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CN114555829A - 检测稀有序列变体的测定方法和试剂盒 - Google Patents

检测稀有序列变体的测定方法和试剂盒 Download PDF

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CN114555829A CN202080069243.4A CN202080069243A CN114555829A CN 114555829 A CN114555829 A CN 114555829A CN 202080069243 A CN202080069243 A CN 202080069243A CN 114555829 A CN114555829 A CN 114555829A
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F·R·克雷默
D·瓦尔加斯-戈尔德
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Rutgers State University of New Jersey
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Abstract

本发明涉及分析核酸的方法。本公开提供了引物依赖性扩增的方法和检测方法，所述检测方法能够在存在大量密切相关的非目标靶序列的情况下在样品中扩增和检测少至十个拷贝的至少一种稀有目标靶序列。还提供了用于实施所述方法的反应组合物和试剂盒。

Description

检测稀有序列变体的测定方法和试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月2日提交的美国临时申请号62/909,483的优先权，其公开通过引用并入本文。
发明背景
能够检测和定量含有大量密切相关序列的样品中的极其稀有的核酸序列变体的存在一直是长期追求的目标；例如，在含有大量拷贝的来自正常细胞的野生型序列的临床样品(通常为10,000或100,000个细胞)中检测发生在肿瘤细胞中的稀有(每10,000中有10个或更少)体细胞突变序列。已采用下一代序列分析来实现这一目标，但由于需要对样品中的核酸进行广泛扩增，并且由于核酸聚合酶有时会并入不正确的核苷酸(产生原始样品中不存在的突变序列)，测序方法的灵敏度是有限的。此外，序列分析需要昂贵的设备，速度慢(数天)，而且价格昂贵，每次测定花费约$4,000。
等位基因分辨引物(allele-discriminating primer)的多种设计已用于指数扩增测定，希望选择性开始对一种或多种稀有核酸变体的扩增而忽略大量的密切相关的野生型核酸。这些设计的共同点在于它们包含至少一个核苷酸，我们称之为询问核苷酸(interrogating nucleotide)，其与目标靶序列互补但与密切相关的非目标靶序列错配。它们包括：发夹形引物(已公开的国际专利申请WO 2000/71562(2000年11月30日)和相应的美国专利6,365,729)；扩增阻滞突变系统(Amplification Refractory Mutation System，“ARMS”)引物(Newton等人(1989)Nucleic Acids Research 17:2503-2516；Kwok等人(1990)Nucleic Acids Research 18:999-1005)；和含有夹在两个靶互补序列之间的与靶序列不互补的内部序列(internal sequence)的多部分引物(multi-part primer)。多部分引物包括我们自己实验室的针对密切相关等位基因的非常高选择性的超选择性引物(SuperSelective primer)，其公开在已公开的国际专利申请WO 2014/124290(2014年8月14日)和WO 2017/176852(2017年10月12日)，以及美国专利9,909,159中。等位基因分辨引物的共同点在于包含与目标稀有靶序列互补但与非目标的大量密切相关序列错配的询问核苷酸。
超选择性引物具有相当高的选择性(参见，例如，Vargas等人(2016)PLoS ONE 11:e0156546和Vargas等人(2018)Journal of Molecular Diagnostics 20:415-427)，其极少拷贝大量的密切相关链。尤其渴望确保在分析仅含有极少数突变靶标的临床样品(例如，在存在10,000个密切相关的野生型分子的情况下含有十个或更少个突变分子的样品)时，无需平均多个平行扩增就能确定所扩增的信号是否归因于那些少数突变分子的存在或信号是否是在大量野生型分子上发生的非目标扩增的结果。因此，当仅进行单个扩增时，仅含有极少数突变靶标的样品有时可能会与不含突变靶标的样品混淆(导致假阴性结论)，且不含突变靶标的样品有时可能会与仅含有极少数突变靶标的样品混淆(假阳性结论)。
非常需要一种测定方法来检测非常稀有的突变，所述方法极其灵敏，易于在现有的荧光光谱热循环仪(spectrofluorometric thermal cycler)上使用，低成本、快速(数小时而不是数天)且是非侵入的。所需测定必须能够区分仅含有大量核酸序列(例如，野生型序列)的样品和每10,000个拷贝的大量核酸序列含有少至十个拷贝的密切相关的稀有核酸序列(例如，突变序列)的样品。
对于使用等位基因分辨引物的测定，需要稳健的测定方法以检测在大量野生型序列背景中的极少数突变靶序列，例如，在含有10,000个野生型序列的混合物中的10个突变序列。选择性和灵敏度可以精简为能够在含有10,000个拷贝的不同之处在于一个或两个核苷酸的密切相关序列的混合物中检测少至十个拷贝的稀有靶序列的单个特征。
发明内容
本发明在多个方面解决了上述需要。
在一个方面，本发明提供了一种引物依赖性的扩增和检测方法，所述方法能够扩增和检测样品的少至十个拷贝的至少一种稀有DNA目标靶序列(“稀有靶序列”)，所述稀有靶序列处于对于每种稀有靶序列而言含有10,000个拷贝的与稀有靶序列不同之处在于少至一或两个碱基对的密切相关的非目标靶序列(“密切相关序列”或“非目标靶序列”)的混合物中，所述方法包括：(a)制备引物依赖性扩增反应混合物，其包含样品、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、扩增缓冲液、用于检测扩增产物的同类荧光检测工具(homogeneousfluorescence detection means)，以及针对每种稀有靶序列的由对稀有靶序列特异但与密切相关序列错配的第一引物和第二引物组成的引物对，(b)重复循环引物依赖性扩增反应混合物以扩增样品中存在的每种稀有靶序列，和(c)通过测量来自同类荧光检测工具的荧光强度来检测该稀有靶序列。第一引物可以是等位基因分辨多部分引物，其从5'端到3'端包含第一锚定序列(first anchor sequence)、第一桥序列(first bridge sequence)和至少在其3'-末端或3'-倒数第二个核苷酸处与密切相关序列错配的第一足序列(firstfoot sequence)。第二引物可以是等位基因分辨引物。
在所述方法中，第一引物、第二引物或两者可以是至少在其3'-末端或3'-倒数第二个核苷酸处与密切相关序列错配的超选择性引物。每种引物可以含有与稀有靶序列互补但与非目标靶序列错配的3'-末端询问核苷酸。
在上文所述的方法中，循环可以包括在非对称聚合酶链式反应(PCR)方法中的温度循环。在一个实施方案中，检测步骤可以包括实时检测。在另一个实施方案中，PCR方法可以是数字PCR方法(digital PCR method)，并且检测可以包括终点检测(end-pointdetection)。
在上文所述的方法中，样品中的至少一种稀有靶序列包含至少两种不同的稀有靶序列。在这种情况下，同类荧光检测工具可以包含分别针对所述至少两种不同的稀有靶序列的至少两种不同的同类荧光检测探针。所述至少两种稀有靶序列可以包括一组稀有靶序列，并且该组中针对稀有靶序列的探针用相同的颜色标记。探针可以是颜色编码的(color-coded)。
在一些实施方案中，每种不同的非目标靶序列与其对应的稀有靶序列的不同之处可以在于单个碱基对，并且第一和第二引物两者均与该单个碱基对错配。每个第二引物可以是从5'端到3'端包含第二锚定序列、第二桥序列和第二足序列的多部分引物。同类荧光检测工具可以包含针对每种稀有靶序列的探针。针对每种稀有靶序列的第一或第二引物或第一和第二引物两者可以含有5'-标签序列(5’-tag sequence)，并且每种5'-标签序列的互补物(complement)是探针或探针对的靶标。
如上所述的每种探针可以包含与第一桥序列的互补物或第二桥序列的互补物互补的序列。探针的示例包括共享茎分子信标(shared-stem molecular beacon)。
在上述方法中，所述至少一种稀有靶序列与其对应的非目标靶序列的不同之处可以在于在相同基因中顺式发生的第一碱基对和第二碱基对。在这种情况下，第一引物可以与第一碱基对互补，并且第二引物可以与第二碱基对互补。在一些实施方案中，样品中的所述至少一种稀有靶序列可以包含两种或更多种稀有靶序列，并且同类荧光检测工具可以包含针对每种稀有靶序列的至少一种同类荧光检测探针。针对每种稀有靶序列的同类荧光检测工具的示例包含引物间特异性分子信标探针。
上述引物依赖性扩增反应混合物可以进一步包含有效量的选择性增强试剂，例如霍夫迈斯特盐(Hofmeister salt)。示例包括四甲基氯化铵(tetramethylammoniumchloride，TMAC)和双四甲基草酸铵(bis-tetramethylammonium oxalate)。
本发明还提供了用于进行上述方法的试剂的试剂盒或组合物(例如，反应混合物)。试剂盒或组合物可以包括一种、两种或更多种选自以下的试剂：上述引物、核酸聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和检测剂。检测剂的示例包括同类荧光检测工具，例如针对每种稀有靶序列的分子信标探针。
根据本发明的方法针对至少一种稀有靶序列中的每一种使用一对第一和第二等位基因分辨引物，其至少一种是多部分第一引物，优选超选择性引物。每对扩增引物中的两个引物均对靶序列特异，但与密切相关序列错配。每个多部分第一引物至少在其3'-末端或3'-倒数第二个核苷酸处与密切相关序列错配。在某些优选的实施方案中，每种等位基因分辨第二引物也可以是这样。优选的是，在每个引物对的正向和反向引物两者中，询问核苷酸是3'-末端核苷酸。根据本发明的方法任选地包含扩增和检测不相关野生型基因序列以用于定量。
所述方法可以分为两种通常类型：
