野计数PI阳性细胞数(比例尺：25μm)，并计算感光细胞存活率。

结果：

分组	PI数目
		空白组	0.00±0.00
模型组	854.0±62.04
		对照组	835.3±51.15
实验组	415.0±10.39

由上表可见，与空白组相比，模型组、对照组以及实验组感光细胞PI阳性数目增加，具有统计学差异(P<0.05)，与模型组相比，对照组PI阳性细胞数目无统计学差异(P>0.05)，与对照组相比，实验组PI阳性细胞显著减少，结果具有统计学差异(P<0.05)。

定量分析证明视网膜脱离后感光细胞在1天达到焦亡高峰，感光细胞层厚度显著减小(模型组、对照组)；与之对比，注射AAV_Gsdmd-C-HA大鼠感光细胞焦亡不显著，显示AAV_Gsdmd-C-HA对感光细胞具有保护作用(图3、图4)。

由上述实验可见，本发明的重组腺相关病毒AAV_Gsdmd-C-HA能显著降低小鼠感光细胞焦亡，有效的治疗视网膜脱离感光细胞损伤。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用

<130> P2019-1588

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgggaacca atgaggaaga agtaatcagg gaagacttcc aaggcctgcg tgcggaggtg 60

gaggcaggct cttcagaact gcggagctta gaaatggagt tgagacaaca gctactagta 120

gacatcggga ggattttaca ggaccagccc agcatggaag ccttagaggc ctcactagag 180

cagggtctgt gcagtggtga gcaggtagag cctctggaag gcccagcagg cagcatcctt 240

gagtgtctgg tgctcgactc tggagaactg gtgccggaac ttgcagcccc cgtcttctac 300

ctgttgggag cactggctgg gttgagtgaa acccagcagc agctactggc tactaaggct 360

ctggaggcaa cggtgctgtc aaaggagcta gagttggtga agcacgtctt ggaacagagc 420

accccatggc aggagcagag atctgtgccc ctgccctcca ggctccttgg ggacagctgg 480

gatgaggagg ctctcacctg ggtcttgcta gaagaatgtg gcctaacgct gcaggtggaa 540

cccccccagg tatactggga accaacatct cagggcccca tatgtgcact ctatgcctcc 600

ctggccctat tgtcaagtct aggccagaaa tcgtgttacc catacgatgt tccagattac 660

gcttcg 666

<210> 2

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Gly Thr Asn Glu Glu Glu Val Ile Arg Glu Asp Phe Gln Gly Leu

1 5 10 15

Arg Ala Glu Val Glu Ala Gly Ser Ser Glu Leu Arg Ser Leu Glu Met

20 25 30

Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Val Asp Ile Gly Arg Ile Leu Gln Asp

35 40 45

Gln Pro Ser Met Glu Ala Leu Glu Ala Ser Leu Glu Gln Gly Leu Cys

50 55 60

Ser Gly Glu Gln Val Glu Pro Leu Glu Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu

65 70 75 80

Glu Cys Leu Val Leu Asp Ser Gly Glu Leu Val Pro Glu Leu Ala Ala

85 90 95

Pro Val Phe Tyr Leu Leu Gly Ala Leu Ala Gly Leu Ser Glu Thr Gln

100 105 110

Gln Gln Leu Leu Ala Thr Lys Ala Leu Glu Ala Thr Val Leu Ser Lys

115 120 125

Glu Leu Glu Leu Val Lys His Glu Leu Val Lys His Val Leu Glu Gln

130 135 140

Ser Thr Pro Trp Gln Glu Leu Pro Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ser Trp

145 150 155 160

Asp Glu Glu Ala Leu Thr Trp Val Leu Leu Glu Glu Cys Gly Leu Thr

165 170 175

Leu Gln Val Glu Pro Pro Gln Val Tyr Trp Glu Pro Thr Ser Gln Gly

180 185 190

Pro Ile Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Leu Ala Leu Leu Ser Ser Leu Gly

195 200 205

Gln Lys Ser Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

210 215 220

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc t 141

<210> 4

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

acgcgtggaa ttcgctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgt caatagggac 180

