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CN114672494A - 烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用 - Google Patents

烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用 Download PDF

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CN114672494A
CN114672494A CN202210206578.7A CN202210206578A CN114672494A CN 114672494 A CN114672494 A CN 114672494A CN 202210206578 A CN202210206578 A CN 202210206578A CN 114672494 A CN114672494 A CN 114672494A
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CN
China
Prior art keywords
ntexb1
gene
tobacco
plant
regulation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210206578.7A
Other languages
English (en)
Inventor
王林
曹培健
金静静
许亚龙
谢小东
张剑锋
罗朝鹏
徐馨
武明珠
杨军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Original Assignee
Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC filed Critical Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC
Priority to CN202210206578.7A priority Critical patent/CN114672494A/zh
Publication of CN114672494A publication Critical patent/CN114672494A/zh
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用专利申请事宜。烟草NtEXB1基因与腋芽处分枝发育相关，具有增加或者减少植物分枝的作用，用于植物株型调控；烟草NtEXB1基因序列如SEQ ID No.1所示。本申请中，通过对该基因组织表达特点研究，发明人发现：烟草NtEXB1基因在雌蕊处表达量最高，同时在腋芽中有相对较高的表达量，而在顶芽中表达量最低。进一步对该基因沉默后植株表型研究后发现，通过降低NtEXB1基因表达量后，烟草腋芽发育速度明显变缓。基于这些结果，可为针对性培育合适植株株型新品种奠定一定理论基础和技术基础。

Description

烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用专利申请事宜。
背景技术
植物的分枝是通过腋生分生组织发育形成的，在植物株型调控中具有决定性作用，而植物株型又与作物产量和品质密切相关，因此，植物株型调控研究具有重要的生产应用意义。而已有研究表明，植物侧枝发育虽然受植物激素、环境等多种因素的影响，但归根结底而言，遗传因素对于植物分枝发育仍然是具有基础性决定作用的。
相关植物基因研究工作表明，大量的基因均参与了植物的分枝发育调控过程，比如植物腋分生组织发育起始相关的番茄LS基因，研究表明，将LS基因发生突变后，营养生长阶段的腋生分生组织形成被完全抑制。另有研究表明，MYB转录因子家族的RAX1和RAX2基因在拟南芥腋分生组织形成中发挥重要作用。再如，研究表明，TB1基因是调控玉米腋芽休眠的关键基因，在调控腋芽发育中具有关键作用。
烟草作为一种以收获叶片为生产原料的经济作物，其分枝发育相关基因研究，对于于改良烟草株型和提升烟叶产量，显然具有重要的技术意义。
发明内容
基于分枝发育基因对于烟草生产的重要技术意义，本申请通过对烟草NtEXB1基因与植株分枝发育活动相关研究，从而为烟草株型调控奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案简述如下。
烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用，烟草NtEXB1基因与烟草腋芽处分枝发育相关，具有增加或者减少植物分枝的作用，可用于植物株型调控；所述植物，具体例如为烟草；
具体应用时，通过基因工程技术手段，通过将NtEXB1基因沉默进而抑制NtEXB1基因表达翻译为NtEXB1蛋白后，基因沉默植株中，烟草腋芽生长缓慢（即，通过基因沉默方式抑制烟草分枝发育）；
所述烟草NtEXB1基因，其编码碱基序列长度为927bp，序列如SEQ ID No.1所示；具体如下：
