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CN114652852B - 诱导肿瘤细胞发生自发钙化的分子及其应用 - Google Patents

诱导肿瘤细胞发生自发钙化的分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了诱导肿瘤细胞发生自发钙化的分子及其应用，所述诱导肿瘤细胞自发钙化的分子至少含有两个基本单元，其中一个基本单元为靶向功能单元，为肿瘤细胞/组织/微环境的靶向功能分子片段，另一个基本单元为钙化诱导功能单元；或者诱导肿瘤细胞自发钙化的分子至少含有一个基本单元，所述基本单元同时为靶向功能单元和钙化诱导单元。肿瘤细胞发生钙化之后，一方面细胞表面的钙盐沉积会影响肿瘤细胞的代谢等生理过程，进一步诱导肿瘤细胞凋亡，起到肿瘤抑制和治疗的作用；另一方面钙化后的肿瘤细胞和组织在临床影像中的对比度提高，便于肿瘤病灶的早期诊断和精准诊断。

Description

诱导肿瘤细胞发生自发钙化的分子及其应用
技术领域
本发明涉及一类在生理条件下选择性诱导肿瘤细胞发生自发钙化的分子，以及应用。
背景技术
化学疗法是最常使用的癌症患者治疗方法之一，即使手术可以完全清除所有可见的病灶，仍然有必要使用化学治疗药物消除不可见的癌细胞。不幸的是，由于大多数化学治疗药物通过影响细胞生长和增殖过程起作用，因此它们也会对正常细胞造成损害。用于治疗癌症的全身化学疗法的副作用通常很严重，可能导致免疫系统受损，从而引起神经病变和中性粒细胞减少。钙化是人体重要的生物学过程，例如骨骼和牙齿的形成就是钙化，在某些病理疾病(例如动脉粥样硬化和肾结石)中也很重要。在癌症中也观察到钙化现象，尽管其机制尚不清楚，研究人员报告肿瘤钙化和区域淋巴结钙化是结直肠癌和肺癌的良性预后因素。2019年，华东师范大学的课题组发展了一种采用过氧化钙纳米颗粒系统注射诱导肿瘤钙化的方法。纳米颗粒用于药物递送的肝脏积聚问题一直存在，所以这种方法的临床转化安全性值得进一步探究。
2016年，发明人报告了一种通过大剂量叶酸(folateacid，FA)和Ca2+形成癌细胞靶向钙化来治疗肿瘤的新策略。但是，每个FA分子只能提供两个羧基残基来结合生物体液中的Ca2+，以促进钙矿物质的成核。因此该方法依赖于高于生理范围的Ca2+水平，这可能引起高钙血症危象，临床应用前景受限。而且，系统注射叶酸也证实会促进肿瘤生长，大幅降低小鼠体重，造成小鼠生存时间的锐减。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种可以在体内生理环境中选择性诱导肿瘤细胞发生自发性钙化的分子，通过该分子诱导肿瘤发生自发性钙化，实现抑制肿瘤生长，提高放化疗、免疫治疗的治疗效果，以及影像学成像的对比度达到早期诊断、精准诊疗的目标。
为实现本发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明公开了一种诱导肿瘤细胞自发钙化的分子，所述诱导肿瘤细胞自发钙化的分子至少含有两个基本单元，其中一个基本单元为靶向功能单元，为肿瘤细胞/组织/微环境的靶向功能分子片段，另一个基本单元为钙化诱导功能单元；或者诱导肿瘤细胞自发钙化的分子至少含有一个基本单元，所述基本单元同时为靶向功能单元和钙化诱导单元。
本发明中靶向功能单元没有特别限制，只要能满足为肿瘤细胞/组织/微环境的靶向功能分子片段即可。
进一步，所述靶向功能单元为靶向肿瘤细胞表面特异性抗原的抗体、靶向肿瘤细胞高表达受体的配体分子、具有特定肿瘤细胞靶向性的多肽或其环肽形式、具有特定肿瘤细胞靶向性的核酸适配体、靶向肿瘤细胞的多糖、靶向肿瘤特定微环境的分子中的一种或多种。
