CN114660292A - 检测c5补体的试剂盒及其检测方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫检测领域，涉及一种检测C5补体的试剂盒及其检测方法和用途。具体来说，本发明涉及检测C5补体的试剂盒，及其在制备用于检测病原体感染的诊断剂、用于肿瘤标志物的早期诊断筛查的诊断剂，或制备检测C5补体的试剂或试剂盒中的用途。本发明提供的试剂盒的检测结果准确度高、精密度高、稳定性好、线性好，可用于癌症的初步筛查以及术后跟踪，为肿瘤进展的风险程度提供可靠信息；也可用于检测病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次氏体中的一种或多种病原体，对临床具有指导意义。

Description

检测C5补体的试剂盒及其检测方法和用途

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种检测C5补体的试剂盒及其检测方法和用途。

背景技术

补体成分5(The fifth component of complement,C5)是补体系统中一种重要组分，目前有关C5基因在人类、小鼠、虹鳟鱼、牛这几种生物中都有报道。人类C5基因位于9号染色体长臂32-34区。C5前体蛋白由α、β两条多态链通过二硫键组成，分子量为190kDa。靠近N端的第74-75位精氨酸-亮氨酸键为C5转化酶作用的部位。无活性C5前体蛋白在C5转化酶的作用下，C5酶链N末端裂解出一个小片段C5a进入液相中，其余部分为C5b，仍结合在细胞膜表面。

感染是由细菌、病毒入侵机体而造成，不能高效的鉴别病原体，导致抗生素的滥用现象越来越严重，细菌感染引发耐药性，抗生素的耐药性不断发生。临床上作细菌培养需要3-5天时间，等待的时间过长，耽误救治，医生无法当即给出患者的用药方案，等细菌培养好再用药，耽误病机。

C5测定世界各国包括中国都是沿用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术，此方法费时费力，准确率不高，病人取报告需要2天。市面上某人补体C5检测试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被补体成分5(C5)透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中补体成分5(C5)浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中补体成分5(C5)含量。

由于现有技术中存在的缺陷，目前亟待提供一种快速、准确检测C5补体浓度的试剂盒。

发明内容

发明要解决的问题

由于现有技术中存在以上问题，本发明的目的在于提供一种快速、结果准确度高、精密度高、稳定性好、线性好的检测细菌和/或病毒感染的试剂盒。

用于解决问题的方案

(1)一种检测C5补体的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：

试剂I：第一缓冲液、第一PEG缓冲液；

试剂II：抗C5补体抗体，包含有单克隆抗体和/或多克隆抗体、第二PEG缓冲液、IgG；所述第一缓冲液的pH值为3～10。

(2)根据(1)所述的试剂盒，其中，所述抗C5补体抗体选自兔抗人C5补体抗体、羊抗人C5补体抗体、鼠抗人C5补体抗体中的一种或两种以上的组合；优选的，所述兔抗人C5补体抗体、所述羊抗人C5补体抗体、所述鼠抗人C5补体抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；任选的，所述抗C5补体抗体的抗体效价为1:64-1:128，浓度为100ml/L～800ml/L。

(3)根据(1)或(2)所述的试剂盒，其中，多克隆抗体用微量二氧化锰或高锰酸钾处理修饰后，抗C5补体抗体亲脂性基团改为亲水性。

(4)根据(1)或(2)所述的试剂盒，其中，C5补体单克隆抗体用微量二氧化锰或高锰酸钾处理修饰后，抗C5补体抗体亲脂性基团改为亲水性。

(5)根据(1)～(4)任一项所述的试剂盒，其中，所述抗C5补体抗体共价结合到胶乳颗粒上；优选的，所述抗C5补体单克隆抗体先结合，然后，再结合C5补体多克隆抗体通过碳二亚胺反应共价结合到胶乳颗粒上。

(6)根据(1)～(5)任一项所述的试剂盒在制备用于检测病原体感染的诊断剂中的用途；可选地，所述病原体包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次氏体中的一种或多种。

(7)根据(1)～(6)任一项所述的试剂盒在制备用于肿瘤标志物的早期诊断筛查的诊断剂中的用途，其中，所述肿瘤标志物选自甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结/直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质瘤。