在第一种类型中，每种稀有靶序列含有单差异，例如一个突变(作为缺失、插入或核苷酸改变如单核苷酸多态性(SNP)的结果)。在一个SNP的情况下，稀有目标靶序列含有与密切相关序列不同的单个碱基对，例如，其中突变序列与野生型序列的不同之处在于单个碱基对。在这种情况下，两种引物均具有对稀有靶序列中不同的单个碱基对特异的询问核苷酸；即，正向引物具有与突变核酸两条链中一条的单个碱基对互补的3'-末端或3'-倒数第二个询问核苷酸，并且反向引物具有与突变核酸两条链中另一条的该碱基对的另一突变核苷酸互补的3'-末端或3'-倒数第二个询问核苷酸，从而一种引物与靶链结合，且另一种引物与互补靶链结合。将含有样品的扩增反应混合物进行多个循环的引物依赖性扩增反应，并且实时或在扩增后(终点检测，其用于数字PCR)检测荧光。在扩增过程中，核酸聚合酶无法将不正确的核苷酸并入从非目标靶序列产生的扩增子(产生一个不存在于原始样品中的突变序列)，这是因为引物仅在除靶突变会存在的位置之外的位置启动合成。
第二种类型解决了有时确定两个不同突变是否发生在不同的姐妹染色体上(即，反式)的需要，在这种情况下，存在可以产生的两个不同版本的编码蛋白，但每个版本仅由这两个突变中的一个编码；或解决了这两个突变是否存在和发生在同一染色体上(顺式)的需要，在这种情况下，由突变染色体上的该基因编码的蛋白包含两个突变。在第二种类型中，稀有靶序列含有与野生型序列不同的两个碱基对，其中所述碱基对发生在相同的外显子或不同的外显子中，并且可以以顺式关系或以反式关系任一者发生。在这种靶标类型中，正向引物具有对所述突变中的一个突变特异的询问核苷酸，并且反向引物具有对另一突变特异的询问核苷酸。例如，在患者的非小细胞肺癌的EGFR基因的外显子20中的T790M突变或C797S突变任一者的发生会将一个氨基酸取代引入编码的EGFR蛋白中，这指明了一线治疗(吉非替尼(Gefitinib)或埃罗替尼(Erlotinib))将不起作用，并表明了使用奥西替尼(Osimertinib)将是有效的(Lamb和Scott(2017)Targeted Oncology 12:555-562)。然而，近期变得明显的是，如果T790M突变和C797S突变均发生在同一染色体(即顺式)上的EGFR基因中(其导致发生在同一EGFR蛋白中的两个氨基酸取代)，则奥西替尼将不能杀死这些癌细胞，并且仅布加替尼(Brigatinib)将是有效的(Uchibori等人(2017)NatureCommunications 18:14768)。在本发明的进行该确定的方法中，引物对中的一个引物在一个片段链即(+)链中询问T790M突变，而另一个引物在互补链即(-)链中询问C797S突变。只有含有两个突变的片段才会被扩增。尽管探测所得扩增子可以靶向限制性引物的桥序列的互补物或限制性引物的5'-标签序列的互补物，但我们的优选实施方案使用同类荧光检测探针，优选分子信标探针，其靶向两个探针结合的序列之间的扩增子部分(即，引物间特异性探针)。
根据本发明的方法是高选择性的、高灵敏度的并且表现出改善的稳健性(robustness)。高选择性意指在具有密切相关序列的混合物中检测稀有序列(当比例低至1/1,000时)的能力。高灵敏度意指在此类混合物中检测少至十个拷贝的稀有序列的能力。选择性和灵敏度可以精简为单个要求，即在含有10,000个拷贝的不同之处在于一个或两个核苷酸的密切相关序列的混合物中检测少至10个拷贝的稀有靶序列的能力。所公开的国际专利申请WO 2014/124290(2014年8月14日)和WO 2017/176852(2017年10月12日)以及美国专利9,909,159描述了利用由超选择性正向引物和常规反向引物组成的引物对的实时PCR方法，包括能够在含有10,000个拷贝的此类密切相关序列的混合物中检测少至10个拷贝的稀有靶序列的方法，其中来自仅含有10,000个拷贝的密切相关序列的样品的阈值循环与来自额外含有十个拷贝的稀有靶序列的样品的阈值循环之间的差异(ΔCt)通常相差在两个或数个循环，通常在重复之间存在一些可变性。根据本发明的方法在不牺牲前述选择性和灵敏度的前提下具有改善的稳健性。“改善的稳健性”意指所述方法满足以下两个标准之一：仅含有10,000个拷贝的密切相关序列的样品在至少55个扩增循环下没有达到阈值荧光强度，或仅含有密切相关序列的样品与额外含有10个拷贝的稀有靶序列的样品之间的ΔCt比当引物对含有相同的超选择性引物和常规引物时多至少5个循环。
如上所述，根据本发明的方法和试剂盒利用一对等位基因分辨引物，其中每个引物与稀有靶序列互补，但与与稀有靶序列不同之处在于一个或两个核苷酸的密切相关序列错配。在所有情况下，第一引物是多部分引物，优选超选择性引物。第二引物是等位基因分辨引物。它可以是例如超选择性引物或另一种多部分引物、等位基因分辨发夹引物或ARMS引物。在第一种类型的实施方案中，第二引物与第一引物一样，在其3'末端处或附近含有一个询问核苷酸。多部分引物和ARMS引物能够满足这种要求，但等位基因分辨发夹引物不能。然而，第二种类型的实施方案对第二引物没有这种要求，因此可以使用多部分引物(优选超选择性引物)、ARMS引物或等位基因分辨发夹引物。
根据本发明的测定方法是引物依赖性扩增和检测方法。可用于本发明方法的引物依赖性扩增反应可以是任何合适的指数扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)、切口酶扩增反应(nicking enzyme amplification，NEAR)、链置换扩增(strand-displacement amplification，SDA)、基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、转录介导的扩增(transcription-mediated amplification，TMA)和滚环扩增(rolling circleamplification，RCA)。优选方法使用PCR。
根据本发明的引物依赖性扩增和检测方法可以使用非对称DNA扩增，例如不对称PCR。也可以使用对称DNA扩增，但我们优选非对称扩增。在非对称PCR扩增方法中，一种引物即限制性引物以有限的量存在，以便在扩增完成之前(优选在阈值循环时或在阈值循环后不久)耗尽，随后线性扩增发生，其使用剩余的引物即过量引物(excess primer)。可用于本发明的非对称PCR方法是LATE-PCR(参见，例如，欧洲专利EP 1,468,114；和Pierce等人(2005)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 102:8609-8614)。
优选方法还包括数字PCR(参见，例如，Vogelstein和Kinzler(1999)Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 96:9236-9241)，其中单个PCR测定混合物被分成非常大量的单孔或液滴，使得每个孔或液滴中仅存在一个靶分子(或没有靶分子)，并且因此其需要从存在于也可以含有相关的野生型分子的单孔或液滴中的单个突变模板分子检测扩增子。
如果扩增反应使用依赖RNA的DNA聚合酶(一个示例是NASBA)，则扩增反应可以是等温的。我们将扩增产物合成的重复轮数称为“循环”，但对于NASBA来说它们不是热循环。对于此类扩增，由根据本发明的多部分引物启动的“目标靶序列”和“非目标靶序列”是发生在原始样品和扩增反应混合物中的RNA序列，其中它们与DNA聚合酶和多部分引物一同存在。
如果扩增反应使用依赖DNA的DNA聚合酶(一个示例是PCR)，则原始样品可含有DNA或RNA靶标。对于此类扩增，由可用于本发明方法的多部分引物启动的“目标靶序列”和“非目标靶序列”是在原始样品中发生或通过逆转录在原始样本中发生的RNA序列而产生的DNA序列。如果使用多部分引物进行逆转录，则“目标靶序列”和“非目标靶序列”是RNA以及cDNA。如果使用单独的外部引物(outsider primer)进行逆转录，则“目标靶序列”和“非目标靶序列”是cDNA。在任一情况下，“目标靶序列”和“非目标靶序列”是在扩增反应混合物中与DNA聚合酶和多部分引物一同存在的核酸序列。
引物依赖性扩增反应包含引物退火、引物延伸和链变性(链解链)的重复热循环。引物退火可以在低于引物延伸温度的温度下进行(例如，三温度PCR(three-temperaturePCR))，或者引物退火和引物延伸可以在相同温度下进行(例如，两温度PCR(two-temperature PCR))。反应的总体热谱(profile)可以包含特定循环的重复，或者温度/时间可以在一个或多个循环期间变化。例如，一旦扩增已经开始并且多部分引物的启动(priming)序列被延长，则可以使用适合较长引物的较高退火温度来完成扩增反应。
根据本发明的优选方法是引物依赖性扩增和检测方法，最优选是非对称方法，其能够非对称扩增和检测样品混合物中少至十个拷贝的至少一种稀有DNA目标靶序列，所述混合物对于每种稀有靶序列来说含有10,000个拷贝的与稀有靶序列不同之处在于少至一个或两个核苷酸的密切相关的非目标靶序列，所述方法包括：
(a)制备引物依赖性扩增反应混合物，其包含样品、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、扩增缓冲液、用于检测扩增产物的同类荧光探针，以及针对每种稀有靶序列的一对对靶基因特异但与密切相关序列错配的等位基因特异性扩增引物，每个引物对包含与密切相关序列在至少3'-末端或3'-倒数第二个核苷酸上错配的等位基因分辨多部分第一引物和等位基因分辨第二引物；
(b)通过所述引物依赖性扩增方法重复循环反应混合物以扩增样品中存在的每种稀有DNA靶序列，并通过测量来自靶向其扩增产物的可区分标记探针的荧光强度来检测该序列；
其中，如果所述方法在在含有10,000个拷贝的非目标靶序列的第一样品和在具有10,000个拷贝的非目标靶序列的混合物中含有10个拷贝的目标靶序列的第二样品中进行试验，则(a)来自第一样品的荧光信号在55个扩增循环下被抑制，或(b)两次扩增之间的阈值循环差(ΔCt)比所进行的其中第二引物被替换为常规引物的相同试验所获得的循环多至少五个循环。
如果第二引物是多部分引物，则它与密切相关序列在至少其3'-末端或3'-倒数第二个核苷酸上错配。如果第二引物是ARMS引物，则它与密切相关序列在其3'末端核苷酸上错配。如果第二引物是发夹引物，则它与密切相关序列在其单链环中的一个核苷酸上错配。
在下文所述的实施例中，我们使用了一种典型的非专有(non-proprietary)缓冲液，其含有KCl、Tris-HCl(pH 8.0)和MgCl2。一些扩增缓冲液的内容被认为是由供应商专有。由于此类缓冲液在功能上是等效的，因此也可以使用它们。在一些优选的实施方案中，扩增反应混合物包含有效浓度的选择性增强试剂，优选四甲基氯化铵(TMAC)。