本发明中具有特定肿瘤细胞靶向性的多肽可以是线性或环形形式。
进一步，所述靶向肿瘤细胞表面特异性抗原的抗体为HER-2抗体和/或EGFR抗体。
进一步，所述靶向肿瘤细胞高表达受体的配体分子为叶酸。
进一步，所述靶向肿瘤细胞高表达受体的配体分子为尿激酶型纤溶酶原激活物受体(Urokinasetype Plasrinogen Activator Receptor,uPAR)。
进一步，所述具有特定肿瘤细胞靶向性的多肽可以为靶向肝癌细胞的SP94多肽、靶向肺癌细胞的多肽TDSILRSYDWTY(如SEQ ID NO:2所示)或靶向肿瘤血管的RGD肽中的一种或多种，线性分子或其环肽形式。
其中，靶向肝癌细胞的SP94多肽序列为SFSIIHTPILPL，如SEQ ID NO:1所示。
靶向多肽分子中如果含有的游离羧基数目大于5，则可能自身同时满足靶向及钙化两种功能，独立完成本发明目的。然而靶向多肽分子通常含有的游离羧基数目有限(n<5)，一般难以同时具备靶向及钙化两种功能。
多肽分子中靶向部分负责结合癌细胞膜表面高表达的膜蛋白，防止脱靶，因此限于本发明篇幅，未能穷尽列举，但是即使本发明未阐述的其他靶向分子也可发挥相同的作用。钙化功能端可以是含有游离羧基的多聚谷氨酸的重复单元(En,n≥5)，也可以是pS-pS-pS-pS这种酪蛋白磷酸肽的重复序列，钙化部分负责富集微环境中的钙磷离子产生钙化，其他本发明未详细阐述的含有大量游离羧基的分子也可发挥相同作用。
进一步，所述靶向肿瘤细胞的多糖为靶向表面CD44的透明质酸和/或靶向P-selectin的褐藻糖胶。
进一步，所述靶向肿瘤特定微环境的分子为MMP响应切割的多肽-疏水烃链-亲水链和/或碱性磷酸酶响应切割的磷酸-疏水烃链-亲水链。
进一步，所述钙化诱导功能单元含有强负电荷基团。
所述钙化诱导功能单元在满足保留大量强负电荷基团的情况下，其他取代不影响钙化的效果。
进一步，所述强负电荷基团可以为羧基、磺酸基、胍基、磷酸基中的一种或多种。
进一步，所述钙化诱导功能单元为含有强负电荷基因的同一官能团的重复排列或含有强负电荷基因的不同官能团的组合。
分子中官能团的数量根据需要可以变换，即聚合物大分子的单体数量从1到无穷大均可。
进一步，所述钙化诱导功能单元为多聚唾液酸和/或多聚谷氨酸。
本发明中，所述诱导肿瘤细胞自发钙化分子可以是上述的靶向功能单元和钙化诱导功能单元的任意组合。
进一步，所述分子为叶酸-聚唾液酸交联分子，靶向部分可以是叶酸，负责结合癌细胞膜表面高表达的受体蛋白，防止脱靶，也可以是其他癌症靶向分子。钙化功能端是聚唾液酸，含有大量游离的羧基，负责富集微环境中的钙磷离子产生钙化。
本发明中，所述诱导肿瘤细胞自发钙化分子的两个功能区域(靶向+诱导钙化)既可以通过两个不同的分子单元实现(靶向功能域+诱导钙化功能域)，比如叶酸-聚唾液酸交联分子；也可以是合二为一的，即一个功能单元同时具有这两个方面的功能(靶向+诱导钙化)。比如透明质酸既可以靶向肿瘤干细胞的特异性表面分子CD44，自身又同时具有诱导钙化能力；褐藻糖胶既可以靶向肿瘤特异性分子P-selectin，自身又同时具有诱导钙化能力。
本发明提供的诱导肿瘤细胞自发钙化的分子适用于所有类型的癌症，所述肿瘤可以选自血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。
本发明还提供上述的诱导肿瘤细胞自发钙化的分子在制备肿瘤药物中的用途。
此外，本发明还提供一种肿瘤药物，所述药物中包含上述的诱导肿瘤细胞自发钙化的分子。
