CN114634972A

CN114634972A - 利用Cas酶进行核酸检测的方法

Info

Publication number: CN114634972A
Application number: CN202210541135.3A
Authority: CN
Inventors: 梁亚峰; 李珊珊
Original assignee: Shunfeng Biotechnology Hainan Co ltd; Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shunfeng Biotechnology Hainan Co ltd; Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-05-19
Also published as: CN114634972B

Abstract

本发明提供了一种利用Cas蛋白进行核酸检测的方法，具体的，提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入第一核酸检测组合物、第二核酸检测组合物中的任意一种或两种，以实现对于靶核酸的检测。

Description

利用Cas酶进行核酸检测的方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，涉及利用Cas蛋白进行核酸检测的方法，具体涉及基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒，尤其涉及一种基于CRISPR技术进行多重靶核酸检测的方法。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs, nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs, singlenucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术（SHERLOCK技术），Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术（DETECTR技术）,中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术（HOLMES技术）。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

尽管现有核酸检测技术众多，如何更加快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向，尤其是如何对核酸进行多重检测，是亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行核酸检测的方法，尤其是对核酸进行多重检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；

所述核酸检测组合物选自第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的任意一种或两种；

所述第一核酸检测组合物包括Cas-sf3452，可以结合Cas-sf3452以及与靶核酸上的第一靶序列杂交的第一gRNA，和第一单链核酸检测器；

所述第二核酸检测组合物包括Cas12i，可以结合Cas12i以及与靶核酸上的第二靶序列杂交的第二gRNA，和第二单链核酸检测器。

所述Cas-sf3452选自如下i-iii：

i、与SEQ ID No.1相比，具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列同一性，并且具有trans切割活性的Cas蛋白；

ii、与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个（如2 个、3 个、4 个，5 个，6 个，7 个，8个，9 个或10 个）氨基酸的置换、缺失或添加的氨基酸序列，并且具有trans切割活性的Cas蛋白；

iii、包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的Cas蛋白。

所述Cas12i选自如下i-iii：

i、与SEQ ID No.2相比，具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列同一性，并且具有trans切割活性的Cas蛋白；

ii、与SEQ ID No.2相比，具有一个或多个（如2 个、3 个、4 个，5 个，6 个，7 个，8个，9 个或10 个）氨基酸的置换、缺失或添加的氨基酸序列，并且具有trans切割活性的Cas蛋白；

iii、包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的Cas蛋白。

在一个实施方式中，所述第一gRNA结合Cas-sf3452的区域序列如SEQ ID No.3所示。所述第二gRNA结合Cas12i的区域序列如SEQ ID No.4所示。

所述第一单链核酸检测器含有1个无碱基间隔物和2个脱氧核糖核苷酸，所述2个脱氧核糖核苷酸分别置于无碱基间隔物的两端，所述无碱基间隔物的5’端为脱氧核糖核苷酸A，所述无碱基间隔物的3’端为脱氧核糖核苷酸T。

所述第二单链核酸检测器为含有无碱基间隔物的单链核酸检测器，所述含有无碱基间隔物的单链核酸检测器含有两个连续的无碱基间隔物和两个连续的脱氧核糖核苷酸，所述两个连续的脱氧核糖核苷酸置于所述两个连续的无碱基间隔物的5’端，所述两个连续的脱氧核糖核苷酸为TG。

在一个实施方式中，所述第二单链核酸检测器为两个连续的脱氧核糖核苷酸，所述两个连续的脱氧核糖核苷酸为CT。

所述无碱基间隔物选自dSpacer，Spacer C3，Spacer C6，Spacer C12，Spacer9，Spacer12，Spacer18，Inverted Abasic Site (dSpacer abasic furan)和 rAbasic Site(rSpacer abasic furan)中的一种或任意几种；优选的，所述无碱基间隔物为 dSpacer。

本发明中，“dSpacer”又称为无碱基位点，四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF)或无嘌呤/无嘧啶位点（apurinic/apyrimidinic (AP) site）或，无碱基连接子，其中亚甲基位于2'-脱氧核糖的1位。

dSpacer是本领域公知的无碱基间隔物，例如，美国专利US8153772B2中公开了dSpacer。dSpacer不仅在结构上与天然位点非常相似，而且相当稳定。结构如下所示：