在某些优选的方法中，每种引物含有一个3'-末端询问核苷酸，其与目标靶序列互补但与非目标靶序列错配。在一些实施方案中，一对引物中的一个引物含有5'-标签序列，并且5'-标签序列的互补物是探针的靶标。
检测可以通过用于检测扩增产物的同类检测工具进行。检测工具可以包含一个同类检测探针，全都用相同颜色标记的多个同类检测探针；标记的引物，例如Scorpion引物或LUX引物；或嵌入DNA染料，例如
Figure BDA0003574959870000091
Green(如果无需区分多种稀有目标靶序列的扩增产物，例如当仅有一个待检测靶标或一组靶标时，或当仅需要检测多个靶标中的任一个是否存在时)。否则，针对待检测的每个靶标(或靶标组)，具有不同颜色的同类荧光检测探针。同类荧光检测探针可以是例如
Figure BDA0003574959870000092
探针、小沟结合物(minor groove binder，MGB)探针、分子信标探针或MNAzyme/可切割探针组合(WO 2013/123552)。我们优选的检测是通过分子信标探针，所述分子信标探针靶向与包含在限制性多部分引物序列中的5'-标签序列互补的扩增子(扩增产物)序列，或靶向与限制性多部分引物中的桥序列互补的扩增子序列。
如上所述，此类测定的功能特征是(a)它们能够在存在10,000个拷贝的其密切相关大量序列的情况下，检测少至10个拷贝的每种稀有靶序列，并且(b)它们在区分以下时具有改善的稳健性：(i)仅含有10,000个拷贝的密切相关序列和(ii)含有10,000个拷贝的密切相关序列拷贝和10个拷贝的稀有目标靶序列，根据以下试验。如果将含有两种样品的反应混合物进行使用根据本发明的第一和第二引物的实时PCR，并且还进行除了常规引物被替换为第二等位基因分辨引物之外的相同方法，则获得任一以下结果：(1)对于仅含有密切相关序列的样品，使用根据本发明的引物对，荧光在55个循环下不升至高于背景，或(2)两个样品之间强度高于背景的荧光信号的表现差异(ΔCt)在使用本发明的引物对时比当常规引物被替换时大至少五个扩增循环。
优选实施方案中的灵敏度可以通过在扩增反应混合物中包含选择性增强试剂，优选四甲基氯化铵(TMAC)或另外的霍夫迈斯特盐来改善，公开在国际专利申请WO 2017/176852(2017年10月12日)中。该试剂可以包含在扩增反应混合物中以改善针对野生型或其他密切相关的非目标靶序列的选择性。此类试剂以有效浓度添加，如通过试错(trial anderror)确定的。本发明方法中使用的某些优选的超选择性引物具有相对长的足，例如9-11个核苷酸，并且还形成32-48个核苷酸的大凸起(bubble)，其通常包含15-24个核苷酸范围内的长桥序列。对于含有此类超选择性引物的反应混合物，可以以相对高的浓度如50mM或60mM包含TMAC。对于含有具有较短足如5-7个核苷酸的超选择性引物的反应混合物，可以以较小的浓度如10mM、20mM或30mM添加TMAC，以避免对扩增反应产生有害影响。前述段落中描述的试验可用于确定特定反应混合物中是否包含以及包含多少选择性增强试剂，例如通过比较在不同浓度(例如0、10mM、50mM和60mM)的TMAC下获得的结果。“有效浓度”意指允许通过试验的浓度，最佳地，意指对试验结果改善最多并且不会显著干扰扩增反应的浓度。
根据本发明的方法尤其适用于多重化(multiplexing)，具有扩增样品中可能存在的多种稀有靶序列的能力。不同的实施方案具有不同的目的和特征。例如，某些多重实施方案可以被设计成能够在存在大量野生型序列的情况下在含有基因组DNA片段的样品中检测至少两个突变中的每一个的存在。一种不同的引物对可用于每种靶序列，其具有独特颜色的荧光探针，优选分子信标探针，靶向不存在于探针本身或野生型正确扩增产物中的扩增子序列。对于第一种类型的方法，每个探针的靶标优选是每个不同限制性引物的桥或5'标签的互补物。对于第二种类型的方法，每种探针的靶标也可以是桥或5'标签的互补物，但我们优选使用引物间特异性探针。或者，一种不同的引物对可用于每种不同的靶序列组，其中一个组中一个或多个突变的存在在技术上是重要的，例如，对于癌症患者的治疗是重要的。上述单重和多重方法通常可以在荧光光谱热循环仪(spectrofluorometric thermalcycler)中进行，其将可区分荧光标记的数量(常用的热循环仪为5-颜色仪器)限制为最多七种，或有时十种。用于检测不同的稀有靶序列组的测定的反应混合物包含针对每种突变靶序列的不同的多部分限制性引物，和任选的用于定量目的的不相关野生型基因序列，其中在引物组中的每个多部分限制性引物具有相同的5'-标签序列，并且每个组具有不同的5'-标签序列。
第二种类型的方法，即检测顺式关系的两个突变，可具有以下可能性：两个稀有碱基对中的任一个或甚至两者具有甚至可能产生相同氨基酸变化的多种可能性。例如，可存在以下情况：其中一个碱基对变化可以是恒定的，但另一个碱基对变化可以是可变的，即变化X、变化Y或变化Z，例如在相同位置或在细微不同的位置。当这种情况发生时，多重测定方法可以具有对每种可能性特异的等位基因分辨引物；例如，一种对恒定变化特异的引物，但三种对可变变化特异的引物(一种针对X，一种针对Y，一种针对Z)。此外，引物间特异性探针会发出存在变化的信号，但它将不会识别是什么变化。为了这个目的，引物的每一个(针对X、Y和Z)可以具有独特的5'标签或独特的桥，其互补物将成为具有独特颜色的不同探针的靶标。
多重测定的其他实施方案，尤其是第一种类型的方法，是筛选测定，其目的是确定许多不同突变靶序列的列表中的哪一种突变靶序列存在于样品中，或确定这些突变靶序列中没有一种存在于该样品中。在这些测定中，无论存在哪一种突变靶序列，都将其指数扩增，优选在聚合酶链式反应中，并且用荧光标记的杂交探针来检测所得扩增子(所述扩增子仅当样品中存在突变靶序列时才产生)。在这样的实施方案中，对于每个可能的突变靶序列，存在多部分限制性引物，优选超选择性引物，其每个均具有不同的5'-标签序列，所述5'-标签序列的互补物是杂交探针的靶标。通常，列表上的突变靶序列的数量会超过检测仪器能够区分的不同荧光颜色的数量，其他多重检测也可能发生这种情况。我们通过两种方式中的任一种来解决这个问题。一种方式是使用颜色编码的同类检测探针，优选在国际专利公开WO 2004/099434 A3、美国专利7,385,043和Marras等人(2019)PloS ONE 14:e0213906中公开的颜色编码分子信标探针。简言之，将一个批次的探针(a batch of aprobe)分为编码方案中的等分试样(aliquot)数量，通常为两个或三个，并且然后用不同颜色的荧光团标记每个等分试样，然后将等分试样重新组合以创建含有两种或三种颜色的编码的批次。克服荧光光谱热循环仪的颜色限制的第二种方式是使用我们所称的“热特异性”分子信标探针，其探针-靶标杂交体具有不同的解链温度(Tm)。例如，如果要在五色荧光光谱热循环仪上测试液体活检样品中是否存在35种不同靶序列中的一种或多种，可以将35种每种对不同靶序列特异的不同的多部分限制性引物分为五组，每组七种。五组中每组的所有七种具有不同的5'标签，其互补序列是七种不同热特异性分子信标探针的靶标，所有这些都用相同的荧光团标记，但所有这些都产生具有可区分解链温度(Tm)的探针-靶标杂交体。因此，35种不同靶序列中的每一种，如果存在的话，可以通过结合荧光颜色和在扩增后(终点)热分析中确定的Tm来识别。
作为通过实时扩增和检测测定方法进行的第一种类型测定的替代方法，它们可以通过数字PCR测定方法进行，包括在热循环仪中的许多不同反应孔中进行的测定，以及在热循环仪中的许多不同液滴中进行的液滴数字PCR(ddPCR)测定。在这两种情况下，扩增后对所得扩增子的检测(终点检测)通常在单独的检测仪器中进行，例如Bio-Rad QX200TM液滴数字PCR系统或Stilla Technologies NaicaTM系统。数字PCR测定的基本原理是含有样品的反应混合物可以被稀释至如下程度：对于每种待检测的稀有靶分子，孔或液滴中通常仅存在一个靶DNA分子(稀有的目标靶分子或大量的非目标靶分子)(或孔或液滴中不存在靶分子)，并且存在大量的孔或液滴；然而，一些孔或液滴可以不含靶分子，含有两个或三个非目标靶分子，或含有一个目标靶分子加上一个或两个非目标靶分子。然后，在每个孔或液滴中同时进行PCR扩增。存在于所有孔或液滴中的荧光标记探针与每个孔或液滴中产生的扩增子(如果它含有目标靶分子)结合，并以特定颜色或颜色代码发出明亮的荧光，表明了所述孔或液滴含有目标靶分子并确定了其是哪一种目标靶序列。将荧光强度高于在扩增完成时选定的阈值强度(背景)的孔或液滴认为是呈特定颜色或颜色代码的阳性。以相同的颜色或颜色代码点亮的液滴或孔的数量提供了原始样品中相应靶分子的数量的准确量度。这种方法灵敏到甚至可以检测到孔或液滴中含有靶序列的单个DNA片段的程度。
经典液滴数字PCR已被用于检测和定量与癌症诊断、预后和治疗相关的稀有体细胞突变。参见Sanmamed等人(2015)Clinical Chemistry 61:297-304。为了将稀有的突变靶分子从大量得多的相关野生型分子中分离出来，需要超过一百万个液滴。例如，参见Hindson等人(2011)Analytical Chemistry 83:8604-8610。如此大量的液滴是必要的，因为样品中的野生型靶标比稀有相关突变靶标(其与野生型靶标的不同之处通常仅在于单核苷酸多态性)的数量多得多，并且由于探针(其被设计为与含有突变的扩增子内的子序列结合)偶尔会与从相关野生型靶标产生的扩增子中的相应序列结合，因此希望的是具有这么大量的液滴以使得含有突变靶标的液滴极不可能也将含有一个或多个相关野生型靶标。这确保了将不会存在如下的含有足够野生型靶标的液滴：该液滴中产生的信号强度与如果该液滴被错误地认为含有相关突变靶标时会产生的信号强度相似。换句话说，如果原始样品被分为太少的液滴，则含有一些野生型靶序列且不含相关的突变靶序列的液滴可能被误认为含有突变靶标的液滴。
然而，当使用采用本发明的方法以检测样品中稀有的突变靶分子的数字PCR实施方案时，需要少得多的液滴或孔(例如，仅需要10,000到30,000个液滴)，因为所使用的引物对不会从孔或液滴中可能也存在的相对少的密切相关野生型DNA分子产生可检测的扩增子。在根据本发明的数字PCR测定方法中，检测可以在热循环仪、流式细胞仪或显微镜以及上述检测仪器之一中进行。
本发明还包含用于进行上述方法的试剂盒。此类试剂盒可包含一对或多对针对一种或多种目标稀有靶序列的等位基因特异性引物、dNTP、引物依赖性聚合酶、针对每种目标稀有靶序列(或在一些实施方案中针对一组稀有靶序列)的检测探针，以及扩增所需的其他试剂，尤其是扩增缓冲液。每个引物对中的一个引物可以是多部分引物，且每个引物对中的另一个引物可以是超选择性引物或其他多部分引物，或ARMS引物。
