CN114685572A - 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 - Google Patents
用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114685572A CN114685572A CN202210618471.3A CN202210618471A CN114685572A CN 114685572 A CN114685572 A CN 114685572A CN 202210618471 A CN202210618471 A CN 202210618471A CN 114685572 A CN114685572 A CN 114685572A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oxidant
- mgb
- iodine
- nucleic acid
- imidazole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于MGB核酸探针合成的氧化剂组合物，所述组合物包括：氧化剂碘，和与MGB上的N‑H键竞争结合氧化剂碘、不干扰MGB的化合物，该化合物具有比MGB上的N‑H键更强的与氧化剂碘结合的能力。通过本发明方法制备的MGB探针，提高了探针在QPCR实验中性能、均一性、稳定性，特别是降低了PCR反应中荧光本底，提高了反应的荧光信号，显著增加了检测的信噪比。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及用于MGB核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法。
背景技术
单链核酸是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸组合而成。核酸探针是在单链核酸的3端或5端添加修饰基团，形成了DNA修饰探针以及RNA修饰探针。DNA修饰探针与RNA 修饰探针广泛应用在分子诊断QPCR（实时荧光定量）、STR（短串联重复序列）、以及FISH（荧光原位杂交技术）等领域。
MGB（minor groove binding，小沟结合淬灭剂）核酸探针，一般指的是核酸探针的3’端标记小沟结合剂（minor groove binder）的单链核酸。小沟结合剂具有大的共轭结构以及小沟嵌合结构，因此可以与单链DNA模板形成非常稳定的双链，同时也可以提高核酸探针的TM值，因此探针设计可以设计为更短的序列，更好的淬灭5’端荧光产生的信号，本底更低，更好的灵敏度和特异性，广泛应用于基因分析和基因表达等领域。
目前比较成熟的合成核酸探针的方法为固相亚磷酰胺三酯法。固相亚磷酰胺三酯法的合成过程主要有脱保护、偶联、盖帽、氧化4个步骤。每完成4个步骤就连接上一个脱氧核苷酸或核苷酸，通过重复这4个步骤，就把一个个的脱氧核苷酸或核苷酸连接起来就形成了核酸。氧化剂是氧化步骤中所必须的原料，其作用是把三价亚磷酸酯氧化为稳定的五价磷酸酯，防止在DNA或RNA合成到下一个循环时被酸或碱水解导致合成失败。
在固相亚磷酰胺三酯法合成过程中，其氧化步骤使用的碘氧化剂对核酸探针的部分碱基和修饰基团存在破坏作用，对MGB类核酸探针而言，3端的MGB小沟结合剂的化学结构是由吲哚基团构成，吲哚结构上的N-H键更易被碘氧化剂碘化，影响核酸探针的纯度和收率。
目前在固相亚磷酰胺三酯合成法中，所用的氧化剂主要是碘氧化剂，主要分为三类。第一类氧化剂组合物是目前普遍使用的氧化剂是四氢呋喃、吡啶、超纯水以体积比为7：2：1的比例混合后与碘单质配制而成，第一类氧化剂组合物具有以下问题：
1. 在核酸探针合成周期中的氧化步骤会对MGB修饰上的吲哚残基碘化，导致最后核酸探针粗产品纯度很低，纯化后纯度低于常规修饰探针。
2. MGB基团上吲哚残基碘化，降低MGB小沟基团和DNA模板的结合能力，从而影响QPCR实验的扩增曲线和荧光信号强度。
3. 这个配方的氧化剂在氧化步骤中氧化不够温和，会对部分碱基以及修饰产生破坏
第二类氧化剂组合物是吡啶、超纯水以体积比为9：1的比例混合与碘单质配制而成，第一类氧化剂组合物具有以下问题：
1. 这个组合物由于吡啶作为主要反应溶剂，因吡啶的价格相比较高，导致其使用成本偏高。
2. 因吡啶的比重高，在后续生产使用时，因需要经过电子阀控制的管道传输，经常会导致电子阀故障或者出现传输量不足的问题。
3. 氧化剂仍然不够温和，对核酸碱基和修饰的破坏也未能得到改善。
4. 会对MGB修饰的吲哚残基碘化，降低了引物粗品纯度及最终收率。同时影响后续QPCR实验的扩增曲线、荧光本底以及CV值等。
第三类氧化剂组合物是在技术方案一的基础上改变了其超纯水的占比，其体积比为四氢呋喃、吡啶、超纯水（8.8：1：0.2），主要作用是减少了核酸探针合成周期中所含的水分，通过降低氧化效率来提高合成周期中的耦合效率。该氧化剂组合物具有以下问题：
1. 氧化效率过低，产生更多的不完整链的杂质，降低了引物纯度。不适用于大批量的核酸探针合成。
2. 氧化剂仍然会对MGB修饰的吲哚残基碘化，核酸探针的最终收率低。