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360

agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420

gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480

caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 540

ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 600

atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc 660

agc 663

<210> 5

<211> 493

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gattcgaatc ccggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc caagagtgac 60

gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acaaaaaatg ctttcttctt ttaatatact 120

tttttgttta tcttatttct aatactttcc ctaatctctt tctttcaggg caataatgat 180

acaatgtatc atgcctcttt gcaccattct aaagaataac agtgataatt tctgggttaa 240

ggcaatagca atatttctgc atataaatat ttctgcatat aaattgtaac tgatgtaaga 300

ggtttcatat tgctaatagc agctacaatc cagctaccat tctgctttta ttttatggtt 360

gggataaggc tggattattc tgagtccaag ctaggccctt ttgctaatca tgttcatacc 420

tcttatcttc ctcccacagc tcctgggcaa cgtgctggtc tgtgtgctgg cccatcactt 480

tggcaaagaa ttg 493

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

atcgattgaa ttccccgggg atcctctaga gtcgacctgc agaagcttgc ctcgagcagc 60

gctgctcgag agatct 76

<210> 7

<211> 479

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60

cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300

tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210> 9

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840

tcactgatta agcattggta a 861

<210> 10

<211> 4654

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

atgggaacca atgaggaaga agtaatcagg gaagacttcc aaggcctgcg tgcggaggtg 60

gaggcaggct cttcagaact gcggagctta gaaatggagt tgagacaaca gctactagta 120

gacatcggga ggattttaca ggaccagccc agcatggaag ccttagaggc ctcactagag 180

cagggtctgt gcagtggtga gcaggtagag cctctggaag gcccagcagg cagcatcctt 240

gagtgtctgg tgctcgactc tggagaactg gtgccggaac ttgcagcccc cgtcttctac 300

ctgttgggag cactggctgg gttgagtgaa acccagcagc agctactggc tactaaggct 360

ctggaggcaa cggtgctgtc aaaggagcta gagttggtga agcacgtctt ggaacagagc 420

accccatggc aggagcagag atctgtgccc ctgccctcca ggctccttgg ggacagctgg 480

gatgaggagg ctctcacctg ggtcttgcta gaagaatgtg gcctaacgct gcaggtggaa 540

cccccccagg tatactggga accaacatct cagggcccca tatgtgcact ctatgcctcc 600

ctggccctat tgtcaagtct aggccagaaa tcgtgttacc catacgatgt tccagattac 660

gcttcggtaa caactccgcc ccattgacgc aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720

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acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg attcgaatcc cggccgggaa 840

cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc ctatagagtc 900

tataggccca caaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta 960

atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg 1020

caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 1080

tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 1140

gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 1200

gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 1260

cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tgggattcga 1320

acatcgattg aattccccgg ggatcctcta gagtcgacct gcagaagctt gcctcgagca 1380

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ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca 1500

ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca 1560

aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga 1620

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tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat 1800

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ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga 1920

acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 1980

gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 2040

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ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 2460

aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 2520

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt 2580

acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc 2640

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ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 2820

ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2880

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 2940

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 3000

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 3060

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 3120

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catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 3360

aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 3420

ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 3480

gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 3540

aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 3600

gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 3660

gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 3720

gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 3780

gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 3840

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 3900

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3960

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4020

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ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4140

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4200

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4260

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gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 4560

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ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgt 4654

<210> 11

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 60

gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 120

aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 180

cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 240

acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 300

tattgg 306

<210> 12

<211> 6124

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggaat tcgctagtta ttaatagtaa 180

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 240

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tatgttccca tagtaacgtc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 540

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 600

cccattgacg tcaatgggag tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 660

gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 720

taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 780

acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg attcgaatcc cggccgggaa 840

cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc ctatagagtc 900

tataggccca caaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta 960

atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg 1020

caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 1080

tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 1140

gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 1200

gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 1260

cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tgggattcga 1320

acatcgattg aattccacca tgatggtcag aaagcctgtt gtgtccacca tctccaaagg 1380

aggttacctg cagggaaatg ttaacgggag gctgccttcc ctgggcaaca aggagccacc 1440

tgggcaggag aaagtgcagc tgaagaggaa agtcacttta ctgaggggag tctccattat 1500

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gggcagcgtg ggcatgtctc tgaccatctg gacggtgtgt ggggtcctgt cactatttgg 1620

agctttgtct tatgctgaat tgggaacaac tataaagaaa tctggaggtc attacacata 1680

tattttggaa gtctttggtc cattaccagc ttttgtacga gtctgggtgg aactcctcat 1740

aatacgccct gcagctactg ctgtgatatc cctggcattt ggacgctaca ttctggaacc 1800

attttttatt caatgtgaaa tccctgaact tgcgatcaag ctcattacag ctgtgggcat 1860

aactgtagtg atggtcctaa atagcatgag tgtcagctgg agcgcccgga tccagatttt 1920

cttaaccttt tgcaagctca cagcaattct gataattata gtccctggag ttatgcagct 1980

aattaaaggt caaacgcaga actttaaaga cgccttttca ggaagagatt caagtattac 2040

gcggttgcca ctggcttttt attatggaat gtatgcatat gctggctggt tttacctcaa 2100

ctttgttact gaagaagtag aaaaccctga aaaaaccatt ccccttgcaa tatgtatatc 2160

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tgctgaggag ctgctgcttt caaatgcagt ggcagtgacc ttttctgagc ggctactggg 2280

