CN114686410A

CN114686410A - 一种增强1-磷酸果糖激酶基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法

Info

Publication number: CN114686410A
Application number: CN202011567728.4A
Authority: CN
Inventors: 步国建; 武立清; 白林泉
Original assignee: Jiangsu Donghui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN114686410B

Abstract

本发明公开了一种提升谷氨酰胺转氨酶产量的方法，通过增强1‑磷酸果糖激酶(1‑phosphofructokinase)基因SMDS_3792的转录水平，进而提高谷氨酰胺转氨酶产量。通过在茂原链霉菌C2中，利用人工强启动子kasOp*过量表达内源1‑phosphofructokinase基因SMDS_3792，得到高产谷氨酰胺转氨酶的突变株TGS104，通过增强1‑phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平，明显提高谷氨酰胺转氨酶产量。

Description

一种增强1-磷酸果糖激酶基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种增强1-磷酸果糖激酶(1-phosphofructokinase) 基因SMDS_3792转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase)又称转谷氨酰胺酶，是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的。TGase主要催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-羟胺基团与伯胺化合物(酰基受体)之间发生酰基转移反应，使蛋白质发生共价交联，通过胺的导入、交联及脱胺三种途径改变蛋白质的功能性质。TGase介导的分子交联能够改善蛋白质的热稳定性、持水力等特性，有助于形成强有力的凝胶，改善蛋白质的品质。TGase是一种外分泌蛋白，在胞内以pre-pro-TGase的形式存在，通过跨膜运输，识别信号肽，并以pro-TGase的前体蛋白的形式转运到胞外。在胞外pro-TGase经过内切金属蛋白酶TAMEP从N端切割一段多肽序列，得到FRAP-TGase，此时的酶已经具有一定的催化能力，可以催化蛋白质交联成多聚物；再经过丝氨酸蛋白酶TAP的切割，切掉N端四肽Phe-Arg-Ala-Pro(即FRAP)，形成最终成熟的TGase。该酶分子量为37.9kD，由331 个氨基酸组成。

由于TGase具有非常特殊的结构及强交联能力，目前作为一种新型的食品添加剂，在世界范围的食品工业中广泛应用。包括在肉制品中可以改善经机械处理的肉制品的质地和结构，通过交联作用增强凝胶性，减轻断裂程度，从而提升产品品质并提高持水力；在乳制品中，提高酸奶质量，改善乳蛋白的乳化特性及提高乳蛋白的热稳定性等；在食品包装及膜领域被广泛用于改善生物聚合物的薄膜的机械和阻隔性能，如明胶、蛋清蛋白、乳清蛋白及其与果胶、壳聚糖的组合等等。同时，在面制品、烘焙食品以及大豆蛋白产品等加工过程中，同样有很大的应用前景。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株 TGS104，以及一种通过增强1-磷酸果糖激酶(1-phosphofructokinase)基因SMDS_3792的转录水平以提高TGase发酵水平的方法。本发明基于基因组学信息，通过在茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达内源1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，最终提升谷氨酰胺转氨酶产量。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种茂原链霉菌C2，由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis C2，保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020194，保藏日期为2020年6月10日。

本发明还提供了一种高产谷氨酰胺转氨酶TGase的菌株TGS104，所述菌株通过增强 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平获得。

进一步的，所述菌株由茂原链霉菌C2过量表达来源于茂原链霉菌C2的 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792后获得。

进一步的，所述菌株通过在茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达1-phosphofructokinase基因SMDS_3792后获得。

所述菌株的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达。

“过量表达”指在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的1-phosphofructokinase 基因SMDS_3792(来源于茂原链霉菌C2)，增强1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平。

所述菌株含有人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的表达盒。

所述表达盒含有：人工强启动子kasOp*、1-phosphofructokinase基因SMDS_3792、转录终止序列。

所述1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒含有：人工强启动子kasOp*、 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792、转录终止序列。

本发明还提供了所述的表达盒在高效筛选菌株TGS104中的应用。

本发明还提供了一种通过增强1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平以提高 TGase发酵水平的方法，所述方法的具体步骤如下：

第一步：设计并构建用于过量表达内源1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的整合型质粒载体pTDS104；

第二步：利用整合型质粒载体pTDS104(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*启动子)，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS104。

第三步：将培养的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达突变株TGS104的孢子接种于种子培养基中，25-35℃、180-220rpm(优选地，30℃、200rpm)的条件下培养20-24 h(优选地，24h)，以8-15％(优选地，10％)的接种量转接至发酵培养基中，25-35℃、180-220 rpm(优选地，30℃、200rpm)的条件下发酵28-32h(优选地，28h)，收集发酵液并进行酶活检测。

