CN114606207A - 一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用。具体是利用CRISPR/Cas9切割猪流行性腹泻病毒变异毒株AJ1102株感染性克隆质粒pBAC‑AJ1102，再通过同源重组方式获得将PEDV AJ1102株S2'基因替换为JS2008株S2'基因的重组质粒pBAC‑AJ1102‑S2'_JS2008，转染细胞后拯救出不依赖胰酶的重组病毒rAJ1102‑S2'_JS2008。重组病毒rAJ1102‑S2'_JS2008在细胞中的增殖滴度明显高于AJ1102株；与AJ1102株相比，rAJ1102‑S2'_JS2008株可诱导更高水平的针对PEDV经典毒株JS2008的中和抗体。

Description

一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与 应用

技术领域

本发明属于动物病毒学与基因工程学技术领域，具体涉及一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一种肠道冠状病毒，主要引起新生仔猪的呕吐、腹泻、脱水和死亡。1971年，英国首次报道了PEDV的出现，之后欧洲多个国家也陆续报道了PED的发生(Pensaert MB et al.A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine.Arch Virol,1978,58:243-247；Takahashi K et al.An outbreak of swine diarrhea of a new type associated withcoronavirus like particles in Japan.Vet Sci,1983,45:829-832)。并且发现以经典毒株制备的疫苗不能有效保护免疫猪抵抗PEDV变异毒株的感染，因此亟需以PEDV变异毒株研制疫苗。

但目前PEDV变异毒株在细胞中培养时需要添加胰酶，从而加大了病毒培养的难度，影响了病毒的基础研究和疫苗的研制，而PEDV经典毒株的培养不需要添加胰酶。有文献报道通过对PEDV变异毒株连续传代或者加入其他试剂进行筛选可以获得不依赖胰酶的毒株，但往往需要传约30代，此方法耗时长，而且病毒在体外传代培养过程中，病毒的编码基因可能会产生突变，从而可能导致其免疫原性和致病性的改变(Sun M etal.Identification of two mutation sites in spike and envelope proteinsmediating optimal cellular infection of porcine epidemic diarrhea virus fromdifferent pathways.Vet Res,2017,30:48(1):44)。

CRISPR/Cas9技术是近几年发展起来的一种新的基因编辑技术，可在体外对含有病毒全长DNA或cDNA的BAC质粒进行切割，再通过同源重组方式获得重组BAC质粒，转染细胞后拯救出重组病毒。利用该方法可以快速获得精准编辑的毒株，同时该方法还具有操作简单、效率高等突出优点。

现有技术中，谈郁蓓利用CRISPR/Cas9技术将G2型PEDV变异毒株YN200的S2亚基替换成G1型疫苗株DR13毒株的S2亚基后，YN200的胰酶依赖性发生改变，变成胰酶不依赖毒株(谈郁蓓.猪流行性腹泻病毒S蛋白影响病毒胰酶依赖性的机制研究[D].华中农业大学,2021)。但该重组毒将PEDV毒株YN200的整个S2亚基进行了替换，重组毒缺失了YN200株S2亚基中的部分抗原位点，不利于制备抵抗PEDV变异毒株的疫苗，另外，有研究报道通过对PEDV毒株S基因S2亚基上氨基酸位点突变可以改变毒株对胰酶的依赖性，但病毒的滴度不能够提高(Li W et al.A single point mutation creating a furin cleavage site in thespike protein renders porcine epidemic diarrhea coronavirus trypsinindependent for cell entry and fusion.J Virol,2015,89(15):8077-81.)。

发明内容

本发明的目的在于提供了通过替换变异毒株AJ1102的部分S2基因，快速获得不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株，且该重组的变异毒株在体外的增殖滴度与亲本毒株AJ1102相比有明显的提高。

本发明的另一个目的在于提供上述的不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株在制备猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

通过对PEDV经典毒株和变异毒株S基因序列比对，发现变异毒株AJ1102株和经典毒株JS2008株S基因有较大差异。本发明通过用经典毒株JS2008株的S2′亚基对变异毒株AJ1102株的S2′亚基进行替换，获得了完全不依赖胰酶、并可在体外稳定传代的重组病毒rAJ1102-S2′_JS2008，而且重组病毒的增殖滴度与亲本毒株相比有明显的提高；动物实验证实其不仅可诱导产生与亲本毒株AJ1102株一致的针对PEDV变异毒株AJ1102的中和抗体，并且，与AJ1102株相比，rAJ1102-S2′_JS2008株可诱导更高水平的针对PEDV经典毒株JS2008的中和抗体，因此该毒株可以作为生产猪流行性腹泻灭活疫苗的候选毒株。同时该毒株用于疫苗制备，可简化疫苗生产工序，提高抗原含量，降低成本。