所述肿瘤药物中除了包含本发明的诱导肿瘤细胞自发钙化的分子，还包含必要的辅料，也可以包含其他治疗药物。
进一步，所述肿瘤药物可以将所述的钙化诱导分子通过口服、静脉给药、瘤内介入给药、淋巴结介入给药。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了靶向诱导肿瘤细胞选择性发生自发钙化的分子，该分子一般由两个功能区域组成，一部分为肿瘤靶向功能区域，另一部分为诱导钙化功能区域。其基本原理是分子的靶向功能区域选择该分子发挥作用的细胞类型，诱导钙化的功能区域行使在生理环境中细胞钙化的诱导作用。肿瘤细胞发生钙化之后，一方面细胞表面的钙盐沉积会影响肿瘤细胞的代谢等生理过程，进一步诱导肿瘤细胞凋亡，起到肿瘤抑制和治疗的作用；另一方面钙化后的肿瘤细胞和组织在临床影像中的对比度提高，便于肿瘤病灶的早期诊断和精准诊断。
本发明提供的诱导肿瘤细胞自发钙化的分子可以实现抑制肿瘤生长，逆转其他肿瘤化疗药物的耐药状态、协同提高肿瘤放疗、协同提高肿瘤免疫治疗等效果，并具有疫苗的功效效果，而且通过将本发明钙化诱导分子通过口服、静脉给药、瘤内介入给药、淋巴结介入给药等方式可以改变(提高或降低)临床影像学，比如计算机断层扫描(CT)、超声、正电子发射计算机断层显像(PET-CT)、核磁共振成像(MRI)的影像对比度，更早期发现病灶，或者区分良恶性肿瘤病灶。
本发明通过动物实验可以看到这类分子包含两个功能区，一个是癌细胞膜表面受体的靶向功能区，可以选择性地靶向在癌细胞膜上而对正常的细胞无靶向作用。另一端是有诱导钙化能力的功能区，可以选择性诱导微环境中的钙磷等离子向癌细胞膜上沉积，使得肿瘤细胞发生钙化，钙化后癌细胞的生长和转移被显著抑制，荷瘤小鼠的生存期得以显著延长。同时，肿瘤细胞和癌组织的钙化可以提高临床影像的成像对比度，更早期、更准确地发现和鉴别肿瘤微小病灶。
总之，本发明公开的分子以选择性诱导肿瘤细胞发生钙化，起到肿瘤治疗的作用，抑制肿瘤生长，逆转肿瘤耐药，提高肿瘤放化疗和免疫治疗效果，延长肿瘤病人的生存期；同时，肿瘤细胞和组织的钙化可以提高临床影像的成像对比度，更早期、更准确地发现和鉴别肿瘤微小病灶。
附图说明
图1为实施例1中流式细胞仪检测不同细胞表面结合的靶向肽情况，峰值右移说明靶向肽分子选择性结合在肺癌细胞表面，而对正常上皮细胞无结合。
图2为实施例1中肺癌细胞和正常肺上皮细胞经CiP肽处理后，扫描电镜的元素谱。可以看到，与正常肺上皮细胞对比，肺癌细胞经CiP肽处理后细胞表面的钙磷元素峰显著增加，说明靶向肽分子能选择性的诱导肺癌细胞发生钙化，而对正常上皮细胞无显著影响。
图3为实施例1中不同浓度靶向肽处理后不同肺癌细胞及正常肺上皮细胞增值活性的变化。可以看到，靶向肽诱导的钙化可选择性地抑制多种肺癌细胞的增殖活性，而对正常的肺上皮细胞无显著的毒副作用。
图4为实施例1中靶向肽尾静脉注射处理肺癌及肺结节小鼠，处理前后小鼠肺部结节在超声上的影像学变化。可以看到，靶向肽诱导的非小细胞肺癌钙化在超声上呈高密度钙化灶，而常规肺癌及肺结节边界不清，钙化后的肺癌能清晰和周围组织辨别，说明肺癌钙化能帮助肺癌的早期超声成像及与肺结节的鉴别诊断。
图5为实施例1中靶向肽尾静脉注射处理肺癌及肺结节小鼠，处理前后小鼠肺部结节在CT上的影像学变化。可以看到，靶向肽诱导的非小细胞肺癌钙化在CT上边界清晰，能清晰和周围组织辨别，说明钙化能帮助肺癌的早期成像及与肺结节的鉴别诊断。
图6为实施例1中靶向肽尾静脉注射处理肺癌小鼠，钙化诱导后小鼠肺部瘤体在小动物活体成像仪上的影像学变化。可以看到生理浓度钙磷条件下靶向肽诱导的非小细胞肺癌钙化能有效地抑制肺癌的生长转移。