因此现有的这三类氧化剂配方都未能解决氧化过程中碘对核酸探针的碱基和MGB小沟结合剂的破坏问题。。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于MGB类荧光探针引物合成的氧化剂。
在一种实施方式中，本发明提供一种用于MGB核酸探针合成的氧化剂组合物，所述组合物包括：氧化剂碘，和与MGB上的N-H键竞争结合氧化剂碘、不干扰MGB的化合物，该化合物具有比MGB上的N-H键更强的与氧化剂碘结合的能力。
在一种实施方式中，与MGB上的N-H键竞争结合氧化剂碘、不干扰MGB的化合物是咪唑衍生物，优选地是咪唑、苯并咪唑、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、2-甲基咪唑啉、N-三苯甲基咪唑、N-甲基苯并咪唑、5-甲基苯并咪唑、2-苯甲基咪唑啉、4-胺甲基咪唑、2，4二甲基咪唑、1，2-二甲基咪唑、4，5-二甲基咪唑、4-甲基-1H-咪唑、5-氯-1-甲基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑、2-乙基咪唑、1-乙基咪唑、2-乙基苯并咪唑、2-乙基-4甲基咪唑。
在一种实施方式中，所述咪唑衍生物是苯并咪唑类化合物，更优选地是苯并咪唑。
在一种实施方式中，所述组合物还包括四氢呋喃、吡啶、超纯水，优选地所述四氢呋喃、吡啶、超纯水的体积比是7：2：1。
在一种实施方式中，所述氧化剂碘的浓度为0.02-0.1M，优选地是0.03-0.08M，更优选地是0.05M。
在一种实施方式中，所述咪唑衍生物的浓度为0.35M-0.65M，优选地是0.45M-0.65M，更优选地是0.55M。
在一种实施方式中，提供一种MGB核酸探针合成方法，所述合成方法中使用上述的氧化剂组合物。
在一种实施方式中，所述氧化剂组合物在配制过程中采用四氢呋喃→碘→吡啶→咪唑衍生物→超纯水的试剂添加顺序。
在一种实施方式中，所述合成方法中反应温度不超过20℃，优选第为4-20℃，更优选地为4℃。
在一种实施方式中，所述合成方法中反应时间为1-12小时，优选地为12小时。
本发明用于MGB核酸探针合成的氧化剂价格便宜，适用于研发和工业合成。本发明中通过引入与MGB上的N-H键竞争结合氧化剂碘、不干扰MGB的化合物，该化合物具有比MGB上的N-H键更强的与氧化剂碘结合的能力，从而降低了原有氧化剂中碘对MGB基团上吲哚残基的作用。核酸探针的合成是通过若干个核苷单体通过亚磷酰胺三酯法四个步骤循环反应合成的，核苷单体上存在一些保护基会被氧化剂破坏，从而影响到最终的合成效果，使用本发明的氧化剂，可以减少甚至避免氧化剂对于保护基的破坏，从而提高了MGB类修饰探针的得率，节约成本，提高了MGB类修饰探针的纯度，提高了合成引物质量。通过本发明方法制备的MGB探针，提高了探针在QPCR实验中性能、均一性、稳定性，特别是降低了PCR反应中荧光本底，提高了反应的荧光信号，显著增加了检测的信噪比。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为使用普通氧化剂合成MGB引物的分子量质谱图。
图2为使用本发明的新型氧化剂合成MGB引物的分子量质谱图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例一本发明的基本原理
目前氧化剂的使用是根据固相亚磷酰胺三酯法中氧化步骤的原理，参见反应式1，在水和吡啶的存在下，通过吡啶提供的空电子轨道，和超纯水中提供的氧孤对电子，发生亲电加成反应将三价磷氧化为更稳定的五价磷。
反应式1
需要说明的是在氧化的过程中，处于寡核苷酸的3端的MGB（小沟结合剂）中的N—H键也会裸露在反应试剂中，3’MGB-CPG的化学结构式如下所示，N—H键也会与碘离子发生副反应，参见反应式2，导致合成的MGB核酸探针的分子量与理论分子量相差一个碘原子，正好是I－的相对分子量。
3’MGB-CPG的化学结构
反应式2
为了解决目前MGB（“小沟”结合修饰）探针合成会被碘化的问题，本发明开发出适用于MGB类核酸探针合成的氧化剂，需要说明的是，在本发明中考虑到成本的问题并没有完全放弃传统的氧化剂，而是在传统的氧化剂中引入了具有亲电力的咪唑衍生物，与MGB（小沟结合剂）上的N-H键产生反应竞争关系，游离的I－与咪唑衍生物反应，参见反应式3，不干扰MGB（小沟结合剂）基团，防止MGB基团（小沟结合剂）上吲哚结构被碘化。
反应式3
本发明一种实施方式中，用于MGB核酸探针合成的氧化剂组合物具体的配方如下：
反应试剂 四氢呋喃、吡啶、超纯水（例如，体积比为7：2：1）
氧化物 碘单质（0.05M）
咪唑衍生物 苯并咪唑0.55M
其中涉及的一些具体组分的参数要求或具体类型选择可进一步详细描述：所述的反应试剂可以是实验室分析级的四氢呋喃（纯度≥99.8%）、吡啶（纯度≥99.8%）和新鲜超纯水。所述的氧化物可以是实验室分析级的碘（纯度≥99.8%）。