ATGTCTGATAATAACCCTTTTTATCATGATTACTTGGGAACAGGAGGGATAAATAATGCATTTTCTAATTTCTTTGGTGATCAAAATCCCTCAATTTATGATCAAATAATACCTCCTAATACACAAACCCCTCATCAGGATTTTGATCCTTCATCTTATATGAGTACTCTCACTGAGTGTTTACATGGTTCTATGGACTATAACTCTTTATCAAATGTTCTTGGCATGAGTTGCTCATCTTCTGAAGTTGTTTGTCCACCATTAGATCAAGAATCTTCAAGAAAAAACACTGCTGAAATTCCATTGACTCCAAATTCTTTGGTCTCTTCATCTTCTAGTGAGGCTGGAGGTGAAGAAGATTCTTCAAAAAGCAAGAAAGATTTGCAAGCAAAAGATCAGTGTGAAGATGGAGATGATAAGTCTAAGAAAGTGAGCAAAGCAAAGAAGAAAGGAGAAAAGAAGCAAAAGGAGCCGCGATTTGCCTTTATGACTAAGAGTGAGATTGACAATCTTGAAGATGGCTATCGATGGAGAAAATATGGGCAGAAAGCAGTGAAAAATAGTCCTTTTCCGAGGAGTTATTACAGATGCACAAGTCAAAAGTGCAGTGTGAAGAAACGTGTGGAAAGATCATATGAAGATCCATCAGTCGTGATCACTACATACGAAGGCCAACATAATCATCACTGTCCCGCAACTCTTCGTGGAAATGCAGCTGCAGCTATGCTTTCACCTTCCTTCTTATCCTCTTCACAATTAATTCCTCAAGATGTACTCTTTGCCCAAATGCTTACAACCCCAACCAATCAAAATCAGCTCCCTATTAATTATTCTGTCTATAATTATCAGCAGCAACCCCAATTAGGTCCTGAATATGGCCTATTTCAAGATATGGTTGCATCATTGATCCACAAACGAGAGCCATGA；
烟草NtEXB1基因所编码烟草分枝发育调控蛋白NtEXB1的氨基酸序列长度为308AA，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
MSDNNPFYHDYLGTGGINNAFSNFFGDQNPSIYDQIIPPNTQTPHQDFDPSSYMSTLTECLHGSMDYNSLSNVLGMSCSSSEVVCPPLDQESSRKNTAEIPLTPNSLVSSSSSEAGGEEDSSKSKKDLQAKDQCEDGDDKSKKVSKAKKKGEKKQKEPRFAFMTKSEIDNLEDGYRWRKYGQKAVKNSPFPRSYYRCTSQKCSVKKRVERSYEDPSVVITTYEGQHNHHCPATLRGNAAAAMLSPSFLSSSQLIPQDVLFAQMLTTPTNQNQLPINYSVYNYQQQPQLGPEYGLFQDMVASLIHKREP。
烟草NtEXB1基因PCR扩增用引物序列，具体设计如下：
NtEXB1-F: 5'-ATGTCTGATAATAACCCTTTTTATC-3'
NtEXB1-R: 5'-GATAAAAAGGGTTATTATCAGACAT-3'。
用于敲低烟草NtEXB1基因表达的重组载体，该重组载体命名为pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1，通过如下步骤构建获得：
（一）设计引物，并进行PCR扩增
基于基因沉默目的序列，设计PCR扩增用引物序列如下：
NtEXB1-F(+)：5’-cagtGGTCTCacaacACACAAACCCCTCATCAGGA-3’，
NtEXB1-F(-)：5’-cgatGGTCTCacaggTTTGCTTGCAAATCTTTCTT-3’；
利用上述引物扩增目的片段序列如下：
ACACAAACCCCTCATCAGGATTTTGATCCTTCATCTTATATGAGTACTCTCACTGAGTGTTTACATGGTTCTATGGACTATAACTCTTTATCAAATGTTCTTGGCATGAGTTGCTCATCTTCTGAAGTTGTTTGTCCACCATTAGATCAAGAATCTTCAAGAAAAAACACTGCTGAAATTCCATTGACTCCAAATTCTTTGGTCTCTTCATCTTCTAGTGAGGCTGGAGGTGAAGAAGATTCTTCAAAAAGCAAGAAAGATTTGCAAGCAAA；
NtEXB1-R(+)：5’-cagtGGTCTCagggcTTTGCTTGCAAATCTTTCTT-3’；
NtEXB1-R(-)：5’-cagtGGTCTCatacaACACAAACCCCTCATCAGGA-3’；
利用上述引物扩增目的片段序列如下：
TTTGCTTGCAAATCTTTCTTGCTTTTTGAAGAATCTTCTTCACCTCCAGCCTCACTAGAAGATGAAGAGACCAAAGAATTTGGAGTCAATGGAATTTCAGCAGTGTTTTTTCTTGAAGATTCTTGATCTAATGGTGGACAAACAACTTCAGAAGATGAGCAACTCATGCCAAGAACATTTGATAAAGAGTTATAGTCCATAGAACCATGTAAACACTCAGTGAGAGTACTCATATAAGATGAAGGATCAAAATCCTGATGAGGGGTTTGTGT；