(8)根据(6)或(7)所述的用途，其中采用全血、末梢血、血清预以检测。

(9)一种根据(1)～(8)任一项所述的试剂盒在制备通过以下方法检测C5补体的诊断剂中的用途，其中，所述方法包括：免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、免疫胶乳法、化学发光法或胶体金渗滤法或层析法、即时检测；优选的，所述免疫比浊法包括免疫透射比浊法、免疫散射比浊法波长为340nm、免疫胶乳法波长为600nm-700nm。尤其是在胶体金渗滤法或层析法、Poct(即时检验)、化学发光法、微流控芯片、磁微粒法中，鼠单克隆抗体加入，将试剂的灵敏度提高，而且加入了C5补体多克隆抗体，将使线性更宽，单克隆抗体包含有鼠、兔、羊、马细胞株，多克隆抗体有鼠、兔、羊、马抗体。

(10)根据(9)所述的用途，其中检测人外周血清、全血和末梢血。

(11)根据(9)或(10)所述的用途，其中，所述免疫比浊法包括以下步骤：

样本试剂I加入步骤：将样品加入试剂Ⅰ后，孵育，读测第1点样本A1；

样本试剂II加入步骤：样本试剂I加入步骤后，加入试剂Ⅱ，孵育，读测第2点样本A2。

校准品试剂I加入步骤：将校准品加入试剂Ⅰ后，孵育，读测第1点校准品A1；

校准品试剂II加入步骤：校准品试剂I加入步骤后，加入试剂Ⅱ，孵育，读测第2点校准品A2；其中，

C5补体浓度(mg/L)通过以下公式计算：

(12)根据(1)～(5)任一项所述的试剂盒在制备检测C5补体的试剂或试剂盒中的用途。

发明的效果

本发明提供的试剂盒的检测结果准确度高、精密度高、稳定性好、线性好。

在本发明的一个实施方式中，采用本发明的试剂盒可去除无用的抗体，使抗体与抗原亲和力加强，结合速度加快，加速到达终点。

本发明免疫比浊法只需10分钟即可出报告，便捷快速，准确率高，缩短病人候诊时间，10分钟即可看到报告。

本发明的用于检测和诊断筛查甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质瘤的试剂盒，可提高上述癌症诊断的准确性，特异性好，可用于上述癌症的初步筛查以及术后跟踪，为肿瘤进展的风险程度提供可靠信息；也可用于检测病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次氏体中的一种或多种病原体，对临床具有指导意义。

附图说明

图1示出了本发明试剂盒3中的试剂盒检测六个浓度梯度的标准品，每个浓度梯度检测3次，取平均值，对测定值的平均值和标准品的理论浓度作回归分析，X轴表示理论浓度，Y轴表示测定值均值。

图2示出了胶体金试纸条的结构示意图。

图3示出了以胶体金试纸条进行C5补体检测的结果判读示意图。

具体实施方式

本申请的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

需要说明的是：

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，用“PEG”表示聚乙二醇；其中，“PEG1000”是指聚合度为1000的PEG。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

<第一方面>

本发明提供了一种检测C5补体的试剂盒，所述试剂盒包括：

试剂I：第一缓冲液、第一PEG溶液；

试剂II：抗C5补体抗体、第二PEG溶液、IgG；所述第一缓冲液的pH值为3～10。

本发明发明人发现C5抗原能够与细菌浸提或病毒体粘附在一起，测定C5浓度，即可得知细菌或病毒感染的量，便可得知患者有没有细菌感染或病毒感染。

本发明免疫比浊法只需10分钟，即可出报告，便捷快速，准确率高，缩短病人候诊时间，10分钟即可看到报告。胶体金渗滤法或层析法、(Poct)即时检验更快，2分钟即可准确出报告，减少病人的等待时间。本发明的方法有望取代ELISA双抗体夹心法检测C5补体，应用免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、免疫胶乳法、化学发光法、微流控芯片法、胶体金渗滤法或层析法、Poct即时检测等方法检测C5补体。

本发明试剂盒可检测的病原体包括：病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次氏体中的一种或多种。

进一步的，本发明试剂盒可检测的病毒包括RNA病毒，DNA病毒和蛋白质病毒。在一些具体的实施方案中，本发明的试剂盒所检测的病毒选自肝炎病毒、肠道病毒、麻疹病毒、风疹病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、禽流感病毒、朊病毒、冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒中的一种或多种。示例性的，肝炎病毒可以是甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒等；肠道病毒可以是诺如病毒、轮状病毒、柯萨奇病毒，埃可病毒，星状病毒等；疱疹病毒可以是带状疱疹病毒、EB病毒等；流感病毒可以是甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒等；