上述重组病毒rAJ1102-S2′_JS2008的构建使用的是CRISPR/Cas9技术，具体如下：

(1)设计两条靶向PEDV AJ1102株S基因S2′亚基上下游的sgRNA引物，分别与引物scaffold oligo进行重叠延伸PCR扩增，获得sgRNA-S2′a和sgRNA-S2′b的转录模板，体外转录获得sgRNA-S2′a和sgRNA-S2′b。

(2)利用CRISPR/Cas9系统对含有PEDV AJ1102株全长cDNA的BAC质粒pBAC-AJ1102进行切割，经试剂盒回收获得线性化的BAC质粒。

(3)通过融合PCR扩增获得PEDV AJ1102株S2′亚基替换为JS2008毒株S2′亚基的序列，该融合片段与上述线性化的BAC质粒的上、下游各含有20bp的同源臂。

(4)将步骤(2)线性化的的BAC质粒与步骤(3)的融合片段进行同源重组，获得AJ1102 S基因S2′亚基替换为JS2008 S基因S2′亚基序列的感染性克隆质粒pBAC-AJ1102-S2′_JS2008。

(5)将pBAC-AJ1102-S2′_JS2008转化DH10B化学感受态细胞，通过PCR筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆扩大培养后大量提取质粒。

(6)将pBAC-AJ1102-S2′_JS2008阳性克隆转染Vero细胞，拯救重组病毒PEDVrAJ1102-S2′_JS2008株，即得到猪流行性腹泻病毒变异毒株PEDV rAJ1102-S2′_JS2008。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明根据变异毒株AJ1102和经典毒株JS2008的S基因差异，替换最小的基因片段S2′，尽可能保留原始毒株的免疫原性。获得的重组毒株仍为PEDV变异毒株，但其在体外培养中不需要添加胰酶，且增殖滴度与亲本株AJ1102相比有明显的提高，并可诱导更高的针对PEDV经典毒株JS2008的中和抗体。

附图说明

图1：猪流行性腹泻病毒感染性克隆质粒pBAC-AJ1102-S2′_JS2008的构建示意图。

图2：pBAC-AJ1102体外切割后的电泳图。

图3：PEDV AJ1102株S基因S2′亚基的置换模板的电泳图。

图4：PEDV AJ1102株、JS2008株和拯救的PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株感染Vero细胞的图片。

图5：间接免疫荧光鉴定拯救的PEDV rAJ1102-S2′_JS2008，图中Trypsin和NoTrypsin分别表示在胰酶条件下和无胰酶条件下；Mock表示对照不接毒组。

图6：添加胰酶和不添加胰酶情况下PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株、JS2008株、AJ1102株在Vero细胞中的增殖曲线。

图7：PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株、JS2008株和AJ1102株免疫仔猪后产生的针对AJ1102株的中和抗体。

图8：PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株、JS2008株和AJ1102株免疫仔猪后产生的针对JS2008株的中和抗体。

图9：PEDV AJ1102株S2基因不同片段替换或不同点突变的示意图。

图10：间接免疫荧光鉴定拯救的PEDV AJ1102株S2基因不同点突变的病毒示意图，图中Trypsin和No Trypsin分别表示在胰酶条件下和无胰酶条件下。

保藏信息

猪流行性腹泻病毒JS2008株：

保藏时间：2022年2月23日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:V202207；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学；

分类命名：猪流行性腹泻病毒PEDV JS2008；

猪流行性腹泻病毒重组毒株rAJ1102-S2′_JS2008株：

保藏时间：2022年2月23日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:V202206；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学；

分类命名：猪流行性腹泻病毒重组毒株PEDV rAJ1102-S2′_JS2008。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于以下实施例，实施例中未详细描述的试验方法均为本领域常规方法。

PEDV AJ1102株(GenBank登录号：MK584552)由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室分离鉴定保存(Jing Bi,Songlin Zeng,Shaobo Xiao,Huanchun Chen,Liurong Fang.Complete genome sequence of porcine epidemic diarrhea virusstrain AJ1102isolated from a suckling piglet with acute diarrhea inChina.Journal of Virology.2012,86(19):10910-10911)。

PEDV JS2008株由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室保存。

pBAC-AJ1102为含PEDV AJ1102株全长cDNA的感染性克隆质粒，转染Vero细胞可拯救出PEDV(pBAC-AJ1102制备方法参照Peng Q,Fang L,Ding Z,Wang D,Peng G,and XiaoS.Rapid manipulation of the porcine epidemic diarrhea virus genome by CRISPR/Cas9technology.J.Virol.Methods.2020,276:113772.doi:10.1016/j.jviromet.2019.113772)，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室构建保存。

