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CN114574426A - 一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3d类器官培养的方法 - Google Patents

一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3d类器官培养的方法 Download PDF

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CN114574426A
CN114574426A CN202210085801.7A CN202210085801A CN114574426A CN 114574426 A CN114574426 A CN 114574426A CN 202210085801 A CN202210085801 A CN 202210085801A CN 114574426 A CN114574426 A CN 114574426A
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small intestine
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organoid
crypt stem
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张昊
魏文焯
陈芳
罗祥
吴艳
梁振华
皮劲松
潘爱銮
申杰
杜金平
孙静
黄涛
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Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
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Abstract

本发明属于动物组织分离和培养技术领域。具体涉及一种鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养的方法。本发明首次在鸭肠道领域提出3D类器官培养，并通过调整消化液的配比与浓度、水平摇床低温消化的时间与次数，优化鸭小肠隐窝干细胞的分离技术，使获得的鸭小肠隐窝干细胞形态更加完整，存活率与出芽率更高。本发明优化了用于培养鸭小肠隐窝干细胞的培养基的配方，使鸭小肠隐窝干细胞能更好的分化形成3D类器官。本发明确定了鸭小肠隐窝干细胞的分离条件与最佳培养方法，为后续利用鸭小肠3D类器官研究肠道隐窝干细胞功能奠定了良好的基础。

Description

一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3D类器官培养的方法
技术领域
本发明属于动物组织分离和培养技术领域。具体涉及一种鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养的方法。
背景技术
随着人类对生命科学研究的不断深入，模型系统已经成为相关研究的重要工具。传统用于肠道生理病理研究的模型是由某单一种类细胞构成的，而肠道各部分具有独特生理功能与组织结构，传统单细胞模型无法做到真实模拟肠道的结构、形态及功能的作用，严重限制了肠道健康功能调控的研究。近年来，肠道3D类器官的发展为肠道健康研究提供了一个新的模型。类器官(organoids)来源于干细胞或器官祖细胞，是利用干细胞增殖分化的特性进行体外3D培养后形成的细胞团。类器官与来源器官的关系紧密，具有来源器官的三维细胞结构，可重现来源器官的部分功能与空间构架，可真实的反应肠道内的生理和病理过程。
目前人和小鼠的肠道3D类器官模型的研究已经比较成熟，人们能够在体外稳定传代培养人和小鼠的肠道3D类器官，且能长期冻存和复苏，已被广泛应用。
肠道是机体消化吸收营养物质的主要器官，也是防止肠道微生物侵袭的先天屏障，肠道健康对机体至关重要。鸭肠道损伤会导致生产力下降、抗病力差甚至死亡，给养殖户带来严重的经济损失，目前人们主要利用传统的2D单细胞培养来进行鸭肠道损伤的相关研究，但由于2D培养的种种缺点，很难真实的反映鸭肠道内的生理与病理情况。类器官培养是一种新型的3D模型，可真实反映肠道内的病理与生理情况，但目前有关鸭肠道类器官培养的相关文章却鲜见报道。
发明内容
本发明的目的在于建立稳定的鸭小肠隐窝干细胞的分离鉴定方法和鸭小肠3D类器官模型培养方法。本发明通过参考小鼠、猪、鸡等动物的肠道隐窝干细胞分离和3D类器官培养方法，建立了稳定的鸭小肠隐窝干细胞分离和3D类器官培养技术。
为达到上述技术目的，本发明具体技术方案如下：
首先，本发明提供一种鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下分离啄壳鸭胚小肠，洗涤后剥离肠系膜，纵向将肠道剖开，剪成小块后用冰DPBS缓冲液冲洗干净；
(2)转移至消化液中4℃摇晃消化15min；