进一步的，本发明试剂盒可检测的细菌包括球菌，杆菌和螺旋菌。在一些具体的实施方案中，本发明的试剂盒所检测的病毒选自革兰氏阳性需氧球菌、革兰氏阴性需氧球菌、革兰氏阴性需氧杆菌、革兰氏阴性兼性厌氧菌、革兰氏阴性厌氧杆菌等等。在一些更为具体的实施方案中，本发明的试剂盒所检测的细菌选自葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、奈瑟菌属、莫拉菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、产碱菌属、布鲁菌属、博德氏菌属、军团菌属、埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普鲁菲登菌属、摩根菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、弧菌属、气单胞菌属、消化球菌属、消化链球菌属、微球菌属、类杆菌属、梭杆菌属、炭疽杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、李斯特菌属、丹毒丝菌属、棒状杆菌属、放线菌属、分枝杆菌属、志贺氏菌属中的一种或多种细菌。

示例性的，葡萄球菌属包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等，链球菌属包括α型溶血链球菌、β型溶血链球菌、非溶血链球菌、肺炎球菌等，肠球菌属包括肠球菌等，奈瑟菌属包括脑膜炎球菌、淋球菌、奈瑟氏球菌等，莫拉菌属包括卡他莫拉菌等，不动杆菌属包括无硝不动杆菌、洛菲氏不动杆菌等，假单胞菌属包括绿脓杆菌和其他假单胞菌，产碱菌属包括粪产碱杆菌，博德氏菌属包括百日咳杆菌等，埃希氏菌属包括大肠杆菌等，耶尔森氏菌属包括鼠疫杆菌等，嗜血杆菌属包括流感杆菌等，弧菌属包括霍乱弧菌、ElTor弧菌、副溶血弧菌等，气单胞菌属包括嗜水气单胞菌等，消化球菌属包括消化球菌等，消化链球菌属包括消化链球菌等，微球菌属包括费氏微球菌等，梭杆菌属包括脆弱类杆菌、梭形杆菌等，炭疽杆菌属包括炭疽杆菌等，芽孢杆菌属包括蜡样芽孢杆菌、破伤风芽孢杆菌等，梭菌属包括肉毒杆菌、难辨梭菌、艰难梭状芽孢杆菌等，棒状杆菌属包括白喉杆菌等，分枝杆菌包括结核杆菌、麻风杆菌等，志贺氏菌属包括痢疾杆菌等，放线菌属包括星形奴卡菌等，克雷伯氏菌属包括肺炎杆菌等，军团菌属包括嗜肺军团菌等。

进一步的，本发明试剂盒还可检测念珠菌、曲菌、新型隐球菌、毛霉菌等真菌，肺炎支原体等支原体、Q热立克次体等立克次氏体，或者衣原体等等的病原体。

本发明试剂盒也可以检测肿瘤标志物：甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结/直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质瘤。

试剂I

本发明试剂I中包括第一缓冲液、第一PEG溶液；所述第一缓冲液的pH值为3～10。

在本发明的一些具体的实施方案中，可以使用三羟甲基氨基甲烷缓冲液。三羟甲基氨基甲烷缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷溶液与盐酸溶液按比例混合制备得到的。作为优选的实施方式，本发明中的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为7.5～9.5；作为进一步优选的实施方式，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为8.1。

在本发明中，第一PEG与第二PEG可以相同或者不同。

本发明试剂I中包括第一PEG溶液(聚乙二醇)，当抗C5补体抗体(抗体)与C5补体(抗原)结合形成具有一定结构的免疫复合物，在PEG的作用下，成为悬浮于反应溶液中的微粒，使样品浊度发生变化。

在本发明的一些具体的实施方案中，试剂I中使用的第一PEG包括：PEG1000；在试剂II中使用的第二PEG为PEG 6000～10000，利用试剂I与试剂II的分子量相差极大的PEG，来促使反应加快、加强。反应终点的吸光度稳定，亲和力比一般试剂强。在本发明试剂I中，所述PEG1000的浓度为所述PEG1000的浓度为400g/L～600g/L；作为优选的实施方式，所述PEG1000的浓度为500g/L，在该PEG1000的浓度下，减少样本中的非特异性反应。

本发明试剂I还可进一步包括氯化钙，当本发明中使用的抗C5补体抗体为抗C5补体抗血清时，C5补体抗血清中除了C5补体抗体外的其它抗体被其中的氯化钙结合，可去除无用的抗体，使抗体与抗原亲和力加强，结合速度加快，加速到达终点。作为优选的实施方式，所述氯化钙的浓度为0.25g/mL～0.35g/mL；作为进一步优选的实施方式，所述氯化钙的浓度为0.294g/mL。本发明中加入CaCl₂使抗体与抗原亲和力加强，使反应结合速度加快。更重要的是极大的改善了免疫比浊法的反应线性。