Vero细胞：购自位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

氯霉素(货号：BS049B)：购自Biosharp公司。

DMEM培养基(货号：12100046)，SuperScript IV Reverse Transcriptase(货号：18090010)，Platinum SuperFi Green PCR Master Mix(货号：12359-010)，T4 DNA Ligase(货号：15224025)，Lipofectamine 3000(货号：L3000015)：均购自美国ThermofisherScientific公司。

胎牛血清(FBS，货号：P30-3302)：购自德国PAN Biotech公司。

Infusion Clone Kit(货号：12462)：购自宝生物工程(大连)有限公司。

DH10B化学感受态细胞(货号：CY80233d)：购自上海超研生物技术有限公司。

Cas9 nuclease,S.Pyogenes(货号：M0386S)，T7 RNA聚合酶(货号：M0251S)：均购自英国NEB公司。

PEDV N蛋白单克隆抗体为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室制备并保存(N蛋白单克隆抗体制备以AJ1102株完整的N基因构建pET-30a-N重组质粒，按照单克隆抗体常规方法进行制备)。

FITC标记的羊抗小鼠IgG(货号：A0568)、细胞核染料DAPI(货号：C1005)：购自上海碧云天生物技术有限公司。

100mM ATP溶液(pH7.5)：称取2.75g无水ATPNa₂到40mL ddH₂O中，用10M NaOH调节pH至7.5，加ddH₂O定容至50mL，分装后，-20℃保存备用。

LB培养基的配制：称取5g蛋白胨，2.5g酵母提取物，5g NaCl于1L的锥形瓶中，加ddH₂O定容至500mL，121℃高压灭菌20min。

实施例1猪流行性腹泻病毒重组毒株rAJ1102-S2′_JS2008的构建

(1)PEDV AJ1102株sgRNA-S2′a和sgRNA-S2′b的转录模板的制备：设计两条靶向PEDV AJ1102株S基因S2′亚基的sgRNA引物sgRNA-F1(SEQ ID NO:1所示)和sgRNA-F2(SEQID NO:2所示)，利用引物对sgRNA-F1和scaffold oligo(SEQ ID NO:3所示)、引物对sgRNA-F2和scaffold oligo分别进行重叠延伸PCR，扩增体系为25μL Platinum SuperFi GreenPCR Master Mix，10μL GC Enhancer，上、下游引物各20μM(终浓度)，加ddH₂O至总体积为50μL。反应条件如下：98℃30s；98℃10s，55℃10s，72℃30s；30个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照说明书用Gel Extraction Kit回收目的片段，即获得PEDV AJ1102株sgRNA-S2′a(SEQ ID NO:4所示)和sgRNA-S2′b(SEQ ID NO:5所示)的转录模板。

(2)PEDV AJ1102株sgRNA-S2′a和sgRNA-S2′b的制备：利用T7体外转录试剂盒对步骤1)获得的转录模板进行体外转录，转录体系与条件如下：2μL 10×Transcriptionbuffer，终浓度为2mM的NTPs，1μg转录模板，2μL T7 RNA polymerase，终浓度为1U/μL的RNase inhibitor，1μL DTT，补加无RNase水至20μL，混匀后于37℃反应16h。反应完成后，即获得sgRNA-S2′a和sgRNA-S2′b，直接用于后续实验或保存于-80℃备用。

(3)pBAC-AJ1102的切割与回收：用NEB公司的Cas9核酸酶对重组质粒pBAC-AJ1102进行切割，切割反应体系和条件如下：5μg pBAC-AJ1102，5μL Cas9 nuclease，10μgsgRNA-S2′a，10μg sgRNA-S2′b，5μL 10×reaction buffer，补加无RNase水至总体积为50μL，混匀后，37℃孵育2.5h。按照说明书用Cycle Pure Kit对切割产物进行回收。取5μL回收产物经1％琼脂糖凝胶电泳以检测切割效果，如图2所示，结果证实pBAC-AJ1102被成功切割。

(4)置换模板的扩增：以PEDV AJ1102株cDNA为模板，用引物对PEDV-S2′F(SEQ IDNO:6所示)和PEDV-S2′_JS2008-R(SEQ ID NO:7所示)扩增PEDV S2′置换模板上游片段(SEQ IDNO:12所示)；以PEDV JS2008株cDNA为模板，用引物对PEDV-S2′_JS2008-F(SEQ ID NO:9所示)和PEDV-S2′R(SEQ ID NO:8所示)扩增PEDV S2′置换模板下游片段(SEQ ID NO:13所示)。PCR反应体系如下：25μL Platinum SuperFi Green PCR Master Mix，10μL GC Enhancer，上游引物、下游引物各20μM(终浓度)，6μL cDNA，补加ddH₂O至总体积为50μL。反应条件如下：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃1min；34个循环后，72℃10min。PCR扩增完成后，将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电泳完成之后按照说明书用Omega公司的Gel ExtractionKit回收。