图7为实施例2中卵巢癌细胞HeLa和正常卵巢上皮细胞Etc/E6E7经Folate-polySia复合分子处理后，扫描电镜图。可以看到，与正常卵巢上皮细胞对比，卵巢癌细胞HeLa经Folate-polySia分子处理后HeLa细胞表面显著形成了钙化层，而正常卵巢上皮细胞Etc/E6E7表面光滑。说明Folate-polySia分子能选择性地诱导卵巢癌细胞HeLa发生钙化，而对正常上皮细胞无显著影响。
图8为实施例2中不同浓度Folate-polySia分子处理后HeLa细胞及正常卵巢上皮细胞增殖活性的变化。可以看到，Folate-polySia分子诱导的钙化可选择性地抑制HeLa细胞的增殖活性，而对正常的卵巢上皮细胞无显著的毒副作用。
图9为实施例2中Folate-polySia分子腹腔注射HeLa细胞皮下移植瘤模型小鼠，小鼠瘤体的体积变化情况。可以看到生理浓度钙磷条件下，Folate-polySia分子诱导的HeLa细胞钙化在体内能有效地抑制卵巢癌细胞的生长。
图10为实施例2中Folate-polySia分子腹腔注射HeLa细胞皮下移植瘤模型小鼠，小鼠生存周期的变化情况。可以看到生理浓度钙磷条件下，Folate-polySia复合分子诱导的HeLa细胞钙化在体内能有效地延长卵巢癌细胞荷瘤小鼠的生存时间。
图11为实施例2中Folate-polySia复合分子腹腔注射Hela细胞皮下移植瘤模型小鼠，小鼠瘤体的钙化扫描情况。可以看到生理浓度钙磷条件下，Folate-polySia复合分子腹腔注射能诱导瘤体在micro-CT上显示出显著的白色钙化块。
图12为实施例2中不同浓度Folate-polySia分子处理48h后HeLa耐药细胞增殖活性的变化。可以看到，Folate-polySia分子诱导的钙化可有效地抑制HeLa耐药细胞的增殖活性，说明Folate-polySia分子诱导的钙化能对耐药的HeLa再次产生杀伤。
图13为实施例2中不同浓度Folate-polySia分子处理72h后HeLa耐药细胞增殖活性的变化。可以看到，Folate-polySia分子处理72h诱导的钙化可对HeLa耐药细胞产生更强的杀伤作用。
图14为实施例2中不同浓度Folate-polySia分子加不同浓度顺铂处理HeLa顺铂耐药细胞48h后，细胞死活情况的变化。可以看到，Folate-polySia分子处理可显著促进顺铂对原本耐药的HeLa细胞产生更强的杀伤作用。
图15为实施例2中Folate-polySia分子腹腔注射HeLa耐药细胞皮下移植瘤模型小鼠，小鼠瘤体的体积变化情况。可以看到生理浓度钙磷条件下，Folate-polySia分子诱导的HeLa细胞钙化在体内能有效地抑制卵巢癌耐药细胞的生长。
图16为实施例2中Folate-polySia复合分子腹腔注射HeLa耐药细胞皮下移植瘤模型小鼠，小鼠生存周期的变化情况。可以看到生理浓度钙磷条件下，Folate-polySia分子诱导的HeLa细胞钙化在体内能有效地延长卵巢癌耐药细胞荷瘤小鼠的生存时间。
图17为实施例2中Folate-polySia分子腹腔注射HeLa耐药细胞皮下移植瘤模型小鼠，小鼠瘤体的钙化扫描情况。可以看到生理浓度钙磷条件下，Folate-polySia分子腹腔注射能诱导瘤体在micro-CT上显示出显著的白色钙化块，说明Folate-polySia分子在体内能显著诱导卵巢癌耐药细胞产生钙化。
图18为实施例3中不同浓度褐藻糖胶处理胰腺癌细胞(KPC、Panc02)、人肝癌细胞(Hep1-6)及正常胰腺上皮细胞(HPDE)，细胞的增殖活性的变化。可以看到，褐藻糖胶分子诱导的钙化可选择性地抑制癌细胞的增殖活性，而对正常的上皮细胞无显著的毒副作用。
具体实施方式