试剂II

本发明试剂II中包括抗C5补体抗体、第二PEG溶液、IgG。

本发明试剂II中包括抗C5补体抗体，所述抗C5补体抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体。在本发明的一些具体的实施方式中，所述多克隆抗体为含有抗C5补体抗体的抗血清。作为优选的实施方式，本发明中的抗C5补体抗体为单克隆抗体。在本发明的一些具体的实施方式中，所述抗C5补体抗体选自兔抗人C5补体抗体、羊抗人C5补体抗体、鼠抗人C5补体抗体中的一种或两种以上的组合。作为优选的实施方式，所述兔抗人C5补体抗体、所述羊抗人C5补体抗体、所述鼠抗人C5补体抗体为单克隆抗体。在本发明一些具体的实施方案中，所述抗C5补体抗体的浓度为100ml/L～800ml/L。作为优选的实施方式，所述抗C5补体抗体的浓度为600ml/L。

本发明试剂II中包括第二PEG，试剂II中可以使用的第二PEG包括：PEG6000～10000。举例而言，所述第二PEG溶液可以是分子量为6000、7000、8000、9000或10000的PEG中的一种或多种。本发明试剂II中所述PEG 6000～10000的浓度为50g/L～70g/L；优选的，所述PEG 6000～10000的浓度为60g/L。当抗C5补体抗体(抗体)与C5补体(抗原)结合形成一定结构的免疫复合物，在PEG的作用下，成为悬浮于反应溶液中的微粒，使样品浊度发生变化。本发明中PEG 1000在试剂I中是400g/L～600g/L，PEG 6000～10000在试剂II中是50～70g/L，利用试剂I与试剂II的比例相差极大，来促使反应加快、加强。反应终点的吸光度稳定，亲和力比一般试剂要强。

在本发明的一些具体的实施方式中，所述试剂II中进一步包括第二缓冲液。所述第二缓冲液的pH值为3～10；优选为8.1。作为优选的实施方式，所述第二缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。缓冲液PH为8.1，反应加快，终点到达速度快。

在本发明的一些具体的实施方式中，在用PEG处理抗体前，加入微量的二氧化锰或高锰酸钾，或二氧化锰及高锰酸钾进行修饰，在二氧化锰或高锰酸钾，或二氧化锰及高锰酸钾达到饱和前都有一定的效果，而实际应用中，二氧化锰与高锰酸钾在浓度为5-15mg/L是，效果最佳。多克隆抗体用微量二氧化锰或高锰酸钾处理修饰后，抗C5补体抗体亲脂性基团改为亲水性，使抗体的效能更加大化，效能更强，使试剂的稳定性更好，保存效期更长可保存24个月，线性更佳，抗干扰性更强。

在本发明的一些具体的实施方式中，在用PEG处理抗体前，加入微量的二氧化锰或高锰酸钾，或二氧化锰及高锰酸钾进行修饰，在二氧化锰或高锰酸钾，或二氧化锰及高锰酸钾达到饱和前都有一定的效果，而实际应用中，二氧化锰与高锰酸钾在浓度为5-15mg/L是，效果最佳。C5补体单克隆抗体用微量二氧化锰或高锰酸钾处理修饰后，抗C5补体抗体亲脂性基团改为亲水性。可以提高试剂灵敏度，使其快速稳定，误差小，可以相应带动多克隆C5补体抗体线性更好反应更佳。

在本发明的一些具体的实施方式中，所述抗C5补体抗体共价结合到胶乳颗粒上。作为优选的实施方式，所述抗C5补体抗体通过碳二亚胺反应共价结合到胶乳颗粒上。在本发明中对胶乳颗粒的种类和大小不做特定限定，可以使用直径为15～120nm的胶乳颗粒。

<第二方面>

在本发明的第二方面提供了一种根据第一方面所述的试剂盒，在制备通过以下方法检测C5补体的诊断剂中的用途，所述方法包括：免疫比浊法和/或化学发光法。本发明中所述免疫比浊法选自免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、免疫胶乳法。

本发明中的免疫比浊法包括以下步骤：

样本试剂I加入步骤：将样品加入试剂Ⅰ后，孵育，读测第1点样本A1；

样本试剂II加入步骤：样本试剂I加入步骤后，加入试剂Ⅱ，孵育，读测第2点样本A2。

校准品试剂I加入步骤：将校准品加入试剂Ⅰ后，孵育，读测第1点校准品A1；

校准品试剂II加入步骤：校准品试剂I加入步骤后，加入试剂Ⅱ，孵育，读测第2点校准品A2。

免疫比浊法测定后，C5补体浓度(mg/L)通过以下公式计算：

具体地，本发明中的免疫比浊法包括：采用生化分析仪测定样本的步骤，将样本加入试剂Ⅰ160ul，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入试剂Ⅱ40ul，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A＝样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤，将校准品加入试剂Ⅰ160ul，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入试剂Ⅱ40ul，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A＝校准A2-校准A1；