以回收的产物作为模板，利用引物PEDV-S2′F和PEDV-S2′R进行融合PCR扩增，反应体系为：25μL Platinum SuperFi Green PCR Master Mix，10μL GC Enhancer，上、下游引物各20μM(终浓度)，S2′置换模板上、下游片段(上述回收产物)各2μL，补加ddH₂O至总体积为50μL。反应条件如下：98℃30min；98℃3s，50℃30s，72℃2min；34个循环后，72℃延伸10min。PCR完成后，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，获得一条大小约2.6kb的扩增条带，即为置换模板，如图3所示。电泳完成之后按照说明书用Gel Extraction Kit进行回收。回收产物于-20℃保存备用。

(5)置换模板与线性化的pBAC-AJ1102的同源重组连接：将步骤(3)切割后回收的线性化pBAC-AJ1102与步骤(4)的置换模板用Infusion Clone Kit进行同源重组连接，反应体系如下：4μL pBAC-AJ1102，4μL置换模板，2μL Infusion Clone酶，其中pBAC-AJ1102与置换模板的摩尔比为1:5，轻轻混匀后，50℃反应30min。

(6)连接产物的转化：取步骤(5)的连接产物10μL缓慢加入100μL DH10B化学感受态细胞中，轻轻混匀后，在冰水浴中静置30min。42℃热激90s后，立即置冰水浴中2min，加600μL LB培养基，37℃180rpm复苏1h。复苏完成后5000rpm离心2min，弃掉500μL LB培养基，用剩余的LB培养基重悬感受态细胞，涂布于含有12.5μg/mL氯霉素的LB固体平板，10min后将平板倒置于37℃培养箱中继续培养15h。

(7)阳性克隆的筛选：挑取10个菌落于含有1mL LB的细菌瓶中，37℃225rpm培养8h后，利用引物PEDV S2′DF(SEQ ID NO:10所示)和PEDV S2′DR(SEQ ID NO:11所示)进行PCR扩增鉴定。PCR条件如下：2.5μL 10×Buffer，上下游引物各10μM(终浓度)，1μL dNTPs，0.25μL rTaq，2.5μL菌液，补加ddH₂O至25μL。扩增条件如下：95℃2min；95℃30s，53℃30s，72℃2min；34个循环后，72℃延伸5min。反应结束后，取4μL扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳以鉴定阳性克隆，将鉴定为阳性克隆的PCR产物送武汉擎科生物技术有限公司测序。测序结果显示，已将PEDV JS2008株的S2′亚基成功替换到pBAC-AJ1102 S基因的C端(nt 2679～nt4160)，阳性克隆质粒命名为pBAC-AJ1102-S2′_JS2008，阳性克隆中，含有S2′_JS2008替换片段的S基因序列如SEQ ID NO:14所示。猪流行性腹泻病毒感染性克隆质粒pBAC-AJ1102-S2′_JS2008的构建示意图如图1所示。

(8)pBAC-AJ1102-S2′_JS2008的提取：将步骤(7)鉴定为阳性的菌落扩大培养后，按照说明书用Plasmid DNA purification Kit大量提取质粒pBAC-AJ1102-S2′_JS2008。最后一步用100μL ddH₂O洗脱，-20℃保存备用。

(9)重组病毒rAJ1102-S2′_JS2008的拯救：按照说明书用Lipofectamine 3000将2μg重组质粒pBAC-AJ1102-S2′_JS2008转染至80％融合的Vero细胞(2μg/孔)。转染6h后，将细胞用含2％胎牛血清的DMEM洗2遍，每孔再加入2mL含有2％胎牛血清的DMEM，继续培养至80％以上细胞病变时，收获细胞培养物，于-70℃冻融2次，2000rpm离心5min，取上清再接种Vero细胞进行传代培养。

如图4所示，pBAC-AJ1102-S2′_JS2008转染Vero细胞后48h，细胞出现明显的病变，主要表现为细胞裂解，与PEDV JS2008株所致细胞病变一致，但与PEDV AJ1102株所致的细胞病变(主要表现为细胞轮廓消失、细胞融合)不同，说明重组病毒拯救成功，将其命名为PEDVrAJ1102-S2′_JS2008株。

