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CN114652896A - 一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法 - Google Patents

一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法 Download PDF

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郭家宏
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Abstract

本发明涉及一种高细胞亲和性多糖‑活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备。具体地，所述水凝胶活性微球采用双组分体系，即(1)带有多个羧基官能团的水溶性多糖；及(2)同时带有精氨酸‑甘氨酸‑天门冬氨酸序列(RGD肽段)及两个及以上赖氨酸(氨基官能团)的水溶性蛋白或多肽链段作为交联剂。通过乳液法，根据成胶组分溶液的性质不同，在4‑(4,6‑二甲氧基三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)或1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐/N‑羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)等缩合剂催化作用下，两个组分可以在乳液体系中进行酰胺化共价交联(‑(C＝O)‑N‑)形成水凝胶微球。本发明的多糖‑活性蛋白/多肽基水凝胶可具有支持细胞生长、刺激纤维细胞分泌胶原生成、促进正常组织生成等功能；该体系材料制备工艺简单，生物相容性优异，且可赋予材料多种功能。

Description

一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制 备方法
技术领域
本发明属于组织填充和组织工程微载体材料领域，具体涉及一种具有高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球的制备及所得产品和应用。
背景技术
随着社会经济的发展以及人们抗老意识的提高，人们对美容填充剂的需求逐渐增加。近年来，一定比例的微球分散在凝胶液基质中而得到的真皮填充剂受到广泛的关注，微球在体内逐渐被成纤维细胞包裹，同时刺激成纤维细胞分泌胶原蛋白，随后生成的胶原蛋白填充在微球缓慢降解而造成的空隙中。因为具有胶原刺激作用，微球分散液的填充效果维持时间较长。目前代表性的刺激胶原再生的聚合物微球有聚己内酯、羟基磷灰石、聚乙烯醇。
多糖是一种重要的生物活性成分，包括透明质酸(钠)、海藻酸(钠)、肝素(钠)、羧甲基几丁糖、羧甲基纤维素等。其中透明质酸(HA)又名玻尿酸，是现阶段最受欢迎的注射类美容填充剂，不仅具有优良的生物相容性、无免疫原性、生物可降解性等优点，还可对皮肤起着支撑、保水的作用。随着全球医美项目渗透率的提升，未来HA仍有很大的发展空间。然而多糖基材料，包括HA，不与蛋白质共价结合，大量研究表明HA基水凝胶及HA涂层不利于细胞和蛋白的粘附，但是细胞粘附会影响随后的细胞增殖和分化。为了提高多糖类材料的细胞亲和性，需要对其进行修饰。
Arg-Gly-Asp(RGD)是由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成的三肽序列，源于纤维连接蛋白，存在于多种细胞外基质中。RGD能与细胞表面蛋白整合素特异性结合，是细胞粘附和迁移的重要识别位点。研究表明，将RGD引入到水凝胶结构中，能有效地促进细胞对生物材料的粘附。因此，含有RGD短肽序列的活性蛋白/多肽非常适于作为一种提高细胞亲和性的材料。
综上，以多糖高分子为基底，引入含有RGD短肽序列的活性蛋白/多肽的基材，不需要再额外接枝吸引细胞粘附分子，从而开发出一种主动引导细胞粘附、具有细胞亲和性的填充剂，为细胞的生长和迁移以及组织的进一步延伸提供力学支撑。上述制备工艺思路创新，原理上可行，有望用于组织填充和组织再生材料领域。
发明内容
针对多糖类材质的细胞亲和性不足问题，本发明提供了一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球及其制备方法。
本发明提供的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球的制备方法，采用双组份体系，即带有多个羧基官能团的水溶性多糖和同时带有RGD肽段及两个及以上赖氨酸(氨基官能团)的水溶性蛋白或多肽链段，在缩合剂催化作用下，通过乳液法，两个组分体系在乳液体系中进行酰胺化共价交联形成水凝胶微球。
本发明的具体技术方案如下：
(a)配制成胶缓冲液；
(b)用成胶缓冲液溶解带有羧基的多糖，作为溶液(1)；
(c)用成胶缓冲液溶解带有RGD肽段及分子表面含有多个伯氨基团的蛋白或多肽分子，作为溶液(2)；
(d)将溶液(1)和溶液(2)混合后，根据所选缓冲液pH，选择缩合剂加入上述溶液中溶解并搅拌均匀得到成胶溶液(3)并开始反应；
(e)将乳化剂加到油中并搅拌均匀作为油相；
(f)在搅拌过程中，将成胶溶液(3)缓慢滴加到油相中，进行乳化并进行继续反应；
(h)反应完成后，离心去除上清油相后，用含30％、50％、70％梯度乙醇水溶液进行离心洗涤，最后用PBS缓冲液多次抽滤洗涤。
通过上述方法制备的高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球，由生物相容性多糖和带有RGD活性成分的蛋白或多肽链段组成，其粒径可调，可具有支持细胞生长、刺激纤维细胞分泌胶原生成、促进正常组织生成等功能。
术语说明
粘附性多肽RGD：带有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列的多肽，其多肽链段与整合素特异性结合，对细胞的粘附具有促进作用。