(3)离心沉淀换新的消化液4℃摇晃消化45min；
(4)DPBS清洗一遍，再加入冰DPBS轻柔吹打肠段，将悬液转移至新的离心管中，即为隐窝悬液。
具体的，所述步骤(2)和(3)中消化液为含2.5mmol/L EGTA和0.5％葡萄糖的冰DPBS缓冲液。
具体的，所述步骤(2)和(3)中摇晃的条件为摇床转数100r/min。
具体的，所述步骤(4)中冰DPBS清洗和冰DPBS轻柔吹打肠段的步骤重复4～5次，最终收集的悬液即为隐窝悬液。
其次，本发明提供一种鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法，包括以下步骤：
(a)将上述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法得到的隐窝悬液离心后弃上清，冰PBS缓冲液重悬后铺于24孔板中，吸弃PBS，用4％多聚甲醛溶液固定；
(b)吸弃多聚甲醛，用DPBS洗涤隐窝干细胞3次，每次3min；
(c)吸弃DPBS，加入适量胎牛血清封闭30min；
(d)吸弃胎牛血清，加入稀释好的Lgr5一抗37℃封闭2小时，用PBS洗涤3次，每次3min；
(e)加入稀释好的FITC二抗，避光封闭30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(f)利用Dapi试剂对细胞核进行染色，时间为5-8min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(g)利用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，时间为30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(h)染色完成后利用荧光显微镜对染色结果进行拍照记录。
最后，本发明还提供一种鸭小肠3D类器官培养的方法，制备类器官生长培养基和类器官分化培养基，将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液计数后，去上清重悬隐窝干细胞铺于24孔板中，依次加入类器官生长培养基和更换类器官分化培养基。
具体的，所述类器官生长培养基，其配方为：Wnt3a 40μl；R-spondin1 40μl；Noggin 40μl；B27 supplement 800μl；N2 supplement 400μl；n-Acetyl Cysteine 80μl；EGF 40μl；SB202190 40μl；Y27632 40μl；Nicotinamide 400μl；GastrinⅠ20μl；A83-01 80μl；DMEM-F12 37.98ml，共40ml；所用的类器官分化培养基，其配方为：B27 supplement 800μl；R-spondin1 40μl；Noggin40μl；N2 supplement 400μl；n-Acetyl Cysteine 80μl；EGF40μl；Y27632 40μl；GastrinⅠ20μl；A83-01 80μl；LY2157299 40μl；Primocin 80μl；DAPT40μl；DMEM-F12 37.98ml，共40ml；培养条件为于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
具体的，所述隐窝悬液离心后弃上清，加入适量类器官生长培养基重悬后计数，计数完成后离心去上清，根据离心管内隐窝干细胞的个数加入适量且提前预冷的基质胶重悬隐窝干细胞，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中孵育30min。
具体的，待基质胶完全凝固后，加入提前预热的类器官生长培养基，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
具体的，隔天更换培养基，将类器官生长培养基换为类器官分化培养基，之后隔天换液。
培养4天左右(具体培养时间根据类器官的大小及数量决定)，可进行传代培养。
传代后隔天即可看到大量鸭小肠3D类器官，可直接用于实验研究。
另外，另外上述鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法和鸭小肠3D类器官培养的方法可应用于鸭小肠类器官相关研究中。
本发明的有益效果：1)本发明首次在鸭肠道领域提出3D类器官培养，并通过调整消化液的配比与浓度、水平摇床低温消化的时间与次数，优化鸭小肠隐窝干细胞的分离技术，使获得的鸭小肠隐窝干细胞形态更加完整，存活率与出芽率更高；2)本发明优化了用于培养鸭小肠隐窝干细胞的培养基的配方，使鸭小肠隐窝干细胞能更好的分化形成3D类器官；3)本发明确定了鸭小肠隐窝干细胞的分离条件与最佳培养方法，为后续利用鸭小肠3D类器官研究肠道健康调控机制奠定了良好的基础。
附图说明
图1：倒置式生物显微镜下观察到的新鲜分离的鸭小肠隐窝干细胞形态，比例尺为100μm；
