CN114599778A

CN114599778A - 生产多胺缀合物的酵母

Info

Publication number: CN114599778A
Application number: CN202080075687.9A
Authority: CN
Inventors: 秦久福; J·尼尔森
Original assignee: Clichy Ltd
Current assignee: Clichy Ltd
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2022-06-07
Also published as: CA3156097A1; WO2021083870A1; MX2022004991A; US20240294927A1; JP2023501189A; BR112022006280A2; EP4051801A1; AU2020376487A1; KR20220088729A

Abstract

本发明涉及在能够生产至少一种多胺的酵母细胞中的多胺缀合物的生产。该酵母细胞还包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因和至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。该酵母细胞能够生产各种多胺‑谷胱甘肽缀合物。

Description

生产多胺缀合物的酵母

技术领域

本发明总体涉及遗传工程化酵母，并且特别涉及能够生产多胺缀合物的这类酵母。

背景技术

需要具有新颖作用机制的小分子来帮助处理当今最具挑战性的生物医学问题和农业问题。然而，几十年间，由目标是识别用于药物和农用化学品开发的先导化合物的合成化学产生的超过1.35亿的小分子，尽管通过了初始筛选，但是被逐步淘汰。显然，改善小分子的复杂性和多样性是必要的。实际上，在自然界中多样的化合物，即具有复杂结构的天然产物和它们的衍生物是容易得到的，数千年来其在疾病的研究和治疗中发挥了重要作用。特别地，多胺缀合物是一组多样并且数量上主要的植物次级代谢物，其展示出广阔的结构多样性和复杂性。由此，已经报道多项对这些化合物的有益性质的研究。例如，已经提议多胺-谷胱甘肽缀合物，也被称为锥虫胱甘肽(trypanothione)，作为药物化学中的特异性分子探针和用于谷胱甘肽还原酶抑制剂的开发。

遗憾的是，由于其结构复杂性和在自然界中的低丰度，从传统的合成化学或自天然来源的提取均难以获得多胺类似物。已经寻求在快速生长、遗传上易处理的物种中基于微生物的生产作为天然产物及它们的衍生物的传统供应链的替代方案。特别地，面包师的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已经用做细胞工厂用于生产许多不同的燃料、化学品、食品配料和医药品，特别是为了它的天然产物生产。

因此，期望开发用于多胺缀合物的发现和生产的新方法。

发明内容

提供能够生产多胺缀合物的酵母细胞是总体的目的。

通过实施方案满足该目的以及其他目的。

在独立权利要求中定义了本发明。在从属权利要求中定义了本发明进一步的实施方案。

本发明涉及能够生产谷胱甘肽-多胺缀合物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺。该酵母细胞还包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因和至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。

本发明还涉及生产谷胱甘肽-多胺缀合物的方法。该方法包含在培养基中并且在适合于通过根据本发明的酵母细胞生产谷胱甘肽-多胺缀合物的培养条件下培养所述酵母细胞。该方法还包含从培养基和/或从酵母细胞中收集谷胱甘肽-多胺缀合物。

本发明提供用于各种谷胱甘肽-多胺缀合物的生产的有效手段，所述谷胱甘肽-多胺缀合物包括单取代和/或多取代多胺，诸如锥虫胱甘肽。因此本发明可以用作涉及传统的合成化学或自天然来源的提取以获得多胺缀合物的现有技术方法的有成本效益的替代方案。

附图说明

通过参考以下与附图一起的描述可以最好地理解实施方案，连同其进一步的目的和优点，其中：

图1a至1f说明用于亚精胺和高级多胺(higher-polyamine)过量合成的工程酵母代谢。

图2a和2b说明酵母中锥虫胱甘肽-(SH)₂的生产。

图3a和3b说明用于酵母中复杂的酚酰胺和锥虫胱甘肽-(SH)₂的生物合成的工程化途径。

具体实施方案

为了使得能够有效获取多胺缀合物的多样性，我们工程化了酵母代谢以过量生产一类复杂的多胺，例如亚精胺、高亚精胺(homo-spermidine)、热精胺(thermospermine)和精胺。通过具有按需定制途径(tailoring pathway)的多样的多胺缀合物的生物合成证明该酵母平台的多用性。具体地，由计算机模拟辅助，我们系统地重构了酵母中心碳代谢和氮代谢、甲硫氨酸补救途径、腺嘌呤的补救途径、多胺转运机器和多胺降解途径，由此使得酵母能够在深孔(deep-well)规模发酵中生产>400 mg/l的亚精胺。此外，通过插入按需定制途径以及产生合成聚生体，我们证明了酵母中多胺缀合物(包括锥虫胱甘肽)的从头生物合成。

现在将参考其中展示本发明的实施方案的附图和实施例在下文中描述本发明。该描述并非旨在成为可以实施本发明的所有不同方式或可以添加至本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可以并入到其他实施方案中，并且关于特定的实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。因此，本发明设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略载于本文的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本公开，本文提出的对各种实施方案的很多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，它们不背离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些特定的实施方案，并且并非旨在详尽地指定其所有的排列、组合和变化。

除非本文另有定义，本文所使用的科学术语和技术术语将具有本领域普通的技术人员通常所理解的含义。

一般地，本文所述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交的技术有关使用的名词是在本领域众所周知且通常使用的那些。

本文提及的常规方法和技术在，例如Molecular Cloning, a laboratory manual[second edition] Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989中，例如，在其第1.21章节"Extraction And Purification Of Plasmid DNA"、第1.53章节"Strategies For Cloning In Plasmid Vectors"、第1.85章节"Identification OfBacterial Colonies That Contain Recombinant Plasmids"、第6章节"GelElectrophoresis Of DNA"、第14章节 "In vitro Amplification Of DNA By ThePolymerase Chain Reaction"和第17章节"Expression Of Cloned Genes InEscherichia coli")中更详细地解释。

本说明书通篇涉及的酶委员会(Enzyme Commission)(EC)编号(本文也称为"种类")是根据国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee ofthe International Union of Biochemistry and Molecular Biology) (NC-IUBMB)在其例如作为以下得到的资源"Enzyme Nomenclature" (1992，包括附录6-17)中： "Enzymenomenclature 1992: recommendations of the Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclatureand classification of enzymes", Webb, E. C. (1992), San Diego: 由AcademicPress为国际生物化学与分子生物学联合会(the International Union of Biochemistryand Molecular Biology)出版(ISBN 0-12-227164-5)。这是基于由每个酶种类催化的化学反应的数字分类方案。

除非上下文另有指示，具体地意指本文所述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略载于本文的任何特征或特征的组合。为了说明，如果本说明书声明组合物包含组分A、B和C，其具体地意指可以单独地或以任何组合省略和放弃A、B或C或其组合的任一个。

如在本发明的描述和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有清楚指示，单数形式"一(a)"、"一(an)"和"该/所述(the)"也旨在包括复数形式。也如本文所使用的，"和/或"指的是并且包括一种或多种关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及在替代方案("或")中解释时为组合的缺少。

贯穿该说明书的描述和权利要求，词语"包含(comprise)"和"含有(contain)"以及词语的变化，例如"包含(comprising)"和"包含(comprises)"，意为"包括但不限于"并且不排除其他的部分、添加物、组分、整数或步骤。贯穿该说明书的描述和权利要求，除非上下文另有要求，单数包括复数。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，本说明书应理解为设想复数以及单数。

如本文所使用的，过渡词组基本上由…"组成"意为权利要求的范围应解释为包括在权利要求中所列举的指定的材料或步骤以及实质上不影响所要求保护的发明的基本和新颖特性的那些材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语基本上由…"组成"并非旨在解释为等效于"包含"。

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。

如本文所使用的，术语"多胺"指的是具有两个或更多个伯氨基基团的有机化合物。多胺的示例包括腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)、热精胺(Tspm)、对称-高亚精胺(sym-homospermidine)(Hspd)、1,2-二氨基丙烷、尸胺、胍丁胺、对称-降亚精胺(sym-norspermidine)和降精胺(norspermine)。

如本文所使用的，术语"多胺缀合物"或"谷胱甘肽-多胺缀合物"指的是至少一个谷胱甘肽(GSH)分子和多胺之间的缀合物。优选地，谷胱甘肽-多胺缀合物包含在GSH的羧基基团和多胺的胺基团之间形成的酰胺键。谷胱甘肽-多胺缀合物的非限制性而是说明性的示例包括锥虫胱甘肽(N ¹ ,N ¹⁰-双(谷胱甘酰基)亚精胺)、N ¹-谷胱甘酰基亚精胺、N ¹⁰-谷胱甘酰基亚精胺、N ¹ ,N ¹⁰-双(谷胱甘酰基)精胺、N ¹ ,N ⁵ ,N ¹⁰-三(谷胱甘酰基)精胺、N ¹ ,N ⁵ ,N ¹⁰ ,N ¹⁴-四(谷胱甘酰基)精胺。因此，谷胱甘肽-多胺缀合物可以是一个多胺(诸如亚精胺或精胺)和一个、两个或更多个(诸如三个或四个)谷胱甘肽分子之间的缀合物。

也如本文所使用的，术语"核苷酸序列"、"核酸"、"核酸分子"、"寡核苷酸"和"多核苷酸"指的是RNA或DNA，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其中的任何一种可以是单链或双链的、线性或分支的、或其杂合体。本文所提供的核酸分子和/或核苷酸序列以5'至3'方向、从左至右呈现于本文，并且使用如载于美国序列细则 37 CFR §§1.821 - 1.825和世界知识产权组织(the World Intellectual PropertyOrganization)(WIPO)标准ST.25中的用于代表核苷酸性状的标准代码来代表。当人工合成地生产dsRNA时，不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可以用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，已经证明包含尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA并且是基因表达的有力反义抑制剂。也可以进行其他的修饰，诸如对磷酸二酯主链或RNA的核糖糖基团中的2'-羟基的修饰。如本文所使用的术语"重组体"在使用时意为特定的核酸(DNA或RNA)是克隆、限制和/或连接步骤的各种组合的产物，所述各种组合造成具有结构编码序列或非编码序列的可区别于天然系统中发现的内源核酸的构建体。

如本文所使用的，术语"基因"指的是能够用于生产mRNA、反义RNA、miRNA、抗-微RNA反义寡聚脱氧核苷酸(anti-microRNA antisense oligodeoxyribonucleotide)(AMO)等的核酸分子。基因可以能够或不能够用于生产功能蛋白或功能基因产物。基因可以包括编码区域和非编码区域(例如，内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'非翻译区域和3'非翻译区域)两者。基因可以是"分离的"，其意为核酸实质上或基本上没有通常发现的与处于其天然状态的核酸关联的组分。这类组分包括其他细胞材料、来自重组体生产的培养基和/或在化学合成核酸中使用的各种化学品。

如本文所定义的"扰乱的基因"涉及造成部分或完全无功能基因和基因产物的对基因的任何突变或修饰。这种突变或修饰包括但不限于错义突变、无义突变、缺失、取代、插入、靶向序列的添加等。此外或备选地，基因的扰乱还可以通过控制基因转录的控制元件的突变或修饰(诸如启动子、终止子和/或增强元件中的突变和修饰)来达到。在这种情况下，这种突变或修饰造成基因转录的部分或完全丧失，即，当与天然和未修饰的控制元件相比，转录较低或减少。作为结果，转录和翻译之后可用的基因产物的量(如果有的话)将减少。此外，基因的扰乱可能还需要向基因中添加或从中去除定位信号，造成基因产物在其天然的亚细胞区室中的存在降低。

基因扰乱的目的是减少基因产物的可用的量，包括完全阻止基因产物的任何生产，或表达当与天然或野生型基因产物相比缺少或具有较低的酶活性的基因产物。

如本文所使用的术语"缺失"或"敲除"指的是无效或敲除的基因。

术语"减弱的活性"在涉及酶时指的是与对照或野生型状态相比酶在其天然区室中的活性降低。造成减弱的酶活性的操作包括但不限于错义突变、无义突变、缺失、取代、插入、靶向序列的添加、靶向序列的去除等。包含造成减弱的酶活性的修饰的细胞与不包含这类修饰的细胞相比将具有较低的酶活性。减弱的酶活性可以通过编码无功能基因产物(例如，具有基本上无活性例如，当与野生型多肽的活性相比活性小于约10%或者甚至5%的多肽)来达到。

基因的密码子优化版本指的是引入到细胞中的外源基因，并且其中基因的密码子已经关于特定的细胞进行了优化。一般地，并非所有的tRNA横跨物种都是同等地或者在相同水平表达。由此，基因序列的密码子优化涉及改变密码子以匹配最优势的tRNA，即，在给定细胞中，用由相对更优势的tRNA识别的同义密码子去改变由低优势的tRNA识别的密码子。这样，来自密码子优化基因的mRNA将被更有效地翻译。优选地，密码子和同义密码子编码相同的氨基酸。

如本文所使用的，术语"肽"、"多肽"和"蛋白"可互换使用以指示氨基酸残基的聚合物。术语"肽'、"多肽"和"蛋白"还包括修饰，所述修饰包括但不限于脂质附着、糖基化、糖基化、硫酸酯化、羟基化、L-谷氨酸残基的γ-羧基化和ADP-核糖基化。

如本文所使用的，术语"酶"定义为在细胞中催化化学或生化反应的蛋白。通常地，根据本发明，编码酶的核苷酸序列可操作地连接至核苷酸序列(启动子)，该核苷酸序列(启动子)引起相应基因在细胞中的充分表达以赋予细胞生产亚精胺的能力。

如本文所使用的，术语"开放阅读框(ORF)"指的是编码多肽、肽或蛋白的RNA或DNA区域。

如本文所使用的，术语"基因组"包括宿主细胞中的质粒和染色体两者。例如，无论它们是染色体整合的还是质粒定位的，引入到宿主细胞中的本公开的编码核酸都可以是基因组的一部分。

如本文所使用的，术语"启动子"指的是具有控制一个或多个基因转录的功能的核酸序列，其位于关于基因的转录起始位点的转录方向的上游。在该上下文中合适的启动子包括组成型天然启动子和诱导型天然启动子两者，以及本领域的技术人员所熟知的工程化启动子。

用于在酵母细胞中使用的合适的启动子包括但不限于PDC、GPD1、TEF1、PGK1和TDH的启动子。其他合适的启动子包括GAL1、GAL2、GAL10、GAL7、CUP1、HIS3、CYC1、ADH1、PGL、GAPDH、ADC1、URA3、TRP1、LEU2、TPI、AOX1和ENOl的启动子。

如本文所使用的，如果没有另外注释，术语"终止子"指的是"转录终止信号"。终止子是阻碍或停止聚合酶的转录的序列。

如本文所使用的，根据本公开的"重组真核细胞"定义为包含内源核酸序列的额外多份或一份拷贝的细胞，或用在真核细胞中不天然存在的多肽或核苷酸序列转化或遗传修饰的细胞。如本文所使用的，野生型真核细胞定义为重组真核细胞的亲本细胞。

如本文所使用的，术语"增加(increase)"、"增加(increased)"、"增加(increasing)"、"增强(enhance)"、"增强(enhanced)"、"增强(enhancing)"和"增强(enhancement)"(及其语法变化)指示当与对照相比，至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%、500% 或更多，或其中任何范围的提高。

如本文所使用的，术语"减少(reduce)"、"减少(reduced)"、"减少(reduction)"、"缩减"、"抑制"和"降低"以及相似的术语意为当与对照相比，至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、300%、400%、500% 或更多，或其中任何范围的降低。

如本文所使用的减少的基因表达涉及减少基因的转录、减少转录自基因的mRNA的翻译和/或减少翻译自mRNA的蛋白的翻译后加工的遗传修饰。这类遗传修饰包括应用于基因的控制序列(诸如启动子和增强子)的插入、缺失、置换或突变。例如，基因的启动子可以由较少活性的启动子或诱导型启动子替换，从而造成减少的基因转录。启动子的敲除也会造成减少的基因表达(典型地为0)。

如本文所使用的，术语本发明的核苷酸序列的"部分"或"片段"将理解为意为核苷酸序列相对于参考核酸或参考核苷酸序列长度减少，并且包含与参考核酸或参考核苷酸序列同一或几乎同一的(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%、99%同一性)连续核苷酸的核苷酸序列、基本上由之组成和/或由之组成。根据本发明的这种核酸片段或部分可以在适当的情况下包含于较大的多核苷酸中作为其组分。

具有同源性的不同的核酸或蛋白在本文中称为"同源物"。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源序列，以及来自相同物种和其他物种的直系同源序列。"同源性"指的是用位置同一性的百分比(即，序列相似性或同一性)表示的在两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平。同源性还指的是不同的核酸或蛋白中相似的功能性质的概念。因此，本发明的组合物和方法进一步包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文所使用的，"直系同源的"指的是不同物种中的在物种形成期间由共同的祖先基因产生的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的核苷酸序列的同源物与所述核苷酸序列具有实质的序列同一性，例如，至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和/或100%。

如本文所使用的术语"过量表达(overexpress)"或"过量表达(overexpression)"指的是，与在其天然或对照状态下(例如，未用特定的过量表达的异源或重组多肽转化)在细胞中相比，更高水平的基因活性(例如，基因的转录)、更高水平的mRNA翻译为蛋白和/或更高水平的基因产物(例如，多肽)的生产。过量表达基因的典型示例是在当与基因的天然启动子相比另一启动子的转录控制下的基因。另外或备选地，基因的控制元件(诸如增强子)中的其他改变也可以用于过量表达特定的基因。此外，如本文所使用的，影响(即，增加)转录自基因的mRNA的翻译的修饰可以备选地或额外用于达到基因过量表达。这些术语也可以指的是细胞中基因的拷贝数量的增加和/或mRNA和/或基因产物的量的增加。还可以通过包括来自不同物种的编码相同或同源基因产物(诸如酶)的基因达到过量表达。过量表达可以造成当与对照水平相比细胞中25%、50%、75%、100%、200%、300%、400%、500%、750%、1000%、1500%、2000%或更高，或其中任何范围的水平。

如本文所使用的，术语"外源的"或"异源的"在关于核酸(RNA或DNA)、蛋白或基因使用时指的是，核酸、蛋白或基因作为将其导入的细胞、生物体、基因组、RNA或DNA序列的部分非天然地存在，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多份拷贝。这种外源基因可以是来自另一物种或株系的基因、在宿主细胞中天然存在的基因的修饰、突变或进化版本或在宿主细胞中天然存在的基因的嵌合版本或融合基因。在这些前例中，修饰、突变或进化引起基因的核苷酸序列的改变，从而获得当与宿主细胞中天然存在的基因相比具有另一核苷酸序列的修饰、突变或进化的基因。进化基因指的是编码进化基因并且通过遗传修饰(诸如突变或暴露于进化压力)以衍生出当与野生型或天然基因相比具有不同的核苷酸序列的新基因而获得的基因。嵌合基因是通过将一个或多个编码序列的部分组合以产生新基因而形成的。这些修饰与将整个基因序列合并到单个阅读框中的融合基因不同，并且经常保留它们的原始功能。

"内源的"、"天然的"或"野生型"核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列指的是天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，"野生型mRNA"是天然存在于生物体中或生物体内源的mRNA。

如本文所使用的，术语"修饰的"，当其关于生物体使用时，指的是当与除了未进行如此修饰之外相同的宿主生物体相比，已进行修饰以生产多胺缀合物的宿主生物体。原则上，根据本公开的这类"修饰"可以包含当与除了未经过修饰之外相同的生物体相比，在宿主生物体中适当地变更多胺缀合物的生产的任何生理、遗传、化学或其他的修饰。然而，在大多数实施方案中，修饰将包含遗传修饰。在某些实施方案中，如本文所述，修饰包含将基因引入到宿主细胞中。提升多肽活性的遗传修饰包括但不限于：引入一份或多份拷贝的编码多肽的基因(其可能区别于已存在于宿主细胞中的编码具有相同活性的多肽的任何基因)；变更存在于细胞中的基因以增加基因的转录或翻译(例如，变更例如调节序列、启动子序列或其他序列、向其添加额外的序列、置换其一个或多个核苷酸、从其缺失序列或将其交换)；以及变更编码多肽的基因的序列(例如非编码或编码的)以提升活性(例如通过增加酶活性、降低反馈抑制、靶向特定的亚细胞定位、提升mRNA稳定性、提升蛋白稳定性)。减少多肽活性的遗传修饰包括但不限于：缺失编码多肽的基因的部分或全部；插入扰乱编码多肽的基因的核酸序列；改变存在于细胞中的基因以减少基因的转录或翻译或减少由基因编码的mRNA或多肽的稳定性(例如通过添加额外的序列至启动子序列、调控序列或其他序列、将其变更、从其缺失序列、置换其一个或多个核苷酸或将其交换例如置换其一个或多个氨基酸)。术语"过量生产"在本文中关于宿主细胞中产物的生产使用，并且指示依靠编码涉及宿主细胞的代谢途径的不同多肽的核酸序列的引入或作为其他的修饰的结果，当与未修饰宿主细胞或野生型细胞相比宿主细胞生产更多的产物。

如本文所使用的术语"载体"定义为线性或环状DNA分子，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸可操作地连接至确保其表达的额外核苷酸。

"引入"在酵母细胞的上下文中意为以核酸分子得以进入细胞的内部的方式使核酸分子与细胞接触。相应地，多核苷酸和/或核酸分子可以在单个的转化事件中、在分开的转化事件中引入酵母细胞。因此，如本文所使用的术语"转化"指的是将异源核酸引入到细胞中。酵母细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。

"瞬时转化"在多核苷酸的上下文中意为多核苷酸被引入到细胞中并且不整合到细胞的基因组中。

在将多核苷酸引入到细胞中的上下文中提到"稳定地引入"或"稳定地引入的"意指引入的多核苷酸稳定地并入到细胞的基因组中，并且因此多核苷酸稳定地转化了细胞。如本文所使用的"稳定转化"或"稳定地转化的"意为核酸分子被引入到细胞中并且整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够由其后代，更特别地，由多个连续世代的后代遗传。如本文所使用的稳定转化也可以指的是染色体外(例如作为微型染色体)维持的核酸分子。

瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来检测，其可以检测由一个或多个引入到生物体中的核酸分子编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的基因组DNA与核酸序列的DNA印迹杂交测定来检测，所述核酸序列特异性地与引入到生物体(例如，酵母)中的核酸分子的核苷酸序列杂交。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与核酸序列的RNA印迹杂交测定来检测，所述核酸序列特异性地与引入到酵母或其他生物体中的核酸分子的核苷酸序列杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如本领域所熟知的聚合酶链式反应(PCR)或其他扩增反应来检测，所述反应采用与核酸分子的靶标序列杂交的特异性引物序列，造成靶标序列的扩增，其可以根据标准方法检测。转化也可以通过本领域熟知的直接测序和/或杂交方案来检测。

本发明的实施方案还包括如本文所述的多肽的变体。如本文所使用的，"变体"意为其中氨基酸序列与它衍生自的基础序列的不同在于序列内一个或多个氨基酸由其他氨基酸取代的多肽。例如，SEQ ID NO: 1的变体可以具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ IDNO: 1具有至少约50%同一性(例如，至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约100%同一性)。该变体和/或片段是功能变体/片段，因为变体序列具有与酶相似或同一的功能酶活性特性，所述酶具有本文所指定的非变体氨基酸序列(并且这是如本说明书通篇所使用的术语"功能变体"的含义)。

因此，任何呈现的氨基酸序列的"功能变体"或"功能片段"是保持在与非变体序列相同酶类别(即，具有相同EC编号)内的任何氨基酸序列。确定酶是否落在特定类别内的方法是技术人员所熟知的，技术人员可以在不使用创造性技能的情况下确定酶类别。例如，合适的方法可以从国际生物化学与分子生物学联合会(the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology)获得。

氨基酸由具有大致相似的性质的不同的氨基酸置换的氨基酸取代可以视为"保守的"。非保守取代是其中氨基酸由不同类型的氨基酸置换。

"保守取代"意为一种氨基酸由相同种类的另一氨基酸取代，其中种类定义如下：

种类氨基酸示例

非极性的：A、V、L、I、P、M、F、W

不带电荷的极性的：G、S、T、C、Y、N、Q

酸性的：D、E

碱性的：K、R、H。

如本领域技术人员所熟知的，通过保守取代变更多肽的一级结构可能不会显著变更该多肽的活性，因为插入到序列中的氨基酸的侧链可能能够形成与已被取代掉的氨基酸的侧链相似的键和接触。甚至当取代在对确定多肽构象关键的区域中时也是如此。

在本发明的实施方案中，如本文别处所定义的，假如非保守取代不干扰多肽的酶活性，它们就是可能的。酶的取代版本必须保留特性，以使它们保持在与非取代酶相同的酶种类中，所述酶种类使用以上所讨论的NC-IUBMB命名法确定。

一般来说，在不变更多肽的生物活性的情况下，比保守取代更少的非保守取代将是可能的。确定任何取代(以及事实上任何氨基酸缺失或插入)的影响完全在技术人员的常规能力内，技术人员可以容易地确定变体多肽是否保留根据本发明的方面的酶活性。例如，当确定多肽的变体是否落在本发明的范围内(即，为如上所定义的"功能变体或片段")时，技术人员将确定该变体或片段是否保留如本文别处所提及的参考NC-IUBMB命名法所定义的底物转换酶活性。所有这类变体都在本发明的范围内。

除本文所公开的那些之外，使用标准的遗传代码，技术人员可以容易地构思和制造编码多肽的进一步的核酸序列。核酸序列可以是DNA或RNA，并且当它是DNA分子时，它可以例如包含cDNA或基因组DNA。如本文别处所述，核酸可以包含在表达载体内。

因此，本发明的实施方案包括编码本发明的实施方案所设想的多肽的变体核酸序列。与核酸序列相关的术语"变体"意为多核苷酸序列的任何取代、变化、修饰、置换、缺失或自其或向其添加一个或多个核苷酸，只要由该多核苷酸编码的所得多肽序列表现出与由基础序列编码的多肽至少相同或相似的酶性质。该术语包括等位基因的变体并且还包括多核苷酸("探针序列")，该多核苷酸实质上与本发明的实施方案的多核苷酸序列杂交。这类杂交可能发生在低严谨性条件下和高严谨性条件下或两者之间。概括地，低严谨性条件可以定义为其中洗涤步骤发生在低于探针序列的计算或实际解链温度(Tm)约40°C-48°C(例如，约实验室环境温度至约55°C)的温度下在0.330-0.825 M NaCl缓冲液溶液中的杂交，而高严谨性条件涉及在低于探针序列的计算或实际Tm约5°C-10°C(例如，约65°C)的温度下在0.0165-0.0330 M N缓冲液溶液中的洗涤。缓冲液溶液可以是，例如盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液(0.15M NaCl和0.015M 柠檬酸三钠)，其中低严谨性洗涤发生在3 × SSC缓冲液中，并且高严谨性洗涤发生在0.1 × SSC 缓冲液中。涉及核酸序列的杂交的步骤已经在例如Molecular Cloning, a laboratory manual [second edition] Sambrook et al. ColdSpring Harbor Laboratory, 1989中，例如在其第11章节"Synthetic OligonucleotideProbes"中描述。

优选地，核酸序列变体具有约80%或更多的与本发明的实施方案的核酸序列相同的核苷酸，更优选至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的序列同一性。

本发明的变体核酸可以进行密码子优化以用于在特定的宿主细胞中表达。

如本文所使用的，"序列同一性"指的是两个核苷酸序列或两个肽序列或蛋白序列之间的序列相似性。通过序列比对确定相似性，以确定序列之间的结构和/或功能关系。

氨基酸序列之间的序列同一性可以通过使用从the National Center forBiotechnology Information (NCBI), Bethesda, Md., USA得到的Needleman-Wunsch 全局序列比对工具(Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment Tool)，例如，经由http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi，使用默认参数设置(对于蛋白比对，Gapcosts Existence: 11 Extension: 1)比较序列的比对来确定。本说明书中提及的序列比较和百分比同一性已使用该软件确定。当将序列同一性水平与例如SEQ ID NO: 1比较时，优选地，这应相对于SEQ ID NO: 1的整个长度进行(即，使用全局比对方法)，以避免短区域的高同一性重叠造成同一性的高总体评价。例如，具有例如五个氨基酸的短多肽片段可能具有与整个SEQ ID NO: 1内的五个氨基酸区域具有100%同一性的序列，但这不提供100%的氨基酸同一性，除非该片段形成较长序列的部分，该较长序列在等效于SEQ ID NO: 1中的位置的其他位置也具有同一的氨基酸。当比较序列中的等效位置由相同的氨基酸占据时，那么分子在该位置是同一的。将比对评分为同一性的百分比是与比较序列共享的位置处同一的氨基酸的数量的函数。在比较序列时，最佳比对可能要求将空位引入到一个或多个序列中，以考虑序列中可能的插入和缺失。序列比较方法可以采用空位罚分，以便对于被比较的序列中相同数量的同一的分子，具有尽可能少的空位的序列比对，其反映两个比较序列之间较高的相关性，将达到比具有许多空位的序列更高的分数。最大百分比同一性的计算涉及考虑空位罚分的最佳比对的产生。如上所提及的，可以使用Needleman-Wunsch全局序列比对工具，使用默认参数设置确定百分比序列同一性。Needleman-Wunsch算法出版于J. Mol. Biol. (1970) 48卷: 443-453。

本发明的一个方面涉及能够生产谷胱甘肽-多胺缀合物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺并且该酵母细胞包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因和至少一种多胺合酶编码基因，但是缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。

在一个实施方案中，酵母细胞被工程化以用于多胺:谷胱甘肽连接酶的过量表达。

在一个实施方案中，多胺:谷胱甘肽连接酶的过量表达通过将多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因置于在酵母细胞中高活性的启动子的转录控制下来达到。用于在酵母细胞中使用的合适的启动子包括但不限于，PDC、GPD、GPD1、TEF1、PGK1、TDH和TDH3的启动子。其他合适的启动子包括GAL1、GAL2、GAL10、GAL7、CUP1、HIS3、CYC1、ADH1、PGL、GAPDH、ADC1、URA3、TRP1、LEU2、TPI、AOX1和ENO1的启动子。

酵母细胞可以包含一份或多份(即至少两份)拷贝的多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因，从而增加多胺:谷胱甘肽连接酶的mRNA的拷贝数量并且从而增加由酵母细胞生产的多胺:谷胱甘肽连接酶的量。在这种情况下，多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因的多份拷贝可以在一个启动子的转录控制下，或每个多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因可以在各自的启动子的转录控制下。在后一种情况下，相同类型的启动子可以用于控制各个多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因的转录，或可以使用不同类型的启动子。

在一个实施方案中，谷胱甘肽-多胺缀合物选自锥虫胱甘肽(N ¹ ,N ¹⁰-双(谷胱甘酰基)亚精胺)、N ¹-谷胱甘酰基亚精胺、N ¹⁰-谷胱甘酰基亚精胺、N ¹ ,N ¹⁰-双(谷胱甘酰基)精胺、N ¹ ,N ⁵ ,N ¹⁰-三(谷胱甘酰基)精胺、N ¹ ,N ⁵ ,N ¹⁰ ,N ¹⁴-四(谷胱甘酰基)精胺。因此，缀合物可以是一个多胺(诸如亚精胺或精胺)和一个、两个或多个(诸如三个或四个)谷胱甘肽分子之间的缀合物。

在一个实施方案中，多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因选自锥虫胱甘肽合酶(EC6.3.1.9)、谷胱甘酰基亚精胺合酶(EC 6.3.1.8)及其组合。

在一个实施方案中，锥虫胱甘肽合酶(TryS)编码基因选自布氏锥虫指名亚种(Trypanosoma brucei brucei)锥虫胱甘肽合酶(TbbTryS)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与锥虫胱甘肽合酶TbbTryS具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与布氏锥虫指名亚种TrrS具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶能够催化谷胱甘肽和多胺转换为谷胱甘酰基多胺和/或催化谷胱甘肽和谷胱甘酰基多胺转换为双(谷胱甘酰基)多胺，优选地，能够催化谷胱甘肽和亚精胺转换为谷胱甘酰基亚精胺和催化谷胱甘肽和谷胱甘酰基亚精胺转换为N ¹ , N ¹⁰-双(谷胱甘酰基)亚精胺。具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于TbbTrrS相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。

TbbTryS的氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 34中并且TbbTrrS的核苷酸序列展示于SEQ ID NO: 35中。

在一个实施方案中，谷胱甘酰基亚精胺合酶(GSS)编码基因选自大肠杆菌(Escherichia coli)谷胱甘酰基亚精胺合酶(EcGSS)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与谷胱甘酰基亚精胺合酶EcGSS具有至少80%的序列同一性的谷胱甘酰基亚精胺合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与大肠杆菌EcGSS具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的谷胱甘酰基亚精胺合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的谷胱甘酰基亚精胺合酶能够催化谷胱甘肽和多胺转换为谷胱甘酰基多胺，优选地，能够催化谷胱甘肽和亚精胺转换为谷胱甘酰基亚精胺。具有至少80%的序列同一性的谷胱甘酰基亚精胺合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于EcGSS相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。

EcGSS的氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 259中并且EcGSS的核苷酸序列展示于SEQID NO: 260中。

在一个实施方案中，至少一种多胺选自精胺、热精胺、对称-高亚精胺、1,3-二氨基丙烷、腐胺、尸胺、胍丁胺、亚精胺、对称-降亚精胺、降精胺及其组合。

本发明的酵母细胞缺少多胺氧化酶(EC 1.5.3.17)编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。该酵母细胞还包含至少一种多胺合酶编码基因。

由酵母细胞表达的至少一种多胺合酶在酵母细胞中催化至少一种多胺的生产。多胺氧化酶是催化精胺转换回亚精胺的酶。因此，酵母细胞缺少任何多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。这意为优选酵母细胞缺少任何多胺氧化酶，或如果酵母细胞中表达这种多胺氧化酶，优选该多胺氧化酶为酶促非活性的或至少当与天然多胺氧化酶相比具有显著较低的酶效力。

在一个实施方案中，酵母细胞被工程化以用于至少一种多胺合酶的过量表达。

在一个实施方案中，至少一种多胺合酶的过量表达通过将至少一种至少一种多胺合酶编码基因置于在酵母细胞中高活性的启动子的转录控制下来达到。用于在酵母细胞中使用的合适的启动子包括但不限于，PDC、GPD、GPD1、TEF1、PGK1、TDH和TDH3的启动子。其他合适的启动子包括GAL1、GAL2、GAL10、GAL7、CUP1、HIS3、CYC1、ADH1、PGL、GAPDH、ADC1、URA3、TRP1、LEU2、TPI、AOX1和ENO1的启动子。

酵母细胞可以包含一份或多份拷贝的多胺合酶编码基因，从而增加多胺合酶的mRNA的拷贝数量并且从而增加由酵母细胞生产的多胺合酶的量。在这种情况下，多胺合酶编码基因的多份拷贝可以在一个启动子的转录控制下，或每个多胺合酶编码基因可以在各自的启动子的转录控制下。在后一种情况下，相同类型的启动子可以用于控制各个多胺合酶编码基因的转录，或可以使用不同类型的启动子。

在一个实施方案中，多胺合酶编码基因选自精胺合酶(EC 2.5.1.22)编码基因、热精胺合酶(EC 2.5.1.79)编码基因和高亚精胺合酶(EC 2.5.1.44或EC 2.5.1.45)编码基因。

在一个实施方案中，精胺合酶编码基因选自酿酒酵母精胺合酶(优选ScSPE4)、拟南芥精胺合酶(AtSPMS)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与精胺合酶ScSPE4或精胺合酶AtSPMS具有至少80%的序列同一性的精胺合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与ScSPE4或AtSPMS具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的精胺合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的精胺合酶能够催化亚精胺转换为精胺。具有至少80%的序列同一性的精胺合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于ScSPE4或AtSPES相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。

ScSPE4的氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 1中并且ScSPE4的核苷酸序列展示于SEQID NO: 2中。AtSPMS相应的氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 3中并且AtSPMS的核苷酸序列展示于SEQ ID NO: 4中。

在一个实施方案中，热精胺合酶编码基因选自拟南芥热精胺合酶(优选AtACL5)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与热精胺合酶AtACL5具有至少80%的序列同一性的热精胺合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与AtACL5具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的热精胺合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的热精胺合酶能够催化亚精胺转换为热精胺。具有至少80%的序列同一性的热精胺合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于AtACL5相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。

AtACL5的氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 5中并且AtACL5的核苷酸序列展示于SEQID NO: 6中。

在一个实施方案中，高亚精胺合酶(HSS)编码基因选自春千里光(Senecio vernalis)高亚精胺合酶(SvHSS)、绿色芽生绿菌(Blastochloris viridis)高亚精胺合酶(BvHSS)和核苷酸序列，该核苷酸序列编码与高亚精胺合酶SvHSS或高亚精胺合酶BvHSS具有至少80%的序列同一性的高亚精胺合酶。在一个实施方案中，该核苷酸序列编码与SvHSS或BvHSS具有至少85%或甚至90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的高亚精胺合酶。在一个实施方案中，该具有至少80%的序列同一性的高亚精胺合酶能够催化腐胺转换为对称-高亚精胺，或催化腐胺或亚精胺转换为对称-高亚精胺。具有至少80%的序列同一性的高亚精胺合酶的酶效力可以低于、实质上等于或高于SvHSS或BvHSS相应的酶效力，优选至少实质上相等或较高的酶效力。

SvHSS的氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 7中并且SvHSS的核苷酸序列展示于SEQID NO: 8中。BvHSS相应的氨基酸序列展示于SEQ ID NO: 9中并且BvHSS的核苷酸序列展示于SEQ ID NO: 10中。

在一个实施方案中，酵母细胞选自酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、三角酵母属(Trigonopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、德巴利酵母属(Debaromyces)、拿逊酵母属(Nadsonia)、油脂酵母属(Lipomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、短梗霉属(Aureobasidium)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红酵母属(Rhodotorula)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、法夫酵母属(Phaffia)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、曲霉属(Aspergillus)和阿氏酵母属(Ashbya)。在特定的实施方案中，酵母细胞选自酿酒酵母、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、圆球形假丝酵母(Candida sphaerica)或解苹果酸裂殖酵母(Schizosaccharomyces malidevorans)。酿酒酵母是优选的酵母物种。

在一个实施方案中，酵母细胞是酿酒酵母细胞并且多胺氧化酶是FMS1。因此，在一个实施方案中，酿酒酵母细胞缺少FMS1或包含扰乱的FMS1。

本发明的另一方面涉及能够生产谷胱甘肽-多胺缀合物的酵母细胞。该酵母细胞能够生产至少一种多胺并且该酵母细胞包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因。

如前文中所述的酵母细胞的各种实施方案也可以应用于本发明的这个方面。

本发明的另一方面涉及生产谷胱甘肽-多胺缀合物的方法。该方法包含在培养基中并且在适合于通过根据本发明的酵母细胞生产谷胱甘肽-多胺缀合物的培养条件下培养所述酵母细胞。该方法还包含从培养基和/或从酵母细胞中收集谷胱甘肽-多胺缀合物。

在本发明的这个方面中的培养基可以是其中可以培养酵母细胞以生产谷胱甘肽-多胺缀合物的任何培养基。培养可以是，例如分批培养、补料分批培养或灌注培养或发酵、生物反应器发酵等的形式。

实施例

实施例1：通过系统地重新布线酵母中的天然代谢来改善亚精胺生产

在该实施例1中，我们系统地重构了酵母菌株中的代谢，包括中心碳代谢和氮代谢、甲硫氨酸补救途径、腺嘌呤的补救途径、多胺转运机器和多胺消耗/降解途径。此外，我们还引入了另外潜在的阳性遗传靶标。该酵母菌株用新的模块化遗传设计建造。具体地，从头Spd生物合成途径分成多个遗传模块，其包含很多生物合成酶的编码序列以将更大的碳通量从糖碳来源转移至Spd。

设计以增加L-鸟氨酸(Orn)的积累的前体过量生产模块(I)包括八种蛋白的过量表达：来自酿酒酵母的NADP⁽⁺⁾-依赖的谷氨酸脱氢酶(GDH1)[SEQ ID NO: 11]、来自酿酒酵母的线粒体天冬氨酸和谷氨酸载体蛋白(AGC1)[SEQ ID NO: 12]、来自酿酒酵母的线粒体L-鸟氨酸载体蛋白(ORT1)[SEQ ID NO: 13]、来自大肠杆菌的谷氨酸N-乙酰基转移酶(EcargA)[SEQ ID NO: 14]、来自大肠杆菌的乙酰基谷氨酸激酶(EcargB)[SEQ ID NO:15]、来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的N-乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶(CgargC)[SEQ ID NO: 16]、来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰基鸟氨酸氨基转移酶(CgargD)[SEQ ID NO: 17]和来自谷氨酸棒状杆菌的鸟氨酸乙酰基转移酶(CgargJ)[SEQID NO: 18]。此外，该模块(I)中还包括两种蛋白的减弱或去除：通过用较弱的启动子P_KEX2交换其天然启动子P_ARG3来减弱酵母天然的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ARG3)[SEQ ID NO:19]，和通过敲除CAR2来去除L-鸟氨酸转氨酶(CAR2)[SEQ ID NO: 20]的活性。

设计以从L-鸟氨酸过量生产Put的腐胺(Put)模块(II)包括两个遗传修饰；来自酿酒酵母的鸟氨酸脱羧酶(SPE1)[SEQ ID NO: 21]的过量表达和天然的鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ1)[SEQ ID NO: 22]的缺失。

设计亚精胺生物合成模块(III)用于从腐胺过量生产亚精胺(Spd)，并且其特点在于来自酿酒酵母的两种蛋白的过量表达：腺苷甲硫氨酸脱羧酶(AdoMetDC；SPE2)[SEQ IDNO: 23]和亚精胺合酶(SpdSyn；SPE3)[SEQ ID NO: 24]。该模块还包括两种天然蛋白的缺失以避免亚精胺消耗或降解：编码精胺合酶的SPE4 [SEQ ID NO: 2]和编码非特异性多胺氧化酶的FMS1 [SEQ ID NO: 25]的缺失。

设计S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)模块(IV)以增加辅因子AdoMet的可达性。这些修饰包括很多蛋白的过量表达：5'-甲硫腺苷磷酸化酶(MEU1)[SEQ ID NO: 26](来自酿酒酵母)、支链氨基酸氨基转移酶(BAT2)[SEQ ID NO: 27](来自酿酒酵母)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APT1)[SEQ ID NO: 28](来自酿酒酵母)、核糖磷酸焦磷酸激酶(PRS5)[SEQ IDNO: 29](来自酿酒酵母)和来自婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)的S-腺苷甲硫氨酸合酶(LiMAT)[SEQ ID NO: 30]。该模块还包括腺嘌呤脱氨酶活性(AAH1)[SEQ ID NO:31]的缺失。

设计多胺流出模块(V)以减轻对细胞的细胞毒性或减轻对多胺生物合成的抑制。该模块包括由TPO5[SEQ ID NO: 32]编码的酵母天然的多胺转运蛋白的过量表达。

最后但重要地，设计另外的亚精胺生物合成模块(VI)用于从腐胺和AdoMet过量生产亚精胺。该模块包括由SPE2-SPE3[SEQ ID NO: 33]编码的AdoMetDC-SpdSyn融合蛋白的过量表达。

该实施例1中的基因的过量表达经由基于CRISPR/cas9系统或传统的遗传标记物的方法，通过染色体整合至作为整合基因座的我们预期没有生长缺陷和活性表达的区域来获得。按照由Mans等人2015开发的方案执行基于CRISPR/cas9的基因组编辑。特别地，包含使Cas9能够组成型表达的具有HIS3标记物的质粒pL-CAS9-HIS的酿酒酵母菌株CEN.PK113-11C为用于所有遗传操作的开始菌株。为了使得能够在所选择的基因座中有效地编辑基因组，构建了多个引导RNA(gRNA)质粒。遗传模块根据重叠延伸PCR (OE-PCR)程序构建为整合盒，所述遗传模块包括遗传部分(即，启动子、终止子、ORF和同源臂)的各种组合。该实施例1中使用以下基因和启动子组合：TPI1p-ORT1-pYX212t、tHXT7p-AGC1-CYC1t、TEF1p-GDH1-DIT1t 、PGK1p-SPE3-pYX212t、TEF1p-SPE1-PRM9t、TDH3p-SPE2-DIT1t、TDH3p-CgargJ-TDH2t、PGK1p--EcargB-ADH1t、TEF1p-CgargC-FBA1t、tHXT7p-CgargD-TPI1t、TPI1p-EcargA-CYC1t、TPI1p-MEU1p-FBA1t、PGK1p-BAT2-CYC1t、TDH3p-APT1-DIT1t、TEF1p-PRS5-PRM9t、TEF1p-LiMAT-PRM9、TDH3p-TPO5-CYC1t、TEF1p-SPE2-SPE3-PRM9t。