实施例1：
非小细胞肺癌靶向的多肽(ExTDSILRSYDWTY(x为任意整数)，通过钙化，抑制肺癌的增殖转移，帮助实现肺癌的早期诊断和鉴别诊断。
本实施例以下实验，未经特殊说明者，采用的多肽分子序列为E24TDSILRSYDWTY。
(1)靶向肽在生理条件下诱导非小细胞肺癌细胞发生选择性钙化
靶向肽赖氨酸残基中游离的氨基与异硫氰酸荧光素酯(FITC)在PBS溶液中反应12h，透析袋透析5天，冻干后得到经FITC修饰的靶向肽分子，100μg/ml上述FITC修饰过的靶向肽在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时分别培养人非小细胞肺癌细胞A549，H460，H1299，人肺上皮细胞Beas-2b以及人脐静脉血管内皮细胞HUVECs 30min，PBS清洗3次，流式细胞仪检测细胞表面结合的靶向肽情况。如图1所示：体外生理条件下靶向肽选择性结合在肺癌细胞表面，对正常细胞结合力弱。
(2)靶向肽在生理条件下诱导非小细胞肺癌细胞发生选择性钙化
1mg/ml浓度的靶向肽在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养人非小细胞肺癌细胞A549细胞48小时，2.5％戊二醛固定48小时，脱水干燥后电镜扫描，检测细胞表面钙化情况。EDX元素扫描显示，肺癌细胞经靶向肽处理后细胞膜表面存在晶状钙化物，钙化峰显著增加，而肺上皮细胞表面钙磷元素沉积较少(图2)。说明靶向肽在生理条件下可诱导非小细胞肺癌细胞发生选择性钙化。(3)靶向肽诱导的钙化可选择性杀伤肺癌细胞，抑制癌细胞的增值。
适宜浓度梯度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10、20mg/kg)的靶向肽在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养人非小细胞肺癌细胞A549，H460，H1299和人肺上皮细胞Beas-2b 48小时，CCK8细胞增殖实验检测靶向肽诱导的肺癌细胞钙化对肺癌细胞的杀伤作用。如图3所示：靶向肽诱导的肺癌细胞钙化可选择性地抑制多种肺癌细胞的增殖活性，而对正常的肺上皮细胞无显著的毒副作用。
(4)靶向肽诱导的非小细胞肺癌钙化能帮助肺癌的早期成像及与肺结节的鉴别诊断。
50μg Sod A肽(AAAIAGAFGSFDKFR)和0.25ml不完全弗氏佐剂混合后C57小鼠背部皮下注射，两周后50μg SodA肽与6000粒琼脂糖4B珠溶于0.2ml PBS中，共价偶联后C57小鼠尾静脉注射，构建C57小鼠的肺结节模型。3×106个A549-Luci细胞尾静脉注射构建裸鼠的肺转移瘤模型，200mg/kg浓度的靶向肽尾静脉注射诱导部分小鼠的肺癌发生钙化，在4周时同时对正常肺癌、钙化后的肺癌以及肺结节行超声和CT扫描。影像学结果显示(图4):靶向肽诱导发生钙化的肺癌在超声上能清晰的呈现；钙化后的肺癌在早期能在CT上显像，而常规肺癌不能(图5)；肺结节由于钙化不显著，成像不清晰。说明靶向肽诱导的非小细胞肺癌钙化能帮助肺癌在CT上的早期成像及与肺结节的鉴别诊断，提升肺癌CT诊断的敏感性。
(5)生理浓度钙磷条件下靶向肽诱导的非小细胞肺癌钙化能有效抑制肺癌的生长转移。
3×106个A549-Luci细胞尾静脉注射构建裸鼠的肺转移瘤模型，200mg/kg浓度的靶向肽分子药物(CiP)尾静脉注射，对照组注射PBS，4mg/kg阿霉素(Dox)和与CiP肽等摩尔浓度的对照肽(TP)，明确CiP靶向肽诱导的人A549细胞钙化是否能抑制肺癌的生长转移，小动物活体成像仪追踪监测瘤体生产情况。如图6所示，与对照组相比，CiP靶向肽尾静脉注射能显著抑制A549细胞肺转移瘤的生长。