aaatttctca ttagcagttc cgatctttgt tgccctctcc tgctttggct ccatgaacgg 2340

tggtgtgttt gctgtctcca ggttattcta tgttgcgtct cgagagggtc accttccaga 2400

aatcctctcc atgattcatg tccgcaagca cactcctcta ccagctgtta ttgttttgca 2460

ccctttgaca atgataatgc tcttctctgg agacctcgac agtcttttga atttcctcag 2520

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atgcccagat atgcatcgtc ctttcaaggt gccactgttc atcccagctt tgttttcctt 2640

cacatgcctc ttcatggttg ccctttccct ctattcggac ccatttagta cagggattgg 2700

cttcgtcatc actctgactg gagtccctgc gtattatctc tttattatat gggacaagaa 2760

acccaggtgg tttagaataa tgtcagagaa aataaccaga acattacaaa taatactgga 2820

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gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata 3000

ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg 3060

cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa 3120

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aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca 3240

tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca 3300

aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg 3360

taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 3420

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tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 3660

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 3720

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ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta 3960

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 4020

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tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg 4260

atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 4320

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cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 4560

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 4620

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aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 5640

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 5700

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 5760

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acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 5940

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 6000

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 6060

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 6120

atgt 6124

<210> 13

<211> 484

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Met Gly Ser Ala Phe Glu Arg Val Val Arg Arg Val Val Gln Glu Leu

1 5 10 15

Asp His Gly Gly Glu Phe Ile Pro Val Thr Ser Leu Gln Ser Ser Thr

20 25 30

Gly Phe Gln Pro Tyr Cys Leu Val Val Arg Lys Pro Ser Ser Ser Trp

35 40 45

Phe Trp Lys Pro Arg Tyr Lys Cys Val Asn Leu Ser Ile Lys Asp Ile

50 55 60

Leu Glu Pro Asp Ala Ala Glu Pro Asp Val Gln Arg Gly Arg Ser Phe

65 70 75 80

His Phe Tyr Asp Ala Met Asp Gly Gln Ile Gln Gly Ser Val Glu Leu

85 90 95

Ala Ala Pro Gly Gln Ala Lys Ile Ala Gly Gly Ala Ala Val Ser Asp

100 105 110

Ser Ser Ser Thr Ser Met Asn Val Tyr Ser Leu Ser Val Asp Pro Asn

115 120 125

Thr Trp Gln Thr Leu Leu His Glu Arg His Leu Arg Gln Pro Glu His

130 135 140

Lys Val Leu Gln Gln Leu Arg Ser Arg Gly Asp Asn Val Tyr Val Val

145 150 155 160

Thr Glu Val Leu Gln Thr Gln Lys Glu Val Glu Val Thr Arg Thr His

165 170 175

Lys Arg Glu Gly Ser Gly Arg Phe Ser Leu Pro Gly Ala Thr Cys Leu

180 185 190

Gln Gly Glu Gly Gln Gly His Leu Ser Gln Lys Lys Thr Val Thr Ile

195 200 205

Pro Ser Gly Ser Thr Leu Ala Phe Arg Val Ala Gln Leu Val Ile Asp

210 215 220

Ser Asp Leu Asp Val Leu Leu Phe Pro Asp Lys Lys Gln Arg Thr Phe

225 230 235 240

Gln Pro Pro Ala Thr Gly His Lys Arg Ser Thr Ser Glu Gly Ala Trp

245 250 255

Pro Gln Leu Pro Ser Gly Leu Ser Met Met Arg Cys Leu His Asn Phe

260 265 270

Leu Thr Asp Gly Val Pro Ala Glu Gly Ala Phe Thr Glu Asp Phe Gln

275 280 285

Gly Leu Arg Ala Glu Val Glu Thr Ile Ser Lys Glu Leu Glu Leu Leu

290 295 300

Asp Arg Glu Leu Cys Gln Leu Leu Leu Glu Gly Leu Glu Gly Val Leu

305 310 315 320

Arg Asp Gln Leu Ala Leu Arg Ala Leu Glu Glu Ala Leu Glu Gln Gly

325 330 335

Gln Ser Leu Gly Pro Val Glu Pro Leu Asp Gly Pro Ala Gly Ala Val

340 345 350

Leu Glu Cys Leu Val Leu Ser Ser Gly Met Leu Val Pro Glu Leu Ala

355 360 365

Ile Pro Val Val Tyr Leu Leu Gly Ala Leu Thr Met Leu Ser Glu Thr

370 375 380

Gln His Lys Leu Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ser Gln Thr Leu Leu Gly