所有天然的遗传部分(即天然的启动子、终止子、ORF和同源臂)是使用CEN.PK113-11C基因组DNA作为模板进行PCR扩增的。对于优化的异源基因，使用合成的片段或质粒(从GenScript获得)用于PCR扩增。贯穿整个分子克隆程序使用High-fidelity Phusion DNA聚合酶。通过标准的LiAc/SS DNA/PEG转化方法将盒或质粒引入到酵母中。在合成的不含尿嘧啶完全介质培养基(SC-URA)上选择包含基于URA3的质粒或盒的菌株，所述培养基由6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源基础(YNB)、0.77 g/l不含尿嘧啶的完全补充混合物(CSM-URA)、20g/l葡萄糖和20 g/l琼脂组成。将URA3标记物去除，并在5-氟乳清酸(5'-FOA)平板上选择。此外，基于CRISPR/cas9的系统也用于实践AAH1、SPE4和FMS1的缺失。其他基因敲除实验通过传统的方法进行。本文所使用的所有引物在表1中列出，所有质粒在表2中列出并且所有菌株在表3中列出。

表1-引物

表2-质粒

表3-菌株

使用将深孔规模发酵和高效液相色谱(HPLC)组合的测定以评估所得菌株JQSPD_AA。特别地，所得JQSPD_AA菌株用于多胺的生产的24孔深孔分批发酵在由Verduyn等人1992开发的基本培养基中实行。在0.2的初始OD₆₀₀下用2 ml基本培养基在24孔深孔平板中自24h预培养物接种培养物，并且在300 rpm，30°C下培育120小时。基本培养基包含7.5 g/l(NH₄)₂SO₄、14.4 g/l KH₂PO₄、0.5 g/l MgSO₄∙7H₂O、20 g/l葡萄糖、2 ml/l微量金属和1 ml/l维生素溶液，如果需要，用40 mg/l尿嘧啶、40 mg/l组氨酸补充，pH调节至4.5。样品通过取0.1 ml的液体培养物制备并且经过热水(HW)提取。在该方法中，我们使用在深孔平板的发酵中的基本培养基作为提取背景。将包含0.9 ml的发酵培养基的管在水浴中100°C下预热10 min。然后，将热发酵培养基迅速地倾倒至0.1 ml的液体培养物上；立即涡旋混合物，并且将样品放置于水浴中。30 min后，将每个管放置于冰上5 min。离心后，上清液直接用于衍生化。为了衍生化，将0.125 ml的饱和NaHCO₃溶液和0.25 ml的丹磺酰氯溶液(5 mg/ml在丙酮中)添加至0.25 ml的样品。然后反应混合物在40°C下在黑暗中偶尔摇动(occasionalshaking)孵育1 h。通过添加0.275 ml的甲醇停止反应。通过25 mm针头式滤器(0.45 µmNylon)过滤的样品用于HPLC检测。使用以下色谱条件：C18 (100 mm × 4.6 mm i.d., 2.6µm, Phenomenex Kinetex)，激发波长340 nm，发射波长515 nm，样品注入1.5 µl，柱温40°C，检测器灵敏度7，采集开始于4.0 min。流动相为水和甲醇，其速度为1 ml/min。洗脱程序如下：0-5min 50%至65%甲醇，5-7.5 min 65%至75%甲醇，7.5-9.5 min 75%至87.5%甲醇，9.5-10.5 min 87.5%至100%甲醇，10.5-11.5 min 100%甲醇，11.5-13.5 min 100%至50%甲醇，13.5-16 50% 甲醇。

菌株JQSPD_AA生产的Spd滴度在浓度> 400 mg/l，与如本文所使用的仅有部分的修饰的菌株(见WO 2016/144247和WO 2019/013696中的实施例)相比显著地增加了Spd滴度。

实施例2：酵母中高级多胺的生产

生命已经进化出各式各样的途径来合成多胺的结构变体。事实上，虽然Put和Spd作为常见的多胺典型地发现于大多数细胞中，但不常见的多胺，诸如对称-高亚精胺(Hspd)、热精胺(Tspm)、精胺(Spm)、支链多胺和长链多胺(LCPAs)在自然界中也已被找到。该实施例2通过设计遗传模块(VII)并将其引入到来自实施例1的Spd平台菌株JQSPD_AA中，调查了对称-高亚精胺(Hspd)、热精胺(Tspm)和精胺(Spm)的生物合成。

我们首先着手异源合成三胺Hspd，其存在于植物和细菌两者中。在植物中，Hspd是吡咯里西啶生物碱生物合成中第一个途径特异性的中间体，其由高亚精胺合酶(植物HSS；EC 2.5.1.45)形成。该酶比细菌高亚精胺合酶(细菌HSS；EC 2.5.1.44)更具特异性，因为后者不能使用Put作为氨基丁基基团的供体。为了探索植物HSS和细菌HSS两者用于Hspd微生物生产的可能性，设计以在酵母中生物合成Hspd的遗传子模块(VII-a)和(VII-b)分别编码了春千里光SvHSS和绿色芽生绿菌BvHSS13的表达。子模块作为从GenScipt订购的并且分别包含酵母密码子优化的SvHSS基因[SEQ ID NO: 8]和BvHSS基因[SEQ ID NO: 10]的高拷贝质粒SvHSS_p426GPD和BvHSS_p426GPD引入到Spd平台菌株JQSPD_AA中。转化实验按照与实施例1中相同的程序。用与实施例1中所描述的相同的程序测定所得菌株JQSPD_AA (SvHSS_p426GPD)和JQSPD_AA (BvHSS_p426GPD)的Hspd生产。

我们发现两种HSS的过量表达都使得能够生物合成Hspd。特别地，SvHSS使Hspd滴度能够在40.9 mg/，而BvHSS使Hspd滴度能够在31.1mg/(见图1a和1d)。

随后，我们还通过引入子模块(VII-c)、子模块(VII-d)和子模块(VII-e)，利用Spd平台(实施例1)用于四胺Spm和Tspm的生产。Spm是在所有后生动物中、在有花植物中以及在酵母中发现的最常见的四胺。特异性氨基丙基转移酶，即精胺合酶(SpmSyn；EC 2.5.1.22)负责Spm生物合成。我们首先探索了酵母天然的SpmSyn Spe4p用于Spm过量生产。

当在JQSPD_AA中过量表达作为高拷贝质粒SPE4_p426GPD (子模块(VII-c))的密码子优化的酵母SPE4[SEQ ID NO: 2]时，获得了53.1 mg/l的Spm(见图1c和1f)。我们还通过在JQSPD_AA菌株中过量表达作为高拷贝质粒AtSPMS_p426GPD(子模块(VII-d))的AtSPMS[SEQ ID NO: 4]测试了来自拟南芥的SpmSyn。这造成了Spm的生产(41.8 mg/l；见图1c和1f)。植物ACL5氨基丙基转移酶(TspmSyn；EC 2.5.1.79)(来自拟南芥)被证明合成Spm的异构体Tspm。因此我们还在JQSPD_AA菌株中过量表达作为高拷贝质粒AtACL5_p426GPD (子模块(VII-e))的AtACL5[SEQ ID NO: 6]。该策略使得能够生产43.8 mg/l的Tspm (见图1b和1e)。所有包含酵母密码子优化的基因的质粒购买自GenScript。在该实施例2中使用了与实施例1中所使用的相同的转化和产物测定。所有质粒在表2中列出并且所有菌株在表3中列出。

图3a说明用于酵母中亚精胺和高级多胺的生物合成的工程化途径。

实施例3：酵母中锥虫胱甘肽的生物合成

酰胺键无疑是自然界中最重要的结构基序之一。大约四分之一的所有市售药物和三分之二的所有药物候选物都携带至少一个酰胺键，并且胺的酰基化是制药工业中实践最广泛的反应之一。多胺存在独特的骨架以连接其他部分，并且经常被并入到特化代谢中，导致具有复杂结构的多样的包含酰胺键的天然产物的生物合成。例如，锥虫胱甘肽(N ¹ ,N ¹⁰-双(谷胱甘酰基)亚精胺)，T(SH)₂)是短膜虫属(Crithidia)、锥虫属(Trypanosoma)和利什曼原虫属(Leishmania)的锥虫(trypanosomatid)中主要的低分子量硫醇，后两者的属包含威胁生命的疾病或致残疾病(诸如非洲昏睡病、黑热病、恰加斯病(Chagas’ disease)和美洲利什曼病或东方疖)的病原体。同时，在植物中可以合成丰富的含有多胺的羟基肉桂酰胺，已假定其涉及花、花粉和种子的发育以及病原体抗性。然而，从传统的合成化学或自天然来源的提取均难以获得它们。首先，这些多胺缀合物在自然界中表现出低丰度(Li等人2018)。另一方面，多年来建立用于直接酰胺化反应的有效催化系统仍然是有机化学中难以解决的挑战(Wang 2019)。在该实施例3中，我们通过引入模块(VIII)在多胺缀合物的生物合成中利用了来自实施例1的多胺平台。

我们首先着手酵母中[T(SH)₂]的异源生物合成。[T(SH)₂]是致病的锥虫中主要的氧化还原介体，其在法式短膜虫(Crithidia fasciculate)中由两个相异的酶(即谷胱甘酰基亚精胺合酶(GspS；EC 6.3.1.8)和锥虫胱甘肽合酶(TryS；EC 6.3.1.9))从谷胱甘肽(GSH)和亚精胺(Spd)逐步合成，然而在布氏锥虫指名亚种中两个步骤都由罕见的具有宽广的底物特异性的TryS (EC 6.3.1.9)催化。为了探索TbbTryS用于[T(SH)₂]微生物生产，设计以在酵母中合成[T(SH)₂]的遗传子模块(VIII-a)编码布氏锥虫指名亚种TryS(TbbTryS)的表达。子模块作为从GenScript订购的包含酵母密码子优化的TbbTryS基因[SEQ ID NO: 35]的高拷贝质粒TbbTryS_p426GPD引入至Spd平台菌株JQSPD_AA。按照与实施例1中所描述的相同的程序构建转化实验。所得菌株JQSPD_AA (TbbTryS _p426GPD)用于与实施例1中所描述的相同的程序的基于24孔深孔的发酵。通过取0.1 ml的液体培养物制备发酵样品。发酵样品经过热水(HW)提取，在我们的方法中我们使用发酵培养基提取。将包含0.9 ml的发酵培养基的管在水浴中100°C下预热10 min。然后，将热发酵培养基迅速地倾倒至0.1 ml的液体培养物上；立即涡旋混合物，并且将样品放置于水浴中。30 min后，将每个管放置于冰上5 min。离心后，上清液直接用于检测。

多胺缀合物的检测通过在连接到Orbitrap Fusion Mass Spectrometer (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA)的Dionex UltiMate 3000 UHPLC (FisherScientific, San Jose, CA)上的液相色谱-质谱(LC-MS)测量来进行。该系统使用保持在35°C下的Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 2.1 x 100 mm, 1.8 µm柱。流速为0.350mL/min，用0.1%甲酸(A)和在乙腈中的0.1%甲酸(B)作为流动相。梯度开始为5% B 1min并且然后接着线性梯度至95% B直到5 min。该溶剂组合物持续1.5 min，其后将它改变至5% B并且持续直到8 min。样品(5 µl)传递至装备有正离子或正离子模式的加热电喷雾离子化源(HESI)的MS，其中鞘气设置为50(a.u.)，辅助气设置为10(a.u.)并且吹扫气设置为1(a.u.)。锥温和探针温度分别为325°C和380°C，并且喷雾电压为3500 V。扫描范围为80 Da至500 Da并且扫描之间的时间为50 ms。符合TbbTrs催化两个GSH部分到亚精胺上的性质，该酶在来自实施例1的Spd平台JQSPD_AA中的过量表达造成了[T(SH)₂]的生产。特别地，检测到m/z值对应于722.2977[M + H]⁺或361.6524[M + H]²⁺的新的单个LC-MS峰，指示[T(SH)₂]的存在(见图2a和2b)。所有质粒在表2中列出并且所有菌株在表3中列出。

图3b说明用于酵母中谷胱甘肽-多胺缀合物的生物合成的工程化途径。

以上所述的实施方案应理解为本发明的一些说明性示例。本领域的技术人员将理解可以在不背离本发明范围的情况下对实施方案进行各种修饰、组合和改变。特别地，在技术上可能的情况下，可以将不同实施方案中的不同部分技术方案合并成其他配置。然而，本发明的范围由所附权利要求定义。

参考文献

Bienz, S., Detterbeck R., Ensch C., Guggisberg A., Häusermann U.,Meisterhans C., Wendt B., Werner C. & Hesse M. Putrescine, spermidine,spermine, and related polyamine alkaloids. Alkaloids Chem Biol. 58, 83-338(2002).

Kim, S.-K., Jin, Y.-S., Choi, I.-G., Park, Y.-C. & Seo, J.-H.Enhanced tolerance of Saccharomyces cerevisiae to multiple lignocellulose-derived inhibitors through modulation of spermidine contents. MetabolicEngineering 29, 46-55, doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2015.02.004(2015).

Li, S., Li, Y. & Smolke, C. D. Strategies for microbial synthesis ofhigh-value phytochemicals. Nat Chem 10, 395-404, doi:10.1038/s41557-018-0013-z (2018).

Mans, R., van Rossum, H. M., Wijsman, M., Backx, A., Kuijpers, N. G.,van den Broek, M., Daran-Lapujade, P., Pronk, J. T., van Maris, A. J. &Daran, J. M. CRISPR/Cas9: a molecular Swiss army knife for simultaneousintroduction of multiple genetic modifications in Saccharomyces cerevisiae.FEMS Yeast Res. 15, fov004-fov004, doi:10.1093/femsyr/fov004 (2015).

Michael, A. J. Polyamines in Eukaryotes, Bacteria, and Archaea. J.Biol. Chem. 291, 14896-14903, doi:10.1074/jbc.R116.734780 (2016).

Nielsen, J. Yeast cell factories on the horizon. Science 349, 1050-1051, doi:10.1126/science.aad2081 (2015).

Nielsen, J. Cell factory engineering for improved production ofnatural products. Natural Product Reports, doi:10.1039/C9NP00005D (2019).

Nielsen, J. & Keasling, Jay D. Engineering Cellular Metabolism. Cell164, 1185-1197, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.02.004 (2016).

Ober, D. & Hartmann, T. Homospermidine synthase, the first pathway-specific enzyme of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis, evolved fromdeoxyhypusine synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences 96,14777-14782, doi:10.1073/pnas.96.26.14777 (1999).

Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, W.A., Van Dijken, J.P. Effect ofbenzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: A continuous-culture study on theregulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast 8, 501–517, doi:10.1002/yea.320080703 (1992).

Wang, X. Challenges and outlook for catalytic direct amidationreactions. Nature Catalysis 2, 98-102, doi:10.1038/s41929-018-0215-1 (2019).

Yu, T. Zhou, Y. J., Huang, M., Liu, Q., Pereira, R., David, F., &Nielsen, J. Reprogramming Yeast Metabolism from Alcoholic Fermentation toLipogenesis. Cell 174, 1549-1558. e1514, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.07.013 (2018).

Zhou, Y. J., Buijs, N. A., Zhu, Z., Qin, J., Siewers, V. & Nielsen,J. Production of fatty acid-derived oleochemicals and biofuels by syntheticyeast cell factories. Nat. Commun 7, 11709, doi:10.1038/ncomms11709, https://www.nature.com/articles/ncomms11709#supplementary-information (2016)。

<110> Chrysea Limited

<120> 生产多胺缀合物的酵母

<130> HSJ103132P.WOP

<150> SE 1951232-6

<151> 2019-10-28

<160> 260

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

Met Val Asn Asn Ser Gln His Ser Tyr Ile Lys Asp Gly Trp Phe Arg

1 5 10 15

Glu Ile Asn Asp Lys Ser Phe Pro Gly Gln Ala Phe Thr Met Thr Val

20 25 30

Asp Ser Ile Leu Tyr Glu Ala Arg Ser Glu Phe Gln Asp Ile Leu Ile

35 40 45

Phe Arg Asn Lys Val Tyr Gly Thr Val Leu Val Leu Asp Gly Ile Val

50 55 60

Gln Cys Thr Glu Phe Asp Glu Phe Ala Tyr Gln Glu Met Ile Thr His

65 70 75 80

Ile Ala Met Phe Ala His Ser Asn Pro Lys Arg Val Leu Ile Ile Gly

85 90 95

Gly Gly Asp Gly Gly Val Leu Arg Glu Val Ala Lys His Ser Cys Val

100 105 110

Glu Asp Ile Thr Met Val Glu Ile Asp Ser Ser Val Ile Glu Leu Ser

115 120 125

Arg Lys Phe Leu Pro Thr Leu Ser Asn Gly Ala Phe Asp Asp Glu Arg

130 135 140

Leu Asp Leu Lys Leu Cys Asp Gly Phe Lys Phe Leu Gln Asp Ile Gly

145 150 155 160

Ala Ser Asp Val His Lys Lys Phe Asp Val Ile Ile Thr Asp Ser Ser

165 170 175

Asp Pro Glu Gly Pro Ala Glu Ala Phe Phe Gln Glu Arg Tyr Phe Glu

180 185 190

Leu Leu Lys Asp Ala Leu Asn Pro Asn Gly Val Val Ile Met Gln Ser

195 200 205

Ser Glu Asn Phe Trp Leu Asn Leu Lys Tyr Leu His Asp Leu Lys Asn

210 215 220

Thr Ala Lys Lys Val Phe Pro Asn Thr Glu Tyr Cys Tyr Thr Met Val

225 230 235 240

Pro Thr Tyr Thr Ser Gly Gln Leu Gly Leu Ile Val Cys Ser Asn Asn

245 250 255

Ala Asn Ile Pro Leu Asn Ile Pro Gln Arg Lys Ile Ser Glu Gln Glu

260 265 270

Gln Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Asn Pro Gln Ile His Ser Ser Ala Phe

275 280 285

Val Leu Pro Thr Trp Ala Asp Lys Val Ile Asn Glu

290 295 300

<210> 2

<211> 904

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 2

atggttaaca actctcaaca tccatacatc aaggatggtt ggttcagaga aattaatgat 60

aagtcattcc caggtcaagc ttttactatg acagttgatt ctatcttgta cgaagcaaga 120

tcagaatttc aagatatctt gatttttaga aataaggttt acggtactgt tttggttttg 180

gatggtatcg ttcaatgtac agaatttgat gaatttgctt accaagaaat gatcactcat 240

atcgctatgt tcgcacattc taacccaaaa agagttttga tcattggtgg tggtgacggt 300

ggtgttttga gagaagttgc aaagcattca tgtgttgaag atatcactat ggttgaaatc 360

gattcttcag ttattgaatt gtctagaaag ttcttaccaa cattgtcaaa tggtgctttc 420

gatgatgaaa gattggattt gaagttgtgt gatggtttta aattcttgca agatatcggt 480

gcatctgatg ttcataagaa attcgatgtt atcatcactg attcttcaga tccagaaggt 540

ccagctgaag ctttctttca agaaagatac ttcgaattgt tgaaggatgc tttgaaccca 600

aacggtgttg ttattatgca atcttcagaa aacttctggt tgaatttgaa gtatttgcat 660

gatttgaaaa atacagctaa gaaagttttc ccaaacactg aatactgtta cacaatggtt 720

ccaacttaca catctggtca attaggtttg atcgtttgtt caaacaacgc taacatccca 780

ttgaacatcc cacaaagaaa aatttctgaa caagaacagg gtaaattgaa gtactacaac 840

ccacaaatcc attcttcagc ttttgttttg ccaacatggg cagataaagt tattaatgaa 900

taag 904

<210> 3

<211> 359

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

Met Glu Gly Asp Val Gly Lys Gly Leu Val Cys Gln Asn Thr Met Asp

1 5 10 15

Gly Lys Ala Ser Asn Gly Asn Gly Leu Glu Lys Thr Val Pro Ser Cys

20 25 30

Cys Leu Lys Ala Met Ala Cys Val Pro Glu Asp Asp Ala Lys Cys His

35 40 45

Ser Thr Val Val Ser Gly Trp Phe Ser Glu Pro His Pro Arg Ser Gly

50 55 60

Lys Lys Gly Gly Lys Ala Val Tyr Phe Asn Asn Pro Met Trp Pro Gly

65 70 75 80

Glu Ala His Ser Leu Lys Val Glu Lys Val Leu Phe Lys Asp Lys Ser

85 90 95

Asp Phe Gln Glu Val Leu Val Phe Glu Ser Ala Thr Tyr Gly Lys Val

100 105 110

Leu Val Leu Asp Gly Ile Val Gln Leu Thr Glu Lys Asp Glu Cys Ala

115 120 125

Tyr Gln Glu Met Ile Ala His Leu Pro Leu Cys Ser Ile Ser Ser Pro

130 135 140

Lys Asn Val Leu Val Val Gly Gly Gly Asp Gly Gly Val Leu Arg Glu

145 150 155 160

Ile Ser Arg His Ser Ser Val Glu Val Ile Asp Ile Cys Glu Ile Asp

165 170 175

Lys Met Val Ile Asp Val Ser Lys Lys Phe Phe Pro Glu Leu Ala Val

180 185 190

Gly Phe Asp Asp Pro Arg Val Gln Leu His Ile Gly Asp Ala Ala Glu

195 200 205

Phe Leu Arg Lys Ser Pro Glu Gly Lys Tyr Asp Ala Ile Ile Val Asp

210 215 220

Ser Ser Asp Pro Val Gly Pro Ala Leu Ala Leu Val Glu Lys Pro Phe

225 230 235 240

Phe Glu Thr Leu Ala Arg Ala Leu Lys Pro Gly Gly Val Leu Cys Asn

245 250 255

Met Ala Glu Ser Met Trp Leu His Thr His Leu Ile Glu Asp Met Ile

260 265 270

Ser Ile Cys Arg Gln Thr Phe Lys Ser Val His Tyr Ala Trp Ser Ser

275 280 285

Val Pro Thr Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Phe Val Leu Cys Ser Thr