活性蛋白：活性蛋白是一种复杂的有机化合物。该化合物可以在体内发挥特定功能，例如促进细胞生长、增殖，维持细胞正常的生命活动。
细胞亲和性：细胞的亲和性是指细胞选择性地粘着的现象。
酰胺化反应：在缩合剂的作用下，羧基官能团与氨基官能团发生反应的过程。
缩合剂：缩合剂是指缩合反应中所加的反应辅助剂。一般有起催化作用的缩合剂和缩合时与所生成的分离原子或原子团结合的缩合剂。
乳液法：在乳化剂作用下，借助于机械搅拌，使反应单体溶液在油相中分散成乳状小液体后并进行持续反应。
本发明的优点：
(1)本发明从材料组成出发，将同时带有RGD肽段及两个及以上赖氨酸(氨基官能团)的水溶性蛋白或多肽链段引入到带有多个羧基官能团的水溶性多糖中，其中RGD肽段提高了多糖微球的细胞亲和性，有利于细胞的初期粘附及后期的增殖和迁移。
(2)除了具有RGD肽段，该活性蛋白还同时具有两个及以上赖氨酸(氨基官能团)，可直接充当水凝胶的交联剂，避免了化学交联剂的毒副作用，提高了微球的生物安全性。
(3)通过粒径调控，该细胞亲和性的水凝胶微球具有刺激纤维细胞分泌胶原，促进正常组织生成等功能。
附图说明
图1实施例1中制备的凝胶球的表观尺寸；
图2实施例1中制备的凝胶球的粒径分布图；
图3实施例1制备的凝胶球表面种植的成纤维细胞(L929)，在明场下观察到的细胞形貌图；
图4在实施例1制备的凝胶球表面种植成纤维细胞(L929)，细胞的死活荧光染色图；
图5实施例5中制备的凝胶球的表观尺寸；
图6实施例5中制备的凝胶球的粒径分布图；
图7实施例5制备的凝胶球表面种植的成纤维细胞(L929)，在明场下观察到的细胞形貌图；
图8在实施例5制备的凝胶球表面种植成纤维细胞(L929)，细胞的死活荧光染色图；
具体实施方式
以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解，但不以任何方式限制本发明。本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
实施例1：透明质酸-溶菌酶水凝胶微球的制备
溶液1：准确称取0.12g透明质酸钠粉末(Mw＝40kDa)溶于2.5g磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中，搅拌均匀至澄清透明溶液。
溶液2：准确称取0.24g溶菌酶粉末溶于2.5g磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中，搅拌均匀至澄清透明溶液。
将溶液1和溶液2混合搅拌呈均相后，向其中加入0.02g DMTMM粉末，继续搅拌混合均匀，得到成胶溶液3。
溶液4：在50g二甲基硅油中加入0.75g表面活性剂Span-80，室温下搅拌均匀至澄清透明溶液。
室温下，将溶液3逐滴滴加到溶液4中，搅拌速度为400rpm，室温反应24h后，离心去除上清油相。并用30％、50％、70％乙醇溶液进行梯度清洗，最后用PBS缓冲液多次抽滤洗涤，凝胶球的形貌如图1所示。
实施例2：透明质酸-溶菌酶水凝胶微球粒径范围测试
将实施例1中的凝胶球浸泡在磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中，吸取适量测定凝胶球的粒径分布。凝胶球的尺寸处于20-100μm，且粒径为正态分布，如附图2所示。
实施例3：L929细胞在透明质酸-溶菌酶水凝胶微球表面生长情况观察
将实施例1中的凝胶球用75％的乙醇溶液进行灭菌处理，并在凝胶球表面种植成纤维细胞，1天后细胞在材料表面贴附生长，如附图3所示，在凝胶球表面粘附的成纤维细胞呈现梭形和圆形两种形态。
实施例4：粘附于透明质酸-溶菌酶水凝胶微球表面L929细胞活死荧光染色
配制细胞活死染色液：按比例称取Calcein-AM和PI两种染色试剂，溶于PBS缓冲液中。将实施例4中表面粘附有成纤维细胞的凝胶球用PBS溶液清洗后，加入细胞活死染色剂，于37℃细胞培养箱中培养15min后，在荧光观察细胞的活死情况。如附图4所示，在凝胶球表面粘附的成纤维细胞都为绿色活细胞，而死细胞数量很少，说明实施例1中制备的凝胶球对细胞有很好的生物相容性。
实施例5：透明质酸-胶原水凝胶微球的制备
溶液1：准确称取0.10g透明质酸钠粉末(Mw＝37kDa)溶于吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.5)中，搅拌均匀至澄清透明溶液。
溶液2：准确称取0.075g胶原蛋白溶于2.5g吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.5)中，搅拌均匀至澄清透明溶液。
将溶液1和溶液2混合搅拌至均相后，向其中加入0.025g EDC/NHS粉末，继续搅拌混合均匀，得到成胶溶液3。
溶液4：在50g植物油中加入1.00g表面活性剂吐温-80，室温下搅拌均匀至澄清透明溶液。
室温下，将溶液3逐滴滴加到溶液4中，控制搅拌速度为300rpm，室温反应72h后，离心去除上清油相。并用30％，50％，70％乙醇溶液进行梯度清洗，最后用PBS缓冲液多次抽滤洗涤，水凝胶微球如附图5所示。
实施例6：透明质酸-胶原水凝胶微球粒径范围测试
将实施例5中的凝胶球浸泡在磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)中，吸取适量测定凝胶球的粒径分布。凝胶球的尺寸处于50-100μm，且粒径正太分布，如附图6所示。
实施例7：L929细胞在透明质酸-胶原蛋白水凝胶微球表面生长情况观察
将实施例5中的凝胶球用75％的乙醇溶液进行灭菌处理，并在凝胶球表面种植成纤维细胞，1天后细胞在材料表面贴附生长，如附图7所示，在凝胶球表面粘附的成纤维细胞呈现梭形和圆形两种形态。
实施例8：粘附于透明质酸-胶原蛋白水凝胶微球表面L929细胞活死荧光染色
配制细胞活死染色液：按比例称取Calcein-AM和PI两种染色试剂，溶于PBS缓冲液中。将实施例6中表面粘附有成纤维细胞的凝胶球用PBS溶液清洗后，加入细胞活死染色剂，于37℃细胞培养箱中培养15min后，在荧光观察细胞的活死情况。如图8所示，在凝胶球表面粘附的成纤维细胞都为绿色活细胞，而死细胞数量很少，说明实施例6中制备的凝胶球对细胞有很好的生物相容性。