所述的咪唑衍生物是实验室分析级的咪唑、苯并咪唑、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、2-甲基咪唑啉、N-三苯甲基咪唑、N-甲基苯并咪唑、5-甲基苯并咪唑、2-苯甲基咪唑啉、4-胺甲基咪唑、2，4二甲基咪唑、1，2-二甲基咪唑、4，5-二甲基咪唑、4-甲基-1H-咪唑、5-氯-1-甲基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑、2-乙基咪唑、1-乙基咪唑、2-乙基苯并咪唑、2-乙基-4甲基咪唑。
本发明的原理在于：
1. 通过引进咪唑衍生物来引进活性更强的N-，其咪唑外层的孤对电子活性大于吲哚N-H的活性；
2. 咪唑衍生物与I-离子生成副产物，避免I-离子与MGB发生副反应。
实施例二. 本发明氧化剂对于对引物合成的影响
为了验证添加咪唑衍生物对引物合成的影响，本发明中所使用48道核酸引物合成仪，合成规格为200nmol。本实例中采用上述的固相亚磷酰胺合成法合成核酸探针，其中所使用的氧化剂按照配方所示列举挑选7种咪唑衍生物进行测试，试剂比例按照目前常用的氧化剂试剂比例配制（V四氢呋喃：V吡啶：V水=7:2:1），咪唑衍生物的浓度为0.25M。如图1和图2所示，测试结果显示向传统氧化剂中添加咪唑衍生物，能够很好的消除的MGB引物被碘化的问题。用普通氧化剂与本发明新型氧化剂合成MGB引物的分子量分别如图1和图2中所示，其中使用传统氧化剂合成的引物质谱图显示有比目标分子量多一个和二个碘原子的质谱图，而使用本发明新型氧化剂合成的引物质谱图则基本没有比目标分子量多一个和二个碘原子的质谱图。但是不同的咪唑衍生物对MGB类核酸探针防止碘化的效果不同，其中苯并咪唑能很好的去除MGB类核酸探针被碘化的现象，参见表1。
合成结束后的MGB类核酸探针需要通过氨解去保护基才能应用于客户端。本例中采用气相氨解的方法进行氨解脱保护，将合成结束后的MB探针加入100ul的DEA和100ul的超纯水润湿，离心后再将引物放入气相氨解锅中氨解2h，氨解结束后用超纯水润湿CPG粉末，再将试剂心至96孔板中，所得到的黑红色液体即为所溶解在超纯水中的MGB探针。
最后通过LTQ质谱仪检测核酸探针分子量大小来验证是否被碘化，MS数据中目标分子量峰与理论分子量偏差≤0.05%且占比100%，碘化的质谱分子量占比为0%。Waters纯化仪的HPLC主峰面积验证MGB核酸探针的粗品纯度。其中实验数据如下表1所示：
表1 不同咪唑衍生物对MGB核酸探针防止碘化的结果
在P1-P21的MGB探针中，加入苯并咪唑实验中，碘化质谱峰占比为0，粗品纯度也最高，苯并咪唑的效果最佳；咪唑的技术效果次之；而1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、1-乙基咪唑、2-乙基咪唑和N-三苯甲基咪唑在效果上相差不大，相对于苯并咪唑和咪唑的效果要差。在P22-P24MGB探针中，没有加入本发明的咪唑类化合物到氧化剂中，碘化质谱峰占比分别是60.2%、63.2%和59.3%，远远高于本发明的氧化剂。另外，使用本发明氧化剂得到产物的粗品纯度远远高于现有技术得到产物的粗品纯度。
实施例三碘单质浓度条件优化实验
通过实例一已经验证出向传统的氧化剂中添加咪唑可以很好的去除碘化的情况，同时也得出使用苯并咪唑的引物纯度明显要高于其他咪唑衍生物，于是我们基于苯并咪唑的基础上对配方的条件进行优化。本例中使用了编号P4、P5、P6探针进行了优化条件的测试。
根据固相亚磷酰胺合成法中氧化步骤的原理，其中碘单质作为氧化剂起到至关重要的作用，因此碘单质的浓度大小会验证影响到氧化效率，通过改变碘单质的浓度使氧化效率达到最高。碘单质浓度的优化条件如下表2所示：
表2 碘单质不同浓度条件
碘单质浓度的不同优化条件结果如下表3所示：
表3 碘单质不同浓度优化结果
从粗品纯度的结果分析，所述氧化剂碘的浓度为0.02-0.1M范围时，粗品纯度的效果明显是优于0.01M碘；其中0.03-0.08M的效果较好，浓度是0.05M时效果最佳，测试结果显示碘单质浓度为0.05M时，去除碘化峰达到100%且核酸探针的粗品平均纯度为83.33%；其余浓度测试纯度均低于80%。
实施例四反应试剂配制比例的优化实验
根据固相亚磷酰胺合成法中氧化步骤的原理，其中四氢呋喃作为反应溶剂，不需要再做改变，主要影响到MGB修饰碘化的物质为吡啶、咪唑衍生物，改变两者的比例使反应达到最佳。在碘单质浓度为0.05M的情况下，反应试剂配制比例的优化条件如下表4所示。
表4 反应试剂配制比例条件
表5 反应试剂配制比例实验结果
注释：表5中分子量指的是核酸探针的相对分子量，也即是探针组成中所有原子的原子量的总和通过分子量可以确认合成的核酸探针的碱基序列是正确无误的，标准是理论分子量和实际分子量的偏差≤0.05%。
使用编号P4、P5、P6的MGB核酸探针进行反应试剂配制比例的优化，并且碘单质的浓度为0.05M。测试结果显示，条件编号V1-V3的优化条件，得到的质谱结果和纯度分析是最优的，而编号V7-V9优化条件是最差的，直接导致合成失败，而编号V4-V6的优化条件平均纯度分析也只有50%。其中编号V1-V3中不同比例的咪唑衍生物中，其浓度为0.55M（条件编号V2）的平均纯度分析达到了85%。因此，试剂配比为四氢呋喃：吡啶：超纯水（V四氢呋喃：V吡啶：V水）=7:2:1，碘单质浓度为0.05M，且苯并咪唑的最佳浓度为0.55M。