在一个实施方式中，上述方法中加入试剂I和试剂II的比例可以按照4:1的比例，进行适当的调整。

上述免疫比浊法测定的温度为36.8～37.2；作为优选的实施方式，上述免疫比浊法测定的温度为37℃，上述免疫比浊法测定的主波长为340nm，上述免疫比浊法测定的副波长为700nm上述免疫比浊法测定的样本或校准品的加入量为3μl-5μl，反应时间为10分钟。

免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、胶乳增强免疫比浊法、化学发光法、Poct即时检测胶乳增强免疫比浊法还包括C5校准品是由5g牛白蛋白、0.3ml Proclin，加水至100ml，提取C5补体抗原组成。质控品是由700mg/L牛白蛋白、350mg/L Proclin，提取C5补体抗原组成。

<第三方面>

在本发明的第三方面提供了一种抗C5补体抗体用于制备检测C5补体的诊断剂中的用途。

本发明发现细菌和病毒的菌体粘附在C5补体的抗原上，通过检测C5补体抗体的浓度，便可得知细菌和病毒的含量。

本发明通过对C5补体的进行检测，可用于细菌感染和病毒感染，治疗前后对比，鉴别是否好转，多种项目联合应用诊断准确率可达100％。病原体包括：病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次氏体中的一种或多种。

进一步的，病毒包括RNA病毒，DNA病毒和蛋白质病毒。在一些具体的实施方案中，所检测的病毒选自肝炎病毒、肠道病毒、麻疹病毒、风疹病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、禽流感病毒、朊病毒、冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒中的一种或多种。示例性的，肝炎病毒可以是甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒等；肠道病毒可以是诺如病毒、轮状病毒、柯萨奇病毒，埃可病毒，星状病毒等；疱疹病毒可以是带状疱疹病毒、EB病毒等；流感病毒可以是甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒等；

进一步的，细菌包括球菌，杆菌和螺旋菌。在一些具体的实施方案中，本发明的试剂盒所检测的病毒选自革兰氏阳性需氧球菌、革兰氏阴性需氧球菌、革兰氏阴性需氧杆菌、革兰氏阴性兼性厌氧菌、革兰氏阴性厌氧杆菌等等。在一些更为具体的实施方案中，所检测的细菌选自葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、奈瑟菌属、莫拉菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、产碱菌属、布鲁菌属、博德氏菌属、军团菌属、埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普鲁菲登菌属、摩根菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、弧菌属、气单胞菌属、消化球菌属、消化链球菌属、微球菌属、类杆菌属、梭杆菌属、炭疽杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、李斯特菌属、丹毒丝菌属、棒状杆菌属、放线菌属、分枝杆菌属、志贺氏菌属中的一种或多种细菌。

示例性的，葡萄球菌属包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等，链球菌属包括α型溶血链球菌、β型溶血链球菌、非溶血链球菌、肺炎球菌等，肠球菌属包括肠球菌等，奈瑟菌属包括脑膜炎球菌、淋球菌、奈瑟氏球菌等，莫拉菌属包括卡他莫拉菌等，不动杆菌属包括无硝不动杆菌、洛菲氏不动杆菌等，假单胞菌属包括绿脓杆菌和其他假单胞菌，产碱菌属包括粪产碱杆菌，博德氏菌属包括百日咳杆菌等，埃希氏菌属包括大肠杆菌等，耶尔森氏菌属包括鼠疫杆菌等，嗜血杆菌属包括流感杆菌等，弧菌属包括霍乱弧菌、ElTor弧菌、副溶血弧菌等，气单胞菌属包括嗜水气单胞菌等，消化球菌属包括消化球菌等，消化链球菌属包括消化链球菌等，微球菌属包括费氏微球菌等，梭杆菌属包括脆弱类杆菌、梭形杆菌等，炭疽杆菌属包括炭疽杆菌等，芽孢杆菌属包括蜡样芽孢杆菌、破伤风芽孢杆菌等，梭菌属包括肉毒杆菌、难辨梭菌、艰难梭状芽孢杆菌等，棒状杆菌属包括白喉杆菌等，分枝杆菌包括结核杆菌、麻风杆菌等，志贺氏菌属包括痢疾杆菌等，放线菌属包括星形奴卡菌等，克雷伯氏菌属包括肺炎杆菌等，军团菌属包括嗜肺军团菌等。