随后，以烟草cDNA为模板，分别利用上述引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行提取、纯化备用，获得干扰载体的目标序列片段；
（二）酶切、连接
将步骤（一）中所得PCR扩增产物与pBWA(V)KS-RNAi载体分别进行BsaI/Eco31I双酶切，并利用T4_ligase对酶切产物进行连接；
（三）转化和筛选
将步骤（二）中连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行筛选、鉴定获得重组构建正确的重组质粒表达载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1 。
所述重组载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1在植物中应用，将该重组载体转化植物后，能够降低NtEXB1基因翻译表达水平，进而用于抑制植物分枝发育，从而实现株型调控效果。
一种调控植物株型的植物新品种培育方法，利用农杆菌介导的基因转化方法，将重组载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1转化植物后，进一步筛选、鉴定获得NtEXB1基因表达降低新品种，该新品种腋芽生长缓慢。
基于前期工作积累，本申请中，发明人选择烟草NtEXB1基因作为研究对象，通过对该基因组织表达特点研究，发明人发现：烟草NtEXB1基因在雌蕊处表达量最高，同时在腋芽中有相对较高的表达量，而在顶芽中表达量最低，即，该基因有可能可特定作用于腋芽相关组织调节。进一步对该基因沉默后植株表型研究后发现，通过降低NtEXB1基因表达量后，烟草腋芽发育速度明显变缓。基于这些结果，可为针对性培育合适植株株型新品种奠定一定理论基础和技术基础。
附图说明
图1为NtEXB1基因在不同组织中的表达特征；
图2为NtEXB1干扰植株中NtEXB1基因表达量分析结果；图中EXB1-1、EXB1-2、EXB1-5、EXB1-6表示的为不同的转基因株系，符合名称并不具有特殊技术含义；
图3为NtEXB1干扰植株的腋芽长度，图中EXB-1、EXB-2表示的为不同的转基因栽培株系，符合名称不具有特殊技术含义。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
烟草品种：K326，一种常见的栽培烟草品种，实施例中所采用种子由国家烟草基因研究中心保存提供；
载体：pEASY-T1 Simple 载体，购自北京全式金生物技术有限公司；
pBWA(V)KS-RNAi 载体，由武汉伯远生物科技有限公司提供；
菌株：
Trans1-T1化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；
LBA4404农杆菌菌株，生物实验中常用菌株，可公开获得；
引物的合成和DNA测序由北京六合华大基因科技股份有限公司提供完成；
实验试剂：
荧光定量PCR酶（SYBR qPCR kit），购自郑州安赛生物科技有限公司；
反转录试剂盒、T4连接酶、限制性内切酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；
DNA扩增酶，购自北京全式金生物技术有限公司；
RNA 提取试剂盒（SuperPure Plant polyRNA Kit）、DNA纯化胶回收试剂盒购自QIAGEN公司。
实施例1
基于前期研究工作总结，发明人选择烟草NtEXB1基因作为研究对象。为便于对该基因对植物生长实际影响情况进行明确，发明人首先对该基因进行了克隆。具体过程简介如下。
（1）制备cDNA作为克隆模板
取旺长期烟草（K326）的叶片100mg作为样品，在液氮中充分研磨，参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，然后反转录为cDNA备用；
（2）设计引物，进行PCR扩增
设计用于扩增NtEXB1基因的引物序列如下：
NtEXB1-F: 5'-ATGTCTGATAATAACCCTTTTTATC-3'
NtEXB1-R: 5'-GATAAAAAGGGTTATTATCAGACAT-3'
以步骤（1）中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，
50 μl扩增体系设计如下：
cDNA 模板，2 μl；
上、下游引物，各1 ul；
2×TransStart GoldPfu PCR SuperMix，25 μl；
ddH2O加至50 ul。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；再72℃终延伸10min。
对PCR扩增产物进行电泳检测分析后，参照胶回收试剂盒说明书，对PCR扩增产物进行回收纯化。
（3）与pEASY-T1载体连接、转化
将步骤（2）中所提取PCR扩增产物连接到pEASY-T1载体上，具体连接体系参考如下：
PCR扩增产物，6μL；
pEASY-T1 载体，1μL；
混匀后，25℃连接25 min。