超选择性引物的选择性可以通过调整足长度和凸起周长来针对特定靶标进行最大化，通常较大的凸起和较短的足会增加选择性。此外，通过调整桥序列的长度和核苷酸序列，可以对超选择性引物进行微调以实现最大分辨力，并且可以进行微调以确保同一测定中任意引物对的给定Ct值反映了样品中相同数量的核酸靶标。
附图简要说明
图1示出了实施例1中用于检测稀有拷贝的突变的方法的设计，所述方法使用一对与所述突变互补的超选择性引物，通过靶向限制性超选择性引物上的5'-标签的互补物的分子信标探针进行检测。
图2A和2B显示了实施例1的实时PCR测定的结果，其中上小图A显示了使用其3'-询问核苷酸与突变序列互补的超选择性正向引物和与突变序列和其靶突变下游的与突变序列密切相关的野生型序列两者互补的常规反向引物的扩增和检测结果；且下小图B显示了使用一对超选择性引物而其他相同的实时PCR测定的结果，所述一对超选择性引物的两个引物的3'-询问核苷酸均与靶突变互补。
图3示出了实施例2中用于检测稀有拷贝的突变的方法的设计，所述方法使用一对与所述突变互补的超选择性引物，通过靶向限制性超选择性正向引物的桥序列的互补物的共享茎分子信标探针进行检测。
图4A和4B显示了实施例2的实时PCR测定的结果，其中上小图A显示了使用与EGFRT790M突变互补的超选择性正向引物和与突变序列和其靶突变下游的与突变序列密切相关的野生型序列两者互补的常规反向引物的扩增和检测；并且下小图B显示了使用一对超选择性引物而其他相同的实时PCR测定的结果，所述一对超选择性引物的两个引物的3'-询问核苷酸均与T790M靶突变互补。
图5示出了实施例3中用于确定两个突变是否发生在同一染色体上(顺式)的方法的设计，所述方法使用与一个突变互补的超选择性正向引物和与另一个突变互补的超选择性反向引物。
图6A、6B、6C、6D和6E显示了实施例3的实时PCR测定的结果，其中反应混合物含有针对EGFR T790M突变的超选择性正向引物、针对EGFR C797S突变的超选择性正向引物和常规反向引物。(A)10个拷贝的T790M，(B)10个拷贝的C797S，(C)10个拷贝的T790M和C797S(顺式)，(D)10个拷贝的T790M和10个拷贝的C797S(反式)，和(E)仅野生型。
图7A、7B和7C显示了实施例3的实时PCR测定的结果，其中反应混合物含有与一个突变互补的超选择性正向引物，和与另一个突变互补的超选择性反向引物。(A)10个拷贝的T790M和C797S(顺式)，(B)10个拷贝的T790M和10个拷贝的C797S(反式)，和(C)仅野生型。
图8示出了实施例4中用于确定两个突变是否发生在同一染色体上(顺式)的方法的设计，所述方法使用与一个突变互补的超选择性正向引物和与另一个突变互补的ARMS反向引物。
图9A、9B和9C显示了实施例4的实时PCR测定的结果，其中反应混合物含有针对EGFR T790M突变的超选择性正向引物和针对EGFR C797S突变的ARMS反向引物。(A)10个拷贝的T790M和C797S(顺式)，(B)10个拷贝的T790M和10个拷贝的C797S(反式)，和(C)仅野生型。
图10示出了实施例5中用于检测稀有拷贝的突变的方法的设计，所述方法使用与所述突变互补的ARMS正向引物和与所述突变互补的超选择性反向引物，通过靶向ARMS正向引物上的5'-标签的互补物的分子信标探针进行检测。
图11A、11B和11C显示了实施例5的实时PCR测定的结果，其中上小图A显示了使用一对超选择性引物的扩增和检测；左下小图B显示了使用限制性超选择性正向引物和过量的ARMS反向引物的扩增和检测；且右下小图C显示了使用限制性ARMS正向引物和过量超选择性反向引物的扩增和检测，其中在所有三种情况下，两个引物均与目标靶序列中的单个突变碱基对互补。
图12示出了实施例6中用于在存在大量拷贝的正常人基因组DNA的情况下检测稀有拷贝的突变的方法的设计，所述方法使用一对与所述突变互补的超选择性引物，其中检测使用以一种荧光颜色标记的靶向限制性超选择性引物上的5'-标签的互补物的常规分子信标探针完成；并且其中这些测定还包含针对正常人类基因组DNA中的β-肌动蛋白参考基因的超选择性引物和常规反向引物，其中对该参考基因的检测是使用以不同荧光颜色标记的引物间特异性分子信标同时完成的，从而使能够通过比较突变和参考基因的阈值的差异来评估稀有突变的相对丰度。
图13A、13B、13C和13D显示了实施例6的实时PCR测定的结果，其中所有样品含有相同数量的大量拷贝的整个人类基因组，并且四个小图中的每一个均显示了使用还含有不同数量的突变靶DNA的样品，包括不含任何突变靶DNA的样品获得的结果。(A)500个拷贝的G719C，(B)50个拷贝的G719C，(C)5个拷贝的G719C，和(D)0个拷贝的G719C。
定义和命名法
如在本说明书和本专利申请的权利要求中所使用的，以下定义适用：
等位基因分辨“多部分引物”意指具有内部序列的核酸(例如，DNA)扩增引物，我们称该内部序列为“桥序列”，其与靶序列不充分互补以在引物退火条件下与其杂交，并且其夹在我们称之为“锚定序列”和“足序列”的两个靶标互补序列之间。锚定序列，如常规引物一样，具有对靶序列(目标靶序列和非目标靶序列)的充分的互补性，以在引物依赖性扩增反应的引物退火步骤期间与其杂交，引物针对所述引物依赖性扩增反应进行设计，通常为15-40(例如，17-35，或20-30)个互补核苷酸。当锚定序列杂交以启动拷贝时，足序列与稀有的目标靶序列(例如，突变序列)充分互补以在引物退火期间与其杂交，但与大量的密切相关的非目标靶序列(例如，野生型序列)在其3'末端和3'倒数第二个核苷酸的至少一者上错配。我们将与目标靶序列互补但与密切相关非目标靶序列错配的核苷酸称为“询问核苷酸”。足序列可以包含在其3'末端附近有意引入的核苷酸，所述核苷酸与目标靶序列和非目标靶序列均错配，以使足不稳定并增加其等位基因分辨力。足序列通常可以具有与目标靶序列互补的5-12个(例如，5-10个、6-12个、6-9个或最优选8-9个)核苷酸。桥序列可以是1-50个(例如，5-40个、10-30个、15-30个、20-30个或最通常是18-22个或10-14个)核苷酸长度中的任意长度。当多部分引物与其靶序列杂交时，在靶序列中，与桥序列相对，有一个不与桥杂交的区域，我们称之为“间插序列(intervening sequence)”，其可以是1-100个核苷酸长度中的任意长度。桥序列和间插序列一同在引物-靶标杂交体中形成一个“凸起”，其周长在忽略任何二级结构的情况下是桥序列长度和间插序列长度的核苷酸加上四个核苷酸的总和。
“超选择性”引物是一种构建的等位基因分辨多部分引物，当在PCR扩增中将所述引物用作限制性引物时，其能够在存在10,000个拷贝的差异小至单个碱基对的密切相关序列的情况下检测少至10个拷贝的稀有靶序列。超选择性引物具有在5'至3'方向上包含以下三个连续核酸序列(例如，DNA序列)的序列，所述三个连续核酸序列通过另一引物的延伸而拷贝：
足够长的锚定序列，从而其能够在引物退火期间与突变序列或其他密切相关DNA靶序列以及与相关野生型或其他大量DNA靶序列杂交，其长度通常在15-40个核苷酸，通常20-30个核苷酸的范围内；
至少6个核苷酸长的独特的桥序列，其在引物退火期间不与引物的目标靶序列或任何其他密切相关序列杂交；和
独特的足序列，其可以是6到12个核苷酸长，并且其与目标DNA靶序列完美互补，但与密切相关序列在一个或多个核苷酸(一个或多个询问核苷酸)处错配，所述一个或多个核苷酸的至少一个是3'-末端核苷酸或3'-倒数第二个核苷酸。足部序列
超选择性引物还可以具有一种或多种以下在聚合酶链式反应(PCR)扩增和检测测定中的结构和功能特征：
(i)如果锚定序列和足序列均与引物的目标靶序列杂交，则引物-靶标杂交体在引物的5'到3'方向上包含：锚定-靶标杂交体、单链凸起和足-靶标杂交体，所述凸起的周长为18-50个核苷酸，并由靶DNA序列中的至少8个核苷酸长并且在引物退火期间不与桥序列杂交的间插序列形成；
(ii)凸起将足-靶标杂交体与锚定-靶标杂交体分离开，并且分离的足-靶标杂交体是一种弱杂交体，其使对目标靶DNA序列的拷贝不太可能由所述阈值(Ct)与使用不含任何桥DNA序列的常规引物时会发生的Ct相比由至少两个，优选至少五个循环的延迟所证明；
(iii)多部分引物将在PCR扩增期间启动对任何密切相关突变靶DNA序列或相关野生型靶DNA序列的拷贝的可能性比启动对其目标靶序列的拷贝的可能性低至少1,000倍，如通过至少十个热循环的阈值差异(ΔCt)所证明的；
(iv)已生成扩增子链的多部分引物具有与扩增子链的互补链完美互补的桥序列和足序列；和
(v)每个多部分引物的桥序列的长度和序列与其目标靶序列的间插序列的长度一起导致了从仅含有10个拷贝的目标靶DNA序列的样品观察到的阈值(Ct)，所述阈值将在40-65个或优选55个指数扩增循环内发生，并且将比从不含拷贝的样品观察到的Ct少至少两个循环。
等位基因分辨“发夹”引物是一种茎环寡核苷酸，与分子信标探针一样，其含有一个单链区域(“环”)，其侧翼是互补序列(“臂”)，所述互补序列彼此杂交形成双链区域(“茎”)。发夹引物的环和3'臂与目标靶序列充分互补，以在引物退火条件下与之杂交并启动拷贝。等位基因分辨发夹引物在环序列中部处或附近含有询问核苷酸。
ARMS引物是一种分辨等位基因的常规引物，因为它的3'-末端核苷酸是询问核苷酸。ARMS引物可以在其3'末端附近包含一个有意引入的核苷酸，所述核苷酸与目标靶序列和非目标靶序列均错配，从而使引物不稳定，并增加其等位基因分辨力。
“常规”引物是15-40个核苷酸长，更通常20-30个核苷酸长，并且与目标靶标完美互补的单链寡核苷酸。通常使用多种计算机程序中的任一种来设计常规PCR引物。
我们描述引物对的惯例是将限制性引物称为与靶标的(-)模板链互补的“正向”引物，并将过量引物称为与靶标的(+)模板链互补的“反向”引物。我们这样做只是为了方便。应当理解，限制性引物可以与(+)链互补，并且过量引物可以与(-)链互补。
实施例1中的限制性超选择性引物阐述了我们对引物的命名法，所述限制性超选择性引物的序列为：
5’-ACCTGCCGTCAACACGTGCGCAGTAGACCATC-
TCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAA-
CCTCTCCAACGAATCTCGAA-AAGTGCTGT-3’(SEQ ID NO:1)