实施例五反应温度及时间的优化实验
通常，一个化学反应的时间和温度是影响反应效率的关键因素，本发明中的反应也不例外，通过优化反应温度和反应时间以达到最佳的反应效率，反应时间和反应温度优化条件如下表6所示。在本实施例中，在碘单质浓度为0.05M和苯并咪唑浓度为0.55M的情况下进行。
表6 反应温度及时间优化条件
表7 反应温度及时间实验结果
注释：表7中的分子量指的是核酸探针的相对分子量，也即是探针组成中所有原子的原子量的总和。能够通过分子量可以确认说明合成的核酸探针的碱基序列是正确无误的，标准是理论分子量和实际分子量的偏差≤0.05%
从实验结果可以看出，在37℃反应温度下，编号T7-T9的优化条件结果显示有MGB核酸探针被碘化的情况；在20℃反应温度下，编号T4-T6的优化条件无碘化情况，但是平均纯度只有76%；在4℃反应温度下，编号T1-T3中反应时间为12h时，平均纯度达到了89%，因此最佳的配制反应温度为4℃，反应时长为12h。
实施例六反应温度及时间的优化实验
由于碘和超纯水不互溶，与吡啶和四氢呋喃互溶，因此在混合过程加入超纯水时碘会被析出，会影响反应效率。为了最大化的使碘溶解在试剂中，有必要优化试剂添加顺序来使碘充分溶解。试剂添加流程优化条件如下表8所示：
表8 配制流程优化条件
表9 试剂添加顺序的优化实验结果
注释：表9中的分子量指的是核酸探针的相对分子量，也即是探针组成中所有原子的原子量的总和。
使用编号P4、P5、P6的MGB探针进行试剂添加顺序的条件优化，并且采用编号V2的试剂配比和编号T3的反应条件，碘单质浓度为0.05M。测试结果显示编号S5的测试条件得到的质谱结果和纯度都是最优的，其中平均分析纯度达到了91%，而其他的条件均未对纯度和MS有影响。因此最佳的配制流程应为：四氢呋喃→碘→吡啶→咪唑衍生物→超纯水。
实施例七本发明探针的应用
本例中合成三条核酸探针probe1-3，并购买相同序列的商业合成的MGB探针probe4-6，在相同条件下进行QPCR性能验证。结果显示，本发明的probe1-3的Ct值、荧光本底、荧光信号均好于probe4-6。可见，本例中制备的MGB探针的性能优于目前商业中的MGB探针。
表10 引物探针信息
表11 本发明制备探针在QPCR中性能验证
本领域的技术人员容易理解的是，在不冲突的前提下，上述各有利方式可以自由地组合、叠加。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (20)
1.一种用于MGB核酸探针合成的氧化剂组合物，其特征在于，所述组合物包括：氧化剂碘，和与MGB上的N-H键竞争结合氧化剂碘、不干扰MGB的化合物，该化合物具有比MGB上的N-H键更强的与氧化剂碘结合的能力。
2.根据权利要求1所述的氧化剂组合物，其特征在于，与MGB上的N-H键竞争结合氧化剂碘、不干扰MGB的化合物是咪唑衍生物。
3.根据权利要求2所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述咪唑衍生物是咪唑、苯并咪唑、1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、2-甲基咪唑啉、N-三苯甲基咪唑、N-甲基苯并咪唑、5-甲基苯并咪唑、2-苯甲基咪唑啉、4-胺甲基咪唑、2，4二甲基咪唑、1，2-二甲基咪唑、4，5-二甲基咪唑、4-甲基-1H-咪唑、5-氯-1-甲基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑、2-乙基咪唑、1-乙基咪唑、2-乙基苯并咪唑、2-乙基-4甲基咪唑。
4.根据权利要求3所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述咪唑衍生物是苯并咪唑类化合物。
5.根据权利要求4所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述咪唑衍生物是是苯并咪唑。
6.根据权利要求5所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述组合物还包括四氢呋喃、吡啶、超纯水。
7.根据权利要求6所述的氧化剂组合物，其特征在于，四氢呋喃、吡啶、超纯水的体积比是7：2：1。
8.根据权利要求7所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述氧化剂碘的浓度为0.02-0.1M。
9.根据权利要求8所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述氧化剂碘的浓度为0.03-0.08M。
10.根据权利要求9所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述氧化剂碘的浓度为0.05M。
11.根据权利要求4所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述咪唑衍生物的浓度为0.35M-0.65M。
12.根据权利要求11所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述咪唑衍生物的浓度为0.45M-0.65M。