重复上述实验方法，分别采用E6TDSILRSYDWTY、E10TDSILRSYDWTY、E16TDSILRSYDWTY、E30TDSILRSYDWTY，均可发现CiP靶向肽尾静脉注射能显著抑制A549细胞肺转移瘤的生长，因此只要满足ExTDSILRSYDWTY，x>5即可起到显著抑制A549细胞肺转移瘤的生长的作用。
实施例2:
在生理条件下选择性诱导肿瘤细胞发生自发钙化的叶酸-聚唾液酸分子及其癌症诊疗应用。
(1)叶酸受体靶向的聚唾液酸复合分子药物的结构。
Folate-polySia复合分子药物的制备反应如下：2mmol叶酸(FA)溶于20mL干燥的DMSO中，加入1mL重蒸的三乙胺助溶，加入4mmol的N,N'-羰基二咪唑，室温搅拌1h。薄层色谱监测N,N'-羰基二咪唑与叶酸的反应情况，以二氯甲烷：甲醇＝3：1作为展开剂，乙酸乙酯萃取反应液，碘缸显色，RfCDI为0.8。将4mmol N-(氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(EDA-Boc)溶于1mL重蒸过的二氯甲烷中，滴入上述反应液。室温搅拌，反应过夜。薄层色谱监测EDA-Boc反应情况，RfBoc-NH2为0.5。将反应液滴至乙醚中沉降，用乙酸乙酯洗涤三遍，油泵抽干。将固体粉末碾碎溶解在8.8mL二氯甲烷中，加入8.8mL三氟乙酸，有气泡产生，2h后以甲醇为展开剂薄层色谱检测FA-(EDA-Boc)2反应完毕，Rf值为5/6。旋蒸除去二氯甲烷及三氟乙酸，将油状产物滴至乙醚中，捣碎，用乙醚洗涤三遍，油泵抽干，得产物(N-(2-氨基乙基))2叶酸(FA-(EDA)2)。1.6mmol PSA-COOH加至10mL DMSO中，加入1mL三乙胺助溶，加入2mmol N,N'-羰基二咪唑室温反应24h，滴加0.5mL蒸馏水淬灭反应，加入1.6mmol上述合成的FA-(NH2)2，室温反应24h，在乙醇中沉降，透析冻干，得到Folate-polySia复合分子。复合分子的分子式如图所示：包含一个叶酸受体靶向部分和一个钙化诱导功能区，钙化功能区是多个聚唾液酸单体重复序列。
(2)聚唾液酸复合分子药物可选择性诱导叶酸受体高表达的宫颈癌细胞株发生钙化。
1mg/ml的Folate-polySia复合分子在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养叶酸受体高表达的人宫颈癌细胞株HeLa和正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞48小时，如图7所示：扫描电镜下观察到宫颈癌细胞膜表面存在明显的晶状钙化物，而正常宫颈上皮细胞无钙化出现，说明聚唾液酸抗肿瘤药物可选择性诱导叶酸受体高表达的宫颈癌细胞株发生钙化。
(3)体外生理条件下聚唾液酸复合分子诱导的钙化可选择性杀伤宫颈癌细胞。
浓度梯度(0、0.001、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1μM)的Folate-polySia复合分子在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养叶酸受体高表达的人宫颈癌细胞株HeLa和正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞48h，CCK8实验检测Folate-polySia复合分子对癌细胞的杀伤作用。如图8所示：聚唾液酸复合分子(Folate-polySia)诱导的钙化可选择性杀伤宫颈癌细胞，对正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞无显著影响。