290 295 300

Glu Gly Pro Ala Val Asp Phe Lys Asn Pro Ile Asn Pro Ile Glu Lys

305 310 315 320

Leu Asp Gly Ala Met Thr His Lys Arg Glu Leu Lys Phe Tyr Asn Ser

325 330 335

Asp Met His Arg Ala Ala Phe Ala Leu Pro Thr Phe Leu Arg Arg Glu

340 345 350

Val Ala Ser Leu Leu Ala Ser

355

<210> 4

<211> 1080

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 4

atggaaggtg acgttggtaa aggtttggtt tgtcaaaata ctatggatgg taaagcttca 60

aatggtaatg gtttggaaaa gactgttcca tcttgttgtt taaaagctat ggcatgtgtt 120

ccagaagatg atgcaaaatg tcattctact gttgtttcag gttggttttc tgaaccacat 180

ccaagatcag gtaaaaaggg tggtaaagct gtttacttca acaacccaat gtggccaggt 240

gaagcacatt ctttgaaggt tgaaaaggtt ttgtttaaag acaagtcaga ttttcaagaa 300

gttttggttt tcgaatctgc tacttacggt aaagttttgg ttttggatgg tatcgttcaa 360

ttgacagaaa aggatgaatg tgcttaccaa gaaatgattg cacatttgcc attgtgttct 420

atctcttcac ctaaaaatgt tttggttgtt ggtggtggtg acggtggtgt tttgagagaa 480

atctcaagac attcttcagt tgaagttatt gatatctgtg aaatcgataa gatggttatt 540

gatgtttcta agaaattttt cccagaatta gctgttggtt ttgatgatcc aagagttcaa 600

ttgcatattg gtgacgctgc agaatttttg agaaagtcac cagagggtaa atacgatgca 660

atcatcgttg attcttcaga tccagttggt ccagctttgg cattggttga aaagccattt 720

ttcgaaacat tggctagagc attaaaacca ggtggtgttt tgtgtaatat ggctgaatct 780

atgtggttgc atactcattt gatcgaagat atgatctcaa tctgtagaca aacttttaaa 840

tctgttcatt acgcatggtc ttcagttcca acttacccat caggtgttat tggtttcgtt 900

ttgtgttcta cagaaggtcc agctgttgat ttcaagaacc caattaatcc aatcgaaaaa 960

ttggatggtg caatgactca taagagagaa ttgaagttct acaattctga tatgcataga 1020

gctgcatttg ctttgccaac atttttaaga agagaagttg cttcattgtt agcatcttaa 1080

<210> 5

<211> 339

<212> PRT

<213> 拟南芥

<400> 5

Met Gly Glu Ala Val Glu Val Met Phe Gly Asn Gly Phe Pro Glu Ile

1 5 10 15

His Lys Ala Thr Ser Pro Thr Gln Thr Leu His Ser Asn Gln Gln Asp

20 25 30

Cys His Trp Tyr Glu Glu Thr Ile Asp Asp Asp Leu Lys Trp Ser Phe

35 40 45

Ala Leu Asn Ser Val Leu His Gln Gly Thr Ser Glu Tyr Gln Asp Ile

50 55 60

Ala Leu Leu Asp Thr Lys Arg Phe Gly Lys Val Leu Val Ile Asp Gly

65 70 75 80

Lys Met Gln Ser Ala Glu Arg Asp Glu Phe Ile Tyr His Glu Cys Leu

85 90 95

Ile His Pro Ala Leu Leu Phe His Pro Asn Pro Lys Thr Val Phe Ile

100 105 110

Met Gly Gly Gly Glu Gly Ser Ala Ala Arg Glu Ile Leu Lys His Thr

115 120 125

Thr Ile Glu Lys Val Val Met Cys Asp Ile Asp Gln Glu Val Val Asp

130 135 140

Phe Cys Arg Arg Phe Leu Thr Val Asn Ser Asp Ala Phe Cys Asn Lys

145 150 155 160

Lys Leu Glu Leu Val Ile Lys Asp Ala Lys Ala Glu Leu Glu Lys Arg

165 170 175

Glu Glu Lys Phe Asp Ile Ile Val Gly Asp Leu Ala Asp Pro Val Glu

180 185 190

Gly Gly Pro Cys Tyr Gln Leu Tyr Thr Lys Ser Phe Tyr Gln Asn Ile

195 200 205

Leu Lys Pro Lys Leu Ser Pro Asn Gly Ile Phe Val Thr Gln Ala Gly

210 215 220

Pro Ala Gly Ile Phe Thr His Lys Glu Val Phe Thr Ser Ile Tyr Asn

225 230 235 240

Thr Met Lys Gln Val Phe Lys Tyr Val Lys Ala Tyr Thr Ala His Val

245 250 255

Pro Ser Phe Ala Asp Thr Trp Gly Trp Val Met Ala Ser Asp His Glu

260 265 270

Phe Asp Val Glu Val Asp Glu Met Asp Arg Arg Ile Glu Glu Arg Val

275 280 285

Asn Gly Glu Leu Met Tyr Leu Asn Ala Pro Ser Phe Val Ser Ala Ala

290 295 300

Thr Leu Asn Lys Thr Ile Ser Leu Ala Leu Glu Lys Glu Thr Glu Val

305 310 315 320

Tyr Ser Glu Glu Asn Ala Arg Phe Ile His Gly His Gly Val Ala Tyr

325 330 335

Arg His Ile

<210> 6

<211> 1020

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 6

atgggtgaag cagtagaagt aatgttcggt aacggtttcc cagaaatctt aaaagccaca 60

agtccaactc aaaccttgca ctccaatcaa caagattgtc attggtacga agaaactatc 120

gatgatgatt tgaagtggtc tttcgcttta aattctgttt tgcatcaagg tacttctgaa 180

taccaagata tcgcattgtt ggatacaaag agattcggta aagttttggt tattgatggt 240

aaaatgcaat cagctgaaag agatgagttt atatatcatg aatgtttgat ccatccagca 300

ttgttgttcc atccaaaccc aaagactgtt tttattatgg gtggtggtga aggttctgct 360

gcaagagaaa tcttgaagca tactacaatc gaaaaagttg ttatgtgtga tatcgatcaa 420

gaagttgttg atttctgtag aagatttttg acagttaatt cagatgcttt ctgtaataag 480

aaattggaat tagttattaa agatgctaag gcagaattgg aaaagagaga agaaaagttc 540

gatattattg ttggtgactt ggctgatcca gttgaaggtg gtccatgtta tcaattgtac 600

actaagtctt tctaccaaaa cattttgaaa ccaaaattat caccaaatgg tatttttgtt 660

actcaagctg gtccagcagg tatttttaca cataaagaag tttttacttc tatctataac 720

acaatgaagc aagtttttaa atacgttaaa gcttacactg cacatgttcc atcttttgct 780

gatacatggg gttgggttat ggcatcagat catgaatttg atgttgaagt tgatgaaatg 840

gatagaagaa tcgaagaaag agttaacggt gaattgatgt acttaaatgc tccatctttt 900

gtttcagctg caactttgaa taagacaatc tcattggcat tggaaaagga aacagaagtt 960

tactccgaag aaaatgctag attcatccac ggtcacggtg ttgcctacag acatatctaa 1020

<210> 7

<211> 370

<212> PRT

<213> 春千里光(Senecio vernalis)

<400> 7

Met Ala Glu Ser Asn Lys Glu Ala Ile Asp Ser Ala Arg Ser Asn Val

1 5 10 15

Phe Lys Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Thr Cys Ala Lys Ile Gly Gly

20 25 30

Tyr Asp Phe Asn Asn Gly Ile Asp His Ser Lys Leu Leu Lys Ser Met

35 40 45

Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Met Ile Ile

50 55 60

Thr Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Ser His Asp Glu Val Pro Glu

65 70 75 80

Asn Cys Ser Glu Glu Glu Lys Lys Asn Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys

85 90 95

Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly Val Arg Glu

100 105 110

Thr Ile Cys Tyr Leu Thr Gln His Arg Met Val Asp Val Leu Val Thr

115 120 125

Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Phe Ile Lys Cys Leu Ala Ser Thr

130 135 140

Tyr Lys Gly Lys Phe Ser Leu Pro Gly Ala Asp Leu Arg Ser Lys Gly

145 150 155 160

Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Ile Val Pro Asn Asp Asn Tyr Ile Lys

165 170 175

Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Gln Met Leu Ile Glu Gln

180 185 190

Lys Thr Gln Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Arg Met Ile Ala Arg Leu

195 200 205

Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Thr Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys

210 215 220

Asn Asn Ile Pro Val Phe Cys Pro Ser Ile Thr Asp Gly Ser Ile Gly

225 230 235 240

Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Val Ser Asn Pro Gly Pro Gly Leu Val

245 250 255

Val Asp Ile Val Gln Asp Val Ile Ala Met Asp Asn Glu Ala Val His

260 265 270

Ala Ser Pro Gln Lys Thr Gly Ile Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro

275 280 285

Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Phe

290 295 300

Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Gln Glu Tyr Asp Gly Ser Asp Ser Gly

305 310 315 320

Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Ser Ser Thr Gly

325 330 335

Lys Ala Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu

340 345 350

Val Ala Glu Thr Phe Ala Val Lys Lys Glu Lys Ala Ser Lys Val Asn

355 360 365

Gly Phe

370

<210> 8

<211> 1113

<212> DNA

<213> 春千里光

<400> 8

atggctgaat ctaataagga agctatcgat tctgcaagat caaacgtttt taaagaatct 60

gaatcattag aaggtacatg tgcaaagatc ggtggttacg atttcaacaa cggtatcgat 120

cattcaaagt tgttgaagtc tatggtttca acaggtttcc aagcttctaa tttgggtgac 180

gcaatgatca tcactaacca aatgttggat tggagattat ctcatgatga agttccagaa 240

aactgttcag aagaagaaaa gaaaaataga gaatctgtta agtgtaagat tttcttgggt 300

tttacatcaa atttgatctc ttcaggtgtt agagaaacaa tctgttattt gactcaacat 360

agaatggttg atgttttggt tactacaact ggtggtatcg aagaagattt catcaagtgt 420

ttagcttcta cttacaaggg taaattttca ttgccaggtg cagatttgag atctaagggt 480

ttgaacagaa ttggtaattt gatcgttcca aacgataact acatcaagtt cgaagattgg 540

attattccaa tttttgatca aatgttaatt gaacaaaaga ctcaaaatgt tttgtggact 600

ccatcaagaa tgattgctag attgggtaaa gaaattaata acgaaacatc ttatttgtac 660

tgggcataca agaacaacat cccagttttc tgtccatcta ttactgatgg ttcaattggt 720

gacatgttgt acttccattc tgtttcaaac ccaggtccag gtttggttgt tgatatcgtt 780

caagatgtta tcgctatgga taatgaagct gttcatgcat ctccacaaaa gactggtatc 840

atcatcttgg gtggtggttt accaaagcat catatctgta acgctaacat gatgagaaac 900

ggtgctgatt tcgcagtttt tattaacaca gcacaagaat acgatggttc tgattcaggt 960

gctagaccag atgaagcagt ttcatggggt aaaatctctt caactggtaa agctgttaaa 1020

gttcattgtg atgctacaat tgcatttcca ttgttagttg ctgaaacttt cgcagttaag 1080

aaagaaaagg cttctaaagt taatggtttt taa 1113

<210> 9

<211> 280

<212> PRT

<213> 绿色芽生绿菌(Blastochloris viridis)

<400> 9

Met Thr Asp Trp Pro Val Tyr His Arg Ile Asp Gly Pro Ile Val Met

1 5 10 15

Ile Gly Phe Gly Ser Ile Gly Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ile Glu Arg

20 25 30

His Phe Ala Phe Asp Arg Ser Lys Leu Val Val Ile Asp Pro Ser Asp

35 40 45

Glu Ala Arg Lys Leu Ala Glu Ala Arg Gly Val Arg Phe Ile Gln Gln

50 55 60

Ala Val Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Asp Leu Leu Val Pro Leu Leu Thr

65 70 75 80

Ala Gly Pro Gly Gln Gly Phe Cys Val Asn Leu Ser Val Asp Thr Ser

85 90 95

Ser Leu Asp Ile Met Glu Leu Ala Arg Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Ile

100 105 110

Asp Thr Val Val Glu Pro Trp Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Pro Asp Leu

