CN114685654A

CN114685654A - 一种抗fgf21羧基末端的抗体及其应用

Info

Publication number: CN114685654A
Application number: CN202210378314.XA
Authority: CN
Inventors: 刘亮; 林树珊; 李静; 王茜; 凌伊
Original assignee: Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Current assignee: Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2022-07-01
Also published as: WO2022218277A1

Abstract

本发明涉及一种抗FGF21羧基末端的抗体及其应用，该抗体的抗原结合位点清晰，可以特异性结合FGF21的完整羧基端；当FGF21缺少羧基末端三个氨基酸(YAS)时，该抗体与其不结合或结合能力极低；仅当FGF21或包含FGF21的融合蛋白在羧基末端完整(包含YAS)的情况下，该抗体可与之发生特异性结合。基于此，本发明提供了一种可以区别FGF21的羧基末端完整分子和羧基端丢失3个或以上氨基酸的代谢物的生物样品分析方法。

Description

一种抗FGF21羧基末端的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗FGF21羧基末端的抗体及其应用。

背景技术

成纤维细胞生长因子21(FGF21)由181个氨基酸组成，包含β三叶草样核心结构域及无规则的氨基端和羧基端结构。在一系列胰岛素抵抗动物模型中，重组FGF21的使用降低了血浆葡萄糖和胰岛素水平，降低了肝脏和循环中的甘油三酯和胆固醇水平，并改善了胰岛素敏感性、能量消耗、肝脂肪变性和肥胖(Xie T,Leung P S.Fibroblast growth factor21:a regulator of metabolic disease and health span[J].American Journal ofPhysiology-Endocrinology and Metabolism,2017,313(3):E292-E302.)。FGF21已经成为治疗人类2型糖尿病和相关代谢综合征的最有潜力的治疗剂。

有报道显示，FGF21在羧基末端丢失3个氨基酸(YAS，络氨酸-丙氨酸-丝氨酸)后，其活性下降约90％(Yie J,Hecht R,Patel J,et al.FGF21 N-and C-termini playdifferent roles in receptor interaction and activation[J].FEBS letters,2009,583(1):19-24.)。因此，建立可以区别FGF21的羧基末端完整分子和羧基端丢失3个或以上氨基酸的代谢物的生物样品分析方法对于准确描述FGF21或包含FGF21的融合蛋白药物在体内的药代动力学特征非常重要。

在生物大分子药物研发的过程中，建立可以区分完整蛋白/多肽分子和其降解的代谢产物的生物样品分析方法是存在一定挑战的。蛋白/多肽的生物样品分析方法主要是基于免疫分析技术，其本质是抗原和抗体的结合反应，因此，分析方法中所使用的抗体的特异性强弱将决定了该方法的特异性情况。尽管目前商业流通的各类抗体非常多，但通常具有不确定的抗原结合位点，比如抗FGF21抗体，仅知道可与FGF21结合，而具体的结合部位，与哪几个氨基酸结合并不清楚。因此，开发一种仅针对FGF21分子羧基末端3个氨基酸结合的、抗原结合位点清晰的单克隆抗体是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗FGF21羧基末端的抗体及其应用，该抗体的抗原结合位点清晰，可以特异性结合成纤维细胞生长因子21的羧基端；当FGF21缺少羧基末端三个氨基酸(YAS)时，本发明的抗体与其不结合或结合能力极低；仅当FGF21或包含FGF21的融合蛋白在羧基末端完整(包含YAS)的情况下，本发明的抗体可与之发生特异性结合。

为此，第一方面，本发明提供一种抗FGF21羧基末端的抗体，其包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区以及含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区；其中，所述LCDR1的氨基酸序列为RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO：1)，所述LCDR2的氨基酸序列为QMSSLAS(SEQ ID NO：2)或QMSNLAS(SEQ ID NO：3)，所述LCDR3的氨基酸序列为AQTLELPT(SEQ ID NO：4)，所述HCDR1的氨基酸序列为GYTFTNY(SEQ ID NO：5)，HCDR2的氨基酸序列为NTYTGK(SEQ ID NO：6)，HCDR3的氨基酸序列为NYYDYDVAY(SEQ ID NO：7)或NYYDYDIAY(SEQID NO：8)。

进一步，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9或者SEQ ID NO：10所示。

进一步，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11或者SEQ ID NO：12所示。

进一步，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；或者所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

进一步，所述抗体为全长抗体、Fab片段、F(ab)₂片段、双链Fv片段或单链Fv片段(scFv)。

进一步，所述抗体为单克隆抗体。

进一步，所述抗体还包括选自kappa或lambda亚型的轻链恒定区。

进一步，所述轻链恒定区为kappa亚型。

进一步，所述轻链恒定区包括如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

进一步，所述抗体还包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型的重链恒定区。

进一步，所述重链恒定区为IgG1亚型。

进一步，所述重链恒定区包括如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供一种核酸分子，其编码本发明所述的抗FGF21羧基末端的抗体或其抗原结合部分。

本发明的第三方面，提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。

进一步，所述载体包括质粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或逆转录病毒。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其含有本发明所述核酸分子，或包含本发明所述的载体。

进一步，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

进一步，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，例如HEK293细胞。

本发明的第五方面，提供一种检测试剂盒，包含本发明所述的抗体，本发明所述的核酸分子，或本发明所述的载体。本发明的第六方面，提供本发明所述的抗体在诊断或非诊断目的的免疫检测方面的应用。

进一步，所述免疫检测包括：检测FGF21羧基末端的完整性。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

本发明提供的抗体的抗原结合位点清晰，可以特异性结合FGF21的完整羧基端；当FGF21缺少羧基末端三个氨基酸(YAS)时，本发明的抗体与其不结合或结合能力极低；仅当FGF21或包含FGF21的融合蛋白在羧基末端完整(包含YAS)的情况下，本发明的抗体可与之发生特异性结合。基于此，本发明提供了一种可以区别FGF21的羧基末端完整分子和羧基端丢失3个或以上氨基酸的代谢物的生物样品分析方法。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1经第二次亚克隆后筛选得到的六株单克隆抗体纯化电泳图；其中，泳道M为分子量marker，泳道1为非还原电泳，泳道2为还原电泳；

图2为MM21T抗体的SDS-PAGE检测结果；其中，泳道M为分子量marker，泳道1为还原电泳，泳道2为非还原电泳；

图3为MM24T抗体SDS-PAGE检测结果；其中，泳道M为分子量Marker，泳道1为还原电泳，泳道2为非还原电泳。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

除非另外指明，本文的实施例采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

定义

如本文所用术语“抗体”是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab、F(ab)₂、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。

通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。每个轻链含有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。

如本文所用术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合部分可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。对于给定抗体的可变区氨基酸序列，可以通过多种方式分析可变区氨基酸序列的中CDR氨基酸序列，例如在本文中利用在线软件Abysis根据Chothia确定(http://www.abysis.org/)。

实施例1动物免疫

设计合成4条多肽，其中3条含有FGF21羧基末端的3个氨基酸(YAS)，1条不含有YAS，其序列如表1所示。

表1合成多肽序列

将免疫用多肽A分别进行偶联备用于动物免疫。

完成三次免疫后取血测定血清效价。免疫动物的实验分组见表2所示。

表2免疫动物信息

利用间接酶联免疫分析方法(间接ELISA)，筛选对免疫用多肽A效价高，且对筛选用多肽B效价低的动物血清。具体步骤包括：分别用免疫用多肽A、筛选用多肽B(SinoA8627)、蛋白A(SEQ ID NO：22)和蛋白B(SEQ ID NO：23)包被酶标板，利用HRP标记山羊抗小鼠IgG Fc抗体(ICL公司，货号：GGPC-90P)作为检测抗体，使用间接ELISA法测定血清效价。筛选出与免疫用多肽A和蛋白A反应信号强，且与筛选用多肽B和蛋白B反应信号弱的动物。血清效价检测结果如表3-表5所示(S：信号值；S-B：扣除本底后信号值)。

表3三免后一周小鼠血清ELISA检测结果

表4三免后一周小鼠血清ELISA检测结果

表5三免后一周小鼠血清ELISA检测结果

实施例2融合杂交瘤细胞及筛选

根据表3-5的结果，选择编号为SBI180064-2#C的小鼠注射多肽SinoA8624加强免疫；3天后取脾进行融合，将融合后细胞用HAT培养基悬浮，按照每孔6×10⁴个细胞接种于96孔细胞培养板，即共接种30块96孔细胞培养板。分别于融合后第6天、第8天，弃去培养板中培养基，添加新鲜HAT培养基，于融合后第10天取杂交瘤细胞培养上清进行主克隆筛选(结果见表6所示)。

表6主克隆首次筛选ELISA检测结果

将筛选所得阳性的细胞进行细胞计数，然后按照0.75细胞/孔接种到96孔细胞培养板，每个阳性细胞接种0.5块细胞培养板。培养7天后，显微镜下观察细胞状态，挑选并标记仅含有单个细胞团的孔，取培养上清进行ELISA筛选，筛选结果见表7和表8所示(S：信号值；S-B：扣除本底后信号值)。将筛选所得阳性细胞按上述步骤进行第二次有限稀释，直至获得稳定的阳性单克隆细胞。经间接ELISA筛选，获得表8中的6株杂交瘤细胞上清可以满足与SinoA8624及蛋白A结合，且与SinoA8627及蛋白B不结合。

表7第一次亚克隆ELISA检测结果

表8第二次亚克隆ELISA检测结果

实施例3单克隆抗体与小量培养与纯化

取表8所记载的六株杂交瘤细胞，分别将1mL杂交瘤细胞转入100mL培养瓶中，定期加入一定量的培养基进行细胞扩增，培养10天。培养液离心过滤取上清，经Protein A亲和层析纯化，具体步骤包括：

收集培养料液6000rpm离心20min后，用滤器过滤，取上清；

a、层析柱预处理：Protein A亲和层析柱用超纯水冲洗，然后用平衡缓冲液平衡；

b、上样与平衡：料液上样Protein A亲和层析柱，上样完毕后，用平衡缓冲液淋洗至基线平稳；

c、洗脱：用Elution3.0洗脱，收集洗脱峰，用2M Tris中和；

d、Protein A亲和层析柱再生；

e、纯化样品用脱盐至适当的缓冲液中；

f、纯化样品无菌过滤后留样，并用SDS-PAGE分析纯度，结果见图1所示。

实施例4与HRP标记的小鼠抗人IgG4 Fc抗体配对检测FGF21-Fc融合蛋白

取实施例3纯化得到的单克隆抗体作为包被抗体，以HRP标记的小鼠抗人IgG4 Fc抗体(Southern Biotech，货号9200-05)为检测抗体，使用双抗夹心法ELISA分别检测蛋白A和蛋白B，具体步骤包括：

(1)包被：包被纯化后的小鼠单克隆抗体2μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2)封闭：板内液体甩净拍干，加入2％BSA，300μL/孔，密封后室温孵育1h；

(3)洗板：300μL/孔洗涤液，洗板2次，最后一次拍干；

(4)样品准备：将蛋白A及蛋白B分别稀释至5ng/mL、10ng/mL，100μL/孔加入至孔板中，空白对照加入样品稀释液，100μL/孔，混合均匀，室温反应2h；

(5)洗板：300μL/孔洗涤液，洗板3次，最后一次拍干；

(6)加入二抗：HRP标记的小鼠抗人IgG4 Fc单抗(Southern biotech，货号9200-05)按1：2000稀释使用，100μL/孔，密封后室温孵育1h；

(7)洗板：同步骤5；

(8)显色：将A液和B液按1:1混匀后，每孔加入200μL，室温避光孵育20min；

(9)终止：每孔加入50μL终止液，立即在450nm波长处测量OD值，检测结果如表9所示(S：信号值；S-B：扣除本底后信号值)。

表9 6株单克隆抗体与HRP标记的小鼠抗人IgG4 Fc抗体双抗夹心法ELISA检测结果

根据表9，MM21H、MM22H、MM23H、MM24H、MM25H、MM26H均可以与检测抗体配对检测蛋白A，且不受蛋白B干扰。选择响应较高且背景较低的MM21H和MM24H作为候选单克隆抗体株。

实施例5单克隆抗体测序

对实施例4筛选获得的候选单克隆抗体株MM21H和MM24H委托北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)进行杂交瘤细胞株抗体亚型检测和测序。分别取培养的MM21H和MM24H杂交瘤细胞上清采用亚型检测试剂盒(Southern Biotech)进行亚型检测，根据表10所示的ELISA检测结果，MM21H和MM24H鼠源单克隆抗体亚型均为IgG1/kappa。

表10单克隆抗体亚型检测结果

分别将MM21H和MM24H杂交瘤细胞离心后，弃上清，采用TriPure IsolationReagent试剂盒(Roche)提取细胞RNA，经反转录获得cDNA，以cDNA为模板，依据测定的亚型采用特异引物(Sino Biological Inc.)进行PrimeSTAR(TAKARA)高保真PCR，将扩增获得的基因片段插入到表达载体pcDNA系列载体上，克隆测序获得基因序列。将重组抗体分别命名为MM21T及MM24T，根据测序结果，MM21T的轻链可变区包含以下三个互补决定区：

CDR-L1，其氨基酸序列为RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO：1)，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：24；

CDR-L2，其氨基酸序列为QMSSLAS(SEQ ID NO：2)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：25；

CDR-L3，其氨基酸序列为AQTLELPT(SEQ ID NO：4)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：26。

根据测序结果，MM21T的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：27；其中，第1-19位为信号肽，第20-130位为轻链可变区，第131-237位为轻链恒定区。

编码MM21T的轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：28。

MM21T的重链可变区包含以下三个互补决定区：

CDR-H1，其氨基酸序列为GYTFTNY(SEQ ID NO：5)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：29；

CDR-H2，其氨基酸序列为NTYTGK(SEQ ID NO：6)，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：30；

CDR-H3，其氨基酸序列为NYYDYDVAY(SEQ ID NO：7)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：31。

根据测序结果，MM21T的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：32；其中，第1-19位为信号肽，第20-137位为重链可变区，第138-461位为重链恒定区。

编码MM21T的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：33。

MM24T的轻链可变区包含以下三个互补决定区：

CDR-L1’，其氨基酸序列为RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID NO：1)，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：24；

CDR-L2’，其氨基酸序列为QMSNLAS(SEQ ID NO：3)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：34；

CDR-L3’，其氨基酸序列为AQTLELPT(SEQ ID NO：4)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：26。

根据测序结果，MM24T的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：35；其中，第1-19位为信号肽，第20-130位为轻链可变区，第131-237位轻链恒定区。

编码MM24T的轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：36。

MM24T的重链可变区包含以下三个互补决定区：

CDR-H1’，其氨基酸序列为GYTFTNY(SEQ ID NO：5)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：29；

CDR-H2’，其氨基酸序列为NTYTGK(SEQ ID NO：6)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：37；

CDR-H3’，其氨基酸序列为NYYDYDIAY(SEQ ID NO：8)，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO：38。

根据测序结果，MM24T的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：39；其中，第1-19位为信号肽，第20-137位为重链可变区，第138-461位为重链恒定区。

编码MM24T的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：40。

实施例6重组抗体MM21T及MM24T的表达与纯化

用293无血清CD培养基(货号SMM 293-TI)传代培养HEK293细胞，将实施例5构建得到的含目的抗体轻链和重链基因的表达质粒与转染试剂TF1混合后加入HEK293细胞中，转染后第1、3、5天添加293无血清加料液(货号:M293-SUPI-100)。细胞培养7天后进行蛋白纯化。HEK293培养料液离心后，用滤器过滤，取上清，随后使用Protein A亲和层析柱对收集的细胞培养液进行纯化，并收集吸收峰。获取的蛋白样本采取SDS-PAGE和UV OD280的方法对蛋白表达过程进行监控以及对产品进行QC检测。