在5'到3'方向上，该引物含有四个要素，用破折号(-)分隔。在我们的命名法中，该引物是32-28-20/13-8:1:0。要素32表示32个核苷酸长的5'-标签序列；下一个要素28表示28个核苷酸长的锚定序列；下一个要素20/13表示20个核苷酸长的桥序列，其与13个核苷酸的靶序列中的间插序列相对；和最后一个要素8:1:0，表示9个核苷酸长(8+1+0)并具有以下的足序列：从5'末端开始的与目标靶序列和密切相关的非目标靶序列两者互补的8个核苷酸，一个与目标靶序列互补但与非目标靶序列错配的询问核苷酸，和询问核苷酸3'的与目标和非目标靶序列互补的0个核苷酸(即，该引物中的询问核苷酸是3'末端核苷酸)。如果足已含有使其不稳定的核苷酸，如通常发生在ARMS引物中的，它将在序列中用斜体表示，并在表征中用“m”代表。例如，足序列AAGTGCCGT-3’写成6:m1:1:1:0，表明它具有5'末端的与靶标互补的6个核苷酸；然后是1个核苷酸，用“m”表示，其与目标和非目标靶序列均错配；然后是与靶标互补的1个核苷酸；然后是询问核苷酸；且最后是与靶标互补的3'核苷酸的数量(这里是0)。因为桥序列的特征不仅在于它的长度，而且在于相对的间插序列的长度，凸起的圆周大小可以确定为桥序列的长度加间插序列的长度加4，因为凸起在每一侧均包含一个杂交的碱基对。在以上序列示例中，凸起的周长是37个核苷酸(20+13+4＝37)。
发明详述
图1显示了第一个类型的本发明方法的实施方案，其中第一引物是等位基因分辨多部分引物，并且第二引物是等位基因分辨引物，两者都与稀有突变靶序列中的单个碱基对突变(SNP)互补。在上小图中，引物显示为与含有正(+)链和负(-)链的双链模板中的稀有靶序列杂交(由短垂直线表示)。尽管仅一个引物必须是多部分引物，优选超选择性引物，但所述实施方案具有一对超选择性引物。如上图所示，每个引物均具有一个锚定序列、一个与模板中的间插序列相对的未杂交的桥序列和一个足序列。目标靶序列(为了说明的目的，将其称为EGFR基因，如实施例1中所述)含有与密切相关序列不同的单个碱基对。为了说明的目的，将该碱基对命名为目标靶序列的(-)模板链中的A核苷酸和目标靶序列的(+)模板链中的T核苷酸。即，待检测的突变是在EGFR基因的外显子18中发生的单核苷酸多态性(EGFRG719C)，这是实施例1的主题。每个引物均具有一个询问核苷酸，此处是一个3'-末端询问核苷酸，其与该碱基对的一个核苷酸互补。图1示出了一个实施方案，其中扩增反应是非对称的。一个引物，在此处命名为正向引物并且也是中小图中示出的限制性引物，含有与靶链不互补但在扩增反应中被拷贝的5'-标签序列。另一个引物，在此处命名为反向引物，并且也是中小图中示出的过量引物。上图中还显示了同类荧光检测探针，此处是具有单链环和双链茎的发夹形分子信标探针，其中茎的一个臂用荧光团(o)标记，并且茎的另一个臂用淬灭剂(·)标记。在示出的实施方案中，分子信标是“常规”分子信标探针，即，其中仅使其单链环与探针的靶标互补的分子信标探针，所述探针的靶标在这种情况下是5'-标签序列的互补物。下图显示了检测，其可以是实时检测或终点检测，如数字PCR方法中所使用的那样。显示探针与(-)扩增子(即通过过量引物的延伸而产生的扩增产物)杂交，探针的靶标是限制性引物的5'-标签序列的互补物。探针的荧光团通过探针与其靶标的杂交而与探针的猝灭剂分离，并因此发荧光(Tyagi等人(1998)Nature Biotechnology 16:49-53)。
图3显示了与图1所示相似的实施方案，除了探针的靶标是限制性引物的桥序列的互补物而不是限制性引物的5'-标签序列的互补物，并且因此限制性引物不包含5'-标签序列。在所示出的实施方案中，分子信标探针，有时称为“共享茎”分子信标(Tsourkas等人(2002)Nucleic Acids Research 30:4208-4215)，具有一个臂，在这种情况下，所述臂用淬灭剂标记，其也与探针的靶标互补。因此，如下图所示，环和该臂两者均与限制性引物的桥的互补物杂交。为了说明的目的，将在稀有靶标中发生但未在密切相关序列中发生的碱基对命名为目标靶序列(-)链中的核苷酸A和目标靶序列(+)链中的核苷酸T。也就是说，待检测的突变是发生在EGFR基因的外显子20中的单核苷酸多态性(EGFR T790M)，这是实施例2的主题。
在图1和图3中，显示一个检测探针与一种作为探针靶标的序列杂交。这并不排除包含两种作为探针靶标的序列。例如，如果一个引物的桥序列的互补物是第一探针的靶标，则另一个引物的5'-标签序列的互补物可以是相同颜色的不同探针的靶标，在这种情况下，两倍数量的探针拷贝可以结合并发出荧光。
实施例1描述了如图1所示的根据本发明的方法的实施方案。稀有目标靶序列是EGFR基因中的突变G719C。检测到这种突变使尤其有效的靶向治疗(埃罗替尼或吉非替尼)能够用于杀伤患者的非小细胞肺癌中存在的含有该突变的癌细胞(Pao等人(2004)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 101:13306-13311；Kobayashi和Hagiwara(2013)Targeted Oncology 8:27-33)。
多部分第一引物，此处是超选择性限制性引物，和等位基因分辨第二引物，此处也是超选择性引物，两者均询问单个碱基对。稀有的目标靶序列(在这种情况下是EGFR基因中的突变G719C)与大量密切相关的非目标靶序列(在这种情况下是野生型序列)的不同之处在于单个碱基对变化。在这种情况下，突变型中的A:T(参见图1)与野生型中的C:G不同。扩增和检测方法是实时PCR测定。为了比较，在实施例1中，过量的超选择性引物(为方便起见称为反向引物)被替换为与目标和非目标靶序列两者均互补的常规PCR反向引物(在这种情况下是超选择性反向引物的锚定序列的序列)。
在实施例1中，超选择性正向引物的足序列是9个核苷酸长，且当引物与目标靶序列杂交时形成的凸起的周长是37个核苷酸(20+13+4)。反向引物的足序列也是九个核苷酸长，且当该引物与目标靶序列杂交时形成的凸起的周长是32个核苷酸长(18+10+4)。我们已经发现，使用具有相对长(8-12个核苷酸)的足且不具有使不稳定的核苷酸并且产生相对大的凸起周长(28-50个核苷酸)的超选择性引物的本发明的方法受益于包含选择性增强试剂。在实施例1中，每个扩增反应混合物中包含50mM四甲基氯化铵作为有效量的选择性增强试剂。
将样品进行使用实时荧光检测的PCR扩增。一个样品仅含有10,000个拷贝的EGFR野生型序列。第二样品在含有10,000个拷贝的EGFR野生型序列的混合物中含有10个拷贝的G719C突变序列。第三样品在含有10,000个拷贝的EGFR野生型序列的混合物中含有100个拷贝的G719C突变序列。在一式两份的反应中测试每个样品。扩增反应的荧光强度曲线如图2所示。对于每个引物对，仅含有野生型的样品和含有10个拷贝的突变型的样品的(两个重复的)平均Ct值如表1所示，ΔCt也一样。通过将使用两种均针对单个SNP进行选择的超选择性引物的方法(图2的下小图B)与使用相同的限制性超选择性正向引物和常规反向引物(图2的上小图A)的方法进行比较，可以看出，尽管后者确实可以区分10,000个野生型中的10个突变型和10,000个野生型，但本发明的方法的表现要稳健得多。表1显示，包含常规引物的引物对的ΔCt为2.95，而包含两个超选择性引物的引物对的ΔCt为12.87。这是近10个循环的增加，证明了实施例1的使用一对超选择性引物的方法是根据本发明的方法。
实施例2描述了图3中示出的根据本发明的方法的实施方案。靶序列突变是T790M，其位于EGFR基因的外显子20中。所述突变是A:T碱基对代替了G:C碱基对(发生在其他方面相同的密切相关野生型序列中)的单个碱基对取代(SNP)。检测到这种突变表明，能杀伤含有多种不同EGFR突变(包括G719C、G719S、L858R、L861Q和E746-A750缺失)的任一种的癌细胞的常用的靶向治疗(埃罗替尼或吉非替尼)将不起作用，但不同的靶向治疗(奥希替尼)可能能够杀伤患者的非小细胞肺癌中的那些癌细胞(Lamb和Scott(2017)Targeted Oncology12:555-562)。
扩增和检测方法是与实施例1的方法类似的实时PCR方法，除了靶突变是EGFR突变T790M之外，且同类检测探针是靶向超选择性正向引物的桥序列的互补物的共享茎分子信标，其不包含5'-标签序列。在这种情况下，突变型中的A:T(参见图3)不同于野生型中的G:C。与实施例1中一样，一组反应使用一对超选择性引物，其中每个引物均具有一个询问3'-末端核苷酸，并且第二组反应使用限制性超选择性正向引物和与目标和非目标靶序列均互补的常规反向引物，其在这种情况下具有超选择性反向引物的锚定序列的序列。两对引物都针对三个样品进行了测试。所述样品含有10,000个拷贝的野生型的密切相关非目标靶序列加上0个、10个或100个拷贝的突变型的目标靶序列。每个扩增反应混合物中均包含50mMTMAC作为有效量的选择性增强试剂。
将每个样品的5个重复进行使用实时荧光检测的PCR扩增。扩增反应的荧光强度曲线如图4所示。对于每个引物对，仅含有野生型的样品和在存在10,000个野生型的情况下含有10个拷贝的突变型的样品的(五个重复的)平均Ct值如表2所示，这些平均Ct值之间的ΔCt也一样。表2显示，使用超选择性正向限制性引物和常规反向引物的方法给出了显著的平均为5.35的ΔCt。然而，图4的上小图A显示，由于重复之间的可变性，需要多个重复以实现该结果。相比之下，使用两个超选择性引物的方法的表现要稳健得多。图4的下小图B显示，来自仅野生型样品的荧光显著延迟，并且五个重复中的三个在55个循环后没有给出Ct。为了对Ct进行计算和平均，将这些重复的Ct设为>55。这样做的话，平均ΔCt为>14.00。这是近9个循环的增加，证明了实施例2的使用一对超选择性引物的方法是根据本发明的方法。
图5显示了本发明的一个实施方案，其具有与含有正(+)链和负(-)链的双链模板中的稀有靶序列杂交(由短垂直线表示)的一对多部分引物。尽管仅一个引物必须是多部分引物，但所述实施方案具有一对超选择性引物。如上图所示，每个引物均具有一个锚定序列、一个与模板中的间插序列相对的未杂交的桥序列以及一个足序列。目标靶序列含有两个与密切相关序列不同的突变碱基对。为了说明的目的，将第一突变碱基对命名为目标靶标的(-)模板链中的核苷酸A和目标靶标的(+)模板链中的核苷酸T。也就是说，待检测的第一突变是发生在EGFR基因的外显子20中的单核苷酸多态性(EGFR T790M)。将第二突变碱基对命名为目标靶标的(-)模板链中的G和目标靶标的(+)模板链中的C。也就是说，待检测的第二突变是也发生在EGFR基因的外显子20中的单核苷酸多态性(EGFR C797S)。