115 120 125

Lys Pro Glu Ala Arg Ser Asn Tyr Ala Leu Arg Glu Thr Val Leu Ala

130 135 140

Ala Arg Arg Asn Lys Pro Gly Gly Thr Thr Ala Val Ser Cys Cys Gly

145 150 155 160

Ala Asn Pro Gly Met Val Ser Trp Phe Val Lys Gln Ala Leu Val Asn

165 170 175

Leu Ala Ala Asp Leu Gly Val Thr Arg Glu Glu Pro Thr Thr Arg Glu

180 185 190

Glu Trp Ala Arg Leu Ala Met Asp Leu Gly Val Lys Gly Ile His Ile

195 200 205

Ala Glu Arg Asp Thr Gln Arg Ala Asn Phe Pro Lys Pro Phe Asp Val

210 215 220

Phe Val Asn Thr Trp Ser Val Glu Gly Phe Val Ser Glu Gly Leu Gln

225 230 235 240

Pro Ala Glu Leu Gly Trp Gly Thr Phe Glu Arg Trp Met Pro Asp Asn

245 250 255

Ala Arg Gly His Asp Ser Gly Cys Gly Ala Gly Ile Tyr Leu Leu Gln

260 265 270

Pro Gly Ala Asn Thr Arg Val Arg

275 280

<210> 10

<211> 1434

<212> DNA

<213> 绿色芽生绿菌

<400> 10

atgacagatt ggccagttta ccatagaatc gatggtccaa tcgttatgat tggttttggt 60

tctattggta gaggtacttt gccattgatc gaaagacatt tcgcattcga tagatctaag 120

ttggttgtta ttgatccatc agatgaagct agaaaattgg ctgaagcaag aggtgttaga 180

ttcattcaac aagcagttac aagagataac tacagagatt tgttggttcc attgttaact 240

gctggtccag gtcaaggttt ctgtgttaat ttgtctgttg atacatcttc attggatatc 300

atggaattgg ctagagaaaa tggtgcattg tatattgata ctgttgttga accatggttg 360

ggtttctact tcgatccaga tttgaagcca gaagctagat caaactacgc attgagagaa 420

acagttttag ctgcaagaag aaataagcca ggtggtacta cagctgtttc ttgttgtggt 480

gcaaatcctg gtatggtttc atggttcgtt aagcaagctt tggttaattt ggctgcagat 540

ttgggtgtta ctagagaaga accaactaca agagaagaat gggctagatt ggcaatggat 600

ttgggtgtta agggtattca tatcgctgaa agagatacac aaagagcaaa cttcccaaag 660

ccattcgatg ttttcgttaa cacttggtct gttgaaggtt ttgtttcaga aggtttgcaa 720

ccagctgaat taggttgggg tacatttgaa agatggatgc cagataatgc tagaggtcat 780

gattctggtt gtggtgcagg tatatatttg ttacaaccag gtgctaatac tagagttaga 840

tcatggactc caacagctac tgcacaatac ggtttcttgg ttacacataa cgaatctatc 900

tcaatcgcag atttcttgac tgttagagat gctgcaggtc aagctgttta tagaccaaca 960

tgtcattatg cttaccatcc atgtaacgat gcagttttgt ctttgcatga aatgtttggt 1020

tctggtaaaa gacaatcaga ttggttgatc ttggatgaaa ctgaaatcgt tgatggtatc 1080

gatgaattgg gtgttttgtt gtacggtcat ggtaaaaatg cttattggta cggttctcaa 1140

ttgtcaatcg aagaaacaag aagaattgct ccagatcaaa atgcaactgg tttgcaagtt 1200

tcttcagctg ttttagctgg tatggtttgg gctttggaaa atccaaaagc tggtattgtt 1260

gaagcagatg atttggatta cagaagatgt ttggaagttc aaacaccata tttgggtcca 1320

gttgttggtg tttacacaga ttggactcca ttggcaggta gaccaggttt atttccagaa 1380

gatattgatg cttcagatcc atggcaattc agaaatgttt tggttagaga ttaa 1434

<210> 11

<211> 1365

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 11

atgtcagagc cagaatttca acaagcttac gaagaagttg tctcctcttt ggaagactct 60

actcttttcg aacaacaccc agaatacaga aaggttttgc caattgtttc tgttccagaa 120

agaatcatac aattcagagt cacctgggaa aatgacaagg gtgaacaaga agttgctcaa 180

ggttacagag tgcaatataa ctccgccaag ggtccataca agggtggtct acgtttccat 240

ccttccgtga acttgtctat cttgaaattc ttgggtttcg aacaaatctt caagaactcc 300

ttgaccggcc tagacatggg tggtggtaaa ggtggtctat gtgtggactt gaagggaaga 360

tctaataacg aaatcagaag aatctgttat gctttcatga gagaattgag cagacacatt 420

ggtcaagaca ctgacgtgcc agctggtgat atcggtgttg gtggtcgtga aattggttac 480

ctgttcggtg cttacagatc atacaagaac tcctgggaag gtgtcttaac cggtaagggt 540

ttgaactggg gtggttcttt gatcagacca gaagccactg gttacggttt agtttactat 600

actcaagcta tgatcgacta tgccacaaac ggtaaggaat ctttcgaagg taagcgcgtc 660

accatctctg gtagtggtaa cgttgctcaa tacgctgcct tgaaggttat tgagctaggt 720

ggtactgtcg tttccctatc tgactccaag ggttgtatca tctctgaaac tggtatcacc 780

tccgaacaag tcgctgatat ttccagtgct aaggtcaact tcaagtcctt ggaacaaatc 840

gtcaacgaat actctacttt ctccgaaaac aaagtgcaat acattgctgg tgctcgtcca 900

tggacccacg tccaaaaggt cgacattgct ttgccatgtg ccacccaaaa tgaagtcagc 960

ggtgaagaag ccaaggcctt ggttgctcaa ggtgtcaagt ttattgccga aggttccaac 1020

atgggttcca ctccagaagc tattgccgtc tttgaaactg ctcgttccac cgccactgga 1080

ccaagcgaag ctgtttggta cggtccacca aaggctgcta acttgggtgg tgttgctgtt 1140

tctggtttag aaatggcaca aaactctcaa agaatcacat ggactagcga aagagttgac 1200

caagagttga agagaattat gatcaactgt ttcaatgaat gtatcgacta tgccaagaag 1260

tacactaagg acggtaaggt cttgccatct ttggtcaaag gtgctaatat cgcaagtttc 1320

atcaaggtct ctgatgctat gtttgaccaa ggtgatgtat tttaa 1365

<210> 12

<211> 2709

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 12

atggagcaaa tcaattcgaa cagtagaaaa aagaagcaac aattggaagt attcaaatat 60

tttgcaagtg tccttacaaa agaggacaag cctattagta tcagtaatgg tatgttagat 120

atgccgacag tgaactccag taaactcaca gcaggaaatg ggaaacctga cacggagaag 180

cttacaggag aactaatttt aacatacgac gatttcattg aactgatatc tagctcaaag 240

actatttatt cgaagtttac ggaccattcg ttcaatttga accagatacc caagaacgtt 300

ttcgggtgta ttttcttcgc tattgatgaa caaaacaagg gatatctgac gcttaatgat 360

tggttttatt ttaataattt attagaatat gataattatc atctcattat tctatatgag 420

ttctttagga aatttgatgt agagaatttg aaggcaaaac aaaaaaaaga gcttggtagt 480

tcgtcgttta atttaaaggc tgcagatgat cgaattaagt caattaatta tggtaacaga 540

tttctaagct ttgatgatct tcttttgaat ctgaaccaat tcaaagatac tatccgcctg 600

ttgcacgaat ctattgatga taattttgtt aaagataaca aattactact tgattggaat 660

gactttcgat ttctgaaatt ttacaaatgt tatcatgaaa atgaagagta tttgagttta 720

aactctctgg tcacgatttt acaaaatgat cttaagaatg aaaaaatatt tataggtttt 780

gataggttgg cacagatgga ctcacaaggg catcgtttag ccctaagcaa aaatcaactc 840

acctatcttc taaggttatt ttactctcac agggtgtctg cagatatatt ttcctccttg 900

aatctatcaa acaccgaatt actaaaagcg gacaataatt ccattccgta caatgtattc 960

aaggatatat tttatttatt tcaaaatttt gacctactga accaaatatt tcacaagtat 1020

gttactgaaa ataatttgaa tgagcaggat attagggaac aaatagttac taaaaatgac 1080

tttatgacag ttttaaacgc ccagtataac aaagtaaaca atatcattga gttctctcct 1140

tcccaaatca acctactatt ttctatcgtc gcaaattcaa aggaaaacag aagattaaga 1200

aagagaaatc aagatcgaga tgacgagcta ttaaatgatc accattatga ttcagatatt 1260

gattttttta tccataatga gtatttgcat ggagtaagca gatccagaaa aaatttagaa 1320

agttttaatg actattatca tgatctctcg gatggatttg accaagactc tggtgttaaa 1380

aaagcttcaa aagcgagtac tggcttgttt gaatctgtat ttggaggtaa aaaagataaa 1440

gcaacgatgc gttctgactt aacaattgaa gatttcatga aaattttgaa cccaaattac 1500

ctgaacgact tagttcacca aatggaattg caaaaaaatc aaaatgagtc attgtatatt 1560

aattactact tttatccaat tttcgattcg ttgtacaatt tctccttggg ttctattgcg 1620

ggttgtattg gtgcaactgt agtataccca atagacttta taaaaacaag gatgcaagcc 1680

caaagatctt tagcccaata caaaaactca attgattgtt tgttgaagat tatatcccgc 1740

gaaggaataa aaggtctcta ctctggctta gggccacaat taataggagt tgctcctgaa 1800

aaggcgataa aattgactgt caatgatttt atgagaaaca ggttgactga taaaaacggc 1860

aagctaagcc tttttcctga aattatttct ggcgcttcag ctggtgcatg tcaagttata 1920

tttactaatc cgttagagat tgtaaaaatt aggctacagg tccaatccga ctatgttggt 1980

gaaaacatac aacaagccaa tgaaactgcc actcaaatag tcaaaaaatt aggactgagg 2040

ggcttgtaca atggtgtagc cgcatgttta atgagagatg ttccattctc tgctatttat 2100

tttcccactt atgcacattt aaaaaaagat ctctttgatt ttgatccaaa tgataaaaca 2160

aagaggaatc gattaaaaac atgggagctt ttaactgccg gtgccattgc tggtatgcca 2220

gctgccttct tgactactcc ttttgatgtt ataaaaacaa ggctccagat agatcctcga 2280

aaaggtgaga caaagtataa cggtatattt catgctatcc gaactatctt aaaggaagag 2340

agctttagaa gctttttcaa aggtggtgga gcccgtgtcc taagaagttc tccccaattt 2400

gggttcactc tggccgccta tgaattattc aagggcttta ttccctcccc cgataacaaa 2460

ttaaaaagca gagagggtag gaagagattt tgtatcgatg acgacgcagg caatgaagag 2520

acagtagttc atagtaacgg tgaactccca cagcaaaagt tttactctga tgatagaaaa 2580

catgccaatt attactataa aagctgtcaa attgcgaaaa cattcattga tttggacaat 2640

aacttttcta ggtttgactc ttcagtttat aaaaactttc aagagcacct aagaagcatt 2700

aacgggtga 2709

<210> 13

<211> 879

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 13

atggaggaca gtaaaaagaa aggattaata gaaggcgcta tactcgatat aataaacggt 60

tccattgcag gcgcctgtgg taaggtgatc gagtttcctt tcgatactgt gaaagtcagg 120

ttgcaaacac aagcatccaa cgtgttccca acaacatggt cttgtataaa atttacttac 180

caaaatgaag gaatagcacg agggtttttt caaggcattg cttcaccttt agttggagca 240

tgtctggaga acgcgacatt atttgtgtct tataaccaat gttctaaatt tttagaaaaa 300

catacaaacg tttccccgtt ggggcaaatc ctgatctctg gtggagtagc gggttcatgt 360

gctagtttag ttttgacacc cgtggagctg gtgaagtgta agttgcaggt tgcgaactta 420

caagttgcat cagctaaaac gaaacataca aaggtgttgc ctacaataaa agcaattata 480

actgagagag gattggcagg attgtggcaa gggcaatcgg gcacttttat tcgagaaagc 540

ttcggtggtg ttgcctggtt tgcaacctac gaaatagtta agaagtcgtt gaaagatagg 600

cactcccttg atgacccaaa aagagatgaa agtaagatat gggaactact tattagtgga 660

gggagcgctg gattggcatt caacgccagt atttttcctg cggatactgt gaaatcagta 720

atgcaaactg aacatataag cctcaccaat gcggtgaaga agatatttgg caaatttgga 780

ctaaagggtt tttatcgagg actgggtata acccttttta gggcagtacc agcaaacgct 840

gcagtttttt acatctttga gactctttct gcactttaa 879

<210> 14

<211> 1332

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 14

atggtaaagg aacgtaaaac cgagttggtc gagggattcc gccattcggt tccctatatc 60

aatacccacc ggggaaaaac gtttgtcatc atgctcggcg gtgaagccat tgagcatgag 120

aatttctcca gtatcgttaa tgatatcggg ttgttgcaca gcctcggcat ccgtctggtg 180

gtggtctatg gcgcacgtcc gcagatcgac gcaaatctgg ctgcgcatca ccacgaaccg 240

ctgtatcaca agaatatacg tgtgaccgac gccaaaacac tggaactggt gaagcaggct 300

gcgggaacat tgcaactgga tattactgct cgcctgtcga tgagtctcaa taacacgccg 360

ctgcagggcg cgcatatcaa cgtcgtcagt ggcaatttta ttattgccca gccgctgggc 420

gtcgatgacg gcgtggatta ctgccatagc gggcgtatcc ggcggattga tgaagacgcg 480

atccatcgtc aactggacag cggtgcaata gtgctaatgg ggccggtcgc tgtttcagtc 540

actggcgaga gctttaacct gacctcggaa gagattgcca ctcaactggc catcaaactg 600

aaagctgaaa agatgattgg tttttgctct tcccagggcg tcactaatga cgacggtgat 660

attgtctccg aacttttccc taacgaagcg caagcgcggg tagaagccca ggaagagaaa 720

ggcgattaca actccggtac ggtgcgcttt ttgcgtggcg cagtgaaagc ctgccgcagc 780

ggcgtgcgtc gctgtcattt aatcagttat caggaagatg gcgcgctgtt gcaagagttg 840

ttctcacgcg acggtatcgg tacgcagatt gtgatggaaa gcgccgagca gattcgtcgc 900

gcaacaatca acgatattgg cggtattctg gagttgattc gcccactgga gcagcaaggt 960

attctggtac gccgttctcg cgagcagctg gagatggaaa tcgacaaatt caccattatt 1020

cagcgcgata acacgactat tgcctgcgcc gcgctctatc cgttcccgga agagaagatt 1080

ggggaaatgg cctgtgtggc agttcacccg gattaccgca gttcatcaag gggtgaagtt 1140

ctgctggaac gcattgccgc tcaggcgaag cagagcggct taagcaaatt gtttgtgctg 1200

accacgcgca gtattcactg gttccaggaa cgtggattta ccccagtgga tattgattta 1260

ctgcccgaga gcaaaaagca gttgtacaac taccagcgta aatccaaagt gttgatggcg 1320

gatttagggt aa 1332

<210> 15

<211> 777

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 15

atgatgaatc cattaattat caaactgggc ggcgtactgc tggatagtga agaggcgctg 60

gaacgtctgt ttagcgcact ggtgaattat cgtgagtcac atcagcgtcc gctggtgatt 120

gtgcacggcg gcggttgcgt ggtggatgag ctgatgaaag ggctgaatct gccggtgaaa 180

aagaaaaacg gcctgcgggt gacgcctgct gatcagatag acattatcac cggagcactg 240

gcgggaacgg caaataaaac cctgttggca tgggcgaaga aacatcagat tgcggccgta 300

ggtttgtttc tcggtgacgg cgacagcgtc aaagtgaccc agcttgatga agagttaggt 360

catgttggac tggcgcagcc aggttcgcct aagcttatca actccttgct ggagaacggt 420

tatctgccgg tggtcagctc cattggcgta acagacgaag ggcaactgat gaacgtcaat 480

gccgaccagg cggcaacggc gctggcggca acgctgggcg cggatctgat tttgctctcc 540

gacgtcagcg gcattctcga cggcaaaggg caacgcattg ccgaaatgac cgccgcgaaa 600

gcagaacaac tgattgagca gggcattatt actgacggca tgatagtgaa agtgaacgcg 660

gcgctggatg cggcccgcac gctgggccgt ccggtagata tcgcctcctg gcgtcatgcg 720

gagcagcttc cggcactgtt taacggtatg ccgatgggta cgcggatttt agcttaa 777

<210> 16

<211> 1074

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 16

atgataatgc acaatgtcta tggtgttaca atgactatta aggtcgcaat cgcaggtgcc 60

tcaggttacg caggtggtga aatcttgaga ttgttattgg gtcatccagc atatgcctct 120

ggtgaattag aaataggtgc attgaccgct gcatccactg ccggtagtac attgggtgaa 180

ttgatgccac atattcctca attagctgat agagttatac aagacactac agctgaaaca 240

ttggcaggtc atgatgttgt ctttttaggt ttgccacacg gtttctcagc agaaatagcc 300

ttacaattgg gtcctgatgt cacagtaatc gattgtgccg ctgactttag attacaaaat 360

gcagccgact gggaaaaatt ctatggttcc gaacatcaag gtacctggcc atacggtatt 420

ccagaaatgc ctggtcacag agaagccttg agaggtgcta agagagttgc agtcccaggt 480

tgctttccta caggtgctac cttagcatta ttgccagccg ttcaagctgg tttgatcgaa 540

cctgatgtat ctgtagtttc aattaccggt gtttccggtg caggtaaaaa ggctagtgtt 600

gccttattgg gttctgaaac tatgggttca ttgaaggcat acaacacctc aggtaaacat 660

agacacactc cagaaatcgc tcaaaacttg ggtgaagttt ctgacaaacc agtaaaggtt 720

tcattcacac ctgttttagc tccattgcct agaggtattt taaccactgc tacagcacct 780

ttgaaagaag gtgtcaccgc cgaacaagcc agagctgttt acgaagaatt ctacgctcaa 840

gaaactttcg tccatgtatt accagaaggt gcccaacctc aaacacaagc tgttttgggt 900

tccaacatgt gtcacgttca agtcgaaatt gatgaagaag ctggtaaagt attggttact 960

agtgcaatcg acaatttgac taagggtaca gcaggtgctg cagttcaatg catgaactta 1020

tctgtcggtt ttgatgaagc cgctggtttg ccacaagtcg gtgtagctcc ttaa 1074

<210> 17

<211> 1176

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 17

atgtctacat tggaaacctg gcctcaagtc atcatcaaca catacggtac tcctcctgtc 60

gaattggtct ctggtaaagg tgctacagta accgatgacc agggtaacgt ttacatcgat 120

ttgttggctg gtatagcagt taacgccttg ggtcatgctc acccagcaat aatcgaagct 180

gtaactaacc aaataggtca attgggtcat gtttctaact tatttgcatc aagacctgtt 240

gtcgaagttg ccgaagaatt aattaagaga ttctctttgg atgacgcaac attagctgca 300

caaaccagag ttttcttttg taattcaggt gcagaagcca acgaagccgc ttttaaaatc 360

gctagattga caggtagatc cagaatttta gcagccgttc atggtttcca cggtagaacc 420

atgggtagtt tggcattaac tggtcaacca gataagagag aagcattttt gccaatgcct 480

tccggtgttg aattctatcc ttacggtgac actgactatt tgagaaaaat ggtcgaaacc 540

aatccaactg atgtagctgc aatcttttta gaacctattc aaggtgaaac aggtgtagtt 600

ccagcccctg aaggtttctt gaaggctgtt agagaattgt gtgatgaata cggtatcttg 660

atgatcactg acgaagtaca aacaggtgtt ggtagaaccg gtgacttttt cgcacatcaa 720

cacgatggtg tcgtaccaga cgttgtcact atggctaaag gtttgggtgg tggtttacct 780

attggtgcct gcttggctac aggtagagcc gctgaattaa tgaccccagg taaacatggt 840

actacatttg gtggtaaccc tgttgcttgt gcagccgcta aagcagtctt gtcagtagtt 900

gatgacgcat tttgcgccga agttgctaga aagggtgaat tattcaagga attgttggct 960

aaggttgatg gtgtcgtaga cgtcagaggt agaggtttga tgttaggtgt tgtcttggaa 1020

agagatgtcg caaagcaagc cgtattggac ggttttaaac acggtgttat tttaaatgct 1080

ccagcagata acatcattag attgactcca cctttagtca taacagatga agaaattgcc 1140

gacgctgtta aagcaattgc cgaaacaata gcttaa 1176

<210> 18

<211> 1167

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 18

atggccgaaa aaggtataac agctccaaaa ggtttcgttg cctctgctac tacagccggt 60

atcaaggctt caggtaatcc agatatggca ttggttgtca accaaggtcc tgaattttct 120

gctgcagccg ttttcactag aaatagagtc tttgctgcac ctgttaaagt ctctagagaa 180

aacgttgctg atggtcaaat tagagctgtc ttgtataatg ctggtaatgc aaacgcctgt 240

aacggtttac aaggtgaaaa ggatgcaaga gaatccgtaa gtcatttggc ccaaaatttg 300

ggtttagaag attccgacat cggtgtttgc agtacaggtt tgattggtga attgttgcca 360

atggataagt tgaacgctgg tatcgaccaa ttgaccgccg aaggtgcttt aggtgacaac 420

ggtgccgctg cagccaaagc tatcatgacc actgataccg ttgacaagga aactgtagtt 480

tttgcagatg gttggacagt aggtggtatg ggtaaaggtg ttggtatgat ggcaccttca 540

ttggccacca tgttagtatg tttaacaacc gatgcctccg ttactcaaga aatggctcaa 600

attgctttgg caaatgccac cgctgtcact ttcgacacat tagatataga cggttctaca 660

tcaaccaacg atactgtttt cttgttagca tctggtgcct caggtatcac tccaacacaa 720

gatgaattga atgacgctgt ttacgctgca tgctctgata ttgccgctaa attacaagca 780

gacgccgaag gtgttacaaa gagagtagca gttaccgtcg taggtactac aaataacgaa 840

caagctatta atgcagccag aacagttgca agagataact tgtttaaatg tgccatgttc 900

ggttctgacc caaattgggg tagagtctta gctgcagttg gtatggctga tgcagacatg 960

gaacctgaaa agatatccgt ctttttcaac ggtcaagctg tatgcttgga tagtactggt 1020

gctcctggtg caagagaagt cgacttgtct ggtgctgata ttgacgttag aatagatttg 1080

ggtacttcag gtgaaggtca agcaacagtt agaaccactg atttgtcctt tagttacgtc 1140

gaaattaatt ccgcttactc ttcataa 1167

<210> 19

<211> 1017

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 19

atgtcaacca cagcatccac gccttcatct ttacgtcatt tgatttctat aaaagatctt 60

tctgatgaag aattcagaat cttagtacaa agagctcaac atttcaagaa tgtttttaaa 120

gcaaataaaa cgaatgattt ccaatccaac catctgaaac tattgggtag aactatagcc 180

ttaatattta ctaaaagatc aactagaacg agaatttcga ccgaaggtgc agccaccttc 240

tttggtgccc aaccgatgtt tttaggtaaa gaggatattc agcttggtgt caatgaatca 300

ttttacgata ccaccaaggt tgtatcatct atggtttcat gtatttttgc ccgtgtgaac 360

aaacatgaag acatacttgc tttttgcaag gattcctctg taccgatcat caactctcta 420

tgtgacaaat tccacccttt gcaagcaatt tgtgatcttt taacaataat cgaaaacttc 480

aatatatctc tagatgaagt aaataaggga atcaattcaa aattgaagat ggcatggatt 540

ggtgatgcca ataatgtcat aaatgatatg tgcatcgcat gtctgaaatt cggtataagt 600

gtcagtattt ccactccccc cggtattgaa atggattccg atattgtcga tgaagcaaag 660

aaagttgctg agagaaacgg tgcgacattt gaattaacac acgactcttt aaaggcctcc 720

accaatgcca atatattagt aaccgatact ttcgtttcca tgggtgaaga atttgcgaaa 780

caggccaagc tgaaacaatt caaaggtttt caaatcaatc aagaacttgt ctctgtggct 840

gatccaaact acaaatttat gcattgtctg ccaagacatc aagaagaagt tagtgatgat 900

gtcttttatg gagagcattc catagtcttt gaagaagcag aaaacagatt atatgcagct 960

atgtctgcca ttgatatctt tgttaataat aaaggtaatt tcaaggactt gaaataa 1017

<210> 20

<211> 1275

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 20

atgtccgaag ctaccctctc ctccaagcaa accattgaat gggaaaacaa atactccgcc 60

cacaactacc accccttgcc cgtcgttttt cacaaggcta agggcgcaca tgtgtgggac 120

ccggagggta agctgtacct cgacttcctg agcgcttatt ctgccgtcaa ccagggccat 180

tgccatcctc acatcatcaa ggctttgacg gagcaagcac aaacactaac attgtcctcc 240

agagcgttcc acaacgatgt ttacgcgcaa ttcgccaagt tcgtgaccga attcttcggg 300

ttcgaaaccg ttttgcccat gaacaccggt gcagaagccg tggaaactgc tttgaagttg 360

gccagaagat gggggtacat gaagaagaac atccctcaag ataaagccat cattctgggt 420

gccgagggta acttccacgg gagaaccttc ggtgctatca gtttgagtac cgactacgag 480

gactccaagt tgcatttcgg gcctttcgtg cctaacgttg ccagtggtca ctccgtgcac 540

aagatcagat acggccacgc agaagatttc gtccctatct tggaatctcc tgaaggtaag 600

aacgttgccg ccatcattct agagccaatt cagggtgaag ccggtatcgt cgtgcccccc 660

gcagactact tcccaaaggt ctccgcatta tgccgtaagc acaacgtcct attgatcgtt 720

gacgaaattc aaaccggtat cggtagaacc ggtgagttgc tttgctacga ccactacaag 780

gcagaggcca agcctgatat tgttttgtta ggtaaggctc tctcaggtgg tgttcttccc 840

gtctcatgtg ttctgtcttc tcacgacatc atgtcttgct ttaccccagg atctcacggt 900

tctactttcg gcggtaatcc tttggcttcc cgcgttgcca tcgccgccct cgaggtcatc 960

cgcgacgaga agctgtgcca aagagccgcc caactgggta gctctttcat cgcccaattg 1020

aaagctctcc aagccaaatc taacggtata atctctgagg tgcgtggtat gggactgctt 1080

accgccatcg taatcgaccc atccaaggcc aatggtaaga ccgcttggga cttgtgtcta 1140

ttgatgaagg atcacggcct cttggctaag cccacccacg accacatcat cagattggct 1200

cctcctttgg tcatctccga agaggacttg caaaccggtg tcgaaaccat tgccaagtgt 1260

atcgatctgt tataa 1275

<210> 21

<211> 1401

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 21

atgtctagta ctcaagtagg aaatgctcta tctagttcca ctactacttt agtggacttg 60

tctaattcta cggttaccca aaagaagcaa tattataaag atggcgagac gctgcacaat 120

cttttgcttg aactaaagaa taaccaagat ttggaacttt taccgcatga acaagcgcat 180

cctaaaatat ttcaagcgct caaggctcgt attggtagaa ttaataatga aacgtgcgac 240

cccggtgagg agaactcgtt tttcatatgc gatttgggag aagtcaagag attattcaac 300

aactgggtga aggagcttcc tagaattaag ccattttatg ccgtcaaatg taatcctgat 360

accaaggttt tgtcattatt agcagagttg ggcgttaatt tcgattgcgc ttccaaagtg 420

gaaattgaca gagtattatc gatgaacatc tcgccggata gaattgttta cgctaatcct 480

tgtaaagtag catctttcat tagatatgca gcttcaaaaa atgtaatgaa gtctactttt 540

gacaatgtag aagaattgca taaaatcaaa aagtttcatc ctgagtctca gttgttatta 600

agaatcgcta ccgatgactc taccgctcaa tgtcgacttt ccaccaaata tggctgtgaa 660

atggaaaacg tagacgtttt attaaaggct ataaaggaac taggtttaaa cctggctggt 720

gtttctttcc acgtcggttc aggcgcttct gattttacaa gcttatacaa agccgttaga 780