(10)重组病毒rAJ1102-S2′_JS2008的鉴定：以PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株的基因组为模板，用引物PEDV S2′DF/R进行RT-PCR扩增，并将扩增产物测序，结果与亲本毒株PEDVAJ1102相比，PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株S基因nt 2679～nt 4160替换为JS2008毒株的相应序列，含有替换JS2008株S2′的S基因序列如SEQ ID NO.14所示，说明重组病毒构建正确。

进一步以PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗对PEDV AJ1102株和rAJ1102-S2′_JS2008株分别进行间接免疫荧光(IFA)检测，结果如图5所示，在倒置荧光显微镜下PEDV AJ1102株和rAJ1102-S2′_JS2008株感染的细胞均出现了特异性绿色荧光，而对照不接毒细胞没有荧光，说明拯救的病毒为PEDV。

(11)重组病毒rAJ1102-S2′_JS2008在细胞培养中的增殖特性：

PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株对胰酶依赖性的检测：在添加胰酶和不添加胰酶的情况下，检测PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株、JS2008株和AJ1102株在Vero细胞上形成的空斑和增殖曲线，结果发现PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株和JS2008株接种Vero细胞无论是否添加胰酶均不形成空斑，而PEDV AJ1102株在Vero细胞上培养时如不添加胰酶则不形成空斑，添加胰酶能形成空斑。

如图6所示，在添加胰酶时rAJ1102-S2′_JS2008株、JS2008株和AJ1102株在Vero细胞上的增殖曲线一致，而在不添加胰酶时，rAJ1102-S2′_JS2008株和JS2008株有一致的增殖趋势，不过，rAJ1102-S2′_JS2008株和JS2008株在无胰酶时的增殖滴度显著高于有胰酶时的增殖滴度，而AJ1102株则是有胰酶时的增殖滴度显著高于无胰酶时的增殖滴度。说明PEDVrAJ1102-S2′_JS2008株在Vero细胞上的增殖特性不同于AJ1102株，而与经典毒株JS2008一致，在Vero细胞上增殖不依赖胰酶的存在。

在细胞中传代的稳定性检测：将PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株在Vero细胞上连续传至20代，均可稳定地引起典型的细胞病变，且P15代以后的病毒滴度均不低于10^7.5TCID₅₀/mL。用引物PEDV S2′DF/R对P5、P10、P15、P20和P30代病毒的S2′片段分别进行RT-PCR扩增和测序，结果均与JS2008的S2′片段序列一致，说明PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株可以在细胞上稳定传代。

实施例2：PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株的免疫原性

将PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株、JS2008株和AJ1102株(病毒含量均调整为10^6.5TCID₅₀/mL)分别经0.2％甲醛灭活48h，灭活结束后接种Vero细胞进行灭活检验，将检验合格的病毒液加入等质量的201佐剂进行乳化。将乳化好的病毒液经颈部肌肉接种28日龄PEDV抗原抗体阴性健康仔猪，每组5头，2mL/头，免疫后14天以相同剂量加强免疫一次，设对照仔猪5头。于首免后14天、31天、45天分别采血，用PEDV AJ1102株和JS2008株分别进行中和抗体检测。

结果如图7和8所示：PEDV rAJ1102-S2′_JS2008株灭活疫苗与AJ1102株灭活疫苗诱导的针对AJ1102株的中和抗体水平相当，JS2008株诱导的针对AJ1102株的中和抗体水平明显低于AJ1102株和rAJ1102-S2′_JS2008；rAJ1102-S2′_JS2008株、AJ1102株和JS2008株诱导的针对JS2008株的中和抗体水平存在显著的差异，以JS2008株诱导的针对JS2008株的中和抗体水平最高，其次是rAJ1102-S2′_JS2008株，AJ1102株诱导的针对JS2008株的中和抗体水平最低。说明rAJ1102-S2′_JS2008株不仅可以诱导免疫猪产生针对AJ1102株的高水平中和抗体，同时也可以诱导较高的针对JS2008株的中和抗体。

实施例3：PEDV AJ1102株S2基因不同片段替换或不同点突变的结果对比

按照实施例1中的实验方法，还构建了AJ1102株S2亚基894和976位氨基酸单点突变毒株、894和976位氨基酸双点突变毒株、AJ1102株S2′-HR1区域替换为JS2008株重组毒株和AJ1102株HR1替换为JS2008株重组毒株(图9所示)，实验步骤参照实施例1，融合PCR扩增所用的引物序列见下表。