进一步的，还可检测念珠菌、曲菌、新型隐球菌、毛霉菌等真菌，肺炎支原体等支原体、Q热立克次体等立克次氏体，或者衣原体等等的病原体。

同时，发现也可以用于肿瘤标志物筛查：甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结/直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质瘤，准确率可达90％—98％。可以普及广大群众，简单一滴血即可筛查甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结/直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质瘤。

实施例

实施例1：胶乳免疫比浊法检测C5浓度的试剂盒组成

增强免疫比浊法检测C5浓度的试剂盒，包括两种试剂：试剂I由三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)。取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加PEG1000 50g，加水稀释至100ml，在试剂I中，所述的PEG1000的质量浓度为500g/L，试剂II由兔抗人C5抗血清或羊抗人C5抗血清或鼠抗人C5抗血清或鼠抗人C5单克隆抗体交联在胶乳颗粒上形成的悬浊液组成，所述的试剂Ⅱ是通过碳二亚胺反应将兔抗人C5抗体共价结合到胶乳颗粒上。所述的兔抗人C5抗血清的效价为1:64-1:128，C5抗体含量是600ml/L，PEG 6000浓度是60g/L。

实施例2：散射免疫比浊法检测C5浓度的试剂盒组成

散射免疫比浊法检测C5浓度的试剂盒，包括两种试剂：试剂I由三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加入PEG1000 30g，加水稀释至100ml，在试剂I中，所述的PEG1000的质量百分比浓度为300g/L。试剂II由三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加入PEG6000和兔抗人C5抗血清，加水稀释至100ml。在所述的试剂II中，所述的PEG6000的质量百分比浓度为60g/L，所述的兔抗人C5抗血清的效价为1:64-1:128，C5抗血清浓度600ml/L。

实施例3：增强纳米胶乳免疫比浊法检测C5浓度的试剂盒组成

增强纳米胶乳免疫比浊法检测C5浓度的试剂盒，包括两种试剂：试剂I由三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加入PEG1000 50g，加水稀释至100ml，在试剂I中，所述的PEG1000的质量浓度为500g/L。试剂II由兔抗人C5抗血清或羊抗人C5抗血清或鼠抗人C5抗血清或鼠抗人C5单克隆抗体交联在胶乳颗粒上悬浊液组成，所述试剂II是通过碳二亚胺反应将兔抗人C5抗体、或羊抗人C5抗体、或鼠抗人C5抗体，或鼠抗人C5单克隆抗体、IgG共价结合到胶乳颗粒上。所述的兔抗人C5抗血清的效价为1:64-1:128，C5抗血清浓度600ml/L，PEG6000的浓度是60g/L。

实施例4：检测人血清中C5浓度的方法

检测人血清中C5浓度的方法，将样本采用日立7100生化分析仪进行测定，将样品加入试剂ⅠR1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入试剂ⅡR2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A＝样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用日立7100生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤中，将校准品加入试剂ⅠR1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入试剂ⅡR2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A＝校准A2-校准A1；

上述测定的参数为：温度37℃，主波长340nm、副波长700nm，样本或校准品3μl，R1：240μl，R2：60μl，反应时间为10分钟。

实施例5：50例健康人正常值标本(免疫比浊法测定)检测人血清中C5浓度的方法

检测人血清中C5浓度的方法，将样本采用日立7100生化分析仪进行测定，在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样品加入试剂ⅠR1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入试剂ⅡR2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A＝样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用日立7100生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤中，将校准品加入试剂ⅠR1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入试剂ⅡR2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A＝校准A2-校准A1；

上述测定的参数为：温度37℃，主波长600nm、副波长700nm，样本或校准品3μl，R1：240μl,R2：60μl，反应时间为10分钟。

表1 50例健康人群的C5的含量

健康人值：肝功能、肾功能、生化指标、免疫功能指标皆正常

检测60例肿瘤患者(甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质瘤)

浓度在36.7mg/L—72mg/L之间是正常。

60例临床诊断结果在72mg/L以上，为阳性，符合临床诊断标准。

A.精密度检测：同一样品中连续抽取20次，按照检测人血清中C5浓度的方法，将样本采用日立7100生化分析仪进行测定，计算测定值的平均值、标准差(SD)和变异系数(CV)，CV＝(标准差/平均值)*100％，结果见表2，CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。