(4)体内生理条件下，聚唾液酸复合分子药物可通过钙化抑制叶酸受体高表达的宫颈癌细胞增殖。
5×106个HeLa细胞皮下注射，构建裸鼠叶酸受体高表达HeLa细胞株的皮下移植瘤模型，给予每只鼠16.7μmol/kg的聚唾液酸复合分子药物腹腔注射，对照组注射PBS，等摩尔浓度的Folate(叶酸)和5mg/kg的阿霉素(Dox)，明确聚唾液酸复合分子药物诱导的宫颈癌钙化是否能抑制裸鼠的移植瘤生长。如图9所示：腹腔注射的聚唾液酸复合分子药物能显著抑制移植瘤体的生长；显著延长裸鼠的生存时间(图10)；小鼠瘤体的micro-CT钙扫描发现，聚唾液酸复合分子药物注射组小鼠瘤体发生了显著的钙化现象(图11)。
(5)生理条件下聚唾液酸复合分子药物可通过钙化逆转叶酸受体高表达的宫颈癌细胞的化疗耐药。
浓度梯度(0,0.70,1.05,1.58,2.37,3.56,5.33,8.0,12.0mg/ml)的Folate-polySia复合分子药物在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养叶酸受体高表达的人宫颈癌顺铂耐药株(HeLa/DDP)48小时(图12)和72小时(图13)，CCK8实验检测Folate-polySia复合分子药物对细胞的杀伤作用；适宜浓度(0、0.2、0.5、1.0mg/ml)的Folate-polySia复合分子药物在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养叶酸受体高表达的人宫颈癌顺铂耐药株(HeLa/DDP)48小时之后，再用一定浓度的顺铂(10、25、50、100μg/ml)处理，Live/Dead染色实验观察顺铂对经钙化和未钙化细胞的杀伤作用的影响，Image J软件统计死细胞数量并计算杀伤作用(图14)。如图12所示：聚唾液酸复合分子(Folate-polySia)处理48小时诱导的钙化可对顺铂耐药的宫颈癌细胞株产生良好的杀伤作用；聚唾液酸复合分子(Folate-polySia)处理72小时诱导的钙化可对顺铂耐药的宫颈癌细胞株产生更强的杀伤作用(图13)；低浓度FA-PSA钙化诱导处理48h，能显著增加化疗药顺铂对顺铂耐药细胞株的杀伤敏感性(图14)。聚唾液酸复合分子药物诱导钙化能显著逆转裸鼠顺铂耐药的皮下移植瘤生长。
5×106个HeLa细胞皮下注射，构建裸鼠叶酸受体高表达HeLa细胞株的皮下移植瘤模型，给予每只裸鼠16.7μmol/kg的聚唾液酸复合分子药物(Folate-polySia)每天腹腔注射，对照组注射生理盐水(Saline)、6.7μmol/kg顺铂每五天一次以及6.7μmol/kg顺铂每5天加16.7μmol/kg Folate-polySia每天腹腔注射，明确Folate-polySia诱导的人宫颈癌钙化是否能增加顺铂耐药的裸鼠皮下移植瘤对化疗药顺铂的敏感性。如图15所示，一定浓度的Folate-polySia腹腔注射能显著抑制HeLa/DDP细胞皮下瘤生长，小浓度Folate-polySia加顺铂对HeLa/DDP细胞的抑制作用更加显著，Folate-polySia增加对化疗药顺铂的敏感性；此外，Folate-polySia抑制的HeLa/DDP细胞皮下瘤的生长能显著延长裸鼠的生存时间(图16)；micro-CT钙扫描发现，Folate-polySia可显著诱导耐药的HeLa/DDP细胞发生钙化(图17)。
实施例3:
在生理条件下选择性诱导肿瘤细胞发生钙化的多糖药物分子。
(1)靶向胰腺癌，肝癌的褐藻糖胶结构：分子式(C6H10O7S)n，n取决于分子量的大小，
褐藻糖胶具有对P-selectin分子的天然靶向性，P-selectin分子是胰腺癌和肝癌中高表达的肿瘤标志物。本专利首次揭示，利用褐藻糖胶对胰腺癌和肝癌中高表达的P-selectin分子的靶向性，通过褐藻糖胶分子中强负电荷的基团(磺酸基)，吸附肿瘤微环境中的钙磷离子，实现对癌细胞的钙化包裹成像和杀伤。
(2)体外生理条件下褐藻糖胶可诱导胰腺癌和肝癌细胞发生钙化
2mg/ml浓度的褐藻糖胶在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养人胰腺癌细胞Panc01和正常胰腺上皮细胞48小时，2.5％戊二醛固定48小时，脱水干燥后电镜扫描，检测细胞表面钙化情况。EDX元素扫描显示，人胰腺癌细胞Panc01经褐藻糖胶处理后胰腺癌细胞膜表面钙化元素峰显著增加，而胰腺正常上皮细胞HPDE表面钙磷元素沉积较少(表1)。这说明褐藻糖胶在生理条件下可诱导胰腺癌细胞发生选择性钙化。
表1褐藻糖胶处理癌细胞及正常上皮细胞后细胞表面主要元素的含量变化
HPDE-fucoidan treated
Pane01-fucoidan treated
(3)体外生理条件下褐藻糖胶分子诱导的钙化可选择性杀伤胰腺癌和肝癌细胞癌细胞。
适宜浓度梯度(0、0.5、1.0、2.0、4.0mg/ml)的褐藻糖胶分子在体外Ca2+浓度达2.75mM，磷酸根浓度范围为1.61mM时培养胰腺癌细胞Panc02，肝癌细胞KPC和Hep1-6，人胰腺正常上皮细胞HPDE，CCK8实验检测褐藻糖胶分子对各种细胞的杀伤作用。如图18所示：褐藻糖胶分子诱导的钙化可显著性杀伤胰腺癌和肝癌细胞，对人胰腺正常上皮细胞的毒副作用不明显，说明褐藻糖胶分子诱导的钙化有良好的选择性抗肿瘤作用。
此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 诱导肿瘤细胞发生自发钙化的分子及其应用
<130> 2021
<150> CN202011532338.3
<151> 2020-12-22
<150> CN202011532304.4
<151> 2020-12-22
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Phe Ser Ile Ile His Thr Pro Ile Leu Pro Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Thr Asp Ser Ile Leu Arg Ser Tyr Asp Trp Thr Tyr
1 5 10

Claims (5)

1.在体内生理环境中选择性诱导肿瘤细胞自发钙化的分子，其特征在于，所述诱导肿瘤细胞自发钙化的分子至少含有两个基本单元，其中一个基本单元为靶向功能单元叶酸，另一个基本单元为钙化诱导功能单元多聚唾液酸，其结构式为：
2.根据权利要求1中所述诱导肿瘤细胞自发钙化的分子，其特征在于，所述肿瘤包括宫颈癌。
3.如权利要求1所述的诱导肿瘤细胞自发钙化的分子在制备宫颈癌肿瘤药物中的用途。
4.肿瘤药物，其特征在于，所述药物中包含如权利要求1-3所述的诱导肿瘤细胞自发钙化的分子。
5.根据权利要求4中所述的肿瘤药物，其特征在于，将所述的钙化诱导分子通过口服、静脉给药、瘤内介入给药、淋巴结介入给药。
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