引物名称	引物序列(5′→3′)
		Mid-S<sub>R894G</sub>-F	AGTGGCAGGGTGGTACAAAAAGGGTCTTTTATTGAAGACCTGC
Mid-S<sub>R894G</sub>-R	GCAGGTCTTCAATAAAAGA CCC TTTTTGTACCACCCTGCCACT
		Mid-S<sub>Y976H</sub>-F	GCGGCATTGCCTTTTAGCGATGCTGTTCAAGCGAGACTGAATTATC
Mid-S<sub>Y976H</sub>-R	CAGTCTCGCTTGAACAGC ATC GCTAAAAGGCAATGCCGCTG

上述构建的三个S2亚基点突变毒株均能成功拯救，采用PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗对重组毒株rAJ1102-S_R894G、rAJ1102-S _H976Y和rAJ1102-S_R894G/H976Y分别进行间接免疫荧光(IFA)检测；结果如图10所示，在胰酶存在条件下，在倒置荧光显微镜下PEDV AJ1102-S_R894G、rAJ1102-S _H976Y和rAJ1102-S_R894G/H976Y株感染的细胞均出现了特异性绿色荧光。在无胰酶存在条件下，rAJ1102-S_R894G/H976Y毒株有很少的荧光，而rAJ1102-S_R894G和rAJ1102-S_H976Y基本无荧光，表明获得的三个点突变毒株仍为胰酶依赖毒株。

另外，AJ1102株S2′-HR1区域替换为JS2008株重组毒株和AJ1102株HR1替换为JS2008株重组毒株经过三次重复转染拯救，未能成功获得重组病毒。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用

<130> 无

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttctaatacg actcactata gcatctgaca ctactatcaa tgttttagag ctaga 55

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttctaatacg actcactata ggccacgtgc agtgatgttt ctgttttaga gctaga 56

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60

gctatttcta gctctaaaac 80

<210> 4

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttctaatacg actcactata gcatctgaca ctactatcaa tgttttagag ctagaaatag 60

caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt 120

t 121

<210> 5

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttctaatacg actcactata ggccacgtgc agtgatgttt ctgttttaga gctagaaata 60

gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 120

tt 122

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catctgacac tactatcaat 20

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcaggtcttc aataaaagac cctttttgta ccaccctgcc act 43

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgtgtattga aaaagtccaa g 21

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agtggcaggg tggtacaaaa agggtctttt attgaagacc tgc 43

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcaggttgc ttttgacc 18

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctagaatcac aatggatttg c 21

<210> 12

<211> 1110

<212> DNA

<213> porcine epidemic diarrhea virus

<400> 12

catctgacac tactatcaat gggtttagtt ctttctgtgt tgacactaga caatttacca 60

tttcactgtt ttataacgtt acaaacagtt atggttacgt gtctaaatca caggacagta 120

attgcccttt taccttgcaa tctgttaatg attatctgtc ttttagcaaa ttttgtgttt 180

ctaccagcct tttggctagt gcctgtacca tagatctttt tggttaccct gagtttggta 240

gtggtgttaa gttcacgtcc ctttactttc aattcacaaa gggtgagttg attactggca 300

cgcctaaacc acttgaaggt gttacggacg tttcttttat gactctggat gtgtgtacca 360

agtatactat ctatggcttt aaaggtgagg gtatcattac ccttacaaat tctagctttt 420

tggcaggtgt ttattataca tctgattctg gacagttgtt agcttttaag aatgtcacta 480

gtggtgctgt ttattctgtt acgccatgtt ctttttcaga gcaggctgca tatgttgatg 540

atgatatagt gggtgttatt tctagtttgt ctagctccac ttttaacagt actagggagt 600

tgcctggttt cttctaccat tctaatgatg gctctaattg tacagagcct gtgttggtgt 660

atagtaacat aggtgtttgt aaatctggca gtattggcta tgtccgatct cagtctggcc 720

aagtcaagat tgcacccacg gttactggga atattagtat tcccaccaac tttagtatga 780

gtattaggac agaatattta cagctttaca acacgcctgt tattgttgat tgtgctacat 840

atgtttgtaa tggtaactct cgttgtaaac aattactcac ccagtacact gcagcatgta 900

agaccataga gtcagcatta caactcagcg ctaggcttga gtctgctgaa gtcaactcta 960

tgcttactat ttctgaagag gctctacagt tagctaccat cagttcgttt aatggtgatg 1020

gatataattt tactaatgtg ctgggtgttt ccgtgtatga ccctgcaagt ggcagggtgg 1080

tacaaaaagg gtcttttatt gaagacctgc 1110

<210> 13

<211> 1529

<212> DNA

<213> porcine epidemic diarrhea virus

<400> 13

agtggcaggg tggtacaaaa agggtctttt attgaagacc tgctttttaa taaagtggtt 60

actaatggcc ttggtactgt tgatgaagac tataagcgct gttctaatgg tcgctctgtg 120

gcagatctag tctgtgcgca gtattactct ggtgtcatgg tactacctgg cgttgttgac 180

gctgagaagc ttcacatgta tagtgcgtct ctcatcggtg gtatggcgct aggaggtctt 240

actactgcag cggcattgcc ttttagccat gctgttcaag cgaggctcaa ttatcttgct 300

ttacagacgg atgttctaca gcgcaaccag caattgcttg ctgagtcttt taactctgct 360

attggtaata taacttcagc ctttgagagt gttaaagagg ctattagtca aacttccaat 420

ggtttgaaca ctgtggctca tgcgcttact aaggttcaag aggttgttaa ttcgcagggt 480

tcagctttga cccaacttac catacagctg caacacaact tccaagccat ttctagttct 540

attgatgaca tttactcccg actggacatt ctttcagccg atgttcaggt tgatcgtctc 600

atcaccggca gattatcagc acttaatgct tttgttgctc aaaccctcac taagtatact 660

gaggttcagg ctagcaggaa gctagcacag caaaaggtta atgagtgcgt caaatcgcaa 720

tctcagcgtt atggtttttg tggtggtgat ggcgagcaca tcttctctct ggtacaggcc 780

gcacctcagg gcctgctgtt cttacataca gtacttgtac cgggtgattt tgtaaatgtt 840

attgccatcg atggcttatg cgttaatggt gatattgcct tgactctacg tgagcctggc 900

ttagtcttgt ttacgcatga acttcaaaat catactgcga cggaatattt tgtttcatcg 960

cgacgtatgt ttgaacctag aaaacctacc gttagtgatt ttgttcaaat tgagaggtgt 1020

gtggtcacct atgtcaatct gactagcgac caactaccag atgtaatccc agattacatc 1080

gatgttaaca aaacacttga tgagattcta gcttctctgc ccaatagaat tggtcctagt 1140

cttcccctag atgtttttaa tgccacttat cttaatctca ctggtgaaat tgcagattta 1200

gagcagcgtt cagagtctct ccgtaatact acagaagagc tccgaagtct catatataat 1260

atcaacaaca cacttgttga ccttgagtgg ctcaaccgag ttgagacata tatcaagtgg 1320

ccgtggtggg tttggttgat tatttttatt gttctcatct ttgttgtgtc attattagtg 1380

ttctgctgca tttccacggg ttgttgtgga tgctgcggtt gttgcggtgc ttgtttttca 1440

ggttgttgta ggggtcctag acttcaacct tacgaagctt ttgaaaaggt ccacgtgcag 1500

tgatgtttct tggacttttt caatacacg 1529

<210> 14

<211> 4160

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> JS2008株的S2’序列

<222> (2680)..(4160)

<400> 14

atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60

caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180

gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240

tttcttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300

gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360

gcgcgactgc gcatttgcca gtttcccagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420

gatgttacaa caggtcgtaa ctgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480

catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540

tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600

ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acttactaca ttcttaatgt tactagtgct 660

ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720

gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780

cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840

gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900

caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960

tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020

ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcag aacctcactt agccaccttt 1080

gccatacctc tgggtgctat ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140

aactccactg tttataaatt cttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200

accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggctact tgcatctcgg tttgttggat 1260

gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg acgtttctgg tttttggacc 1320

atagcatcga ctaattttgt tgatgcactt atcgaagttc aaggaactgc cattcagcgt 1380

attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440

gacgatggtt tttaccgtat ttcctctaca aaccttctga gtcatgaaca gccaacttct 1500

tttgttactt tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta atattactgt ctctgctgct 1560

tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620

tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680

tatggttacg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt ttaccttgca atctgttaat 1740

gattatctgt cttttagcaa attttgtgtt tctaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800

atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtggtgtta agttcacgtc cctttacttt 1860

caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgcctaaac cacttgaagg tgttacggac 1920

gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980

ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattatac atctgattct 2040

ggacagttgt tagcttttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt tacgccatgt 2100

tctttttcag agcaggctgc atatgttgat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160

tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat 2220

ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280

agtattggct atgtccgatc tcagtctggc caagtcaaga ttgcacccac ggttactggg 2340

aatattagta ttcccaccaa ctttagtatg agtattagga cagaatattt acagctttac 2400

aacacgcctg ttattgttga ttgtgctaca tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa 2460

caattactca cccagtacac tgcagcatgt aagaccatag agtcagcatt acaactcagc 2520

gctaggcttg agtctgctga agtcaactct atgcttacta tttctgaaga ggctctacag 2580

ttagctacca tcagttcgtt taatggtgat ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640

tccgtgtatg accctgcaag tggcagggtg gtacaaaaag ggtcttttat tgaagacctg 2700

ctttttaata aagtggttac taatggcctt ggtactgttg atgaagacta taagcgctgt 2760

tctaatggtc gctctgtggc agatctagtc tgtgcgcagt attactctgg tgtcatggta 2820

ctacctggcg ttgttgacgc tgagaagctt cacatgtata gtgcgtctct catcggtggt 2880

atggcgctag gaggtcttac tactgcagcg gcattgcctt ttagccatgc tgttcaagcg 2940

aggctcaatt atcttgcttt acagacggat gttctacagc gcaaccagca attgcttgct 3000

gagtctttta actctgctat tggtaatata acttcagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060

attagtcaaa cttccaatgg tttgaacact gtggctcatg cgcttactaa ggttcaagag 3120

gttgttaatt cgcagggttc agctttgacc caacttacca tacagctgca acacaacttc 3180

caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactcccgac tggacattct ttcagccgat 3240

gttcaggttg atcgtctcat caccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300

accctcacta agtatactga ggttcaggct agcaggaagc tagcacagca aaaggttaat 3360

gagtgcgtca aatcgcaatc tcagcgttat ggtttttgtg gtggtgatgg cgagcacatc 3420

ttctctctgg tacaggccgc acctcagggc ctgctgttct tacatacagt acttgtaccg 3480

ggtgattttg taaatgttat tgccatcgat ggcttatgcg ttaatggtga tattgccttg 3540

actctacgtg agcctggctt agtcttgttt acgcatgaac ttcaaaatca tactgcgacg 3600

gaatattttg tttcatcgcg acgtatgttt gaacctagaa aacctaccgt tagtgatttt 3660

gttcaaattg agaggtgtgt ggtcacctat gtcaatctga ctagcgacca actaccagat 3720

gtaatcccag attacatcga tgttaacaaa acacttgatg agattctagc ttctctgccc 3780

aatagaattg gtcctagtct tcccctagat gtttttaatg ccacttatct taatctcact 3840

ggtgaaattg cagatttaga gcagcgttca gagtctctcc gtaatactac agaagagctc 3900

cgaagtctca tatataatat caacaacaca cttgttgacc ttgagtggct caaccgagtt 3960

gagacatata tcaagtggcc gtggtgggtt tggttgatta tttttattgt tctcatcttt 4020

gttgtgtcat tattagtgtt ctgctgcatt tccacgggtt gttgtggatg ctgcggttgt 4080

tgcggtgctt gtttttcagg ttgttgtagg ggtcctagac ttcaacctta cgaagctttt 4140

gaaaaggtcc acgtgcagtg 4160

Claims (5)

1.一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，用PEDV经典毒株JS2008株的S2'亚基对PEDV变异毒株AJ1102株的S2'亚基替换后，得到不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株。

2.根据权利要求1所述的一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202206，分类命名为猪流行性腹泻病毒重组毒株PEDV rAJ1102-S2'_JS2008。

3.权利要求1所述的一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株的构建方法，其特征在于，包括：

（1）设计两条靶向PEDV AJ1102株S基因S2'亚基上下游的sgRNA引物，分别与引物scaffold oligo进行重叠延伸PCR扩增，获得sgRNA-S2'a和sgRNA-S2'b的转录模板，体外转录获得sgRNA-S2'a和sgRNA-S2'b；

（2）利用CRISPR/Cas9系统对含有PEDV AJ1102株全长cDNA的BAC质粒pBAC-AJ1102进行切割，经试剂盒回收获得线性化的重组BAC质粒；

（3）通过融合PCR扩增获得PEDV AJ1102株S2'亚基替换为JS2008毒株S2'亚基的序列，该融合片段与所述线性化的重组BAC质粒的上、下游各含有20bp的同源臂；

（4）将步骤（2）线性化的的重组BAC质粒与步骤（3）的融合片段进行同源重组，获得AJ1102 S基因S2'亚基替换为JS2008 S基因S2'亚基序列的感染性克隆质粒pBAC-AJ1102-S2'_JS2008；

（5）将pBAC-AJ1102-S2'_JS2008转化感受态细胞，通过PCR筛选阳性克隆并测序，将测序正确的阳性克隆扩大培养后提取质粒；

（6）将pBAC-AJ1102-S2'_JS2008阳性克隆转染Vero细胞，拯救得到猪流行性腹泻病毒重组毒株PEDV rAJ1102-S2'_JS2008。

4.权利要求1所述的一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪流行性腹泻疫苗为灭活疫苗。

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