所述dSpacer在与核苷酸连接时，可以形成如下的结构：

在优选的实施方式中，所述gRNA中，所述与Cas蛋白结合的区域置于所述与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列的5’端。

本发明中，所述Cas-sf3452与Cas12i蛋白相比可以特异性的切割所述第一单链核酸检测器，从而产生第一可检测信号；所述Cas12i与Cas-sf3452蛋白相比可以特异性的切割所述第二单链核酸检测器，从而产生第二可检测信号。

上述特异性的切割，是指某个蛋白与其他蛋白相比，对于其针对的单链核酸检测器，切割效率更高，所表现出的可检测信号更好。

所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，基于荧光信号的检测，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

本发明中，所述可检测信号可以是当切割单链核酸检测器时产生的任何信号。例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，基于荧光信号的检测，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测（通过检测凝胶上的条带的变化），基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异（例如，基于金纳米颗粒）以及电信号的差异。

在优选的实施方式中，第一可检测信号、第二可检测信号彼此之间是不同的检测信号。

优选地，单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。所述荧光基团选自FAM、FITC、HEX、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述第一单链核酸检测器，第二单链核酸检测器的两端分别设置第一荧光基团、第一淬灭基团，第二荧光基团、第二淬灭基团；上述第一荧光基团、第二荧光基团可以是彼此之间相同或不同的荧光基团；上述第一淬灭基团、第二淬灭基团可以是彼此之间相同或不同的淬灭基团。

在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式，检测所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后的胶体金测试结果；所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后在胶体金的检测线和质控线上将表现出不同的显色结果。

本发明中，所述第一靶序列、第二靶序列可以是相同的靶序列，或者，彼此之间是不同的靶序列。

本领域技术人员根据实际需要可以选择上述第一靶序列、第二靶序列是相同的，或者是不同的。

优选的，上述靶序列是彼此之间不同的靶序列，如此设置，本发明检测靶核酸的方法可以实现对于样品中核酸的多重检测；在一个实施方式中，第一靶序列、第二靶序列可以是针对同一靶核酸或同一基因的不同位点设计的靶序列，或者是，针对不同靶核酸或不同基因设计的靶序列。在一个实施方式中，可以针对某一种细菌、病毒或疾病相关的核酸，设计不同的靶序列；在其他的实施方式中，可以是针对不同种类的细菌、病毒或疾病相关的核酸，设计不同的靶序列。

另一方面，本发明提供了一种多重检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述核酸检测组合物选自上述的第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的任意一种或两种。

另一方面，本发明提供了一种核酸检测组合物，所述核酸检测组合物选自上述的第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的任意一种或两种。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统，所述系统包括核酸检测组合物，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；所述核酸检测组合物选自上述的第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的任意一种或两种。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括核酸检测组合物，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；所述核酸检测组合物选自上述的第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的任意一种或两种。

另一方面，本发明还提供了上述系统或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。如上所述，本发明的系统或试剂盒在对样品中靶核酸进行检测时，可以采用第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的一种或任意几种对同一靶序列进行检测，或者针对不同的靶序列进行检测，从而可以实现双重检测效果。

另一方面，本发明还提供了核酸检测组合物在检测样品中靶核酸的应用，或在制备检测样品中靶核酸的系统或试剂盒中的用途。所述核酸检测组合物选自上述的第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的任意一种或两种。

本发明中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量CRISPR/CAS效应蛋白（Cas蛋白）产生的可检测信号的步骤。所述Cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。

在一个实施方式中，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述靶核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等方法富集或扩增的产物。

在一个实施方式中，本发明的方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤。

在一个实施方式中，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸，如特定的突变位点或SNP位点或与对照有差异的核酸；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2（COVID-19）、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。

在一些实施方式中，所述靶核酸来源于细胞，例如，来源于细胞裂解液。

在一些实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定量的，在其他的实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定性的。