在图5所示的本发明的实施方案中，目的是鉴定染色体样品中含有两个靶突变的存在(在这种情况下是EGFR T790M和EGFR C797S两者的存在)。如实施例3所述，样品中在同一染色体上发生两个靶突变(即顺式)不仅与仅具有密切相关的野生型序列的样品区别开，而且还与含有相同两个突变但每个位于不同姐妹染色体上(即反式)的样品区别开。每个引物均具有一个询问核苷酸，此处是一个3'-末端询问核苷酸，其与两个突变中的一个互补。一个引物，此处命名为正向引物，并且也是如中小图所示的限制性引物，其询问核苷酸与(-)模板链中的T790M突变互补。另一个引物，此处命名为反向引物，并且是如中小图所示的过量引物，其询问核苷酸与(+)模板链中的C797S突变互补。上图还显示了具有单链环和双链茎的同类荧光检测探针，此处是分子信标探针，其中茎的一个臂用荧光团(o)标记，并且另一个臂用淬灭剂(·)标记。在所述实施方案中，分子信标是“常规”分子信标探针，即，其中仅使其单链环与探针的靶标互补的分子信标探针，所述探针的靶标在这种情况下是扩增产物中引物序列之间区域的互补物。下图显示了检测，其可以是实时检测或终点检测，如数字PCR方法中所使用的那样。显示这种“引物间特异性”探针与(-)扩增子杂交，其中探针的荧光团通过探针的杂交而与探针的猝灭剂分离。
实施例3描述了图5中所示的根据本发明的方法的实施方案。两个不同的靶突变，T790M(其在EGFR基因的外显子20中具有A:T碱基对代替G:C碱基对)和C797S(其在同一外显子中具有G:C碱基对代替C:G碱基对)，如果它们发生在同一染色体上，即如果它们以顺式发生，则它们彼此相距20个核苷酸。实施例3中所述测定的目的是确定这两个突变(如果它们均存在于样品中)是否确实发生在同一染色体上，或者它们是否(如果它们均存在)发生在姐妹染色体上，即它们是否以反式发生。如果这两个体细胞突变中仅有一个发生在来自患有非小细胞肺癌的患者的样品中，或者如果两者均发生但以反式发生在姐妹染色体上(Vokes和
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(2017)Journal of Thoracic Oncology 12:1608-1610)，奥希替尼将是一种有效的靶向治疗(Lamb和Scott(2017)Targeted Oncology 12:555-562)。然而，如果这些突变两者以顺式发生在同一染色体上，则产生的EGFR蛋白中将会有两个氨基酸取代，并且奥希替尼将不是有效的靶向治疗(Wang等人(2016)Journal of Hematology and Oncology9:59)。取而代之的是，布加替尼(Brigatinib)将取代其而是有效的(Uchibori等人(2017)Nature Communications 8:14768)。
为了获得用于评估ΔCt的参考并且为了说明为什么需要所述方法，使用常规引物作为反向引物进行了第一系列扩增，其实时荧光曲线如图6所报告。下小图E显示了仅含有10,000个拷贝的密切相关(野生型)EGFR序列的样品的四个重复的荧光曲线；左上小图A显示了含有10,000个拷贝的EGFR野生型序列加10个拷贝的EGFR T790M序列的样品的四个重复的曲线；右上小图B显示了含有10,000个拷贝的EGFR野生型序列加10个拷贝的EGFRC797S序列的样品的四个重复的曲线；右中小图D显示了含有10,000个拷贝的EGFR野生型序列加10个拷贝的EGFR T790M序列和10个拷贝的EGFR C797S序列(即，两个突变以反式存在)的样品的四个重复的曲线；并且左中小图C显示了含有10,000个拷贝的EGFR野生型序列加10个拷贝的含有EGFR T790M突变和EGFR C797S突变两者的序列(即，这两个突变以顺式存在)的样品的四个重复的曲线。如表3所示，仅含有10,000个野生型模板的样品的平均Ct值为45.82，而除了10,000个野生型模板之外还含有10个拷贝的任一或两种突变模板的四种不同类型的样品的平均Ct值为38.34、39.95、38.44和39.49(其总体的平均Ct值为39.05)。此处的关键点是，尽管低于仅含有野生型模板的样品的Ct值的平均Ct值(平均ΔCt为6.77)表明了样品中一种或两种突变的存在，但反式配置(其复制曲线如右中小图D所示)的平均Ct值为38.44，这与顺式配置(其复制曲线如左中小图C所示)几乎相同，后者给出了非常相似的39.49的平均Ct值。因此，顺式配置不能与反式配置区分开。
为了实现这种区分，使用图5所示的方法进行了第二系列的扩增。实时PCR扩增和检测是使用一对超选择性引物(如图5所示)，对含有顺式配置的两个突变的样品或对含有反式配置的两个突变的样品进行的，其实时荧光曲线如图7中所报告。下小图C显示了仅含有10,000个拷贝的野生型序列的样品的四个重复的荧光曲线；左上小图B显示了含有10,000个拷贝的野生型序列加10个拷贝的顺式配置的两个突变的样品的四个重复的曲线；且右上小图B显示了含有10,000个拷贝的野生型序列加10个拷贝的在不同序列中即反式配置的两个突变的样品的四个重复的曲线。顺式样品的平均Ct值为41.31。经过55个扩增循环，反式样品和仅野生型样品均未表现出高于背景的荧光。按照我们的规定，给每一个设置>55的Ct值，ΔCt值为13.69。这种方法有资格作为根据本发明的方法。它满足了不具有顺式模板(目标靶序列)的样品在55个扩增循环内均未产生高于背景的Ct值的标准。此外，由于ΔCt值相对于仅野生型样品增加了13.69个循环，因此它满足了增加至少5个循环的另外标准。
在实施例4中，用ARMS引物代替超选择性反向引物来作为反向引物，重复实施例3中第二系列扩增的方法。图8示出了用于检测顺式配置的两个突变的方法，且实时荧光曲线如图9所报告，其中下小图C显示了仅含有10,000个拷贝的野生型序列的样品的四个重复的荧光曲线；左上小图A显示了含有10,000个拷贝的野生型序列加10个拷贝的顺式配置的两个突变的样品的四个重复的曲线；且右上小图B显示了含有10,000个拷贝的野生型序列加10个拷贝的在不同序列中即反式配置的两个突变的样品的四个重复的曲线。顺式样品的平均Ct值为43.31。经过55个扩增循环，反式样品和仅野生型样品均未表现出高于背景的荧光。按照我们的规定，给每一个设置>55的Ct值，ΔCt值为11.69。这种方法有资格作为根据本发明的方法。它满足了不具有顺式模板(目标靶序列)的样品在55个扩增循环内均未产生高于背景的Ct值的标准。此外，由于ΔCt值相对于仅野生型样品增加了11.69个循环，因此它满足了增加至少5个循环的另外标准。
实施例5描述了在方法中使用ARMS引物作为第二引物以检测单个碱基对变化。进行测定以证明使用ARMS引物作为限制性引物或过量引物。如实施例5中所述，进行使用实时检测的实时PCR测定以在含有10,000个拷贝的其密切相关的非目标野生型靶序列的混合物中检测10个拷贝的稀有KRAS G12D目标突变靶序列，所述测定使用以下几种不同的引物对：限制性ARMS正向引物和过量超选择性反向引物、限制性超选择性正向引物和过量ARMS反向引物以及一对超选择性引物(作为对照)。每个多部分引物和每个ARMS引物均具有与突变碱基对的核苷酸互补的3'-末端询问核苷酸。
其中ARMS引物是正向引物的方法如图10所示。这些测定的结果如图11所示。对于含有超选择性引物作为多部分第一引物的所有引物对，仅含有非目标(野生型)模板序列的样品的荧光强度经过55个扩增循环未升至高于背景。因此，使用这些引物对中的每一个的方法是根据本发明的方法。
实施例6描述了实时PCR测定的选择性和灵敏度，所述测定被设计为在含有来自整个正常人类基因组的大量DNA片段的样品中检测稀有突变靶DNA片段的存在并确定其相对丰度。具体地，该实施例证明了使用均与稀有DNA片段(在包含来自整个正常人类基因组的大量DNA片段的样品中对所述稀有DNA片段进行了实时PCR测定的分析)中存在的单个碱基对突变互补的一对等位基因分辨多部分引物，能够可靠地检测极少数量的靶片段。具体地，每一个均据称在来自10,000个拷贝的整个正常人类基因组的DNA片段的存在下含有5个突变DNA片段的10个样品中的每一个均给出了存在突变DNA片段的阳性信号。作为对照，不含突变DNA片段但含有来自10,000个拷贝的整个正常人类基因组的DNA片段的所有10个样品均未给出存在突变DNA片段的阳性信号。
这些结果意味着，可以凭借在使用等位基因分辨引物如超选择性引物的引物对(两者均对相同的突变碱基对特异)的测定中的阳性结果来指示真阳性结果；并且可以凭借这些相同测定中的阴性结果来指示真阴性结果。这是极其敏感的PCR测定的关键标准，例如设计为在从癌症患者获得的10mL血液样品的血浆分离而来的无细胞DNA(cell-free DNA)中检测稀有突变片段的存在，其中存在特定的突变表明特定的靶向治疗将是有效的(Sabari等人(2019)Journal of the National Cancer Institute 111:575-583)。
在这个示例中进行的所有测定均含有来自10,000个拷贝的整个正常人类基因组的DNA片段。这大于通常从患者的10mL血液样品中获得的1mL血浆中分离出的无细胞DNA片段的量(Meddeb等人(2019)Scientific Reports 9:5220)。然而，由于患者血液样品中的无细胞DNA片段的实际数量可能会在不同小时之间变化，因此重要的是在实时PCR测定中包含检测来自正常参考基因的DNA片段的引物和探针，从而使得能够确定样品中DNA的量。然后，结果将表明样品中是否有足够的DNA以能够检测稀有突变DNA片段。此外，PCR测定中获得的突变靶片段的阈值循环(Ct)与获得的参考基因的阈值循环的比较(ΔCt)使得结果能够表示为患者DNA中该突变的相对丰度，这是临床相关的结果。
图12描述了在实施例6的测定中如何使用一对针对EGFR基因中G719C突变的超选择性引物。针对G719C基因的限制性引物含有一个5'-标签序列，并且存在于测定中的FAM标记的常规分子信标通过与被并入过量(-)扩增子的3'末端的5'-标签序列的互补物结合，来发出存在由于样品中存在突变DNA片段而产生的扩增子的信号。实施例6中进行的所有测定还含有限制浓度的针对人β-肌动蛋白基因的超选择性正向引物，和过量浓度的针对β-肌动蛋白基因的常规反向引物，以及发出存在从β-肌动蛋白参考基因产生的扩增子的信号的Quasar 705标记的引物间特异性分子信标。
进行了四组每组十个的测定，其中每个测定含有10,000个拷贝的来自正常人类基因组DNA的DNA限制性片段。此外，在每个测定中，第一组还含有500个拷贝的含有突变靶序列的线性化质粒，第二组也含有50个拷贝的突变DNA质粒，第三组也含有5个拷贝的突变DNA质粒，并且第四组作为阴性对照，不含任何突变DNA质粒。
这40个PCR测定的结果如图13所示。图13的左上小图A显示了每个含有500个突变质粒的测定的结果；右上小图B显示了含有50个突变质粒的测定的结果；左下小图C显示了仅含有5个突变质粒的测定的结果；且右下小图D显示了不含任何突变质粒的测定的结果。
所有这些测定均给出了阳性FAM信号，并且它们的平均Ct值为43.27。相比之下，所有不含任何突变质粒的反应在整个55个扩增循环期间均未产生高于背景的FAM信号。这些结果说明了使用等位基因特异性引物的引物对用于检测单核苷酸多态性的指数扩增测定具有卓越的选择性和敏感性，这表明使用这些引物对的测定将使极其灵敏的临床测定能够相对快速地、低成本地、在广泛可用的仪器中进行。