表2：精密度检测结果

试剂盒	PH值	平均值(mg/L)	标准差(SD)	变异系数(CV)
					试剂盒1	4.0-6.0	47.81	1.79	3.74％
试剂盒2	6.0-8.0	48.87	1.49	3.05％
					试剂盒3	8.0-11.0	48.16	0.75	1.57％

表2中CV值≤3.74％，表明本发明提供的试剂盒精密度较高，其中试剂盒3精密度最高。

B.准确度检测：用血清抗C5补体抗体含量为60mg/L的质控品(质控品是由5g牛白蛋白、0.3ml Proclin，加水至100ml，提取抗原组成C5补体抗原)进行测定，重复5次，取均值，计算相对偏差(CB)，检测结果见表3。对于临床化学检验项目而言，相对偏差不超过±15％，被认为具有优良的准确度。

表3：准确度检测结果

表3中相对偏差均不超过±2.27％，表明本发明提供的试剂盒准确度较高，其中试剂盒3所述的试剂盒准确度最高。

C.稳定性检测：在2-8℃储存条件下，分别在0个月、6个月和12个月对血清抗C5补体抗体含量为60mg/L的同一标准品样本进行测定，每个样本测定10次，取均值，结果见表4。

表4：稳定性检测结果

试剂盒	PH值	0个月	6个月	12个月
					试剂盒1	4.0-6.0	66.41	65.79	65.97
试剂盒2	6.0-8.0	66.33	65.53	65.57
					试剂盒3	8.0-11.0	66.53	66.24	66.45

由表4可以看出，检测值差异较小，表明本发明提供的试剂盒稳定性较好，在2-8℃下储存至少可以稳定12个月以上，其中试剂盒3所述的试剂盒稳定性最好。

D.线性检测：利用试剂盒3所述的试剂盒检测六个浓度梯度的标准品，每个梯度浓度检测3次，取平均值，对测定值的平均值和标准品的理论浓度作回归分析，X轴表示理论浓度，Y轴表示测定值均值。一般R²≥0.9900被认为具有良好的线性，结果见图1。

得到的线性回归方程为：y＝0.9798x+1.5804，相关系数：R²＝0.9994。结果表明，本发明提供的试剂盒具有良好的线性相关关系。

干扰试验

选择四种潜在干扰物，胆红素、血红蛋白、甘油三酯和抗坏血酸，在质控品中分别加入250mg/L、300mg/L、350mg/L的胆红素；3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L的血红蛋白；7.5g/L、8.0g/L、8.5g/L的甘油三酯；450mg/L、500mg/L、550mg/L的抗坏血酸，对照组为不加任何干扰物的质控品，利用试剂盒3所述的试剂盒的检测方法进行测定，每个样本测定5次，取均值，结果见表5。

表5：干扰物试验结果

由表5可以看出，胆红素≤300mg/L，血红蛋白≤4.0g/L，甘油三酯≤8.0g/L，抗坏血酸≤500mg/L，对检测结果无明显干扰。

综上，本发明提供的试剂盒的可检测结果准确度高、精密度高、稳定性好、线性好。其中利用试剂盒3的检测方法进行检测，检测结果最佳。

实施例6Poct法对待测样品中C5的含量进行检测(金标定性)：

实施例6采用了金标定性法，用上海北加生化试剂有限公司生产的FT-J5金标读数仪测定。检测所用胶体金试纸条如图2所示，其中胶体金垫上包被胶体金、葡萄球菌蛋白(SPA)和羊抗人C5补体抗体的结合物，检测线包被兔抗人C5补体抗体，质检线包被抗原。

检测样本包括：感染革兰氏阳性菌的24例阳性人血清样本，感染金黄色葡萄糖球菌的8例阳性人血清样本，感染光滑念珠菌的8例阳性人血清样本，感染肺炎球菌的8例阳性人血清样本，感染丙型肝炎病毒的8例阳性人血清样本，健康人血清样本20例。

检测结果判读如图3所示：若质检线、检测线均显色，为阳性结果；若质检线显色、检测线无色，为阴性结果；若检测线显色、质检线无色，或检测线、质检线均无色，为无效结果。

检测步骤如下：

1、使用前先将全部试剂和样品取出，在室温中放置15—30分钟，使其恢复至室温。

2、取出检测板。

3、在检测板反应孔中心加入封闭液2滴，待封闭液完全渗入。

4、用移液器在检测板反应孔中心加入待测样品40微升，待样品完全渗入。

5、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴，待洗涤液完全渗入。

6、在检测板反应孔中心加入胶体金、葡萄球菌蛋白(SPA)和羊抗人C5补体抗体的结合物3滴，待胶体金结合物完全渗入。

7、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴，待洗涤液完全渗入，目测结果。

表6利用Poct法检测C5补体的结果

细菌感染：

革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、光滑链珠菌、金黄色葡萄糖球菌、肺炎球菌、多脓菌感染。