在一个实施方式中，所述方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤。

本发明中，所述的导向序列包括10-40bp；优选地，12-25bp；优选地，15-23bp；优选地，16-18bp。

本发明中，所述gRNA 与靶核酸上的靶序列至少有50%的匹配度，优选至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少90%。

在一个实施方式中，当所述的靶序列含有一个或多个特征位点（如特定的突变位点或SNP）时，所述的特征位点与gRNA完全匹配。

在一个实施方式中，所述检测方法中可以包含一种或多种导向序列互不相同的gRNA，其靶向不同的靶序列。

在一个实施方式中，所述Cas-sf3452的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者，将SEQ ID No.1所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2 个、3 个、4 个，5 个，6 个，7 个，8 个，9 个或10 个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas12i的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或者，将SEQID No.2所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2 个、3 个、4 个，5 个，6 个，7个，8 个，9 个或10 个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸（例如RNA、DNA）包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式（即核酸特异性结合互补核酸）与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多（例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多）。

应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100%互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60%或更高，65%或更高，70%或更高，75%或更高，80%或更高，85%或更高，90%或更高，95%或更高，98%或更高，99%或更高，99.5%或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100%。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20 种基本氨基酸构成的。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括 DNA、RNA 或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的

匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体

亚单元占据时(例如，两个DNA 分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，

或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上

是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行

比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math.2:482 Pearson&Lipman, 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444，Thompsonetal., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics 软件包中的GAP,BESTFIT, FASTA,和TFASTA，Genetics Computer Group) 来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/) 获得的BLAST 运算法则，使用默认参数确定。

如本文所用，所述“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats），其来自微生物的免疫系统。

如本文所用，“生物素（biotin）”也称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子维生素。“亲和素（avidin）”，又称抗生物素，是一种碱性糖蛋白，具有4个同生物素亲和例极高的结合位点，常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

靶核酸

如本文所用，所述“靶核酸”是指从生物样品（待测样品）中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品（包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。

在其他实施方式中，生物样品可以是植物细胞、愈伤、组织或器官（如根、茎、叶、花、种子、果实）等。

本发明中，所述的靶核酸还包括通过逆转录RNA形成的DNA分子，进一步地，所述的靶核酸可以采用本领域公知的技术对其进行扩增，所述的扩增技术等温扩增技术和非等温扩增技术，等温扩增可以是基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)。在某些示例性实施方式中，可以使用非等温扩增方法，其包括但不限于PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)。

进一步的，本发明所述的检测方法还一步包括对靶核酸扩增的步骤；所述的检测系统，还进一步包括对靶核酸进行扩增的试剂。所述扩增的试剂包括下组中的一种或多种：DNA聚合酶、链置换酶、解旋酶、重组酶、单链结合蛋白等。

Cas蛋白

本发明所述的Cas蛋白为至少具有trans切割活性的蛋白，优选地，所述的Cas蛋白为具有Cis和trans切割活性的蛋白。所述的Cis活性是指Cas蛋白可在gRNA的作用下识别PAM位点并特异性切割靶序列的活性；但在靶序列为单链核酸时，PAM位点并不是必需的。

在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas12，也涵盖Cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。

在一个实施方式中，编码Cas蛋白，如Cas12，的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。

在一个实施方式中，Cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。

在一个实施方式中，Cas蛋白可以来自：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。

在一个实施方式中，Cas蛋白选自如下序列组成的蛋白：

（1）SEQ ID No.1-2所示的蛋白；

（2）将SEQ ID No.1-2所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2 个、3个、4 个，5 个，6 个，7 个，8 个，9 个或10 个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白还包括与上述序列具有50%，优选55%，优选60%，优选65%，优选70%，优选75%，优选80%，优选85%，优选90%，优选95%，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。

所述的Cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得，即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上，再转化到宿主细胞中，使得所述的编码核酸分子在细胞中表达，从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来，或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达，也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合，或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，优选地，本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件，选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

gRNA

如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列（在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer)）组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA（sgRNA）。在某些情况下，导向序列是与靶序列（本发明中所述特征序列）具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构（如茎环结构）供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列（靶序列）100%互补。所述的导向序列不与单链核酸检测器互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度（匹配度）为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少99%。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。