组合物和试剂盒
本发明涵盖了包含用于进行上述方法的上述引物和试剂的组合物或反应混合物。例如，所述组合物可以包含一种或多种选自核酸聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和检测剂的试剂。
检测剂可以是寡核苷酸探针，例如分子信标探针或用荧光团和猝灭剂标记的阴阳探针(Yin-Yang probe)。参见，例如，美国专利号5925517、6103476、6150097、6270967、6326145和7799522。除了上述试剂之外，所述组合物还可以包含以下一种或多种：盐，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4；缓冲剂，例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、MES钠盐、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三-[羟甲基]-甲基-3-氨丙烷磺酸(TAPS)；增溶剂；去污剂，例如非离子去污剂，例如Tween-20；核酸酶抑制剂；等等。
用于扩增和/或检测过程的反应组分可以以多种形式提供。例如，组分(例如，酶、脱氧核糖核苷三磷酸、衔接子(adaptor)、阻滞剂(blocker)和/或引物)可以悬浮在水溶液中或作为冷冻干燥或冻干的粉末、团粒或珠子。在后一种情况下，组分在重构时形成用于测定中的组分的完全混合物。
实施例
实施例1：在实时PCR分析中使用一对超选择性引物，用于在存在大量野生型模板的情况下检测稀有EGFR G719C突变模板
该第一个实施例的设计如图1所示。位于人表皮生长因子(EGFR)基因的外显子18中的靶突变(G719C)是一个代替C:G碱基对的A:T碱基对，前者在其他方面相同的野生型基因序列中发生。使用含有靶基因序列的突变型和野生型质粒进行PCR分析，其中一个超选择性引物(我们会将其称为“正向”引物)的“锚定”序列与样品中的所有(-)模板链(稀有目标靶标和大量的非目标靶标)结合。
在该第一个实施例中，限制性正向引物含有一个独特的“5'-标签序列”。当正向等位基因分辨引物与突变(-)模板结合并开始合成时，所得的(+)扩增子链含有整个正向引物序列，包含在其5'末端的5'-标签序列。随后，这些(+)扩增子用作反向等位基因分辨引物的模板，或在对照实验中用作反向常规(非分辨性)引物。所得的(-)扩增子将含有在其3'末端的5'-标签序列的互补物。存在于这些反应中以点亮合成的扩增子的分子信标探针的靶标是5'标签序列的3'互补物。此外，由于正向引物以有限量存在，单链扩增子是通过过量反向引物(等位基因分辨引物或常规引物任一者)的延伸制备的，这确保了分子信标探针能够与其靶标结合而没有来自折叠的(collapsing)扩增子双链的竞争。本实施例中使用的寡核苷酸序列为：
EGFR G719C超选择性正向引物32-28-20/13-8:1:0
5’-ACCTGCCGTCAACACGTGCGCAGTAGACCATC-TCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAA-CCTCTCCAACGAATCTCGAA-AAGTGCTGT-3’(SEQ ID No.1)，其中5'-标签的核苷酸加下划线，且3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR G719C超选择性反向引物24-18/10-8:1:0
5’-CCAGGGACCTTACCTTATACACCG-GATCCTAACTGAGGTCCA-ACCGGAGCA-3’(SEQ IDNo.2)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR外显子18常规反向引物
5’-CCAGGGACCTTACCTTATACACCG-3’(SEQ ID No.3)
常规分子信标(与5'-标签序列的互补物结合)
5’-Quasar 670-CCGCCTG-ACCTGCCGTCAACACGTGCGCAGTAGACCATC-CAGGCGG-BHQ2-3’,(SEQ ID No.4)，其中单链环中的核苷酸加下划线
含有EGFR G719C突变或相应EGFR野生型序列任一者的靶质粒购自IntegratedDNA Technologies,Coralville,Iowa(USA)，并通过将211个碱基对的基因片段插入pIDTSmart Amp载体来制备。用限制性内切酶Sca I(New England Biolabs,Ipswich,Massachusetts(USA))消化突变型和野生型质粒DNA。消化混合物在含有100mM NaCl、10mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇和50mM Tris-HCl(pH 7.9)的20μL体积中含有10单位的Sca I和4μg的突变型或野生型质粒DNA。反应在37℃下温育120分钟，然后在80℃下温育20分钟以使核酸内切酶失活。
PCR测定在30μL体积中进行，所述30μL体积含有10,000个拷贝的野生型模板，或在含有10,000个拷贝的野生型模板的混合物中含有10个拷贝的突变模板，以及扩增缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、2.5mM MgCl2)、50mM四甲基氯化铵(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri(USA))、0.5％Tween 20(Sigma-Aldrich)、1.5单位的Platinum TaqDNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts(USA))、250μM ATP、250μM CTP、250μM GTP、250μM TTP和300nM常规分子信标。一组反应含有60nM的EGFR G719C超选择性正向引物和300nM的EGFR外显子18常规反向引物。另一组反应含有60nM的EGFR G719C超选择性正向引物和300nM的EGFR G719C超选择性反向引物。两组反应均包含10,000个野生型拷贝的一式两份扩增和在含有10,000个野生型拷贝的混合物中的10个突变拷贝的一式两份扩增。使用0.2ml白色聚丙烯管(USAScientific,Ocala,Florida(USA))在Bio-RadCFX-96 Touch荧光光谱热循环仪(Hercules,California(USA))中一式两份进行扩增。热循环程序为95℃ 2分钟，然后是55个循环，每个循环为95℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 20秒。在每个热循环的60℃退火阶段结束时实时测量分子信标荧光强度。阈值循环(Ct值)由热循环仪自动计算。
图2显示了相对于这些实时PCR扩增和检测测定所完成的热循环的荧光强度读数。上小图A含有使用超选择性(SSP)正向引物和常规反向引物的反应的曲线，且下小图B含有使用超选择性(SSP)正向引物和超选择性(SSP)反向引物的反应的曲线。通过比较在10,000个野生型的存在下含有10个突变型的测定与仅含有10,000个野生型的测定，一式两份扩增的平均阈值循环(Ct值)以及这些测定的平均Ct值之间的差异(ΔCt值)列于表1中。
表1
Figure BDA0003574959870000301
实施例2：在实时PCR测定中使用一对超选择性引物，用于在存在大量野生型模板的情况下检测稀有EGFR T790M突变模板
本发明方法的这个实施例使用图3中所示的设计，其与图1关于检测的设计不同。在这个实施例中，我们使用了有时称为“共享茎”分子信标探针(Tsourkas等人(2002)Nucleic Acids Research 30:4208-4215)的分子信标变体，以靶向限制性超选择性引物的桥序列的互补物。此类分子信标探针与常规分子信标探针(实施例1)的不同之处在于前者具有与茎的一个臂以及与单链环互补的探针的靶序列。位于EGFR基因的外显子20中的靶序列突变(T790M)，是A:T碱基对代替G:C碱基对的单碱基对取代(SNP)，后者发生在其他方面相同的密切相关的野生型序列中。本实施例中使用的寡核苷酸是：
EGFR T790M超选择性正向引物24-22/11-8:1:0
5’-CGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACC-
CAACACGTGCGCAGTAGACCAC-GCTCATCAT-3’(SEQ ID No.5)，其中3'-末端询问核苷酸加粗，并且其互补物由共享茎分子信标检测的桥序列的部分加下划线
EGFR T790M超选择性反向引物23-10/19-7:1:0
5’-TTTGTGTTCCCGGACATAGTCCA-ATCTTCGGTG-GAGCTGCA-3’(SEQ ID No.6)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR外显子20常规反向引物
5’-TTTGTGTTCCCGGACATAGTCCA-3’(SEQ ID No.7)
共享茎分子信标(与正向引物的桥序列的互补物结合)
5’-Quasar 670-TGGTCT-CAACACGTGCGCAGT-AGACCA-BHQ2-3’(SEQ ID No.8)，其中环和与靶标互补的臂中的核苷酸加下划线
含有EGFR T790M突变或相应EGFR野生型序列任一者的靶质粒购自IntegratedDNA Technologies(IDT)，并通过将200个碱基对的基因片段插入pIDTSmart Amp载体来制备。用限制性内切酶Sca I消化突变型和野生型质粒DNA。消化混合物在含有100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇和50mM Tris-HCl(pH 7.9)的20μL体积中含有10单位的Sca I和4μg的突变型或野生型质粒DNA。反应在37℃下温育120分钟，然后在80℃下温育20分钟以使核酸内切酶失活。