第一步中，所述1-phosphofructokinase基因SMDS_3792来源于茂原链霉菌C2。

第一步中，所述的载体pTDS104的构建方法是：通过PCR扩增得到954bp的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点，获得所述载体pTDS104。

第三步中，所述种子培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3 w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，pH 7.4；优选地，为甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.2w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.2w/v％， pH 7.4。

第三步中，所述发酵培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3 w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，发酵促进剂0.1-0.3w/v％， pH 7.4；优选地，为发酵培养基包括甘油2w/v％，酵母提取物0.6w/v％，鱼粉蛋白胨2.5w/v％， MgSO₄·7H₂O 0.2w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.2w/v％，发酵促进剂0.1w/v％，pH7.4。

本发明还提供了一种谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)设计并构建用于过量表达1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的整合型质粒载体 pTDS104；

2)利用整合型质粒载体pTDS104(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*启动子)，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS104。

步骤1)中，所述1-phosphofructokinase基因SMDS_3792来源于茂原链霉菌C2。

步骤1)中，所述载体pTDS104的构建方法是：通过PCR扩增得到954bp的 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。

本发明还提供了一种1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，所述1-phosphofructokinase 基因SMDS_3792的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种用于表达1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的基因序列，所述基因序列为人工强启动子kasOp*的核苷酸序列或者与人工强启动子kasOp*具有90％以上的同源性的核苷酸序列，所述人工强启动子kasOp*的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种质粒载体pTDS104的构建方法，通过PCR扩增得到954bp的 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点，得到质粒载体pTDS104。

本发明还提供了所述茂原链霉菌C2在筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104中的应用。

本发明还提供了所述谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104在提高谷氨酰胺转氨酶发酵产量中的应用。

本发明所涉及的质粒pDR3-K*已经在SCI数据库文献《Xinjuan Ning,XinranWang, Yuanting Wu,Qianjin Kang*and Linquan Bai*:Identification andEngineering of Post-PKS Modification Bottlenecks for Ansamitocin P-3TiterImprovement in Actinosynnema pretiosum subsp.pretiosumATCC31280.Biotechnology Journal 2017,12,1700484》中记载。

本发明所涉及的菌株茂原链霉菌C2由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020194，保藏日期为 2020.6.10。

本发明的有益效果包括：在茂原链霉菌C2中，利用整合型载体pDR3-K*，在茂原链霉菌 C2染色体上分别插入一个拷贝、来源于茂原链霉菌C2的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，实验室摇瓶水平下较对照菌株酶活提高10.43％。通过本发明可提高TGase的发酵产量，使发酵成本降低。

附图说明

图1是SMDS_3792基因过量表达质粒构建示意图。

图2是1-phosphofructokinase基因SMDS_3792增强表达突变株与对照菌株TGase发酵产量对比示意图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

本实施例为制备1-phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达的突变株TGS104的具体过程，具体包括以下步骤：

第一步：构建质粒pTDS104：以茂原链霉菌C2基因组DNA作为模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_3792-F/R，通过PCR扩增得到SMDS_3792(954bp)的基因片段。在质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点插入酶切后的扩增片段，得到质粒pTDS104。

*第一步涉及的内切酶识别位点(酶切位点)如下：

NdeI识别位点： EcoRI识别位点：

5'...CA^TATG...3' 5'...G^AATTC...3'

3'...GTAT^AC...5' 3'...CTTAA^G...5'

*第一步所用到的引物序列为：

*第一步中基因片段制备所采用的PCR体系及条件：

PCR反应体系：DNA模板30ng，引物F/R 20pmol，50％DMSO 5μL，dNTP 10nmol，缓冲液25μL，Taq DNA聚合酶1个单位，加纯水补齐至30μL；

PCR条件：95℃5min；95℃15s，60℃15s，72℃30s，循环30次；72℃10min。

第二步：利用整合型质粒载体pTDS104(ΦC31整合位点，pSET152衍生，带有kasOp*启动子)，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792(来源于茂原链霉菌C2)，并通过抗性及PCR验证筛选正确的接合子，从而得到 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达的突变株，具体包括以下步骤：

将基因过量表达的质粒pTDS104转化进入宿主ET12567(pUZ8002)中，将对应ET12567 (pUZ8002)接种于含有Apr、Kan和Chl三种抗生素的LB中，37℃培养20h，然后用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素；同时制备C2孢子预萌发液，收集生长7天的C2的孢子，50℃热激10min后加2×YT培养基于37℃预萌发2h，然后用新鲜的LB培养基漂洗2次。