单链核酸检测器

本发明的单链核酸检测器的两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态（即未被切割状态时）不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。在本发明中，如果能够检测出可检测的区别，则反映靶核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检检测出所述的可检测的区别，则反映靶核酸中不含有待检测的特征序列。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至5’端第一分子（如FAM或FITC）和连接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测特征序列（优选，胶体金检测方式）。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端（胶体金）设有结合第一分子的抗体（即第一分子抗体），在第一线（control line）处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线（test line）处含有与第二分子结合的第二分子的抗体（即第二分子抗体，如亲和素）。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

附图说明

图1.Cas-sf3452和Cas12i针对单链核酸检测器AST用于体外核酸检测时的荧光结果图。

图2. Cas-sf3452和Cas12i针对单链核酸检测器TGSS用于体外核酸检测时的荧光结果图。

图3. Cas-sf3452和Cas12i针对单链核酸检测器CT用于体外核酸检测时的荧光结果图。

图4.利用Cas-sf3452和Cas12i对病毒的N基因不同靶标位点进行双重检测：Cas-sf3452靶向N-B位点，reporter为FAM-AST，Cas12i靶向N-5exo位点，reporter为HEX-TGSS；样品中同时存在N基因两个不同靶点N-B和N-5exo时，能检测到两种荧光信号；样品中存在N-B靶点而不存在N-5exo靶点时，只能检测到对应于Cas-sf3452的FAM荧光信号；样品中存在N-5exo靶点而不存在N-B位点时，只能检测到对应于Cas12j的HEX荧光信号；样品中不存在N-B和N-5exo时，两种信号都不能检测到。

图5. 利用Cas-sf3452和Cas12i对病毒的N基因不同靶标位点进行双重检测：Cas-sf3452靶向N-B位点，reporter为FAM-AST，Cas12i靶向N-5exo位点，reporter为HEX-CT；样品中同时存在N基因两个不同靶点N-B和N-5exo时，能检测到两种荧光信号；样品中存在N-B靶点而不存在N-5exo靶点时，只能检测到对应于Cas-sf3452的FAM荧光信号；样品中存在N-5exo靶点而不存在N-B位点时，只能检测到对应于Cas12j的HEX荧光信号；样品中不存在N-B和N-5exo时，两种信号都不能检测到。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明技术方案基于如下原理，获得待测样品的核酸，比如，可以通过扩增的方法得到靶核酸，利用可以与靶核酸配对的gRNA引导Cas蛋白识别并结合在靶核酸上；随后，Cas蛋白激发单链核酸检测器的切割活性，从而切割体系里的单链核酸检测器；单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链核酸检测器被切割，则会激发荧光；在其他的实施方式中，单链核酸检测器的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

本实施方式中，所采用的Cas蛋白为Cas-sf3452和Cas12i，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。Cas-sf3452和Cas12i所对应的gRNA的同向重复序列（结合Cas蛋白的区域，又称DR区）分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

实施例1、利用Cas-sf3452和Cas12i进行核酸检测

本实施方式中，设计不同单链核酸检测器，利用Cas-sf3452和Cas12i进行检测。不同的单链核酸检测器分别为，单链核酸检测器-AST 、单链核酸检测器-TGSS、单链核酸检测器-CT、单链核酸检测器-TTATT、单链核酸检测器-Reporter-FB-2U3T、单链核酸检测器-DspacerN-6、单链核酸检测器-TST、单链核酸检测器-ASST。上述单链核酸检测器中Reporter-FB-2U3T中U为核糖核苷酸外，其余单链核酸检测器中核苷酸均为脱氧核糖核苷酸。

不同的单链核酸检测器具体序列和荧光基团信息：

不同的Cas蛋白所针对的靶核酸以及所设计的gRNA分别如下表所示：

采用如下反应体系：Cas酶终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，靶核酸终浓度为50nM, 单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，每个循环30sec，读取FAM荧光/cycles。对照组NTC不添加靶核酸。