gatgcaagaa cggtatttga caaagctgct aacgaatacg ggttgccccc tttgaagatt 840

ttggatgtag gtggtggatt tcaatttgaa tccttcaaag aatcaactgc tgttttgcgt 900

ctagcgctag aggaattttt ccctgtaggt tgtggtgttg atataattgc agagcctggc 960

agatactttg tagctacagc gttcactttg gcatctcatg tgattgcgaa gagaaaactg 1020

tctgagaatg aagcaatgat ttacactaac gatggtgtat acgggaacat gaattgtatt 1080

ttattcgatc atcaagagcc ccatccaaga accctttatc ataatttgga atttcattac 1140

gacgattttg aatccactac tgcggtcctc gactctatca acaaaacaag atctgagtat 1200

ccatataaag tttccatctg gggacccaca tgtgatggtt tggattgtat tgccaaagag 1260

tattacatga agcatgatgt tatagtcggt gattggtttt attttcctgc cctgggtgcc 1320

tacacatcat cggcggctac tcaattcaac ggctttgagc agactgcgga tatagtatac 1380

atagactctg aactcgattg a 1401

<210> 22

<211> 879

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 22

atgtatgaag taatacagaa aaggaaaaca aaaataataa acgttttaca gagtcctgaa 60

ctcatgaggc tcatagagga cccatcaaat ctgggtattt ctttacattt tccagtaagt 120

tcactgctaa aaagtaataa gtgcacacca atgcctaaac tttctacgta tagtttggct 180

agtgggggat ttaaggattg gtgcgcggac atccctctag acgttccacc agagattgat 240

atcatcgatt tttactggga tgttatttta tgcatggaat ctcaattcat attagattac 300

aatgttccgt caaaaaataa ggggaacaat cagaagtctg ttgctaagct gttgaaaaat 360

aagcttgtaa acgatatgaa aactacgtta aaaagactaa tttataatga aaataccaag 420

caatataaaa ataataatag ccacgatggt tacaattgga gaaaactagg ctcgcagtat 480

ttcatactgt atcttcccct atttacgcag gaactgattt ggtgtaaact taatgaaaac 540

tatttccatg ttgtattacc atctttactg aatagtagga acgttcatga taaccacagt 600

acctatataa ataaagattg gttacttgcc cttttagagc taacttccaa cctgaaccaa 660

aacttcaaat tcgaatacat gaaattgaga ttgtatattt taagagatga tttaattaat 720

aatggtttgg atcttttgaa aaatcttaac tgggtcggtg ggaaactgat taaaaatgaa 780

gatagagaag tcttgttgaa ctcgaccgat ttagctacgg attctatttc tcatttatta 840

ggtgatgaaa actttgttat tttagagttt gaatgctaa 879

<210> 23

<211> 1191

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 23

atgactgtca ccataaaaga attgactaac cacaactaca ttgaccacga actatcagcc 60

actttagact caacggatgc gttcgagggt cccgagaagt tgctggaaat ctggttcttc 120

cctcacaaga agtccatcac gaccgaaaag acattaagaa atattggcat ggatagatgg 180

atcgagattt tgaaattagt gaaatgcgaa gttctttcca tgaagaagac taaagaactg 240

gatgcctttt tgttgagtga gtcttccctc ttcgtcttcg atcacaaatt gacgatgaag 300

acgtgcggta ctacaaccac attgttctgt ctcgaaaagc ttttccagat cgttgagcaa 360

gagttatcgt gggctttccg cacaacacaa gggggcaagt acaaaccatt taaagtgttt 420

tattctagac gatgtttcct tttcccctgt aagcaagccg ctatccatca aaactgggct 480

gacgaagtcg actatttgaa caaatttttc gacaatggta aaagttattc cgtgggaaga 540

aatgacaaga gcaaccactg gaacctgtac gtcaccgaga cggaccgctc cacacctaag 600

ggaaaggagt acatcgagga tgacgacgaa actttcgaag tactgatgac ggagctggac 660

ccagaatgcg ctagtaagtt tgtttgcggg cctgaggcat ccacaaccgc tctcgtggag 720

ccaaacgaag ataagggcca caacctcggc taccaaatga ctaaaaatac aaggcttgac 780

gaaatatatg tcaactcggc ccaagactcc gatttatcat ttcaccacga tgcatttgcg 840

ttcacgccat gtggatactc atccaatatg attctcgctg aaaaatacta ttacaccctg 900

cacgtgactc cggaaaaggg ttggtcttac gcctctttcg aaagtaacat acccgtattt 960

gacatttccc aagggaagca agacaacttg gacgttcttc tacatattct gaacgttttt 1020

caaccaagag agttctcgat gacctttttt accaaaaatt atcagaacca atccttccaa 1080

aaactactaa gcatcaacga gtcactgccc gactacatca agttagacaa aattgtttat 1140

gatctggacg actaccacct tttctatatg aaattgcaga agaaaatatg a 1191

<210> 24

<211> 882

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 24

atggcacaag aaatcactca cccaactatt gtagacggct ggttcagaga aatttctgat 60

accatgtggc caggccaggc catgacttta aaagtggaga aagttttaca ccatgagaag 120

tcaaaatatc aagacgtttt gatcttcaaa tccactacat atggtaatgt tctagtttta 180

gataatgtaa ttcaagccac cgaaagggat gaatttgcct accaagaaat gattgcccat 240

cttgccttga attcccatcc aaatcctaag aaggttcttg ttattggtgg gggtgatggt 300

ggtgttttga gagaggttgt caagcatgat tccgttgagg aagcctggtt atgtgacatt 360

gatgaagctg ttattagact atcaaaggag tacctaccag aaatggctgc ctcttattct 420

cacccaaagg ttaagaccca cattggtgat ggtttccaat ttttaagaga ttaccaaaac 480

acatttgacg taatcattac tgactcttct gacccagaag gtccagctga aacccttttc 540

caaaaggaat atttccaatt gttgaacagt gcgttgacag aaaagggtgt aatcactaca 600

caagcagaaa gtatgtggat tcacttgcca atcattaagg acttaaagaa agcctgttct 660

gaagttttcc cagttgcaga atactctttc gttactattc caacttaccc aactggtacg 720

attggtttta tggtttgctc caaagataaa acttgcaatg tcaagaagcc actacgtgaa 780

atctctgatg agaaggaggc tgaattatac agatactata acaagaaaat tcacgaagct 840

tcctttgttc taccaacctg ggcagccaag gaattaaatt ag 882

<210> 25

<211> 1527

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 25

atgaatacag tttcaccagc caaaaaaaag gttattataa ttggtgccgg tattgctggg 60

cttaaagctg catctacgct acaccaaaac ggtattcaag attgtcttgt tcttgaggcc 120

agagatcggg tcggtggtag gttgcaaact gtcacaggct atcaaggtcg gaaatatgat 180

ataggtgcta gctggcacca tgatacgttg acaaaccctt tatttttgga agaggctcaa 240

ctgagtttga atgatgggag aacgaggttt gtttttgatg acgataattt tatttatatc 300

gacgaagaac gtggaagggt agaccatgac aaggaactgc ttcttgaaat tgtggacaat 360

gaaatgagca aattcgcaga gttagaattc catcaacact taggagtttc agattgctcc 420

ttttttcaat tagtaatgaa atacttacta caaagacgcc aatttctcac aaatgaccaa 480

ataagatatt tgccacaact ctgtcgatat ctggaattgt ggcacggctt agattggaag 540

cttttgagtg ccaaggatac atacttcggt caccaaggaa ggaacgcctt tgctttgaac 600

tatgattctg tggttcaaag aattgctcaa agctttcctc aaaattggtt aaagctaagt 660

tgtgaagtga aatcaattac acgagaacct tcaaaaaatg tgacagtgaa ctgtgaagat 720

ggtactgtgt acaatgctga ttatgttatt attacagtac ctcaaagtgt attgaatttg 780

tctgtacaac ctgaaaaaaa tttacgggga agaatagaat ttcaaccacc cttgaaacca 840

gtgattcaag atgcttttga caagatccat tttggagcgc taggtaaagt aatttttgag 900

tttgaagaat gttgttggtc gaacgaaagt tcaaaaattg taactttggc taactctacc 960

aatgaatttg tcgaaatagt acgtaatgcg gaaaatttag atgaattaga ctctatgcta 1020

gaaagggaag attctcaaaa gcatacgagt gttacttgtt ggagccagcc tttatttttc 1080

gtaaatttgt caaaaagcac aggagtagca agctttatga tgttgatgca ggcaccgctt 1140

acaaatcaca tagaatccat tagagaagat aaagagcgtc tttttagttt tttccaacct 1200

gtgctgaaca agattatgaa gtgtctagat tctgaggatg tcatcgacgg aatgaggccg 1260

atagaaaaca ttgcaaacgc taataaacca gtcttaagaa acatcatcgt tagcaactgg 1320

acacgcgatc cttactcacg cggtgcttat tcggcctgtt ttccaggaga tgatccagtt 1380

gatatggttg ttgcaatgtc taatggtcaa gactcccgca taagatttgc aggcgaacat 1440

actatcatgg acggcgccgg ctgtgcctat ggtgcttggg aaagcggaag acgggaggcg 1500

actcgaatct ctgacttact gaaatag 1527

<210> 26

<211> 1014

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 26

atgaacagga ttaagaatac attttctgtt gctaagagat taaaactaag caaagttatg 60

acgaactcag aattaccgag catattcgaa ggaactgttg atttagggat tattggtggt 120

acaggtttat ataaccttga ctgtctggag cccatcgctt tgcttccacc catggtaaca 180

ccatggggta ccacatcgtc tcctgtcaca atctctcagt tcgtaggaac taacagccac 240

tttcacgttg cgttcatagc cagacacggt attaaccacg aatacccacc cactaaagtc 300

ccatttagag caaacatggc ggccttaaag aacttaaatt gtaaagccgt tctttctttt 360

agtgccgtgg ggtctttaca accccatata aagcctagag attttgtgtt accacagcaa 420

ataatcgaca gaactaaagg cataagacat tcttcatatt tcaacgatga aggcttggta 480

ggtcacgttg gtttcggaca gccgttctct caaaaattcg cagagtatat ctatcaattc 540

aagaacgaga taacaaatcc tgaatccgaa gaaccgtgcc atttgcatta cgacaaggat 600

atgaccgttg tgtgtatgga aggcccacaa ttctccacgc gcgctgaatc caagatgtac 660

agaatgtttg gtggccatgt tattaacatg agtgttattc cagaagccaa attggcgcgt 720

gagtgtgagc tgccttacca gatgatttgt atgtctaccg attacgacgc atggagagat 780

gaggcagaac ctgttaccgt agaaaccgtt attggtaatt tgacgaataa tgggcgcaat 840

gcaaatattt tagcttctaa gatcatcgtc tcaatggcca aggaaatccc agagttcatg 900

catactggcg atgggctgcg cggttccatc aagaaatcta tctctaccaa accagaggct 960

atgtccaagg aaaccttaga aagactaaga tacttatttc caaactattg gtaa 1014

<210> 27

<211> 1131

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 27

atgaccttgg cacccctaga cgcctccaaa gttaagataa ctaccacaca acatgcatct 60

aagccaaaac cgaacagtga gttagtgttt ggcaagagct tcacggacca catgttaact 120

gcggaatgga cagctgaaaa agggtggggt accccagaga ttaaacctta tcaaaatctg 180

tctttagacc cttccgcggt ggttttccat tatgcttttg agctattcga agggatgaag 240

gcttacagaa cggtggacaa caaaattaca atgtttcgtc cagatatgaa tatgaagcgc 300

atgaataagt ctgctcagag aatctgtttg ccaacgttcg acccagaaga gttgattacc 360

ctaattggga aactgatcca gcaagataag tgcttagttc ctgaaggaaa aggttactct 420

ttatatatca ggcctacatt aatcggcact acggccggtt taggggtttc cacgcctgat 480

agagccttgc tatatgtcat ttgctgccct gtgggtcctt attacaaaac tggatttaag 540

gcggtcagac tggaagccac tgattatgcc acaagagctt ggccaggagg ctgtggtgac 600

aagaaactag gtgcaaacta cgccccctgc gtcctgccac aattgcaagc tgcttcaagg 660

ggttaccaac aaaatttatg gctatttggt ccaaataaca acattactga agtcggcacc 720

atgaatgctt ttttcgtgtt taaagatagt aaaacgggca agaaggaact agttactgct 780

ccactagacg gtaccatttt ggaaggtgtt actagggatt ccattttaaa tcttgctaaa 840

gaaagactcg aaccaagtga atggaccatt agtgaacgct acttcactat aggcgaagtt 900

actgagagat ccaagaacgg tgaactactt gaagcctttg gttctggtac tgctgcgatt 960

gtttctccca ttaaggaaat cggctggaaa ggcgaacaaa ttaatattcc gttgttgccc 1020

ggcgaacaaa ccggtccatt ggccaaagaa gttgcacaat ggattaatgg aatccaatat 1080

ggcgagactg agcatggcaa ttggtcaagg gttgttactg atttgaactg a 1131

<210> 28

<211> 564

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 28

atgtctatag caagttatgc ccaagagttg aagttggctt tacatcaata tccaaacttc 60

cctagtgaag gcattctctt cgaagatttc ttacccattt tcaggaaccc aggtcttttc 120

cagaagttga tcgatgcttt caaactgcat ttagaagaag cttttccaga agttaaaatt 180

gattatatcg tcgggttgga atcccgtggg ttcttgttcg gaccaacttt agctttggcc 240

ctaggtgttg gtttcgttcc agtcaggaag gcaggtaagc tacctggcga atgttttaag 300

gctacgtacg aaaaggagta cggttctgat ctttttgaga tacagaaaaa cgctattcca 360

gcaggttcca acgttatcat tgttgatgac attattgcca ctggtggttc tgctgctgca 420

gccggcgaat tagttgaaca actcgaagcc aaccttttgg aatataactt tgttatggag 480

ttggatttct tgaaaggcag gagtaagttg aatgctccag tgttcacttt actgaacgct 540

caaaaggaag cgttgaaaaa atga 564

<210> 29

<211> 1491

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 29

atgtcaatga gtaatattgt tgtttttgga ggggactcgc accccgagtt agttactaag 60

atctgtgaaa atttggacat tcacccatcg aaagtagaat tagggaagtt ttctaatggg 120

gaaacgaaca ttgctcttcg cgaatctgtt cgtgaaaagg atgtatatat catccagagt 180

ggttgtggcc aggtgaacga cacgttcatg cagttgctga ttttaatcag tgcctgcaag 240

tccgcttctg cctcgagggt tacagccgta atgccatatc tctgctactc gagacagcca 300

gatattccat atactgccaa gggtgctccc ataatttcca agcctaaaga aaactatact 360

tttgaatcgc atccaggcac acccgtgtca tcttctttaa tgacgcaaag accaggtgct 420

gagagctcgt tgaagagttt ggatagtgca atacgatcaa ctatcaactt agaaaatcct 480

caacctatca gaacaccaaa cagcagtgct acggcgaata acaatttcga catcaagaag 540

acgctttctt tttcaagaat tcctatgatt cccggtggta agttacaaaa tacaagcaat 600

agcacggacg ctggtgaatt gttcaacgct caaaatgcag gctataagct atgggtagta 660

caagccggta ctttgattgc tcatttgttg agtgctgcag gtgctgacca tgtgatcaca 720

atggatttgc acgatccaca gttccctggg ttttttgaca ttccagtgga taatctctac 780

tgtaaaccca ttgcacaaaa ctacatccag catcgcattc cagattatca ggatgctgtg 840

atcgtttctc cagatgctgg tggtgcaaag agagctacgg ctattgcaga cgccttggaa 900

ttgtccttcg ccctaattca taaagaaaga agatctcagt tattgaaggg ccctccagat 960

gcgacgttaa cctctggtgg ttcgttacca gtatctccaa ggccattagt tactactttg 1020

gtttcctccc aaaatactac ttcttcaggt gccactgggg ttgcggccct tgaaatgaag 1080

aaaacaactt caacatcttc cacctcgtcg caatcttcta attcgtccaa gttcgttcaa 1140

actaccatgc ttgttggcga tgttagaaac aaggtgtgta ttatagtcga cgacttggtg 1200

gatacttcat acactattac aagagctgcg aaattgttga aggatcaagg atctaccaaa 1260

gtttatgcct taataacgca cggtgttttt tccggtgatg cgctagaaag aatcggccaa 1320

agtagtatag ataagttgat catttctaac acggttcctc aagatagaac actacagtac 1380

ctaggtaagg acagagtgga tgttattgat gtctcctgca taatcggtga agcaattaga 1440

agaatccata acggtgaatc catttctatg ttgttcgagc atggatggta g 1491

<210> 30

<211> 1197

<212> DNA

<213> 婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)

<400> 30

gttgtttcta gaaaaacaat gtctgttcac tctatcttgt tctcttctga acacgttact 60

gaaggtcacc cagacaagtt gtgtgaccaa gtttctgacg ctgttttgga cgcttgtttg 120

gctggtgacc cattctctaa ggttgcttgt gaatcttgtg ctaagactgg tatggttatg 180

gttttcggtg aaatcactac taaggctgtt ttggactacc aaaagatcgt tagaaacact 240

atcaaggaca tcggtttcga ctctgctgac aagggtttgg actacgaatc ttgtaacgtt 300

ttggttgcta tcgaacaaca atctccagac atctgtcaag gtttgggtaa cttcgactct 360

gaagacttgg gtgctggtga ccaaggtatg atgttcggtt acgctactga cgaaactgaa 420

actttgatgc cattgactta cgaattggct agaggtttgg ctaagaagta ctctgaattg 480

agaagagacg gttctttgga atgggctaga ccagacgcta agactcaagt tactgttgaa 540

tacgactacg acactagaga aggtaagcaa gttttgactc caaagagagt tgctgttgtt 600

ttgatctctg ctcaacacga cgaacacgtt actaacgaca agatctctgt tgacttgatg 660

gaaaaggtta tcaaggctgt tatcccagct aacatgttgg acgctgaaac taagtactgg 720

ttgaacccat ctggtagatt cgttagaggt ggtccacacg gtgacgctgg tttgactggt 780

agaaagatca tcgttgacac ttacggtggt tggggtgctc acggtggtgg tgctttctct 840

ggtaaggacc catctaaggt tgacagatct gctgcttacg ctgctagatg gatcgctaag 900

tctatcgttg ctggtggttt ggctagaaga tgtttggttc aattggctta cgctatcggt 960

gttgctgaac cattgtctat gcacgttgaa acttacggta ctggtaagta cgacgacgct 1020

aagttgttgg aaatcgttaa gcaaaacttc aagttgagac catacgacat catccaagaa 1080

ttgaacttga gaagaccaat ctactacgaa acttctcgtt tcggtcactt cggtagaaag 1140

gacgaattgg gtactggtgg tttcacttgg gaagttccaa agaagatggt tgaataa 1197

<210> 31

<211> 1044

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 31

atggtttctg tggagttttt acaggagtta ccaaaatgtg agcatcactt gcatttggaa 60

ggtactctag aacctgacct attgttccca ttagctaaaa gaaacgatat aattctacct 120

gaaggttttc ctaaatcggt cgaggaatta aacgaaaagt ataagaagtt tcgtgatctg 180

caggatttct tagattacta ttatattggt actaatgtct tgattagtga acaagatttc 240

tttgatttgg cgtgggccta ttttaaaaaa gttcacaaac aaggcttggt ccatgctgaa 300

gtgttttacg accctcagtc acatacatct aggggcatct ccatagaaac agtcactaaa 360

ggtttccaaa gagcttgtga caaagccttc tctgaatttg gtattacatc caagctaatt 420

atgtgtctgt taagacacat tgaaccagag gaatgtttga aaactatcga agaagctacc 480

ccatttatta aagatggtac tatctctgcc ttaggattag attctgctga gaaaccattt 540

cccccacatt tatttgttga atgttacgga aaggccgcct cattgaataa agatttaaaa 600

ctaactgcac acgcaggtga agaaggcccc gctcaattcg tctcggatgc tttagacttg 660

ttgcaagtaa caagaatcga tcacggtatc aacagtcaat acgacgagga gttattggat 720

aggttgtcgc gcgaccagac catgctaact atttgtcctc tctccaacgt gaagctacaa 780

gtagtccaat ccgtttcaga gttaccacta caaaagtttc ttgacagaga tgttccattt 840

tctttaaatt ctgatgaccc cgcctatttt ggtggttata tcttagatgt ctacactcaa 900

gtttcgaaag atttcccaca ctgggaccat gaaacatggg gtcgtatcgc taagaacgcc 960

attaaaggtt catggtgtga cgataaaaga aagaacggtt tgttaagtag agtggacgaa 1020

gtagtcacta aatattcgca ttag 1044

<210> 32

<211> 1857

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 32

atgccagagt atacgctact ggctgataat ataagggaga atatcgttca tttcgatccg 60

aatggtttgt ttgataactt gcacaccatt gttcatgaag atgacagtca agagaacgag 120

gaggccgagc atttcaatta tgatcaggtg ttggataaat cgttattgtc aagaggttct 180

attgtcggtc tcggtttagg actaatgagt cccgttttag gaatgtgcac tagtatggcc 240

attgggctaa ttaatggtgg tccgttaact ataatgctag gttttttaat cagtggagtg 300

tgtatatggt tttcgtcgct ttctcttggt gagattgttt caaaatttcc gatggaactg 360

catgttggga gtgccatgtt ggccccggag aaattgaaat tagtatgttc gtggtacact 420

ggctggttaa tgctcatagg gaattggact atgagtacca gtattacttt tgcaggcgct 480

caacttacca tttctttgat tctgatgacg aactccaacc taatatccga ggcacacttg 540

attttttaca cagtcattgt attttactta gttgtgactg ttgtaggcct cgtgaatttg 600

aaatttgcaa gatttattga aacaataaac aaagtctgtg tttattggat catatatgcc 660

attatattta ttgatattct tctactagta ttccacaaag gtaaatttcg atctttgaag 720

tacgcgctat ttcactttga taataatcta tcagggtata aaagcgcatt tctttccttc 780

atcattggat tccaacagtc taatttcacg ttacaaggtt tcagtatgtt acctgcttta 840

gctgacgaag tcaaagttcc tgagaaggat attccacgtg gtatgtcgaa tgcggtattg 900

ttatccgcgt tctctggagt catttttctt ataccaataa tgttaatcct gccagataat 960

gatttgcttt ttaccaatca taaggttcta ccaatagtga acatttttac aaaatcgact 1020

gattcggtgg tcttgtcttt ttttttagtg ctcctaattt taggaaactt actgttttcc 1080

ggaattggct cgattactac atcttctcgt gcggtatata gttttagtcg tgaccaggct 1140

ataccatact acgataaatg gacctacgtc gaaccggatt ctcagtcaaa agtccccaag 1200

aattctgttg tattgagtat gataatatca tactttttag gtctgctagc tttgatttca 1260

acggccgcat ttaatgcttt tataggcgct gcagtgctct gtctttgttc tgcgactttc 1320

attccgttag tcttggtgct gtttacgaga agaagagcta tccgaagcgc gccagtaaaa 1380

atcaggtata agtttggttg gttcatcaac attgtttcta ttgtgtggct cttgttatct 1440

atggtttctg tttgcctacc aacgcaagtg cctgtaactt tcaaaacaat gaattatgct 1500

ttaatggtgt acgtattctg cattttagtt atcactggtc tttatttcaa atgggggaag 1560

tataatttta gattaccctt ggcagatgac atcaaggctc caattcccag tgatgcggaa 1620

gaaactgttt ttgaactaga ggatagcaat gttgaacata ctctaaactc gggaaccaca 1680

gtgaaagagt ctgtagaaaa taattctgaa gaaggtttca tcaaggtgca tcctaaaagt 1740

agtacagaaa atccctttga ggaaaatgag gaaaacgtga taaccgatta tggtgatgag 1800

caccatacag cagaacaaga atttgatctt gccgatgatc gtagatatga tatatga 1857

<210> 33

<211> 2088

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 33

atgactgtca ccataaaaga attgactaac cacaactaca ttgaccacga actatcagcc 60

actttagact caacggatgc gttcgagggt cccgagaagt tgctggaaat ctggttcttc 120

cctcacaaga agtccatcac gaccgaaaag acattaagaa atattggcat ggatagatgg 180

atcgagattt tgaaattagt gaaatgcgaa gttctttcca tgaagaagac taaagaactg 240

gatgcctttt tgttgagtga gtcttccctc ttcgtcttcg atcacaaatt gacgatgaag 300

acgtgcggta ctacaaccac attgttctgt ctcgaaaagc ttttccagat cgttgagcaa 360

gagttatcgt gggctttccg cacaacacaa gggggcaagt acaaaccatt taaagtgttt 420

tattctagac gatgtttcct tttcccctgt aagcaagccg ctatccatca aaactgggct 480

gacgaagtcg actatttgaa caaatttttc gacaatggta aaagttattc cgtgggaaga 540

aatgacaaga gcaaccactg gaacctgtac gtcaccgaga cggaccgctc cacacctaag 600

ggaaaggagt acatcgagga tgacgacgaa actttcgaag tactgatgac ggagctggac 660

ccagaatgcg ctagtaagtt tgtttgcggg cctgaggcat ccacaaccgc tctcgtggag 720

ccaaacgaag ataagggcca caacctcggc taccaaatga ctaaaaatac aaggcttgac 780

gaaatatatg tcaactcggc ccaagactcc gatttatcat ttcaccacga tgcatttgcg 840

ttcacgccat gtggatactc atccaatatg attctcgctg aaaaatacta ttacaccctg 900

cacgtgactc cggaaaaggg ttggtcttac gcctctttcg aaagtaacat acccgtattt 960

gacatttccc aagggaagca agacaacttg gacgttcttc tacatattct gaacgttttt 1020

caaccaagag agttctcgat gacctttttt accaaaaatt atcagaacca atccttccaa 1080

aaactactaa gcatcaacga gtcactgccc gactacatca agttagacaa aattgtttat 1140

gatctggacg actaccacct tttctatatg aaattgcaga agaaaatagg atctggttct 1200

ggttctatgg cacaagaaat cactcaccca actattgtag acggctggtt cagagaaatt 1260

tctgatacca tgtggccagg ccaggccatg actttaaaag tggagaaagt tttacaccat 1320

gagaagtcaa aatatcaaga cgttttgatc ttcaaatcca ctacatatgg taatgttcta 1380

gttttagata atgtaattca agccaccgaa agggatgaat ttgcctacca agaaatgatt 1440

gcccatcttg ccttgaattc ccatccaaat cctaagaagg ttcttgttat tggtgggggt 1500

gatggtggtg ttttgagaga ggttgtcaag catgattccg ttgaggaagc ctggttatgt 1560

gacattgatg aagctgttat tagactatca aaggagtacc taccagaaat ggctgcctct 1620

tattctcacc caaaggttaa gacccacatt ggtgatggtt tccaattttt aagagattac 1680

caaaacacat ttgacgtaat cattactgac tcttctgacc cagaaggtcc agctgaaacc 1740

cttttccaaa aggaatattt ccaattgttg aacagtgcgt tgacagaaaa gggtgtaatc 1800

actacacaag cagaaagtat gtggattcac ttgccaatca ttaaggactt aaagaaagcc 1860

tgttctgaag ttttcccagt tgcagaatac tctttcgtta ctattccaac ttacccaact 1920

ggtacgattg gttttatggt ttgctccaaa gataaaactt gcaatgtcaa gaagccacta 1980

cgtgaaatct ctgatgagaa ggaggctgaa ttatacagat actataacaa gaaaattcac 2040

gaagcttcct ttgttctacc aacctgggca gccaaggaat taaattag 2088

<210> 34

<211> 627

<212> PRT

<213> 布氏锥虫(Trypanosoma brucei)