Claims (10)

1.一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述水凝胶微球包括：
(1)任选多糖-(C＝O)-N-蛋白质；
(2)任选多糖-(C＝O)-N-多肽；以及
(3)成胶缓冲液；
其中，所述任选多糖来源于糖重复单元中含有羧基官能团；
所述蛋白质中含有RGD序列及同时具备两个及以上的赖氨酸结构单元(即活性伯氨基团)；
所述多肽链上中含有RGD序列及同时具备两个及以上的赖氨酸结构单元。
2.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述多糖成分具有以下一个或多个特征：
(a)多糖重复单元中含有羧基或者羧酸钠结构；
(b)多糖在水中具有良好的溶解性，一般5％(wt/v)溶解后澄清透明，无明显颗粒或絮状物质。
(b)重均分子量为6×105Da以下；
(c)纯度大于99％。
3.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述蛋白或者多肽具有以下一个或多个特征：
(a)肽链结构中含有一个或多个精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列(RGD肽段)单元；
(b)分子结构表面含有两个及以上赖氨酸结构；
(c)纯度大于99％；
(d)蛋白或多肽在水中具有良好的溶解性；一般5％(wt/v％)溶解后澄清透明，无明显颗粒或絮状物质。
4.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述多糖选自下组：透明质酸(钠)、海藻酸(钠)、肝素(钠)、羧甲基几丁糖、羧甲基纤维素或其组合，但不限于此。
5.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，所述活性蛋白/多肽选自下组：胶原蛋白、明胶蛋白、溶菌酶蛋白、柞蚕丝蛋白、含RGD人工合成多肽或其组合，但不限于此。
6.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，成胶缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝6.0～8.0)或吗啉乙磺酸缓冲液(pH＝5.0～6.0)。
7.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，水凝胶微球在PBS中分散均匀且呈现球状，其粒径在20～100μm之间。
8.如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，细胞可在水凝胶微球表面粘附增殖，细胞可包括间充质干细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞等，但不限于此。
9.一种制备如权利要求1所述的一种高细胞亲和性多糖-活性蛋白/多肽基活性水凝胶微球制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)配制成胶缓冲液；
(b)用成胶缓冲液溶解带有羧基的多糖，作为溶液(1)；
(c)用成胶缓冲液溶解带有RGD肽段及分子表面含有多个伯氨基团的蛋白或多肽分子，作为溶液(2)；
(d)将溶液(1)和溶液(2)混合后，根据所选缓冲液pH，选择缩合剂加入上述溶液中溶解并搅拌均匀得到成胶溶液(3)并开始反应；
(e)将乳化剂加到油中并搅拌均匀作为油相；
(f)在搅拌过程中，将成胶溶液(3)缓慢滴加到油相中，进行乳化并进行继续反应；
(h)反应完成后，离心去除上清油相后，用含30％、50％、70％梯度乙醇水溶液进行离心洗涤，最后用PBS缓冲液多次抽滤洗涤。
从而形成所述的水凝胶微球材料。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下一个或者多个特征：
(a)所述的成胶反应液中多糖含量为1～3％(wt/v)；活性蛋白/多肽含量为0.3～3％(wt/v)；缩合剂含量为0.1～1％(wt/v)；
(b)所述油相中乳化剂含量为1～2％(wt/v)；其中油采用液体石蜡、植物油、二甲基硅油等其中一种，但不限于此；表面活性剂采用非离子表面活性剂，通常为司盘-20～80、吐温-20～80，但不限于此；
(c)所述成胶溶液/油相体积比例需≤1:10；
(d)反应过程中采用机械搅拌；转速为300～600rpm；
(e)反应成胶时间为24～72h不等。
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