Cas-sf3452和Cas12i对于不同的单链核酸检测器的检测效率如下表

表中“+”代表Cas酶对单链核酸检测器的有切割活性，“-”代表Cas酶对单链核酸检测器无切割活性，“+”数量代表对单链核酸检测器的切割活性等级，“+++”表示Cas酶对单链核酸检测器的切割活性优秀，“++”表示Cas酶对单链核酸检测器的切割活性良好，“+”表示Cas酶对单链核酸检测器的切割活性一般。

如上表所示，令人意外的是，Cas-sf3452和Cas12i对于不同的单链核酸检测器表现出了不同的偏好性。具体的，二者都可以对TTATT、Reporter-FB-2U3T、DspacerN-6表现出明显的切割活性，同时对于TST、ASST二者都没有切割活性，这表明，Cas-sf3452和Cas12i都可以利用上述TTATT、Reporter-FB-2U3T、DspacerN-6进行核酸检测，但是二者都无法利用TST、ASST进行核酸检测。

但是，针对AST、TGSS、CT，Cas-sf3452和Cas12i表现出了不同的偏好性。如图1-3所示，Cas-sf3452在利用AST的单链核酸检测器时，能够显著的表现出荧光信号，但是，基本不切割TGSS和CT；Cas12i在利用TGSS和或CT的单链核酸检测器时，能够显著的表现出荧光信号，但是，在利用AST时无荧光信号。以上实验反映出，配合各自特异的单链核酸检测器，Cas-sf3452和Cas12i可以用于靶核酸的检测；同时利用Cas-sf3452和Cas12i以及各自特异的单链核酸检测器可以用于靶核酸的双重检测。

实施例2、利用Cas-sf3452和Cas12i进行双重核酸检测

本实施方式中，利用Cas-sf3452、Cas12i对COVID-19病毒的N基因的不同靶位点进行双重检测。不同的单链核酸检测器分别为单链核酸检测器-AST 、单链核酸检测器-TGSS、单链核酸检测器-CT，序列分别为：5’6-FAM-A-dspacer-T-3’BHQ1、5’-HEX-T-G-dspacer-dspacer-3’BHQ1、5’-HEX-C-T-3’BHQ1。其中，单链核酸检测器-AST 为Cas-sf3452所特异的单链核酸检测器；单链核酸检测器-TGSS、单链核酸检测器-CT为Cas12i所特异的单链核酸检测器。不同的Cas蛋白所针对的靶核酸以及所设计的gRNA分别如下表所示：

采用如下反应体系：Cas酶终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，靶核酸终浓度为50nM, 单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，每个循环30sec，读取FAM或者HEX荧光/cycles。

在图4的实验中，同时加入Cas12i、Cas-sf3452、单链核酸检测器-AST 、单链核酸检测器-TGSS、gRNA（sf3452-N-Bi3g1和N-5exo-crRNA1-i3），然后，针对不同的实验组，添加不同的靶核酸N-B和/或N-5exo；包括：同时添加N-B和N-5exo，单独添加N-B或N-5exo，以及不添加任何靶核酸。

在图5的实验中，同时加入Cas12i、Cas-sf3452、单链核酸检测器-AST 、单链核酸检测器-CT、gRNA（sf3452-N-Bi3g1和N-5exo-crRNA1-i3），然后，针对不同的实验组，添加不同的靶核酸N-B和/或N-5exo；包括：同时添加N-B和N-5exo，单独添加N-B或N-5exo，以及不添加任何靶核酸。

如图4-5所示，图左侧是指在该体系中加入的靶核酸（其中，N-B为N-B-i3g1-ssDNA0；N-5exo为N-5exo-crRNA1-i3 ssDNA0）；图上侧是指该体系中的Cas蛋白识别到靶核酸后激活旁路切割活性、特异切割单链核酸检测器所产生的荧光信号，“Cas12i-HEX”是指，此体系中的Cas12蛋白识别到N-5exo靶位点后旁路切割活性被激活，特异性的切割单链核酸检测器5’-HEX-T-G-dspacer-dspacer-3’BHQ1，产生的HEX荧光强度，颜色越深则信号越强。 “Cas12i-CT-HEX”是指，此体系中的Cas12i蛋白识别到N-5exo靶位点后旁路切割活性被激活，特异性的切割单链核酸检测器5’-HEX-CT-3’BHQ1，产生的HEX荧光强度，颜色越深则信号越强。“Cas-sf3452-FAM”是指，此体系中的Cas-sf3452蛋白识别到N-B靶位点后旁路切割活性被激活，特异性的切割单链核酸检测器5’6-FAM-A-dspacer-T-3’BHQ1，产生的FAM荧光强度，颜色越深则信号越强。