病毒感染：丙肝

实施例7：免疫透射比浊法检测待测样品中C5含量

将样本采用日立7100生化分析仪测定，在将样本采用生化分析仪测定的步骤中，将样品加入Ⅰ试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入Ⅱ试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A＝样本A2-样本A1；还包括一个将校准品采用日立7100生化分析仪测定的步骤，在将校准品采用生化分析仪测定的步骤中，将校准品加入Ⅰ试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入Ⅱ试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A＝校准A2-校准A1；

上述测定的参数为：温度37℃,主波长340nm、副波长700nm，样本或校准品3μl，R1：240μl，R2：60μl，反应时间为10分钟。试剂盒组成：R1 Tris缓冲液(PH 8.1)、PEG 2000，R2Tris缓冲液(PH 8.1)、PEG 6000、C5补体。

表7利用免疫透射比浊法检测C5含量的结果

注：数值72mg/L以上为阳性，以下则为阴性。

本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种检测C5补体的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：

试剂I：第一缓冲液、第一PEG缓冲液；

试剂II：抗C5补体抗体，包含有单克隆抗体和/或多克隆抗体、第二PEG缓冲液、IgG；所述第一缓冲液的pH值为3～10。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述抗C5补体抗体选自兔抗人C5补体抗体、羊抗人C5补体抗体、鼠抗人C5补体抗体中的一种或两种以上的组合；优选的，所述兔抗人C5补体抗体、所述羊抗人C5补体抗体、所述鼠抗人C5补体抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；任选的，所述抗C5补体抗体的抗体效价为1:64-1:128，浓度为100ml/L～800ml/L。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，多克隆抗体用微量二氧化锰或高锰酸钾处理修饰后，抗C5补体抗体亲脂性基团改为亲水性。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，C5补体单克隆抗体用微量二氧化锰或高锰酸钾处理修饰后，抗C5补体抗体亲脂性基团改为亲水性。

5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其中，所述抗C5补体抗体共价结合到胶乳颗粒上；优选的，所述抗C5补体单克隆抗体先结合，然后，再结合C5补体多克隆抗体通过碳二亚胺反应共价结合到胶乳颗粒上。

6.根据权利要求1～5任一项所述的试剂盒在制备用于检测病原体感染的诊断剂中的用途；可选地，所述病原体包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次氏体中的一种或多种。

7.根据权利要求1～6任一项所述的试剂盒在制备用于肿瘤标志物的早期诊断筛查的诊断剂中的用途，其中，所述肿瘤标志物选自甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结/直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质瘤。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中采用全血、末梢血、血清预以检测。

9.一种根据权利要求1～8任一项所述的试剂盒在制备通过以下方法检测C5补体的诊断剂中的用途，其中，所述方法包括：免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、免疫胶乳法、化学发光法或胶体金渗滤法或层析法、即时检测；优选的，所述免疫比浊法包括免疫透射比浊法、免疫散射比浊法波长为340nm、免疫胶乳法波长为600nm-700nm。尤其是在胶体金渗滤法或层析法、Poct(即时检验)、化学发光法、微流控芯片、磁微粒法中，鼠单克隆抗体加入，将试剂的灵敏度提高，而且加入了C5补体多克隆抗体，将使线性更宽，单克隆抗体包含有鼠、兔、羊、马细胞株，多克隆抗体有鼠、兔、羊、马抗体。

10.根据权利要求9所述的用途，其中检测人外周血清、全血和末梢血。

11.根据权利要求9或10所述的用途，其中，所述免疫比浊法包括以下步骤：

样本试剂I加入步骤：将样品加入试剂Ⅰ后，孵育，读测第1点样本A1；

样本试剂II加入步骤：样本试剂I加入步骤后，加入试剂Ⅱ，孵育，读测第2点样本A2。

校准品试剂I加入步骤：将校准品加入试剂Ⅰ后，孵育，读测第1点校准品A1；

校准品试剂II加入步骤：校准品试剂I加入步骤后，加入试剂Ⅱ，孵育，读测第2点校准品A2；其中，

C5补体浓度(mg/L)通过以下公式计算：

12.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备检测C5补体的试剂或试剂盒中的用途。

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