<400> 34

Met Thr Lys Ser Ala Leu Ala Asp Thr Lys Glu Glu Pro His Val Pro

1 5 10 15

Phe Gly Glu Ile Gln Gly Tyr Thr Pro Cys Gly Val Pro Ala Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly His Asp Gly Phe Phe Ser Gly Glu Arg Ser Ile Asp Gly Asn

35 40 45

Leu Phe Cys Gly Phe Lys Tyr Gln Cys Val Glu Phe Ala Arg Arg Trp

50 55 60

Leu Tyr Glu Ala Lys Gly Leu Val Leu Pro Asp Val Asn Trp Ala Ala

65 70 75 80

His Ile Phe Asp Leu Thr Glu Val His Asp Ala Ser Thr Ala Thr Pro

85 90 95

Val Pro Cys Val Lys Val Ser Asn Gly Thr Ala Ala Lys Pro Val Ala

100 105 110

Asp Ser Leu Leu Ile Tyr Ala Val Asn Glu Asp Ala Pro Trp Gly His

115 120 125

Val Ala Val Ile Thr Glu Val Gly Asp Lys Trp Val Arg Ile Ala Asp

130 135 140

Gln Asn His Arg Phe His Lys Trp Lys Gly Thr Tyr Ser Ala Glu Leu

145 150 155 160

Leu Leu Lys His Glu Gly Gly Val Trp Thr Val Glu Asp His Ala Ala

165 170 175

Glu Gly Ile Phe Val Pro Leu Gly Trp Val Thr Phe Pro Ser Arg Pro

180 185 190

Asn Arg Asn Pro Lys Glu Pro Leu Val Leu His Glu Ser Leu Tyr Phe

195 200 205

Lys Gln Pro Glu Lys Pro Phe Leu Arg Arg Val Val Phe Thr Pro Glu

210 215 220

Asn Arg Lys Thr Asp Trp Leu Asp Leu Thr Asn Glu Ala Glu Ala Glu

225 230 235 240

Phe Tyr Lys Thr Phe Gly Lys Glu Ala Thr Arg Gly Gly Val Tyr Glu

245 250 255

Ser Cys Tyr Tyr Leu Met Asn Arg Glu Leu Tyr Leu Asn Cys Val Arg

260 265 270

Tyr Gly Thr Gln Leu His Ser Phe Phe Leu Glu Ala Thr Lys Gln Val

275 280 285

Leu Glu Ser Asp Asp Lys Leu Arg Arg Phe Arg Ile Pro Glu Glu Tyr

290 295 300

Trp Pro Arg Ile Arg His Ser Trp Lys Thr Gln Pro His Ala Ile Thr

305 310 315 320

Gly Arg Phe Asp Phe Val Phe Asp Glu Asn Thr Gln Glu Phe Lys Cys

325 330 335

Phe Glu Tyr Asn Ala Asp Ser Ala Ser Thr Leu Leu Glu Cys Ala Val

340 345 350

Ile Gln Glu Lys Trp Ala Asn Ser Val Gly Leu Asp Asp Asn Ala Thr

355 360 365

Arg Ser Ser Gly Lys Phe Met Pro Gln Thr Leu Val Arg Ala Trp Glu

370 375 380

Met Thr Gly Leu Lys Gly Arg Val His Phe Leu Val Asp Asp Asp Gly

385 390 395 400

Glu Glu Arg Tyr Thr Ala Leu Tyr Val Met Glu Lys Ala Arg Glu Ala

405 410 415

Gly Ile Asp Ala Lys Leu Cys Val Met Phe Asp Glu Phe His Phe Asp

420 425 430

Glu Lys Gly Ala Val Val Asp Ser Asp Gly Ile Pro Ala Thr Ala Val

435 440 445

Trp Lys Thr Trp Met Trp Glu Thr Ala Ile Ser Asp His Gln Ala Ala

450 455 460

Arg Glu Gln Arg Gly Ala Glu Trp Lys Pro Thr Pro Lys Asp Lys Val

465 470 475 480

Arg Leu Cys Asp Ile Leu Leu Gly Asn Asn Trp Asp Val Arg Val Phe

485 490 495

Glu Pro Met Trp Lys Leu Ile Pro Ser Asn Lys Ala Ile Leu Pro Ile

500 505 510

Ile Tyr Asn Asn His Pro Asp His Pro Ala Ile Leu Pro Ala Ser Tyr

515 520 525

Glu Leu Thr Asp Glu Leu Arg Arg Thr Gly Tyr Ala Lys Lys Pro Ile

530 535 540

Val Gly Arg Val Gly Arg Asn Val Thr Val Thr Glu Pro Asp Gly Lys

545 550 555 560

Val Leu Ala Glu Ser Asp Gly Asn Phe Ser Asn Arg Asp Met Val Tyr

565 570 575

Gln Gln Leu Phe Arg Ile Pro Lys Arg Gly Asp Tyr Tyr Ala Ile Leu

580 585 590

Gly Gly Trp Met Leu Gly Asp Thr Tyr Ser Gly Thr Gly Val Arg Glu

595 600 605

Asp Lys Lys Leu Thr Thr Gly Leu Glu Ser Pro Phe Gly Pro Val Arg

610 615 620

Ile Gln Met

625

<210> 35

<211> 1884

<212> DNA

<213> 布氏锥虫

<400> 35

atgactaaat cagcattagc agatacaaaa gaagaacctc acgtcccatt cggtgaaata 60

caaggttata ccccatgtgg tgtcccagct tattcaaatg gtcatgatgg tttcttttct 120

ggtgaaagat caatcgatgg taatttgttt tgtggtttta aataccaatg tgttgaattt 180

gctagaagat ggttgtacga agcaaaaggt ttagttttgc cagatgttaa ttgggctgca 240

catatcttcg atttgactga agttcatgat gcttctactg caacaccagt tccatgtgtt 300

aaagtttcaa atggtacagc tgcaaaacca gttgctgatt ctttgttgat ctatgctgtt 360

aacgaagatg caccatgggg tcatgttgct gttattactg aagttggtga caaatgggtt 420

agaatcgcag atcaaaacca tagattccat aagtggaagg gtacttactc agcagaattg 480

ttattgaaac atgaaggtgg tgtttggaca gttgaagatc atgctgcaga aggtattttt 540

gttccattag gttgggttac atttccatca agaccaaaca gaaacccaaa ggaaccattg 600

gttttgcatg aatctttgta cttcaagcaa ccagaaaagc catttttgag aagagttgtt 660

tttacaccag aaaacagaaa gactgattgg ttggatttga caaacgaagc tgaagcagaa 720

ttttacaaga ctttcggtaa agaagctaca agaggtggtg tttacgaatc ttgttactac 780

ttgatgaaca gagaattgta tttgaattgt gttagatacg gtactcaatt gcattctttc 840

tttttggaag ctacaaagca agttttggaa tctgatgata agttgagaag atttcgtatt 900

ccagaagaat attggccaag aattagacat tcatggaaaa ctcaaccaca tgcaattaca 960

ggtagattcg atttcgtttt cgatgaaaac actcaagagt ttaaatgttt tgaatacaat 1020

gctgattctg catcaacatt gttggaatgt gctgttattc aagaaaaatg ggcaaattct 1080

gttggtttag atgataatgc tactagatct tctggtaaat tcatgccaca aactttggtt 1140

agagcatggg aaatgacagg tttaaaaggt agagttcatt tcttggttga tgatgatggt 1200

gaagaaagat acacagcttt gtacgttatg gaaaaagcta gagaagcagg tatcgatgca 1260

aagttgtgtg ttatgttcga tgaatttcat ttcgatgaaa aaggtgctgt tgttgattca 1320

gatggtattc cagctactgc agtttggaaa acatggatgt gggaaactgc tatttctgat 1380

catcaagctg caagagaaca aagaggtgca gaatggaagc caactccaaa ggataaagtt 1440

agattgtgtg atatcttgtt gggtaacaac tgggatgtta gagttttcga accaatgtgg 1500

aagttgatcc catcaaataa ggctatcttg ccaatcatct ataacaacca tccagatcat 1560

ccagctattt tgccagcatc ttacgaattg actgatgaat tgagaagaac aggttacgct 1620

aagaaaccaa ttgttggtag agttggtaga aatgttactg ttacagaacc agatggtaaa 1680

gttttggcag aatctgatgg taacttctca aacagagata tggtttacca acaattgttt 1740

agaataccaa aacgtggtga ctattacgct attttaggtg gttggatgtt gggtgacact 1800

tactctggta caggtgttag agaagataag aagttgacta caggtttaga atcccctttc 1860

ggtccagtta gaatccaaat gtga 1884

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

gtatgaagta atacagaaaa ggaaaac 27

<210> 37

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gacctgcagc gtacgaagct tcagcaatct ctggtggaac gtctag 46

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

ctgaagcttc gtacgctgca ggtc 24

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

ggccactagt ggatctgata tcac 24

<210> 40

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gtgatatcag atccactagt ggcccctgaa ccaaaacttc aaattcgaat ac 52

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

gcattcaaac tctaaaataa caaag 25

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

gtgatatcag atccactagt ggccatagct tcaaaatgtt tctactcc 48

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

tttgtaatta aaacttagat tagattgc 28

<210> 44

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

gcaatctaat ctaagtttta attacaaaat gtctagtact caagtaggaa atgc 54

<210> 45

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

gtgctagtgt ctcccgtctt ctgttcaatc gagttcagag tctatgtata c 51

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

acagaagacg ggagacacta gcac 24

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

attttcaaca tcgtattttc cgaagc 26

<210> 48

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatcctg aaccaaaact tcaaattcga atac 54

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

gtgatatcag atccactagt ggcctgccgt aaaccactaa atcggaaccc 50

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

tagggcccac aagcttacgc gtcgac 26

<210> 51

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

gtcgacgcgt aagcttgtgg gccctactaa tttaattcct tggctgccca g 51

<210> 52

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

ctacttttta caacaaatat aacaaaatgg cacaagaaat cactcaccca ac 52

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

tttgttatat ttgttgtaaa aagtag 26

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

acgcacagat attataacat ctgcac 26

<210> 55

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

gtgcagatgt tataatatct gtgcgtatag cttcaaaatg tttctactcc 50

<210> 56

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

cttcggaaaa tacgatgttg aaaatgttac tccgcaacgc ttttctgaac g 51

<210> 57

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

taaagtaaga gcgctacatt ggtctacc 28

<210> 58

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

ggtagaccaa tgtagcgctc ttactttatc atattttctt ctgcaatttc atatag 56

<210> 59

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa atgactgtca ccataaaaga attgac 56

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

tttgtttgtt tatgtgtgtt tattcgaaac 30

<210> 61

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

tcgagtttat cattatcaat actgcc 26

<210> 62

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

ggcagtattg ataatgataa actcgacctg aaccaaaact tcaaattcga atac 54

<210> 63

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

ggcagtattg ataatgataa actcgagttt aaagattacg gatatttaac ttac 54

<210> 64

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

ttttagttta tgtatgtgtt ttttgtagtt atag 34

<210> 65

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

ctataactac aaaaaacaca tacataaact aaaaatggtt aataattcac agcatcctta 60

c 61

<210> 66

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

gactaataat tcttagttaa aagcacttca ttcattaatg accttgtctg ccc 53

<210> 67

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

agtgctttta actaagaatt attagtc 27

<210> 68

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

aggtatcatc tccatctccc atatgc 26

<210> 69

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

gcatatggga gatggagatg atacctcctg aaccaaaact tcaaattcga atac 54

<210> 70

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

cgtcctctcg aaaggtggtt taaagattac ggatatttaa cttac 45

<210> 71

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

ctacaaaaaa cacatacata aactaaaaat gaacaggatt aagaatacat tttctg 56

<210> 72

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

ggtcgacgcg taagcttgtg ggccctatta ccaatagttt ggaaataagt atc 53

<210> 73

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

caggtggtca tggccctttg ccgtaaacca ctaaatcg 38

<210> 74

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 74

ctacaaaaaa cacatacata aactaaaaat gaccttggca cccctagac 49

<210> 75

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

ggtcgacgcg taagcttgtg ggccctatca gttcaaatca gtaacaacc 49

<210> 76

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

cattaaaaaa ctatatcaat taatttgaat taacttacca atagtttgga aataagtatc 60

<210> 77

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 77

catgactcga ggtcgacggt atctcagttc aaatcagtaa caacccttg 49

<210> 78

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 78

gtaattatct actttttaca acaaatataa caaaatgacc ttggcacccc tagac 55

<210> 79

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 79

caggtggtca tggccctttt tgtaattaaa acttagatta gattgc 46

<210> 80

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 80

gcaatctaat ctaagtttta attacaaaat gtccaagagc aaaactttct tatttacc 58

<210> 81

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 81

ctaaatcatt aaagtaactt aaggagttaa atttaaaatt ccaatttctt tgg 53

<210> 82

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 82

atttaactcc ttaagttact ttaatgattt ag 32

<210> 83

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 83

caggtggtca tggcccttgc gaatttctta tgatttatg 39

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 84

gcgaatttct tatgatttat g 21

<210> 85

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 85

cataaatcat aagaaattcg ctcatttttt caacgcttcc ttttgagc 48

<210> 86

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 86

cgaataaaca cacataaaca aacaaaatgt ctatagcaag ttatgcccaa g 51

<210> 87

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 87

caggtggtca tggccctttt tttgattaaa attaaaaaaa ctttttg 47

<210> 88

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 88

tttttgatta aaattaaaaa aactttttg 29

<210> 89

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 89

caaaaagttt ttttaatttt aatcaaaaaa tgtcaatgag taatattgtt gtttttgg 58

<210> 90

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 90

cgtcctctcg aaaggtggtt aattcaaatt aattgatata gttttttaat g 51

<210> 91

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 91

aagggccatg accacctgat gcaccaatta ggtaggtctg gctatgtcta tacctctggc 60

aattcgccct atagtgagtc g 81

<210> 92

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 92

cacctttcga gaggacgatg cccgtgtcta aatgattcga ccagcctaag aatgttcaac 60

gagctccagc ttttgttccc tttagtg 87

<210> 93

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 93

gcatcgtcct ctcgaaaggt gtcgagttta tcattatcaa tactgcc 47

<210> 94

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 94

atttaactcc ttaagttact ttaatgattt ag 32

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 95

gcgaatttct tatgatttat g 21

<210> 96

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 96

gattaatata attatataaa aatattatct tcttttc 37

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 97

ctggtttgtt ttacaaccaa aag 23

<210> 98

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 98

aactctttca taaaatggta tctttaactt tttatttaat cgtaatg 47

<210> 99

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 99

aatgacaagt ttcatcatc 19

<210> 100

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 100

gcaatctaat ctaagtttta attacaaagt tactccgcaa cgcttttctg aacg 54

<210> 101

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 101

gcaatctaat ctaagtttta attacaaaat gaacaggatt aagaatacat tttctg 56

<210> 102

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 102

ctagtgtctc ccgtcttctg tttaccaata gtttggaaat aagtatc 47

<210> 103

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 103

ctataactac aaaaaacaca tacataaact aaaaatgacc ttggcacccc tagac 55

<210> 104

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 104

gactaataat tcttagttaa aagcacttca gttcaaatca gtaacaacc 49

<210> 105

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 105

gtcgacgcgt aagcttgtgg gccctatcat gatgctgtaa tagcagaatc 50

<210> 106

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 106

ctacttttta caacaaatat aacaaaatgg aaggtggtgg tgctagaaat g 51

<210> 107

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 107

ctataactac aaaaaacaca tacataaact aaaaatgcca gagtatacgc tactg 55

<210> 108

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 108

gactaataat tcttagttaa aagcacttca tatatcatat ctacgatcat cg 52

<210> 109

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 109

gtgaaggaac aactcgtgtc tc 22

<210> 110

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 110

gaggatacgt acatatgcaa gc 22

<210> 111

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 111

tgccgtaaac cactaaatcg gaacc 25

<210> 112

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 112

tcagacttct taactcctgt aaaaacaaaa aaaaaaaaag gcatagcaat aagctggagc 60

tcatagcttc 70

<210> 113

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 113

gtgcctattg atgatctggc ggaatgtctg ccgtgccata gccatgcctt cacatatagt 60

ccgcaaatta aagccttcga g 81

<210> 114

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 114

actatatgtg aaggcatggc tatggcacgg cagacattcc gccagatcat caataggcac 60

cttcgtacgc tgcaggtcga c 81

<210> 115

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 115

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc actcatcaaa 60

ttccgtacat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

<210> 116

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 116

gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac atgtacggaa 60

tttgatgagt gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120

<210> 117

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 117

ataaaatatc aaaacgccga tgagacaggc aggataaagt gacagattca gttatacatt 60

tttattagca ttgatattat tattttaaaa agtctattta cttgtatatt tatccgaata 120

<210> 118

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 118

tattcggata aatatacaag taaatagact ttttaaaata ataatatcaa tgctaataaa 60

aatgtataac tgaatctgtc actttatcct gcctgtctca tcggcgtttt gatattttat 120

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 119

ttttgcaaca tccgggcatg 20

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 120

cggctagctg gtatggatcg 20

<210> 121

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 121

atagcttcaa aatgtttcta ctcc 24

<210> 122

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 122

tgcgacagaa gaaagggaag 20

<210> 123

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 123

cgtctatgag gagactgtta g 21

<210> 124

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 124

ggagtagaaa cattttgaag ctatacgtga ccacttcgag agc 43

<210> 125

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 125

gcaatctaat ctaagtttta attacaaaat gactgtcacc ataaaagaat tg 52

<210> 126

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 126

gtgctagtgt ctcccgtctt ctgttcatat tttcttctgc aatttcatat ag 52

<210> 127

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 127

gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatcctg cataatcggc ctcac 45

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 128

ctcgccaagg cattaccatc 20

<210> 129

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 129

gagaacgaga ggacccaac 19

<210> 130

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 130

ggttccgatt tagtggttta cggcaacgtg accacttcga gagc 44

<210> 131

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 131

gtcgacgcgt aagcttgtgg gccctatcat attttcttct gcaatttcat atag 54

<210> 132

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 132

ctacttttta caacaaatat aacaaaatga ctgtcaccat aaaagaattg 50

<210> 133

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 133

ggtagaccaa tgtagcgctc ttactttatc attttttcaa cgcttccttt tg 52

<210> 134

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 134

gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa atgtctatag caagttatgc ccaag 55