结果显示，样品中同时存在N基因两个不同靶点N-B和N-5exo时，能检测到两种荧光信号；样品中存在N-B靶点而不存在N-5exo靶点时，只能检测到对应于Cas-sf3452的FAM荧光信号；样品中存在N-5exo靶点而不存在N-B位点时，只能检测到对应于Cas12i的HEX荧光信号；样品中不存在N-B和N-5exo时，两种信号都不能检测到。

上述结果证明Cas-sf3452、Cas12i对于单链核酸检测器的偏好性各异，可以用于双重核酸的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 舜丰生物科技（海南）有限公司

山东舜丰生物科技有限公司

<120> 利用Cas酶进行核酸检测的方法

<130> SF103

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 938

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas-sf3452

<400> 1

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas12i

<400> 2

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guaguacuga guuaagaaau acuuagcuca uuguaac 37

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<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas12i

<400> 4

agagaaugug ugcauaguca cac 23

Claims

1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法为非疾病诊断目的的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；

所述第二核酸检测组合物包括Cas12i，可以结合Cas12i以及与靶核酸上的第二靶序列杂交的第二gRNA，和第二单链核酸检测器；

所述Cas-sf3452选自如下i-iii任一所示的Cas蛋白：

ii、与SEQ ID No.1相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的氨基酸序列，并且具有trans切割活性的Cas蛋白；

iii、包含SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的Cas蛋白；

所述Cas12i选自如下i-iii任一所示的Cas蛋白：

ii、与SEQ ID No.2相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的氨基酸序列，并且具有trans切割活性的Cas蛋白；

iii、包含SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的Cas蛋白；

所述第一单链核酸检测器含有1个无碱基间隔物和2个脱氧核糖核苷酸，所述2个脱氧核糖核苷酸分别置于无碱基间隔物的两端，所述无碱基间隔物的5’端为脱氧核糖核苷酸A，所述无碱基间隔物的3’端为脱氧核糖核苷酸T；

所述第二单链核酸检测器为含有无碱基间隔物的单链核酸检测器，所述含有无碱基间隔物的单链核酸检测器含有两个连续的无碱基间隔物和两个连续的脱氧核糖核苷酸，所述两个连续的脱氧核糖核苷酸置于所述两个连续的无碱基间隔物的5’端，所述两个连续的脱氧核糖核苷酸为TG；或者，所述第二单链核酸检测器为两个连续的脱氧核糖核苷酸，所述两个连续的脱氧核糖核苷酸为CT。

2.一种对样品中的靶核酸进行双重检测的方法，所述方法为非疾病诊断目的的方法，所述方法包括将样品与核酸检测组合物接触，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；检测由Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；

所述核酸检测组合物选自权利要求1中所述的第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述无碱基间隔物选自dSpacer，Spacer C3，Spacer C6，Spacer C12，Spacer9，Spacer12，Spacer18，Inverted Abasic Site(dSpacer abasic furan)和 rAbasic Site (rSpacer abasic furan)中的一种或任意几种。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，基于荧光信号的检测，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述单链核酸检测器的 5’端和 3’端分别设置不同的报告基团；或者，所述单链核酸检测器的 5’端和 3’端分别设置不同的标记分子。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于微生物、土壤、水源、人体、动物、植物样品。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于病毒、细菌样品。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤。

10.一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物或试剂盒，所述系统或组合物或试剂盒包括核酸检测组合物，所述核酸检测组合物包括Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸上的靶序列杂交的导向序列；所述核酸检测组合物选自权利要求1中所述的第一核酸检测组合物和第二核酸检测组合物中的任意一种或两种。