随后，将上述连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，具体转化过程操作参考如下：
冰上溶解感受态细胞后，加连接产物于50μL的Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30 min；42℃水浴中热激30s，立即置于冰上2min；加入250μL平衡至室温的LB（不含抗生素），37℃摇荡培养1h；混合后均匀地涂布到LB固体平板（含60μg/μL 氨苄青霉素）平板上，倒置培养皿，37℃培养过夜。
挑取白斑扩增培养后，提取质粒DNA，并对重组质粒进行菌液PCR鉴定，随后，将重组正确的阳性重组质粒送样测序，获得NtEXB1基因序列。
测序分析结果表明，NtEXB1基因编码区长度为927 bp个核苷酸，具体如SEQ IDNO.1所示；进一步分析可知，其所编码的NtEXB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
在实施例1基础上，基于荧光定量PCR技术，发明人对NtEXB1基因的组织表达模式特点进行了分析研究，具体试验过程简介如下。
采集现蕾期烟草的雌蕊、顶芽、根、花瓣、花萼、茎、雄蕊、叶片、叶脉、腋芽作为样品，提取RNA，并利用反转录试剂盒合成cDNA备用（参考试剂盒说明书操作即可）。
以烟草NtL25基因为内参，进行荧光定量PCR检测，检测时，引物序列设计如下：
检测NtEXB1基因的荧光定量引物，引物序列为：
NtEXB1-q-F: 5’- TCTTCGTGGAAATGCAGCTG-3’，
NtEXB1-q-R: 5’- CCTAATTGGGGTTGCTGCTG-3’；
检测烟草NtL25基因时，具体引物设计为：
NtL25-F: 5’-CAAAAGTTACATTCCACCG-3’，
NtL25-F: 5’-TTTCTTCGTCCCATCAGGC-3’；
荧光定量PCR的条件为：第一步预变性，95℃、10 s；第二步PCR反应，95℃、5 s， 60℃、30 s，39个循环；第三步溶解曲线。
每个样品进行3次生物学重复，通过2-△△CT方法分析相对基因表达差异。分析结果如图1所示。可以看出，烟草NtEXB1基因在雌蕊处表达量最高，另外在花瓣、雄蕊、腋芽中也有相对较高的表达量，而在顶芽中表达量最低。
实施例3
为进一步了解NtEXB1基因在植株生长发育中的作用，发明人构建了用于敲低NtEXB1基因的重组表达载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1，下面就该重组载体的构建过程简要介绍如下。
（一）设计靶位点序列和PCR扩增用引物
根据实施例1测序所得NtEXB1基因编码序列，在NtEXB1基因的编码区域选取了部分片段作为RNAi构建的靶序列（272bp）：
ACACAAACCCCTCATCAGGATTTTGATCCTTCATCTTATATGAGTACTCTCACTGAGTGTTTACATGGTTCTATGGACTATAACTCTTTATCAAATGTTCTTGGCATGAGTTGCTCATCTTCTGAAGTTGTTTGTCCACCATTAGATCAAGAATCTTCAAGAAAAAACACTGCTGAAATTCCATTGACTCCAAATTCTTTGGTCTCTTCATCTTCTAGTGAGGCTGGAGGTGAAGAAGATTCTTCAAAAAGCAAGAAAGATTTGCAAGCAAA；
基于所选择的靶位点序列，进一步设计PCR扩增用引物序列如下：
NtEXB1-F(+):5’-cagtGGTCTCacaacACACAAACCCCTCATCAGGA-3’，
NtEXB1-F(-):5’-cgatGGTCTCacaggTTTGCTTGCAAATCTTTCTT-3’；
利用上述引物扩增目的片段序列如下：
ACACAAACCCCTCATCAGGATTTTGATCCTTCATCTTATATGAGTACTCTCACTGAGTGTTTACATGGTTCTATGGACTATAACTCTTTATCAAATGTTCTTGGCATGAGTTGCTCATCTTCTGAAGTTGTTTGTCCACCATTAGATCAAGAATCTTCAAGAAAAAACACTGCTGAAATTCCATTGACTCCAAATTCTTTGGTCTCTTCATCTTCTAGTGAGGCTGGAGGTGAAGAAGATTCTTCAAAAAGCAAGAAAGATTTGCAAGCAAA；
NtEXB1-R(+):5’-cagtGGTCTCagggcTTTGCTTGCAAATCTTTCTT-3’，
NtEXB1-R(-):5’-cagtGGTCTCatacaACACAAACCCCTCATCAGGA-3’；
利用上述引物扩增目的片段序列如下：
TTTGCTTGCAAATCTTTCTTGCTTTTTGAAGAATCTTCTTCACCTCCAGCCTCACTAGAAGATGAAGAGACCAAAGAATTTGGAGTCAATGGAATTTCAGCAGTGTTTTTTCTTGAAGATTCTTGATCTAATGGTGGACAAACAACTTCAGAAGATGAGCAACTCATGCCAAGAACATTTGATAAAGAGTTATAGTCCATAGAACCATGTAAACACTCAGTGAGAGTACTCATATAAGATGAAGGATCAAAATCCTGATGAGGGGTTTGTGT。