所述LB培养基的组分为：胰蛋白胨1w/v％、酵母提取物0.5w/v％、NaCl 1w/v％，pH7.0；

所述2×YT培养基的组分为：胰蛋白胨1.6w/v％、酵母提取物1w/v％、NaCl 0.5w/v％， pH 7.0。

将C2孢子预萌发液与之前制备的宿主菌ET12567(pUZ8002)混合(受体菌细胞和供体菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mM镁离子的ISP4固体培养基上，于30℃培养箱倒置培养。16h后取出平板，分别将阿泊拉霉素(终浓度50μg/mL)和萘啶酮酸(终浓度 25μg/mL)两种抗生素加入1mL无菌水中混匀后覆盖在接合转移平板上，吹干后转移至30℃培养箱中倒置培养。一般3～5d后可见平板上有接合子长出，将其通过转接于含有阿泊拉霉素和萘啶酮酸两种抗生素的高氏I号固体培养基上扩大培养，通过菌丝体PCR验证筛选得到 1-phosphofructokinase基因SMDS_3792加倍的突变株。

所述ISP4固体培养基的组分为：可溶性淀粉1w/v％、MgSO₄·7H₂O 0.1w/v％、(NH₄)₂SO₄ 0.2w/v％、FeSO₄·7H₂O 0.0001w/v％、K₂HPO₄0.1 w/v％、NaCl 0.1w/v％、CaCO₃0.2 w/v％、 MnCl₂·4H₂O 0.0001w/v％、ZnSO₄·7H₂O 0.0001w/v％、琼脂2w/v％，pH7.0-7.4。

所述高氏I号固体培养基的组分为：可溶性淀粉2w/v％、MgSO₄·7H₂O 0.05w/v％、KNO₃ 0.1w/v％、FeSO₄·7H₂O 0.001w/v％、K₂HPO₄0.05 w/v％、NaCl 0.05w/v％、琼脂2w/v％，pH 7.2-7.4。

*第二步中以接合子菌丝体作为DNA模板，使用在两端引入NdeI/EcoRI酶切位点的引物smds_2075-F/R，通过PCR验证筛选突变株时所采用的PCR体系及条件：

PCR体系：DNA模板10～100ng，引物F/R 10pmol，50％DMSO 2μL，2×Mix缓冲液 10μL，加纯水补齐至20μL；

所述2×Mix缓冲液的组分为：Taq DNAPolymerase(recombinant)0.05units/μL、MgCl₂4 mM、dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)0.4mM；

PCR条件：95℃10min；95℃15s，60℃15s，72℃30s，循环30次；72℃10min。

实施例2

本实施例为利用1-phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达的突变株TGS104发酵产生TGase的过程。具体步骤如下：将1-phosphofructokinase过量表达的菌株TGS104分别涂布于高氏I号培养基上活化，30℃培养7d后，刮取一平板孢子接种至种子培养基中，30℃、200rpm的条件下培养24h，以10％的接种量转接至发酵培养基中，30℃、200rpm的条件下发酵28h后收集发酵液进行酶活测定。

实施例3

本实施例为利用比色法检测TGase的酶活的方法，具体为：取200μL稀释20倍的发酵液上清于两支试管中，其中一管加入200μL水作为对照，另一管加入2mL 37℃预热好的A液，37℃反应10min后，加入2mL B液终止反应。用1cm的石英比色皿，在分光光度计 525nm处测定发酵液的吸光度。最终将OD₅₂₅带入由标准曲线换算得到的公式，计算出TGase 的酶活。

其中，溶液配制方法如下：

A液：称取9.688g三羟甲基氨基甲烷，2.780g盐酸羟胺，1.229g还原型谷胱甘肽，4.048 g底物Na-CBZ-GLN-GLY于烧杯中，加350mL水，调节pH为6.0，加水定容至400mL。

B液：3mol/L盐酸，12％三氯乙酸，5％FeCl₃溶于0.1mol/LHCl中，将三种溶液等量混合均匀。

图2为1-phosphofructokinase基因SMDS_3792增强表达突变株与对照菌株TGase相对发酵产量示意图。结果表明，在实验室摇瓶水平下突变株的产量对比野生型菌株提高10.43％。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏东汇生物科技有限公司