图2：倒置式生物显微镜下观察到的隐窝干细胞免疫荧光染色结果，2A为免疫荧光染色前的隐窝干细胞，2B绿色部分为Lgr5蛋白所在位置，2C蓝色部分为细胞核所在位置，2D红色部分为细胞骨架；
图3：倒置式生物显微镜下观察到的传代后包埋于基质胶中的鸭小肠隐窝干细胞24h生长为3D类器官的效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所需的相关试剂与配方：
DMEM/F12培养液(货号：SH30023.01B)购自美国Hyclone公司；
胎牛血清(FBS，货号：10099141)、N2 supplement(货号：17502048)、B27supplement(货号：12587010)、EGF(货号：PHG0311)购自美国Gibco公司；
n-Acetyl Cysteine(货号：)、SB202190(货号：)、Y27632(货号：S1049)、GastrinⅠ(货号：)、LY2157299(货号：S2230)、DAPT(货号：)、A83-01(货号：)购自美国Selleck公司；
Primocin(货号：ant-pm-1)购自美国InvivoGen公司；
Wnt3a(货号：5036-WN-500)、R-spondin1(货号：4645-RS-250)购自美国R&DSystem公司；
Noggin(货号：96-250-38-100)购自美国PeproTech公司；
Matrigel胶(货号：356231)购自美国BD Biosciences公司；
DPBS购自武汉丁香园生物科技有限公司。
实施例1鸭小肠隐窝干细胞分离
将小量分装的基质胶放于4℃冰箱过夜融化；将DPBS溶液提前放于冰箱预冷，同时在隐窝分离试验前准备好冰盒；
(1)无菌采集26日龄左右啄壳鸭胚的小肠组织5-7cm，迅速置于含冰DPBS的无菌培养皿中；将培养皿放在冰上，利用眼科镊剥离肠道组织上的系膜与胰腺组织，用注射器吸取洁净的冰DPBS反复轻柔冲洗肠管内部，将肠道组织纵向剖开，用DPBS反复清洗；将肠道组织剪成1cm左右的小块，集中在50ml离心管中，加入冰20ml DPBS，利用移液枪吹打20次，静置后弃上清，再次加入冰DPBS20ml；重复清洗吹打，直至液体变澄清；
(2)将肠段组织转移至新的50ml离心管中，加入20ml消化液(利用DPBS配制而成，含有2.5mmol/L EGTA，0.5％的10％葡萄糖溶液)；将离心管置于水平摇床上，4℃100r/min，消化15min；
(3)将离心管中的消化液吸弃，加入20ml新的消化液，以相同条件消化45min；
(4)吸弃离心管中的消化液并用冰DPBS洗涤一遍，再加入冰DPBS轻柔吹打肠段，用移液枪反复吹打肠道组织，待肠道组织沉降后收集悬液至新的离心管中，重复此步骤4-5次，收集的悬液即为隐窝悬液。
悬液中隐窝干细胞形态如图1所示。鸭小肠隐窝干细胞的分离。从倒置式生物显微镜下可见分离的隐窝干细胞形态完整，数量较多，说明本发明的方法分离效果良好。
实施例2鸭小肠隐窝干细胞鉴定
在隐窝干细胞鉴定试验前，按照试剂说明书将Lgr5一抗与FITC荧光二抗按比例稀释备用。
(1)将所得的隐窝悬液离心后弃上清，加入适量冰PBS缓冲液重悬后铺于24孔板中，吸弃PBS，用4％多聚甲醛溶液固定30min；
(2)吸弃多聚甲醛，用DPBS洗涤隐窝干细胞3次，每次3min；
(3)吸弃DPBS，加入适量胎牛血清封闭30min；
(4)吸弃胎牛血清，加入稀释好的Lgr5一抗37℃封闭2小时，用PBS洗涤3次，每次3min；
(5)加入稀释好的FITC二抗，避光封闭30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(6)利用Dapi试剂对细胞核进行染色，时间为5-8min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(7)利用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，时间为30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(8)染色完成后利用荧光显微镜对染色结果进行拍照记录。
隐窝干细胞免疫荧光染色结果如图2所示。鸭小肠隐窝干细胞的鉴定。从倒置式生物显微镜下可见明显的三色荧光，绿色荧光即为干细胞标志物Lgr5蛋白，蓝色荧光为细胞核，而红色荧光为细胞骨架。说明本试验成功分离出鸭小肠隐窝干细胞，分离效果良好。
实施例3鸭小肠3D类器官培养
(1)将所得的隐窝悬液离心后弃上清，加入适量类器官生长培养基重悬后计数；
(2)计数完成后离心去上清，根据离心管内隐窝干细胞的个数加入适量且提前预冷的基质胶重悬隐窝干细胞，隐窝干细胞个数与基质胶体积(μl)的比例大概为12:1，铺于24孔板中，每孔50μl基质胶，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育30min；
(3)待基质胶完全凝固后，加入提前预热的类器官生长培养基，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养；