利用上述引物，以烟草cDNA为模板进行PCR扩增，获得构建干扰载体的目标序列片段。
（二）酶切、连接
将步骤（一）中所得PCR扩增产物与pBWA(V)KS-RNAi载体分别进行BsaI/Eco31I双酶切，并利用T4_ligase对酶切产物进行连接；
（三）转化和筛选
将步骤（二）中连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行筛选，挑取阳性质粒进一步经菌液PCR鉴定和测序鉴定后，获得重组构建正确的重组质粒表达载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1（相关操作参考前述及现有技术常规操作即可，不再赘述）。
实施例4
基于农杆菌介导的转化法，发明人进一步将实施例3 所构建重组载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1转化了烟草植株，以期获得NtEXB1基因表达量降低或者NtEXB1基因敲除的转基因植株新品种。具体实验过程简要介绍如下。
（1）转化农杆菌
在冰上冻融农杆菌感受态细胞后，加入6 μL实施例3所制备载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1，轻弹混匀；随后将混合物置于预冷的电转杯中，冰上放置5 min；
将电转仪参数调至：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200 Ω；然后用吸水纸将电转杯外壁上的水滴吸除干净后，把电转杯放入电击槽中，电击5 ms；
迅速加入800 μL的预热至28℃的YEB液体培养基，220 rpm、28℃振荡复苏3 h；
然后将菌液4500 rpm离心1 min，弃一半体积的上清，重新悬浮后均匀涂于含有Rif（100 μg/mL）、Str（50 μg/mL）和Kan（50 μg/mL）的YEB固体培养基上，28℃倒置培养约2~3 d，直至单菌落形成；
挑取单菌落，扩培后对菌液进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性克隆菌株，即为转化正确的农杆菌工程菌。
进一步将农杆菌工程菌培养至OD600=0.6左右，4000 rpm离心5 min收集菌体，再用20 mL的MS液体培养基悬浮菌体，以此作为后续转染用侵染液。
（2）转化烟草植株
取生长一个月左右的K326烟草无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5 cm大小的叶盘，将处理后叶盘在MS固体培养基上预培养3 d；
随后，将上述预培养后叶盘置于步骤（1）中的侵染液中，充分侵染10 min；
用无菌的滤纸吸干浸染后叶盘周围多余的菌液，再在MS+6-BA（2 mg/L）+NAA（0.5mg/L）的固体培养基上暗培养3 d；
用含有Cef（400 mg/L）的无菌水清洗叶盘，并用无菌滤纸吸去多余的液体，将叶盘转到含有6-BA（2 mg/L）、NAA（0.5 mg/L）、Cef（200 mg/L）和Kan（50 mg/L）的MS固体筛选培养基上，28℃光照培养；
待不定芽长到0.5cm时，转移到含Cef（200 mg/L）和Kan（50 mg/L）的MS固体培养基上生根。
待生长一个月左右，取少量叶片，提取DNA，并通过PCR方法检测阳性转基因株系。具体PCR鉴定时，引物设计为：
NtEXB1-J-F: 5’-TTCATTTGGAGAGAACACGGGGGAC-3’，
NtEXB1-J-R: 5’-TCATGGCTCTCGTTTGTGGA-3’。
转基因株系表型变化情况：
进一步地，基于实时定量PCR技术，对鉴定阳性转基因株系中NtEXB1基因表达情况进行检测分析（具体操作参考前述及现有技术即可）。结果如图2所示。
分析可以看出，与野生型K326相比，在不同RNAi植株株系中，烟草NtEXB1基因表达水平均明显降低，也即，表明成功构建获得了NtEXB1基因表达量降低的转基因植株新品种。
进一步T0代植株移栽至盆中后，温室培养至12周时，对阳性株的腋芽长度表型进行检测统计，结果如图3所示。可以看出，相较于野生型K326，转基因株系腋芽发育缓慢，长度明显短于野生型。进一步结合前述NtEXB1基因表达模式特点，有望利用NtEXB1基因针对性对腋芽分枝发育活动进行调控，进而可为植物尤其是烟草的株型调控奠定一定技术基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120> 烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
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130 135 140
Ser Lys Ala Lys Lys Lys Gly Glu Lys Lys Gln Lys Glu Pro Arg Phe
145 150 155 160
Ala Phe Met Thr Lys Ser Glu Ile Asp Asn Leu Glu Asp Gly Tyr Arg