<120> 一种增强1-磷酸果糖激酶基因转录水平的谷氨酰胺转氨酶高产菌株及其制备与发酵方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgatcctca ccgtcacccc caaccccagc ctcgaccgca cctacgaggt ccccgcgctg 60

cggcgcggcg ccgtcctccg cgcggcggcc gaccgcgtcg acccgggcgg caagggcgtc 120

aacgtctcgc gcgcggtcgc ggcggccggc cacgccacca cggccgtgct gccgctcggc 180

ggcgcggagg gcgccctgct ggaacgcctc ctccgtgaac agggcatcga cgtcgcgggg 240

gtccccgtct ccggcgcgac gcgggtcaac gtggccgtcg ccgaacccga cggcacgctc 300

accaaggtca acgccgccgg ccccgaactg acggccgccg aggccgaggc gctgctggac 360

agcgtggggg aacggtcggc gggcgccggc tggatcgcct gctgcggcag cctgccgcgc 420

ggactcgcgc ccgagtggta cgggcggctg gtggcccgcg cccacgccgc cggggccagg 480

atcgcgctcg acacctcggg gccggccctc accgccgccc tgcgcgaacg ccccgacgtc 540

gtcaaaccca acaccgagga actcgcccag gccgtcggcc gccccctgac gaccgtcggg 600

gacgcggccc gggcggcgga ggaactgcgc ggcctcggcg cgcggaccgt cctcgccagc 660

cttggcgcgg acggccagct cctcgtcgac ggctccggaa cgcactacgg aacggccccg 720

gtgacgcgcg tccgcagcaa cgtcggcgcg ggcgacgcct ccctggcggg cttcctcgcc 780

gccggcggcg agagcccggc cgccctcgcg gcggccctgg cccacggcgc ggcggccgtc 840

cggctgcccg gcagcgcgat gccggccccg ggcgacctcg aaccgtccac cgtgacggtc 900

acccgggacg tcccgggcga ccgcgccctg accgaaccgg cgtccggcgt ctga 954

<210> 2

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60

ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagtt 97

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atatcatatg gtgatcctca ccgtcacccc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atatgaattc tcagacgccg gacgccggtt 30

Claims

1.一种茂原链霉菌C2，其特征在于，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomycesmobaraensis C2，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2020194，保藏日期为2020年6月10日。

2.一种谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述菌株通过增强1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平获得。

3.如权利要求2所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述菌株通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792后获得。

4.如权利要求2或3所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述菌株的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达；和/或，所述菌株含有人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的表达盒；和/或，所述1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求4所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104，其特征在于，所述表达盒含有人工强启动子kasOp*、1-phosphofructokinase基因SMDS_3792、转录终止序列。

6.一种增强1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的转录水平以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法，其特征在于，通过在茂原链霉菌C2中利用人工强启动子kasOp*过量表达来源于茂原链霉菌C2的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，进而提升谷氨酰胺转氨酶产量；

所述方法的具体步骤如下：

第一步：设计并构建用于过量表达1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的整合型质粒载体pTDS104；

第二步：利用整合型质粒载体pTDS104，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的来源于如权利要求1所述的茂原链霉菌C2的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS104；

第三步：将培养的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792过量表达突变株TGS104的孢子接种于种子培养基中，25-35℃、180-220rpm的条件下培养20-24h，以8-15％的接种量转接至发酵培养基中，25-35℃、180-220rpm的条件下发酵28-32h，收集发酵液并进行酶活检测。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述整合型质粒载体pTDS104的构建方法为：通过PCR扩增得到954bp的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点，获得所述整合型质粒载体pTDS104。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，pH 7.4；

所述发酵培养基包括甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，鱼粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，发酵促进剂0.1-0.3w/v％，pH7.4。

9.一种谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

第二步：利用整合型质粒载体pTDS104，在受体菌茂原链霉菌C2染色体上插入一个拷贝的来源于如权利要求1所述的茂原链霉菌C2的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792，并通过抗性和PCR验证筛选得到基因过量表达的重组突变株TGS104。

10.如权利要求书9所述的方法，其特征在于，所述整合型质粒载体pTDS104的构建方法为：通过PCR扩增得到954bp的1-phosphofructokinase基因SMDS_3792序列的PCR片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点，得到所述整合型质粒载体pTDS104。

11.一种用于表达1-phosphofructokinase基因SMDS_3792的基因序列，其特征在于，所述基因序列为人工强启动子kasOp*的核苷酸序列或者与人工强启动子kasOp*具有90％以上的同源性的核苷酸序列，所述人工强启动子kasOp*的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

12.如权利要求1所述的茂原链霉菌C2在筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104中的应用。

13.如权利要求2-5之任一项所述的谷氨酰胺转氨酶高产菌株TGS104在提高谷氨酰胺转氨酶发酵产量中的应用。

14.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有：人工强启动子kasOp*、1-phosphofructokinase基因SMDS_3792、转录终止序列。

15.如权利要求14所述的表达盒在高效筛选菌株TGS104中的应用。