(4)隔天更换培养基，将类器官生长培养基换为类器官分化培养基，之后隔天换液；
(5)培养8天左右(具体培养时间根据类器官的大小及数量决定)，可直接用于实验研究。图3为倒置式生物显微镜下观察到的传代后包埋于基质胶中的鸭小肠隐窝干细胞24h生长为3D类器官的效果图，其中A-H依次为3h，6h，9h，12h，15h，18h，21h，24h的倒置式生物显微镜观察的结果图。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在无菌条件下分离啄壳鸭胚小肠，洗涤后剥离肠系膜，纵向将肠道剖开，剪成小块后用冰DPBS缓冲液冲洗干净；
(2)转移至消化液中4℃摇晃消化15min；
(3)离心沉淀换新的消化液4℃摇晃消化45min；
(4)DPBS清洗一遍，再加入冰DPBS轻柔吹打肠段，将悬液转移至新的离心管中，即为隐窝悬液。
2.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中消化液为含2.5mmol/L EGTA和0.5％葡萄糖的冰DPBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中摇晃的条件为摇床转数100r/min。
4.根据权利要求1所述鸭小肠隐窝干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤(4)中冰DPBS清洗和冰DPBS轻柔吹打肠段的步骤重复4～5次，最终收集的悬液即为隐窝悬液。
5.一种鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液离心后弃上清，冰PBS缓冲液重悬后铺于24孔板中，吸弃PBS，用4％多聚甲醛溶液固定；
(b)吸弃多聚甲醛，用DPBS洗涤隐窝干细胞3次，每次3min；
(c)吸弃DPBS，加入适量胎牛血清封闭30min；
(d)吸弃胎牛血清，加入稀释好的Lgr5一抗37℃封闭2小时，用PBS洗涤3次，每次3min；
(e)加入稀释好的FITC二抗，避光封闭30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(f)利用Dapi试剂对细胞核进行染色，时间为5-8min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(g)利用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，时间为30min，用PBS洗涤3次，每次3min；
(h)染色完成后利用荧光显微镜对染色结果进行拍照记录。
6.权利要求5中鸭小肠隐窝干细胞鉴定的方法在鸭小肠类器官相关研究中的应用。
7.一种鸭小肠3D类器官培养的方法，其特征在于，制备类器官生长培养基和类器官分化培养基，将由权利要求1所述的方法得到的隐窝悬液计数后，去上清重悬隐窝干细胞铺于24孔板中，依次加入类器官生长培养基和更换类器官分化培养基，隐窝干细胞培养四天后进行传代。
8.根据权利要求7所述鸭小肠3D类器官培养的方法，其特征在于，所述类器官生长培养基，其配方为：Wnt3a 40μl；R-spondin1 40μl；Noggin 40μl；B27 supplement 800μl；N2supplement 400μl；n-Acetyl Cysteine 80μl；EGF 40μl；SB202190 40μl；Y27632 40μl；Nicotinamide 400μl；GastrinⅠ20μl；A83-01 80μl；DMEM-F12 37.98ml，共40ml；所用的类器官分化培养基，其配方为：B27 supplement 800μl；R-spondin1 40μl；Noggin 40μl；N2supplement 400μl；n-Acetyl Cysteine 80μl；EGF 40μl；Y27632 40μl；GastrinⅠ20μl；A83-01 80μl；LY2157299 40μl；Primocin 80μl；DAPT 40μl；DMEM-F12 37.98ml，共40ml；培养条件为于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
9.根据权利要求7所述鸭小肠3D类器官培养的方法，其特征在于，
所述隐窝悬液离心后弃上清，加入适量类器官生长培养基重悬后计数，计数完成后离心去上清，根据离心管内隐窝干细胞的个数加入适量且提前预冷的基质胶重悬隐窝干细胞，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中孵育30min后，加入500μl类器官生长培养基，再置于37℃培养箱中培养，隔天更换培养基，将类器官生长培养基换为类器官分化培养基，之后隔天换液，培养4天后进行传代。
10.权利要求7中鸭小肠3D类器官培养的方法在鸭小肠类器官相关研究中的应用。
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