13.根据权利要求12所述的氧化剂组合物，其特征在于，所述咪唑衍生物的浓度为0.55M。
14.一种MGB核酸探针合成方法，其特征在于，所述合成方法中使用权利要求1-13任一所述的氧化剂组合物。
15.根据权利要求14所述的合成方法，其特征在于，所述氧化剂组合物在配制过程中采用四氢呋喃→碘→吡啶→咪唑衍生物→超纯水的试剂添加顺序。
16.根据权利要求14所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法中反应温度不超过20℃。
17.根据权利要求16所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法中反应温度为4-20℃。
18.根据权利要求17所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法中反应温度为4℃。
19.根据权利要求14所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法中反应时间为1-12小时。
20.根据权利要求19所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法中反应时间为12小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210618471.3A CN114685572B (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210618471.3A CN114685572B (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114685572A true CN114685572A (zh) | 2022-07-01 |
| CN114685572B CN114685572B (zh) | 2022-08-30 |
Family
ID=82130893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210618471.3A Active CN114685572B (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114685572B (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1737165A (zh) * | 2004-08-19 | 2006-02-22 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 一种减少假阳性结果的方法 |
| US20110275793A1 (en) * | 2008-05-29 | 2011-11-10 | Debart Francoise | Chemical RNA Synthesis Method |
| CN109689668A (zh) * | 2016-06-24 | 2019-04-26 | 比奥根Ma公司 | 无加帽步骤的硫醇化寡核苷酸的合成 |
| CN110922434A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-27 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种脱氧核苷酸引物合成方法 |
| CN112673102A (zh) * | 2018-10-02 | 2021-04-16 | 东丽株式会社 | 发夹型单链rna分子的制备方法 |
| CN112898363A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-06-04 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 |
| WO2021153047A1 (ja) * | 2020-01-29 | 2021-08-05 | 住友化学株式会社 | 核酸オリゴマーの製造方法 |
| CN113528511A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-10-22 | 南方医科大学 | 一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用 |
| CN113993876A (zh) * | 2019-06-11 | 2022-01-28 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用改进的氧化方案制备寡核苷酸的方法 |
| CN114425443A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 江苏金斯瑞生物科技有限公司 | 一种寡核苷酸合成催化剂 |
-
2022