165 170 175
Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ala Val Lys Asn Ser Pro Phe Pro Arg
180 185 190
Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr Ser Gln Lys Cys Ser Val Lys Lys Arg Val
195 200 205
Glu Arg Ser Tyr Glu Asp Pro Ser Val Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly
210 215 220
Gln His Asn His His Cys Pro Ala Thr Leu Arg Gly Asn Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Met Leu Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ser Ser Gln Leu Ile Pro Gln
245 250 255
Asp Val Leu Phe Ala Gln Met Leu Thr Thr Pro Thr Asn Gln Asn Gln
260 265 270
Leu Pro Ile Asn Tyr Ser Val Tyr Asn Tyr Gln Gln Gln Pro Gln Leu
275 280 285
Gly Pro Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Asp Met Val Ala Ser Leu Ile His
290 295 300
Lys Arg Glu Pro
305

Claims (6)

1.烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用，其特征在于，烟草NtEXB1基因与腋芽处分枝发育相关，具有增加或者减少植物分枝的作用，用于植物株型调控；
所述烟草NtEXB1基因，其编码碱基序列长度为927bp，序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述烟草NtEXB1基因在植株分枝发育调控中应用，其特征在于，所述植物，具体为烟草；
具体应用时，通过基因工程技术手段，通过将NtEXB1基因沉默进而抑制NtEXB1基因表达翻译为NtEXB1蛋白后，基因沉默植株中，腋芽生长缓慢。
3.烟草NtEXB1基因PCR扩增用引物序列，其特征在于，所述烟草NtEXB1基因，序列如SEQID No.1所示，PCR扩增时，具体引物序列设计如下：
NtEXB1-F: 5'-ATGTCTGATAATAACCCTTTTTATC-3'
NtEXB1-R: 5'-GATAAAAAGGGTTATTATCAGACAT-3'。
4.用于敲低烟草NtEXB1基因表达的重组载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1，其特征在于，具体通过如下步骤构建获得：
（一）设计引物，并进行PCR扩增
基于基因沉默目的序列，设计PCR扩增用引物序列如下：
NtEXB1-F(+)：5’-cagtGGTCTCacaacACACAAACCCCTCATCAGGA-3’，
NtEXB1-F(-)：5’-cgatGGTCTCacaggTTTGCTTGCAAATCTTTCTT-3’；
NtEXB1-R(+)：5’-cagtGGTCTCagggcTTTGCTTGCAAATCTTTCTT-3’；
NtEXB1-R(-)：5’-cagtGGTCTCatacaACACAAACCCCTCATCAGGA-3’；
随后，分别利用上述引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行提取、纯化备用，获得干扰载体的目标序列片段；
（二）酶切、连接
将步骤（一）中所得PCR扩增产物与pBWA(V)KS-RNAi载体分别进行BsaI/Eco31I双酶切，并利用T4_ligase对酶切产物进行连接；
（三）转化和筛选
将步骤（二）中连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行筛选、鉴定获得重组构建正确的重组质粒表达载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1 。
5.权利要求4所述重组载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1在植物中应用，其特征在于，将该重组载体转化植物后，能够降低NtEXB1基因翻译表达水平，进而抑制植物腋芽分枝发育，从而实现株型调控效果。
6.一种调控植物株型的植物新品种培育方法，其特征在于，利用农杆菌介导的基因转化方法，将重组载体pBWA(V)KS-RNAi-NtEXB1转化植物后，进一步筛选、鉴定获得NtEXB1基因表达降低新品种，该新品种腋芽生长缓慢。
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