SDS-PAGE的检测结果如图2-图3所示，通过SDS-PAGE分析可知，可使用Protein A亲和纯化法从HEK293培养上清液中纯化得到目标抗体。通过非还原胶分析抗体的分子量在150～200KDa区间，符合抗体分子量的特性。非还原胶上靠近抗体主条带下方条带可能是由于不同程度糖基化造成的分子量和移动方式差异，同时，非还原胶上～100KDa处条带可能是由于抗体重链过量表达造成，但总体占比<5％。

实施例7 MM24T重组抗体的活性检测

使用ELISA方法检测MM24T重组抗体的活性，分别包被0.1、1、5μg/mL的蛋白A及蛋白B，抗体点样浓度1μg/mL，验证MM24T能够与蛋白A结合与蛋白B不结合，且与MM24H结合能力情况一致，检测结果如表11所示(设置有两个平行试验，表中OD450的结果取平均值)。

表11 MM24T重组表达抗体活性检测验证

实施例8 MM21T重组抗体的活性检测

使用ELISA方法检测MM21T重组抗体的活性，分别包被0.1、1、5μg/mL的蛋白A及蛋白B，抗体点样浓度1μg/mL，验证MM21T能够与蛋白A结合与蛋白B不结合，检测结果如表12所示(设置有两个平行试验，表中OD450的结果取平均值)。

表12 MM21T重组表达抗体活性检测验证

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 广东东阳光药业有限公司

<120> 一种抗FGF21羧基末端的抗体及其应用

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR1

<400> 1

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR2

<400> 2

Gln Met Ser Ser Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR2

<400> 3

Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR3

<400> 4

Ala Gln Thr Leu Glu Leu Pro Thr

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR1

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR2

<400> 6

Asn Thr Tyr Thr Gly Lys

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR3

<400> 7

Asn Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Ala Tyr

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR3

<400> 8

Asn Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ile Ala Tyr

1 5

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> VL

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gln Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Thr

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> VL

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Thr

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> VH

<400> 11

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Thr Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Leu Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 12

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> VH

<400> 12

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Leu Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ile Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Ala Val Ser Ala

115

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> CL

<400> 13

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> CL

<400> 14

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 15

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> CH

<400> 15

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 16

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> CH

<400> 16

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

1 5 10 15

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

20 25 30

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

35 40 45

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

50 55 60

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

65 70 75 80

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

85 90 95

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

100 105 110

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

115 120 125

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

130 135 140

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

145 150 155 160

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

165 170 175

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

180 185 190

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

195 200 205

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

210 215 220

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

225 230 235 240

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

245 250 255

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

260 265 270

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

275 280 285

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

290 295 300

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

305 310 315 320

Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 17

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> CH

<400> 17

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Val

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> SinoA8624

<400> 18

Cys Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala

1 5 10 15

Ser

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> SinoA8625

<400> 19

Cys Gly Gly Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> SinoA8626

<400> 20

Cys Gly Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

1 5

<210> 21

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> SinoA8627

<400> 21

Cys Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 424

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 蛋白A

<400> 22

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

245 250 255

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

260 265 270

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

275 280 285

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

290 295 300

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

305 310 315 320

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

325 330 335

Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

340 345 350

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

355 360 365

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

370 375 380

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

385 390 395 400

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln

405 410 415

Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

420

<210> 23

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> 蛋白B

<400> 23

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

245 250 255

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

260 265 270

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

275 280 285

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

290 295 300

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

305 310 315 320

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

325 330 335

Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

340 345 350

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

355 360 365

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

370 375 380

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

385 390 395 400

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln

405 410 415

Gly Leu Ser Pro Ser

420

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR1

<400> 24

aggtctagta agagtctcct acatagtaat ggcatcactt atttgtat 48

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR2

<400> 25

cagatgtcca gccttgcctc a 21

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR3

<400> 26

gctcaaactc tagaacttcc gacg 24

<210> 27

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val

20 25 30

Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu

35 40 45

Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gln Met Ser Ser Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gln Thr Leu Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser

165 170 175

Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu

195 200 205

Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser

210 215 220

Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 28

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgac 60

attgtgatga cacaggctgc attctccaat ccagtcactc ttggaacatc agcttccatc 120

tcctgcaggt ctagtaagag tctcctacat agtaatggca tcacttattt gtattggttt 180

ctgcagaagc caggccagtc tcctcaggtc ctgatttatc agatgtccag ccttgcctca 240

ggagtcccag acaggttcag tagcagtggg tcaggaactg atttcacact gagaatcagc 300

agagtggagg ctgaggacgt gggtgtttat tactgtgctc aaactctaga acttccgacg 360

ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa 390

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR1

<400> 29

ggatatacct tcacaaacta t 21

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR2

<400> 30

aacacctaca ctggaaag 18

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCRD3

<400> 31

aactactatg attacgacgt tgcttac 27

<210> 32

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Thr Gly Glu Thr Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Leu Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Thr Asn Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Ala Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 33

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atggcttggg tgtggacctt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagactg gagagacagt caagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggatatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180

ggaaagggtt taaagttgat gggctggata aacacctaca ctggaaagcc aacatatgct 240

gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300

cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaac aaactactat 360

gattacgacg ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg 420

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaataa 1386

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> LCDR2

<400> 34

cagatgtcca accttgcctc a 21

<210> 35

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Met Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val

20 25 30

Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu

35 40 45

Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Gln Thr Leu Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser

165 170 175

Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu

195 200 205

Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser

210 215 220

Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 36

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

atggccccaa ctcagctcct ggggctgctt gtgctctgga tccctggatc cactgcagat 60

attgtgatga cgcaggctgc attctccaat ccagtcactc ttggaacatc agcttccatc 120

tcctgcaggt ctagtaagag tctcctacat agtaatggca tcacttattt gtattggttt 180

ctgcagaagc caggccagtc tcctcaggtc ctgatttatc agatgtccaa ccttgcctca 240

ggagtcccag acaggttcag tagcagtggg tcaggaactg atttcacact gagaatcagc 300

agagtggagg ctgaggacgt gggtgtttat tactgtgctc aaactctaga acttccgacg 360

ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420

ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 480

aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 540

ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac agcaaagaca gcacctacag catgagcagc 600

accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa cgacataaca gctatacctg tgaggccact 660

cacaagacat caacttcacc cattgtcaag agcttcaaca ggaatgagtg ctaa 714

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR2

<400> 37

aacacctaca ctggaaaa 18

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223> HCDR3

<400> 38

aactactatg attacgacat tgcttac 27

<210> 39

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Met Gly Trp Val Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Leu Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Thr Asn Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ile Ala Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 40

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

atgggttggg tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtgc ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120

tgcaaggctt ctggatatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180

ggaaagggtt taaagttgat gggctggata aacacctaca ctggaaaacc aacatatgct 240

gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300

cagctcaaca acctcaagaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaac aaactactat 360

gattacgaca ttgcttactg gggccagggg actctggtcg ctgtctctgc agccaaaacg 420

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaataa 1386

Claims

1.一种抗FGF21羧基末端的抗体，其特征在于，其包含含有LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区以及含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区；其中，所述LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，所述LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，所述HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：9或者SEQ ID NO：10所示。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：11或者SEQ ID NO：12所示。

4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：9所示，并且所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；或者所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，并且所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

5.如权利要求1-4任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体为全长抗体、Fab片段、F(ab)₂片段、双链Fv片段或单链Fv片段；优选地，所述抗体为单克隆抗体。

6.如权利要求1-4任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体还包括选自kappa或lambda亚型的轻链恒定区；优选地，所述轻链恒定区为kappa亚型；优选地，所述轻链恒定区包括如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

7.如权利要求1-4任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体还包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型的重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为IgG1亚型；优选地，所述重链恒定区包括如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。

8.一种核酸分子，其编码权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

9.一种载体，其包含权利要求8所述的核酸分子；

优选地，所述载体包括质粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或逆转录病毒。

10.一种宿主细胞，其含有权利要求8所述的核酸分子，或包含权利要求9所述的载体；

优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；

优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；

优选地，所述宿主细胞为HEK293细胞。

11.一种检测试剂盒，包含权利要求1-7任一项所述的抗体，权利要求8所述的核酸分子，或权利要求9所述的载体。

12.权利要求1-7任一项所述的抗体在诊断或非诊断目的的免疫检测方面的应用；

优选地，所述免疫检测包括：检测FGF21羧基末端的完整性。