- 2022-06-02 CN CN202210618471.3A patent/CN114685572B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1737165A (zh) * | 2004-08-19 | 2006-02-22 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 一种减少假阳性结果的方法 |
| US20110275793A1 (en) * | 2008-05-29 | 2011-11-10 | Debart Francoise | Chemical RNA Synthesis Method |
| CN109689668A (zh) * | 2016-06-24 | 2019-04-26 | 比奥根Ma公司 | 无加帽步骤的硫醇化寡核苷酸的合成 |
| CN112673102A (zh) * | 2018-10-02 | 2021-04-16 | 东丽株式会社 | 发夹型单链rna分子的制备方法 |
| CN113993876A (zh) * | 2019-06-11 | 2022-01-28 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用改进的氧化方案制备寡核苷酸的方法 |
| CN110922434A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-27 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种脱氧核苷酸引物合成方法 |
| WO2021153047A1 (ja) * | 2020-01-29 | 2021-08-05 | 住友化学株式会社 | 核酸オリゴマーの製造方法 |
| CN114425443A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 江苏金斯瑞生物科技有限公司 | 一种寡核苷酸合成催化剂 |
| CN112898363A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-06-04 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种亚磷酰胺单体组合物及其制备方法和应用 |
| CN113528511A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-10-22 | 南方医科大学 | 一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李红霞: "两种Taqman探针的制备及荧光检测性能比较", 《化学研究与应用》 * |
| 江湘儿等: "DNA合成技术与仪器研发进展概述", 《集成技术》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114685572B (zh) | 2022-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0733058B1 (en) | Nucleic acid mediated electron transfer | |
| Capelle et al. | Deoxyribonucleic acid bifunctional intercalators: kinetic investigation of the binding of several acridine dimers to deoxyribonucleic acid | |
| Xu et al. | Spectroscopic studies on the interaction between Pr (III) complex of an ofloxacin derivative and bovine serum albumin or DNA | |
| CN103060924A (zh) | 微量核酸样本的文库制备方法及其应用 | |
| CN101838683A (zh) | 一种kras基因和/或braf基因的核苷酸突变位点的检测方法 | |
| Holland et al. | Transcription of yeast DNA by homologous RNA polymerases I and II: selective transcription of ribosomal genes by RNA polymerase I | |
| CN114685572B (zh) | 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法 | |
| Zhou et al. | Ψ-type hybridization and CRISPR/Cas12a-based two-stage signal amplification for microRNA detection | |
| CN108502888A (zh) | 三氯硅烷的纯化系统以及硅晶体 | |