385 390 395 400

Pro Leu Glu Leu Val Gly Ser Leu Leu Glu Gln Ser Ala Pro Trp Gln

405 410 415

Glu Arg Ser Thr Met Ser Leu Pro Pro Gly Leu Leu Gly Asn Ser Trp

420 425 430

Gly Glu Gly Ala Pro Ala Trp Val Leu Leu Asp Glu Cys Gly Leu Glu

435 440 445

Leu Gly Glu Asp Thr Pro His Val Cys Trp Glu Pro Gln Ala Gln Gly

450 455 460

Arg Met Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu Ser

465 470 475 480

Gln Glu Pro His

<210> 14

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Met Gly Thr Asn Glu Glu Glu Val Ile Arg Glu Asp Phe Gln Gly Leu

1 5 10 15

Arg Ala Glu Val Glu Ala Gly Ser Ser Glu Leu Arg Ser Leu Glu Met

20 25 30

Glu Leu Arg Gln Gln Leu Leu Val Asp Ile Gly Arg Ile Leu Gln Asp

35 40 45

Gln Pro Ser Met Glu Ala Leu Glu Ala Ser Leu Glu Gln Gly Leu Cys

50 55 60

Ser Gly Glu Gln Val Glu Pro Leu Glu Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu

65 70 75 80

Glu Cys Leu Val Leu Asp Ser Gly Glu Leu Val Pro Glu Leu Ala Ala

85 90 95

Pro Val Phe Tyr Leu Leu Gly Ala Leu Ala Gly Leu Ser Glu Thr Gln

100 105 110

Gln Gln Leu Leu Ala Thr Lys Ala Leu Glu Ala Thr Val Leu Ser Lys

115 120 125

Glu Leu Glu Leu Val Lys His Glu Leu Val Lys His Val Leu Glu Gln

130 135 140

Ser Thr Pro Trp Gln Glu Leu Pro Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ser Trp

145 150 155 160

Asp Glu Glu Ala Leu Thr Trp Val Leu Leu Glu Glu Cys Gly Leu Thr

165 170 175

Leu Gln Val Glu Pro Pro Gln Val Tyr Trp Glu Pro Thr Ser Gln Gly

180 185 190

Pro Ile Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Leu Ala Leu Leu Ser Ser Leu Gly

195 200 205

Gln Lys Ser Cys

210

Claims (10)

1.一种用于治疗视网膜脱离的重组基因表达载体，其特征在于，所述的表达载体为AAV载体，其中，所述的腺相关病毒(AAV)载体中，插入有或携带有用于治疗视网膜脱离的治疗基因的表达盒；

所述治疗基因包括：编码可用于结合Gasdermin D(Gsdmd)蛋白的N端结构域的蛋白片段的基因；其中，Gsdmd蛋白的N端结构域为Gsdmd蛋白的氨基酸序列的第1位至第276位的结构域，所述第1位和第276位是对应于如SEQ ID NO:13所示序列的第1位和第276位。

2.如权利要求1所述的重组基因表达载体，其特征在于，所述治疗视网膜脱离是治疗感光细胞损伤焦亡导致的视网膜脱离。

3.如权利要求1所述的重组基因表达载体，其特征在于，所述Gsdmd蛋白的C端结构域片段包括对应于如SEQ ID NO:13所示序列的第277至484位(较佳地，第275至484位；更佳地，第276至484位)的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的重组基因表达载体，其特征在于，所述用于结合Gsdmd蛋白的N端结构域的蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求1所述的重组基因表达载体，其特征在于，所述重组基因表达载体含有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

6.一种药物组合物，其特征在于，包括：

(i)如权利要求1所述的重组基因表达载体；

(ii)药学上可接受的载体。

7.如权利要求1所述的重组基因表达载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或药物组合物，所述制剂或药物组合物用于治疗视网膜脱离。

8.一种制备本如权利要求1所述的基因表达载体的方法，其特征在于，包括步骤：将用于治疗视网膜脱离的治疗基因的表达盒连入AAV载体，从而获得如权利要求1所述的基因表达载体。

9.一种药盒，其特征在于，包括：

(i)第一容器，以及位于第一容器中活性成分(a)，所述的活性成分(a)是如权利要求1所述的重组基因表达载体或如权利要求6所述的药物组合物；

(ii)任选的第二容器，以及位于第二容器中的活性成分(b)，所述的活性成分(b)是其他治疗视网膜脱离的药物或其活性成分；和

(iii)任选的第三容器，以及位于第三容器中的注射器。

10.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述注射器是注射用给药器，优选地为注射针。

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