<210> 135

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 135

ggcagtattg ataatgataa actcgacctg cataatcggc ctcac 45

<210> 136

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 136

gactaataat tcttagttaa aagcactcta ccatccatgc tcgaacaac 49

<210> 137

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 137

gactaataat tcttagttaa aagcactcta ccatccatgc tcgaacaac 49

<210> 138

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 138

gcatatggga gatggagatg atacctcctg cataatcggc ctcac 45

<210> 139

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 139

gggtaccggc cgcaaattaa agccttcgag cgtccc 36

<210> 140

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 140

gtgttcattg tacgtcctag ac 22

<210> 141

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 141

gtgcccaaag ctaagagtc 19

<210> 142

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 142

ctgctcttga atggcgac 18

<210> 143

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 143

gtcgccattc aagagcagca tcgtcctctc gaaaggtg 38

<210> 144

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 144

cgaatcttcc catgcctgca ggtggtcatg gccctt 36

<210> 145

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 145

caggcatggg aagattcg 18

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 146

ctggtgagga tttacggtat g 21

<210> 147

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 147

gtgcgttatc gggttcttac 20

<210> 148

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 148

caggttagtt acttgctcta tg 22

<210> 149

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 149

cagtattgat aatgataaac tcgaaatcag acgcacgctt g 41

<210> 150

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 150

ctttaatttg cggccggtac ccttacgtgg attgagccag 40

<210> 151

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 151

gattgtcata ataggagcta tttg 24

<210> 152

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 152

ccatagtatt actattggtg ttcat 25

<210> 153

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 153

gttatcggtt gtgatattgt tc 22

<210> 154

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 154

ttaagctatt gtttcggcaa tt 22

<210> 155

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 155

cgtgcgauct ctataaaaaa tgtgcgaac 29

<210> 156

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 156

atgacagaut ggtgttgtgg ttctgtg 27

<210> 157

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 157

gagatctttg tgttcggtta c 21

<210> 158

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 158

agtctcgtat gtcggctc 18

<210> 159

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 159

tgtgtccgcg tttctaag 18

<210> 160

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 160

gaggtggtta ttgatcacca g 21

<210> 161

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 161

acgaatcgtt aggcacag 18

<210> 162

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 162

gtgcaatacc aaaatcg 17

<210> 163

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 163

gcagttgttt ggattaaaaa gctgtacg 28

<210> 164

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 164

ccttgtgtca tcatttactc caggc 25

<210> 165

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 165

gtagagtctt agctgcagtt ggtatg 26

<210> 166

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 166

cagggcatta ttactgacgg catg 24

<210> 167

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 167

ctacagcacc tttgaaagaa ggtgtc 26

<210> 168

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 168

gttgatggtg tcgtagacgt cag 23

<210> 169

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 169

ggaacgtgga tttaccccag 20

<210> 170

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 170

gttatcggtt gtgatattgt tcctgc 26

<210> 171

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 171

caaagcgatg ggctccagac 20

<210> 172

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 172

cattccgcag ttaacatgtg gtc 23

<210> 173

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 173

gtgttcattg tacgtcctag actcaaac 28

<210> 174

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 174

cgtgcgttat cgggttctta c 21

<210> 175

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 175

ggaacactgg ggcaataggc tgtcgccatt caagagcagc atcgtcctct cgaaaggtg 59

<210> 176

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 176

ctattgtaat tcaaaaaaaa aaagcgaatc ttcccatgcc tgcaggtggt catggccctt 60

<210> 177

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 177

cttgcataaa ttggtcaatg caag 24

<210> 178

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 178

cgatgacctc ccattgatat ttaag 25

<210> 179

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 179

catcgtcaat ttgtgatcga agac 24

<210> 180

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 180

cattcgccag gtagcttac 19

<210> 181

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 181

tgcattttga gcgttgaaca a 21

<210> 182

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 182

gtgccctgtt ctctgtagtt 20

<210> 183

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 183

atcgggccct ccttactgct ctccttccgt gtaacgcgtt tgccgtaaac cactaaatcg 60

<210> 184

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 184

cgttaagaaa aatttcgaga gagtcgccga tagtagattt tcaacatcgt attttcc 57

<210> 185

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 185

cctccttact gctctccttc cgtgtaacgc gttatagctt caaaatgttt ctactcc 57

<210> 186

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 186

ttatcgagct aactattttc gacacacatg 30

<210> 187

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 187

cgtcgcccag taagtgagac ta 22

<210> 188

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 188

gaaagcatag caatctaatc taagttttaa ttacaaaatg tcaatgagta atattgttg 59

<210> 189

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 189

aagttgtgtg ctagtgtctc ccgtcttctg tctaccatcc atgctcgaac a 51

<210> 190

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 190

ctcgcctagt aaataaacga taaacaaatt tgaagtagta gatacacgta tctcgacatg 60

<210> 191

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 191

gaatgcaaca ccgtagcatg aatcttgaga ttgcatctga taatgggtta gtagtttat 59

<210> 192

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 192

tctccgcagt gaaagataaa tgatcaattt acgaaaaata aaggcgtttt agagctagaa 60

atagcaagtt 70

<210> 193

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 193

aacttgctat ttctagctct aaaacgcctt tatttttcgt aaattgatca tttatctttc 60

actgcggaga 70

<210> 194

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 194

aataaaggca aaaacagtgg tcgtgtgaga aatctatttt ttcgaaatta cttacacttt 60

<210> 195

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 195

aaagtgtaag taatttcgaa aaaatagatt tctcacacga ccactgtttt tgcctttatt 60

<210> 196

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 196

ggtcacccac ccatatacgg 20

<210> 197

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 197

tgtcctccgg ataactgcac 20

<210> 198

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 198

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc aatttacgaa 60

aaataaaggc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

<210> 199

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 199

gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac gcctttattt 60

ttcgtaaatt gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120

<210> 200

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 200

tctttttttg ttcccaacaa gaagtgagtt aataaaggca aaaacagtgg tcgtgtgaga 60

aatctatttt ttcgaaatta cttacacttt tgacggctag aaaaggatat acatacatat 120

<210> 201

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 201

atatgtatgt atatcctttt ctagccgtca aaagtgtaag taatttcgaa aaaatagatt 60

tctcacacga ccactgtttt tgcctttatt aactcacttc ttgttgggaa caaaaaaaga 120

<210> 202

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 202

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc atcttcaaat 60

ccactacata gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

<210> 203

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 203

gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac tatgtagtgg 60

atttgaagat gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120

<210> 204

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 204

ttgtacgctt cacatagtag ttcagtcaag aagagcaaac actaataagc aataaatcta 60

ggagaatata catatatatg catatgtttg tttagctaaa taattttatt gagctttgct 120

<210> 205

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 205

agcaaagctc aataaaatta tttagctaaa caaacatatg catatatatg tatattctcc 60

tagatttatt gcttattagt gtttgctctt cttgactgaa ctactatgtg aagcgtacaa 120

<210> 206

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 206

acaccaatat tctgcacctg c 21

<210> 207

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 207

tgctggagaa gatcgtacgc 20

<210> 208

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 208

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc ttagtagttt 60

ttggaaggat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

<210> 209

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 209

gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac atccttccaa 60

aaactactaa gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120

<210> 210

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 210

ttctttttta tattttttag gttttcatat agtgtcttac gcaaataggc ggaccataga 60

aaagccgcca tttgtgtctc ctcatactta catagaatag ccctcttcta ttatccttcg 120

<210> 211

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 211

cgaaggataa tagaagaggg ctattctatg taagtatgag gagacacaaa tggcggcttt 60

tctatggtcc gcctatttgc gtaagacact atatgaaaac ctaaaaaata taaaaaagaa 120

<210> 212

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 212

tacagctcgc tccttgcatc 20

<210> 213

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 213

gcttgcttgg agggcttttc 20

<210> 214

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 214

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc aagaaccctt 60

tatcataatt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

<210> 215

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 215

gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac aattatgata 60

aagggttctt gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120

<210> 216

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 216

ttttttgatt gttctacaac tttttcatag taatcaaaac ctttgaattt caaacttact 60

aggatatatt taaccacgac tttcgcaaga gagacggagg gggtgggaaa aggctgaatg 120

<210> 217

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 217

cattcagcct tttcccaccc cctccgtctc tcttgcgaaa gtcgtggtta aatatatcct 60

agtaagtttg aaattcaaag gttttgatta ctatgaaaaa gttgtagaac aatcaaaaaa 120

<210> 218

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 218

tcatccaggt ttcagcacgg 20

<210> 219

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 219

agctcgaaca aggtgtcagg 20

<210> 220

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 220

gattacttac caatgtgcca taaactccgt gcaccaatag cttcaaaatg tttctactcc 60

<210> 221

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 221

cttgggttgt gggcaattgg gtgtactatg aagcattttc aacatcgtat tttccgaagc 60

<210> 222

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 222

gcaatctaat ctaagtttta attacaaaat ggcacaagaa atcactc 47

<210> 223

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 223

gtgctagtgt ctcccgtctt ctgtctaatt taattccttg gctgc 45

<210> 224

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 224

gaccatcact aaagcttctc tctta 25

<210> 225

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 225

ttgagcaatt catcgacaac aagag 25

<210> 226

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 226

agaaccagaa ccagatccta ttttcttctg caatttcata tag 43

<210> 227

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 227

ggatctggtt ctggttctat ggcacaagaa atcactc 37

<210> 228

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 228

agaaccagaa ccagatccat ttaattcctt ggctgc 36

<210> 229

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 229

ggatctggtt ctggttctat gactgtcacc ataaaagaat tg 42

<210> 230

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 230

gattacttac caatgtgcca taaactccgt gcaccatgcc gtaaaccact aaatcggaac 60

<210> 231

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 231

tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc ttcttagatt 60

actattatat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120

<210> 232

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 232

gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac atataatagt 60

aatctaagaa gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120

<210> 233

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 233

atagttattt tgaaataata actaccatta gaactaacaa aagaaaagaa aaaaaaaata 60

taccatttgc aagacattgt ataatatttt tgttgaaagt ctttttcgat tcataagcgc 120

<210> 234

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 234

gcgcttatga atcgaaaaag actttcaaca aaaatattat acaatgtctt gcaaatggta 60

tatttttttt ttcttttctt ttgttagttc taatggtagt tattatttca aaataactat 120

<210> 235

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 235

ctcatcgcat gccaacgaag 20

<210> 236

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 236

gcagcaaagc caacccttac 20

<210> 237

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 237

gcaatctaat ctaagtttta attacaaaat gtctgttcac tctatcttg 49

<210> 238

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 238

gtgctagtgt ctcccgtctt ctgtttattc aaccatcttc tttgg 45

<210> 239

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 239

caatgtagcg ctcttacttt attatttcaa gtccttgaaa ttacc 45

<210> 240

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 240

ctggagctca gtttatcatt at 22

<210> 241

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 241

actatagggc gaattgggta c 21

<210> 242

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 242

ataatgataa actgagctcc agagtctcgt atgtcggctc 40

<210> 243

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 243

gtacccaatt cgccctatag ttgtgtccgc gtttctaag 39

<210> 244

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 244

ggtagaccaa tgtagcgctc ttactttatt attcaaccat cttctttgga ac 52

<210> 245

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 245

gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa atgtctgttc actctatctt gt 52

<210> 246

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 246

ctataactac aaaaaacaca tacataaact aaaaatgccg tttggaatag acaacac 57

<210> 247

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 247

gactaataat tcttagttaa aagcacttta ccagacatct tcttggtatc 50

<210> 248

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 248

tggtcacaca acttgtctg 19

<210> 249

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 249

ggtactggtg gtttcacttg 20

<210> 250

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 250

gtagtgatca ttggcttaac g 21

<210> 251

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 251

gttccgattt agtggtttac ggcagtgaca ataaattcaa accggt 46

<210> 252

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 252

gcttcggaaa atacgatgtt gaaaatcaac tcagaagttt gacagc 46

<210> 253

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 253

tcgttagatt ctgtatccct a 21

<210> 254

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 254

ggagtagaaa cattttgaag ctatgtgaca ataaattcaa accggt 46

<210> 255

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 255

atttgtgatc gaagacgaag ag 22

<210> 256

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 256

tcaagaagcc actacgtg 18

<210> 257

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 257

actagaacat taccatatgt agtg 24

<210> 258

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 258

caacttggac gttcttctac 20

<210> 259

<211> 619

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 259

Met Ser Lys Gly Thr Thr Ser Leu Asp Ala Pro Phe Gly Thr Leu Leu

1 5 10 15

Gly Tyr Ala Pro Gly Gly Val Ala Ile Tyr Ser Ser Asp Tyr Ser Ser

20 25 30

Leu Asp Pro Gln Glu Tyr Glu Asp Asp Ala Val Phe Arg Ser Tyr Ile

35 40 45

Asp Asp Glu Tyr Met Gly His Lys Trp Gln Cys Val Glu Phe Ala Arg

50 55 60

Arg Phe Leu Phe Leu Asn Tyr Gly Val Val Phe Thr Asp Val Gly Met

65 70 75 80

Ala Trp Glu Ile Phe Ser Leu Arg Phe Leu Arg Glu Val Val Asn Asp

85 90 95

Asn Ile Leu Pro Leu Gln Ala Phe Pro Asn Gly Ser Pro Arg Ala Pro

100 105 110

Val Ala Gly Ala Leu Leu Ile Trp Asp Lys Gly Gly Glu Phe Lys Asp

115 120 125

Thr Gly His Val Ala Ile Ile Thr Gln Leu His Gly Asn Lys Val Arg

130 135 140

Ile Ala Glu Gln Asn Val Ile His Thr Pro Leu Pro Gln Gly Gln Gln

145 150 155 160

Trp Thr Arg Glu Leu Glu Met Val Val Glu Asn Gly Gly Tyr Thr Leu

165 170 175

Lys Asp Thr Phe Asp Asp Thr Thr Ile Leu Gly Trp Met Ile Gln Thr

180 185 190

Glu Asp Thr Glu Tyr Ser Leu Pro Gln Pro Glu Ile Ala Gly Glu Leu

195 200 205

Leu Lys Ile Ser Gly Ala Arg Leu Glu Asn Lys Gly Gln Phe Asp Gly

210 215 220

Lys Trp Leu Asp Glu Lys Asp Pro Leu Gln Asn Ala Tyr Val Gln Ala

225 230 235 240

Asn Gly Gln Val Ile Asn Gln Asp Pro Tyr His Tyr Tyr Thr Ile Thr

245 250 255

Glu Ser Ala Glu Gln Glu Leu Ile Lys Ala Thr Asn Glu Leu His Leu

260 265 270

Met Tyr Leu His Ala Thr Asp Lys Val Leu Lys Asp Asp Asn Leu Leu

275 280 285

Ala Leu Phe Asp Ile Pro Lys Ile Leu Trp Pro Arg Leu Arg Leu Ser

290 295 300

Trp Gln Arg Arg Arg His His Met Ile Thr Gly Arg Met Asp Phe Cys

305 310 315 320

Met Asp Glu Arg Gly Leu Lys Val Tyr Glu Tyr Asn Ala Asp Ser Ala

325 330 335

Ser Cys His Thr Glu Ala Gly Leu Ile Leu Glu Arg Trp Ala Glu Gln

340 345 350

Gly Tyr Lys Gly Asn Gly Phe Asn Pro Ala Glu Gly Leu Ile Asn Glu

355 360 365

Leu Ala Gly Ala Trp Lys His Ser Arg Ala Arg Pro Phe Val His Ile

370 375 380

Met Gln Asp Lys Asp Ile Glu Glu Asn Tyr His Ala Gln Phe Met Glu

385 390 395 400

Gln Ala Leu Gln Gln Ala Gly Phe Glu Thr Arg Ile Leu Arg Gly Leu

405 410 415

Asp Glu Leu Gly Trp Asp Ala Ala Gly Gln Leu Ile Asp Gly Glu Gly

420 425 430

Arg Leu Val Asn Cys Val Trp Lys Thr Trp Ala Trp Glu Thr Ala Phe

435 440 445

Asp Gln Ile Arg Glu Val Ser Asp Arg Glu Phe Ala Ala Val Pro Ile

450 455 460

Arg Thr Gly His Pro Gln Asn Glu Val Arg Leu Ile Asp Val Leu Leu

465 470 475 480

Arg Pro Glu Val Leu Val Phe Glu Pro Leu Trp Thr Val Ile Pro Gly

485 490 495

Asn Lys Ala Ile Leu Pro Ile Leu Trp Ser Leu Phe Pro His His Arg

500 505 510

Tyr Leu Leu Asp Thr Asp Phe Thr Val Asn Asp Glu Leu Val Lys Thr

515 520 525

Gly Tyr Ala Val Lys Pro Ile Ala Gly Arg Cys Gly Ser Asn Ile Asp

530 535 540

Leu Val Ser His His Glu Glu Val Leu Asp Gln Thr Ser Gly Lys Phe

545 550 555 560

Ala Glu Gln Lys Asn Ile Tyr Gln Gln Leu Trp Cys Leu Pro Lys Val

565 570 575

Asp Gly Lys Tyr Ile Gln Val Cys Thr Phe Thr Val Gly Gly Asn Tyr

580 585 590

Gly Gly Thr Cys Leu Arg Gly Asp Glu Ser Leu Val Ile Lys Lys Glu

595 600 605

Ser Asp Ile Glu Pro Leu Ile Val Val Lys Glu

610 615

<210> 260

<211> 1860

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 260

atgagtaaag ggaccaccag tttggacgcc ccttttggaa cattgttagg atacgcccct 60

gggggggtag caatttatag cagtgactat tcctcactgg acccacaaga atatgaagat 120

gatgccgtct tccgtagtta tatagatgat gaatacatgg gccataaatg gcaatgcgtt 180

gagtttgcta ggcgtttctt attcttgaac tatggtgtcg tatttactga cgtgggaatg 240

gcttgggaga tattctctct aagatttctg cgtgaggtcg tcaatgataa catcctgccg 300

ttacaagcat ttccaaatgg ttcacccaga gcccctgtag ctggtgctct actaatatgg 360

gataaaggag gtgaatttaa ggatactggg cacgtagcga taattacgca attacacggc 420

aacaaagtaa gaattgcaga acaaaatgtc atccatacac cactacctca aggacaacag 480

tggactagag agctagaaat ggttgtggaa aacggtgggt atacgttaaa agatacgttc 540

gacgatacca ccattcttgg ttggatgatc cagacggaag acactgagta ctctctgcca 600

cagcctgaga ttgccggcga attattgaaa atcagcggag cacgtttgga aaacaaaggg 660

caattcgacg ggaagtggct ggatgagaaa gatcctttac agaacgccta cgtacaagcc 720

aacgggcagg ttatcaacca agacccgtat cattattaca cgattacaga aagtgccgag 780

caggagctaa tcaaggccac aaacgagtta caccttatgt acttgcatgc cacggacaag 840

gtcttgaaag acgacaatct tttagcccta tttgacattc ctaagatcct atggcctagg 900

ctacgtttat cctggcagcg taggcgtcac cacatgatca cgggacgtat ggacttctgc 960

atggatgaac gtgggctgaa ggtttatgaa tacaacgccg actctgccag ttgccataca 1020

gaagctggcc ttatcctgga gagatgggct gagcaggggt acaaaggaaa cggattcaac 1080

ccagccgaag gattaatcaa cgaactggcc ggtgcatgga agcatagcag ggctcgtcca 1140

ttcgtccata tcatgcagga caaggatatc gaggaaaatt accatgcgca gtttatggaa 1200

caagcactac aacaagctgg gtttgagacc cgtatactaa ggggccttga tgagcttggc 1260

tgggacgctg ctggccagtt gattgatgga gaaggacgtc ttgtgaattg cgtttggaaa 1320

acgtgggcat gggagacagc cttcgatcag ataagagaag tatcagatag agaatttgct 1380

gctgtaccga ttagaacagg ccacccgcaa aacgaagtaa gactgataga cgtattgtta 1440

agacctgagg tgctggtttt tgaacctctt tggacagtaa tacctggaaa caaagcaata 1500

cttccgatct tatggtcact attcccgcac cacaggtatt tgttggacac cgattttact 1560

gtcaacgatg aactggtcaa gacggggtac gcggtcaaac ccatagctgg ccgttgtggc 1620

agtaatatag atttggtatc tcatcacgag gaggtcttgg atcaaactag tgggaaattt 1680

gccgaacaga aaaatattta tcagcagctg tggtgcttgc ctaaagttga tgggaaatat 1740

attcaagtct gtacttttac agtgggaggt aattacggag gcacgtgttt gagaggtgac 1800

gaatcacttg taataaagaa agagtctgat attgagccct taattgtagt gaaggaatag 1860

Claims

1.能够生产谷胱甘肽-多胺缀合物的酵母细胞，其中

所述酵母细胞能够生产至少一种多胺；

所述酵母细胞包含多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因；

所述酵母细胞包含至少一种多胺合酶编码基因；并且

所述酵母细胞缺少多胺氧化酶编码基因或包含扰乱的多胺氧化酶编码基因。

2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞被工程化以用于多胺:谷胱甘肽连接酶的过量表达。

3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述谷胱甘肽-多胺缀合物选自锥虫胱甘肽、N ¹-谷胱甘酰基亚精胺、N ¹⁰-谷胱甘酰基亚精胺、N ¹ ,N ¹⁰-双(谷胱甘酰基)精胺、N ¹ ,N ⁵ ,N ¹⁰-三(谷胱甘酰基)精胺和N ¹ ,N ⁵ ,N ¹⁰ ,N ¹⁴-四(谷胱甘酰基)精胺。

4.根据权利要求1-3的任一项所述的酵母细胞，其中所述多胺:谷胱甘肽连接酶编码基因选自锥虫胱甘肽合酶、谷胱甘酰基亚精胺合酶及其组合。

5. 根据权利要求4所述的酵母细胞，其中所述锥虫胱甘肽合酶编码基因选自布氏锥虫指名亚种(Trypanosoma brucei brucei) TbbTryS和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与锥虫胱甘肽合酶TbbTryS具有至少80%的序列同一性的锥虫胱甘肽合酶。

6. 根据权利要求4或5所述的酵母细胞，其中所述谷胱甘酰基亚精胺合酶(GSS)编码基因选自大肠杆菌(Escherichia coli) EcGSS和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与谷胱甘酰基亚精胺合酶EcGSS具有至少80%的序列同一性的谷胱甘酰基亚精胺合酶。

7.根据权利要求1-6的任一项所述的酵母细胞，其中所述至少一种多胺选自精胺、热精胺、对称-高亚精胺、1,3-二氨基丙烷、腐胺、尸胺、胍丁胺、亚精胺、对称-降亚精胺、降精胺及其组合。

8.根据权利要求1-7的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞被工程化以用于所述至少一种多胺合酶的过量表达。

9.根据权利要求1-8的任一项所述的酵母细胞，其中所述多胺合酶编码基因选自精胺合酶编码基因、热精胺合酶编码基因和高亚精胺合酶编码基因。

10. 根据权利要求9所述的酵母细胞，其中所述精胺合酶编码基因选自酿酒酵母(Saccharomcyes cerevisiae) SPE4、拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtSPMS和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与精胺合酶SPE4或精胺合酶AtSPMS具有至少80%的序列同一性的精胺合酶。

11.根据权利要求9或10所述的酵母细胞，其中所述热精胺合酶编码基因选自拟南芥AtACL5和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与热精胺合酶AtACL5具有至少80%的序列同一性的热精胺合酶。

12. 根据权利要求9-11的任一项所述的酵母细胞，其中所述高亚精胺合酶编码基因选自春千里光(Senecio vernalis) SvHSS和绿色芽生绿菌(Blastochloris viridis) BvHSS和核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与高亚精胺合酶SvHSS或高亚精胺合酶BvHSS具有至少80%的序列同一性的高亚精胺合酶。

13.根据权利要求1-12的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞并且所述多胺氧化酶为FMS1。

14. 生产谷胱甘肽-多胺缀合物的方法，所述方法包含：

在培养基中并且在适合于通过根据权利要求1-13的任一项所述的酵母细胞生产所述谷胱甘肽-多胺缀合物的培养条件下培养所述酵母细胞；以及

从所述培养基和/或从所述酵母细胞中收集所述谷胱甘肽-多胺缀合物。