| WO1990008838A1 (en) | Labeling of nucleic acids with fluorescent markers | |
| CN108624666A (zh) | 用于构建测序文库的接头核酸分子 | |
| CN108239669B (zh) | 检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒 | |
| WO2020243597A1 (en) | Flexible and high-throughput sequencing of targeted genomic regions | |
| Lee et al. | A label-free detection of ndei endonuclease activity by using dna-templated silver nanoclusters | |
| Dohno et al. | Small molecule-induced trinucleotide repeat contractions during in vitro DNA synthesis | |
| JPS6144353A (ja) | 蛍光標識化されたポリヌクレオチドとその製法 | |
| Suto et al. | Synthesis of γ-phosphate-linked nucleoside affinity chromatography resins for protein purification, including ribonucleoside triphosphate reductase | |
| WO2021061154A1 (en) | Diastereomeric linking reagents for nucleotide probes | |
| CN117987519A (zh) | 延伸试剂缓冲液及其应用、延伸试剂盒、测序方法 | |
| Calderan et al. | Gas‐phase ion chemistry in the ternary SiH4–C3H6–PH3 system | |
| EP4442824A1 (en) | Binding substance and analysis method | |
| Kupryushkin et al. | A convenient method for the synthesis of phosphoramidite non-nucleotide inserts for preparation of functionalized oligonucleotides | |
| WO2002066679A1 (en) | Intercalator suitable for electrochemical detection of double strand dnas and a process for preparing thereof | |
| CN112888699B (zh) | 测序用核苷酸的制备方法 | |
| Kobayashi et al. | Release of free nucleobases from oligomers by copper (II)–peroxide adduct |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Building 23, No. 99, Shuhai Road, Songjiang District, Shanghai, 201611 Patentee after: Briggs Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. Address before: Building 23, No. 99, Shuhai Road, Songjiang District, Shanghai, 201611 Patentee before: SHANGHAI BIOLIGO BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20220701 Assignee: Guangzhou Bailige Life Technology Co.,Ltd. Assignor: Briggs Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980014705 Denomination of invention: Oxidant composition and probe synthesis method for MGB nucleic acid probe synthesis Granted publication date: 20220830 License type: Common License Record date: 20240911 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |