CN114642722A - 纤溶酶原用于制备促进血管新生的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了纤溶酶原用于制备促进血管新生的药物中的用途，属于促血管新生药物领域。本发明首次公开了纤溶酶原的促血管新生作用，将其制备成药物，可显著提促进脑血管新生，帮助脑梗死患者更快地恢复运动和感觉功能。

Description

纤溶酶原用于制备促进血管新生的药物中的用途

技术领域

本发明属于促血管新生药物领域。

背景技术

脑卒中，俗称中风，是由脑部血管受损导致的脑组织损伤。在发达国家，脑卒中是最常见的致残原因，也是常见的死亡原因。而在我国，脑卒中是成年人致死、致残的首位病因，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。脑卒中一般分为两类，即缺血性脑卒中和出血性脑卒中。缺血性脑卒中又称脑梗死，约占我国脑卒中的70％。

药物辅助脑部血管新生，可减轻缺血损伤及促进缺血区域神经功能恢复，改善预后。促血管新生的药物主要有：他汀类药物、血管紧张素受体抑制剂、磷酸二酯酶、血管因子等等。

纤溶酶原(Plasminogen，Plg)是血浆纤维蛋白水解酶无活性的前体。由组织激活物t-PA、尿激酶或凝血接触阶段多种酶激活，外源性激活物如链激酶也可起激活作用。纤溶酶降解纤维蛋白和纤维蛋白原，保持血管和分腺管通畅，进一步研究发现，纤溶酶功能还包括促胶原酶活性及在营养及细胞移动方面起辅助作用。

目前尚未见纤溶酶原关于促血管新生的报道，更未见关于纤溶酶原促脑血管新生的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种促进血管再生的药物。

本发明的技术方案如下：

纤溶酶原用于制备促进血管新生的药物中的用途。

进一步地，所述药物是促进脑部血管新生的药物。

进一步地，所述药物是抑制TSP 1和TSP 2表达的药物。

进一步地，所述药物是治疗脑梗死的药物。

进一步地，所述药物是加快脑梗死后感觉和运动功能恢复的药物。

一种促进血管新生的药物，其特征在于：所述药物是以纤溶酶原为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。

进一步地，所述药物是促进脑部血管新生的药物。

进一步地，所述药物是抑制TSP 1和TSP 2表达的药物。

进一步地，所述药物是治疗脑梗死的药物。

进一步地，所述药物是加快脑梗死后感觉和运动功能恢复的药物。

有益效果：

本发明的药物可以有效促进脑部血管再生，加速脑梗死后运动和感觉功能的恢复，起到一定的治疗脑梗死的作用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：两种小鼠大脑中动脉梗死术后(缺血性卒中后)行为缺陷及恢复情况。(a)错步试验；(b)贴纸去除试验。

图2：单层共聚焦显微镜成像显示脑梗死。(a)显微镜图片，比例尺＝100μm；(b)单位面积内血管长度统计。

图3：脑血管密度与小鼠脑梗死后功能康复的关系。(a)错步试验；(b)贴纸去除试验。

图4：原代脑毛细血管内皮细胞体外血管生成观察。(a)正常小鼠；(b)突变小鼠；(c)单位面积内血管样结构长度统计。

图5：血管生成抑制因子(TSP1/2)的Western blot结果。横坐标为:1＝Plg+/+造模前正常左半球，2＝Plg-/-造模前正常左半球，3＝Plg+/+造模后同侧(右)半球，4＝Plg-/-造模后同侧(右)半球，5＝Plg+/+造模后对侧(左)半球，6＝Plg-/-造模后对侧(左)半球。

具体实施方式

实施例1正常小鼠和纤溶酶原基因敲除小鼠的脑梗死手术实验

1.方法

构建纤溶酶原基因敲除小鼠，与正常小鼠均进行大脑中动脉梗死手术，进行脑梗死造模。

造模方法如下：

(1)对相应基因型的小鼠使用三氟溴氯乙烷气体持续麻醉。提前准备好用于结扎或阻断动脉的缝线，于生理盐水中浸润。

(2)数分钟后，若小鼠不能自由翻身则认为已达到麻醉深度要求，将小鼠绑缚于解剖台上，在小鼠颈下塞以棉签垫高，碘伏消毒小鼠颈部并备皮。

(3)沿小鼠颈部正中剪开皮肤，用眼科弯镊和眼科直镊在体视显微镜放大视野下钝性分离皮下组织和脂肪，划开浅肌膜和颈阔肌，暴露出颈深肌膜和气管前肌。

(4)分离到气管前肌后，在右侧胸锁乳突肌前缘撕开颈深肌膜，显露胸锁乳突肌并将其拉向后侧，沿胸锁乳突肌向下继续分离，直到暴露较深位置的颈动脉鞘。

(5)在避免压迫小鼠气管的同时，划开颈动脉鞘，分离出颈总动脉(CCA,commoncarotid artery)并穿线以活结阻断血流，注意不要伤害到鞘内伴行的颈内静脉与迷走神经，对神经的刺激或损伤可能引起小鼠呼吸骤停。

(6)沿颈总动脉向上分离，于甲状软骨上缘处分出颈外动脉，颈外动脉(Externalcarotid artery，ECA)位于颈内动脉的上方内侧，靠近气管。在颈总动脉分为颈内动脉和颈外动脉处有颈动脉窦和颈动脉小球。颈动脉窦为颈总动脉末端和颈内动脉起始处的膨大部分。

(7)从颈外动脉起始处前内侧壁发出的小分支为甲状腺上动脉，分离后电凝烧断。继续沿颈外动脉向上分离可发现第二分支舌动脉，以及枕动脉和颌外动脉。在靠近枕动脉与颌外动脉分支处以编织线进行双重结扎，在两结扎处中间剪断颈外动脉，近心端结扎线稍微留长以方便之后插栓。

(8)稍提起颈外动脉的近心端结扎线，暴露下方外侧的颈内动脉(internalcarotid artery，ICA)。颈内动脉入颅前分为两支，位于外侧的翼腭动脉和位于内侧的颈内动脉入颅支。为减少建模手术时间和对小鼠的损伤，可以不分离翼腭动脉，只需在颈内动脉下穿线以便在插入栓线时悬线阻碍自颈内动脉的血流。

(9)在颈外动脉的近心端另外备一活结，暂不系紧，待栓线插入至指定位置之后系紧以固定栓线。轻轻提起颈外动脉的近心端结扎线，使颈外动脉与颈内动脉方向一致。悬提颈内动脉下的编织线并以微型动脉夹暂时夹住以控制血流。用眼科剪在颈外动脉的近心端剪一小口，挑选线头圆润、线身光滑、粗细均匀适宜的栓线从小口处轻轻插入，栓线会从颈外动脉穿过分叉处进入颈内动脉。注意当栓线进入颈内动脉时应稍稍下压使栓线头端翘起，这样可避免将栓线插入翼腭动脉。不建议分离或结扎翼腭动脉是因为阻断翼腭动脉后易形成颈内动脉内血栓，血栓包裹在栓线周围会对拔栓造成困难，不易于模型的再灌流。

(10)当栓线插入到9-10mm左右时会遇到轻微阻力，这表明栓线已经插入到大脑前动脉(ACA,anterior cerebral artery)与大脑中动脉(MCA,middle cerebral artery)的分叉处，阻塞了大脑中动脉主干的起始部。至此不要再继续插入，插入过深可能会使栓线刺破ACA并诱发蛛网膜下腔出血(SAH,subarachnoid hemorrhage)导致建模失败甚至小鼠死亡。若栓线插入深度在6mm左右时已感到较大阻力，说明栓线可能过粗无法入颅，或者可能误插进翼腭动脉，此时不可蛮力插栓，应将栓线稍稍退出更换角度后再尝试插入颈内动脉的入颅支。

(11)将栓线插入到指定位置后，把颈外动脉的近心端上所备活结系紧固定栓线。解开阻断颈总动脉的活结，最后缝合皮肤，以碘伏消毒缝合处，将小鼠放回笼内。

1.1观察小鼠行为学表现

(1)错步试验

检测脑梗死受损侧左前爪在非等距网格上踏错步数占总步数的百分比，评估小鼠脑梗死后受损侧左前爪的运动功能。

(2)贴纸去除试验

在小鼠脑梗死受损侧前爪，贴上一个小的四分之一圈胶粘纸，计算小鼠移除胶纸的时间，检测小鼠脑梗死后感觉和运动障碍。

1.2血管密度测量

对小鼠注射FITC，使用单层共聚焦微镜成像显示脑梗死前后不同时间点脑组织的脑血管成像。用ImageJ软件计算同侧皮质梗死周围皮质区的脑血管密度。

1.3脑血管内皮细胞的血管形成能力测量

处死纤溶酶原基因敲除小鼠和正常小鼠(未经过梗死造模)，分离小鼠原代脑毛细血管内皮细胞，加入DMEM完全培养液(含20-30％FBS，100ug/ml肝素钠，3ng/100ml bFGF等)悬浮后，接种于涂布有1mg/ml IV型胶原和0.1％纤连蛋白的6孔或者24孔的一次性塑料培养皿中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中静置培养。随后使用小管形成实验试剂盒，向细胞颗粒中加入2-4ml内皮细胞培养基，然后上下吹打数次，保证单细胞悬液的均匀性。内皮细胞在覆盖率为50％(WT)，和60％(plg-/-)按此过程获取并计数。细胞悬液密度为75000/ml和100000/ml；稀释细胞，并将细胞种植在之前制作好的Coating完整的8孔板中，每个孔中放入150μl细胞(7500/孔和10000/孔)；将八孔板置于37℃5％CO2孵育2-3小时后拍照，每小时检查管腔形成情况。并记录拍照。

1.4血管生成抑制因子的检测

于脑梗死前后14d分别处死一批小鼠，取脑组织，使用Western blot检测血管生成抑制因子TSP 1和TSP 2。

2.结果

2.1行为学表现

如图1所示，脑梗死后一天，小鼠有明显的行为缺陷，然后随着时间的推移，小鼠的感觉和运动功能呈持续的，渐进的，但是不完全的恢复。与正常小鼠(WT组)相比，纤溶酶原基因敲除小鼠(KO组)脑梗死后的运动和感觉功能的改善明显较差(n＝10/组；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

该结果表明，纤溶酶原对脑梗死后的运动和感觉功能恢复有利。

2.2血管密度

如图2a和b所示，与正常小鼠(Plg+/+)相比，纤溶酶原(Plg-/-)基因敲除小鼠在脑梗死后7、14和28天中风受损侧的脑血管密度明显较低(n＝10/组；*p<0.05；单向方差分析)。

该结果表明，纤溶酶原对脑梗死后脑血管再生有利。

2.3脑血管密度与脑梗死后运动功能恢复的关系

如图3所示，脑梗死造模后28天，正常鼠(Plg+/+)和纤溶酶原基因敲除(Plg-/-)小鼠梗死周围皮质区的脑血管密度与错步试验(图3a)和贴纸去除试验(图3b)的结果之间存在显著相关性。

该结果表明，血管密度越高，运动功能越好。

2.4脑血管形成能力测量结果

如图4所示，正常(Plg+/+)小鼠原代脑毛细血管内皮细胞，可以聚集成明显的网状结构，细胞有明显的迁移轨迹，并可以形成中空的管腔(图4a)。纤溶酶原基因敲除(Plg-/-)小鼠原代毛细血管内皮细胞形成的毛细血管样管分散。虽然有部分迁移轨迹和空洞，但没有明显的网状结构形成(图4b)。

将管长与单位面积的比值作为管密度的一个指标，分别计算了两种小鼠的毛细血管形成长度。与正常(Plg+/+)小鼠(图4c)相比，纤溶酶原基因敲除(Plg-/-)缺陷小鼠的血管形成能力明显降低(N＝6/组；*p<0.05；单向方差分析)。

该结果表明，纤溶酶原可作用于毛细血管内皮细胞，促进后者形成新生毛细血管。

2.5血管生成抑制因子检测结果

如图5所示，在脑梗死之前，与正常小鼠相比，纤溶酶原基因敲除(Plg-/-)小鼠的TSP 1/2表达更高(***P<0.001vs WT)。脑梗死后，TSP 1/2在对照组和脑梗死组的表达均显著高于脑梗死前的对照组。此外，与脑梗死后正常(Plg+/+)小鼠相比，纤溶酶原基因敲除(Plg-/-)组TSP 1/2表达增加，尤其是在同侧脑组织中(n＝3/组；*P<0.05，**P<0.05vsWT；#P<0.01，##P<0.01，##P<0.001vs WT)。

该结果主要表明，纤溶酶原的存在会抑制血管生成抑制因子的水平，进而可促进血管新生。

本实施例的结果表明，纤溶酶原可促进血管新生，帮助脑梗死患者恢复梗死周围皮质区脑血管密度，有助于恢复运动和感知能力。

Claims (10)

1.纤溶酶原用于制备促进血管新生的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是促进脑部血管新生的药物。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是抑制TSP 1和TSP 2表达的药物。

4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗脑梗死的药物。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是加快脑梗死后感觉和运动功能恢复的药物。

6.一种促进血管新生的药物，其特征在于：所述药物是以纤溶酶原为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述药物是促进脑部血管新生的药物。

8.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于：所述药物是抑制TSP 1和TSP 2表达的药物。

9.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于：所述药物是治疗脑梗死的药物。

10.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于：所述药物是加快脑梗死后感觉和运动功能恢复的药物。

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