PCR测定在30μL体积中进行，所述30μL体积含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、2.5mM MgCl2、50mM四甲基氯化铵、0.5％Tween 20、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶、250μM ATP、250μM CTP、250μM GTP、250μM TTP和300nM共享茎分子信标。一组反应含有60nM的正向超选择性引物和300nM的常规反向引物。另一组反应含有60nM的超选择性正向引物和300nM的超选择性反向引物。两组反应均包含10,000个野生型拷贝的五个重复扩增和在含有10,000个野生型拷贝的混合物中的10个突变拷贝的五个重复扩增。使用0.2ml白色聚丙烯管在Bio-Rad CFX-96Touch荧光光谱热循环仪中进行扩增。热循环程序为95℃ 2分钟，然后是55个循环，每个循环为95℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 20秒。在每个60℃退火阶段结束时测量分子信标荧光强度。阈值循环由热循环仪自动计算。
图4显示了相对于使用实时荧光检测的PCR扩增所完成的热循环的荧光强度读数。上小图A含有使用限制性超选择性(SSP)正向引物和过量常规反向引物的重复反应的曲线。下小图B含有使用限制性超选择性(SSP)正向引物和过量超选择性(SSP)反向引物的重复反应的曲线。通过比较在10,000个野生型的存在下含有10个突变型的测定与仅含有10,000个野生型的测定，重复扩增的平均阈值循环(Ct值)以及这些测定的平均Ct值之间的差异(ΔCt值)列于表2中。仅野生型模板和超选择性引物对的五个扩增中的三个的荧光强度在55个循环下未升至高于背景，所以我们为每一个设置>55的Ct值。
表2
Figure BDA0003574959870000321
实施例3：在实时PCR测定中使用一对超选择性引物，用于确定同一基因中的两个不同体细胞突变是否以顺式发生在同一染色体上，或者它们是否以反式发生在姐妹染色体上
本发明方法的这个实施例使用图5中所示的方法。两个不同的靶突变，T790M(其在EGFR基因的外显子20中具有代替G:C碱基对的A:T碱基对)和C797S(其在同一外显子中具有代替C:G碱基对的G:C碱基对)，如果它们发生在同一染色体上，即如果它们以顺式发生，则它们彼此相距20个核苷酸。如本实施例所示的测定的目的是为了确定这两个突变(如果它们都存在于样品中)是否确实发生在同一染色体上，或者(如果它们都存在)它们是否发生在姐妹染色体上，即它们是否以反式发生。
我们首先进行了一系列初步测定，其说明了从针对这些单个突变的多重测定(或从其每一个均搜索一个或另一个靶突变的单个测定)会获得的结果类型，其结果将需要顺式或反式测定以确定有效的靶向治疗。在这些测定中，存在三种引物：针对EGFR T790M的超选择性正向引物、针对EGFR C797S的超选择性正向引物和常规反向引物，所述常规反向引物参与扩增子的合成，无论样品中仅存在这两个突变中的一个还是样品中同时存在这两个突变。这些实验中使用的寡核苷酸序列是：
EGFR T790M超选择性正向引物24-22/13-8:1:0
5’-GCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCA-AAGAATCAACAAGCTACAACTC-GCTCATCAT-3’(SEQID No.9)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR C797S超选择性正向引物21-13/20-9:1:0
5’-CTGCCTCACCTCCACCGTGCA-AGCACTCGCAGAA-CCTTCGGCTC-3’(SEQ ID No.10)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR外显子20常规反向引物#2
5’-CACCAGTTGAGCAGGTACTGG-3’(SEQ ID No.11)
扩增子特异性分子信标
5’-FAM-CCGTGG-CTGGACTATGTCCGGGAACACA-CCACGG-BHQ1-3’(SEQ ID No.12)，其中单链环的核苷酸加下划线
在其设计未显示在图5中的第一组实验(其作为对照)中，两个超选择性正向引物均与(-)模板链结合；常规反向引物与两个正向引物在互补链中的结合处下游的互补(+)模板链结合；并且分子信标探针与在超选择性正向引物的结合位点和常规反向引物的结合位点之间的区域中的任何产生的(-)扩增子链结合。
与前述实施例一样，三个靶质粒购自Integrated DNA Technologies，并通过将200个碱基对的基因片段插入pIDTSmart Amp载体来制备。用限制性内切酶Sca I消化这些质粒DNA的每一个。消化混合物在含有100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇和50mMTris-HCl(pH 7.9)的20μL体积中含有10单位的Sca I和4μg的突变型或野生型质粒DNA。反应在37℃下温育120分钟，然后在80℃下温育20分钟以使核酸内切酶失活。
我们制备了在30μL体积中的五种不同的扩增反应混合物。每种均含有10,000个拷贝的野生型DNA模板。一组反应仅含有野生型模板。其他四组反应额外含有10个拷贝的以下靶质粒或质粒组合之一：T790M质粒；C797S质粒；T790M质粒加C797S质粒(模拟这两个突变以反式发生的情况)；或T790M–C797S质粒，其具有存在于同一模板上(顺式)的两个突变。所有反应混合物均含有60nM超选择性T790M正向引物、60nM C797S超选择性正向引物、300nM常规反向引物、300nM的“扩增子特异性”分子信标、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、2.5mM MgCl2、50mM四甲基氯化铵(TMAC)、0.5％Tween 20、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶、250μM ATP、250μM CTP、250μM GTP和250μM TTP。
使用0.2ml白色聚丙烯管在Bio-Rad CFX-96 Touch荧光光谱热循环仪中进行五种不同反应混合物中每一种的四个重复扩增。热循环程序为95℃ 2分钟，然后是55个循环，每个循环为95℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 20秒。在每个60℃退火阶段结束时测量分子信标荧光强度。
图6显示了相对于使用实时荧光检测的PCR扩增的热循环的荧光强度读数。如上所述，所有扩增反应混合物均含有10,000个野生型拷贝(非目标靶模板)。左上小图A显示了其中扩增反应混合物还含有10个拷贝的T790M突变靶模板的重复反应的结果；右上小图B显示了其中扩增反应混合物还含有10个拷贝的C797S突变靶模板的重复反应的结果；中左小图C显示了其中扩增反应混合物还含有10个拷贝的T790M突变靶模板和10个拷贝的T790M-C797S突变靶模板的重复反应的结果；右中小图D显示了其中扩增反应混合物还含有10个拷贝的T790M突变靶模板和10个拷贝的C797S突变靶模板的重复反应的结果；并且下小图E显示了其中扩增反应混合物不含任何拷贝的突变靶模板的重复反应的结果。这些重复扩增的平均阈值循环(Ct值)列于表3中。
表3
Figure BDA0003574959870000351
表3显示了含有EGFR T790M超选择性正向引物和EGFR C797S超选择性正向引物以及EGFR外显子20常规反向引物的对照反应的结果。仅含有野生型的样品的平均Ct值(45.82)与含有顺式的两个突变的样品(39.49)可以区分开。然而，这个平均Ct值与含有反式的两个突变的反应的平均Ct值几乎相同，并且与仅含有两个不同突变的一个的反应的平均Ct值几乎相同。
为了说明如何确定这两个突变是否发生在同一模板上(即，顺式)，根据本发明的一个实施方案，我们进行了额外的三组测定，其设计如图5所示。这些测定含有有限的EGFRT790M超选择性正向引物、过量的EGFR C797S反向引物和靶向超选择性引物结合的序列之间的(-)扩增子的区域的引物间特异性分子信标探针，从而仅当两个引物均已结合并已在含有EGFR T790M突变和EGFR C797S突变的模板分子上延伸时(即，仅当两个突变以顺式存在时)才发出信号。使用的寡核苷酸是：
EGFR T790M超选择性正向引物24-22/13-8:1:0
5’-GCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCA-AAGAATCAACAAGCTACAACTC-GCTCATCAT-3’(SEQID NO.9)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR C797S超选择性反向引物30-20/19-8:1:0
5’-TTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCT-GTCCTTTACAAGCACGAGTG-CCAGGAGGG-3’(SEQ ID No.13)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
引物间特异性分子信标
5’-FAM-CCGTCG-CAGCTCATGCCCTTCGGC-CGACGG-BHQ1-3’(SEQ ID No.14)，其中单链环的核苷酸加下划线
扩增反应混合物含有60nM超选择性正向引物、300nM超选择性反向引物和300nM分子信标。所有反应混合物均含有10,000个拷贝的EGFR野生型靶模板。一组反应额外含有10个拷贝的T790M-C797S靶模板，第二组反应含有10个拷贝的T790M靶模板和10个拷贝的C797S靶模板，并且第三组反应不含任一突变靶模板的拷贝，即仅存在野生型模板。扩增反应混合物的其他方面如上所述。
如上所述地使用实时检测进行三种反应混合物中每一种的四个重复扩增。在前55个扩增循环期间获得的实时荧光读数显示在包含图7的三个图中。下小图C显示了仅含有10,000个野生型模板的反应混合物的结果，其中所有四个重复的荧光经过55个循环均未升至高于背景；因此，四个重复的平均Ct虽然无法确定，但至少大于55。右上小图B显示了含有10,000个野生型模板加10个拷贝的每个T790M模板和C797S模板(即，两个突变以反式存在)的反应混合物的结果；并且所有四个重复的荧光经过55个循环均未升至高于背景；因此，四个重复的平均Ct虽然无法确定，但至少大于55。左上小图A显示了含有10,000个野生型模板加10个拷贝的T790M-C797S模板(即，两个突变以顺式存在)的反应混合物的结果；并且所有四个这些反应均给出了阳性信号，其平均Ct为41.31。在存在10,000个野生型模板的情况下，十个顺式模板之间的ΔCt虽然不能精确确定，但当与含有10个拷贝的两个不同突变模板(以反式存在于还含有10,000个野生型模板的反应中)中的每一个的反应相比时，因而至少大于13.69。
实施例4：在实时PCR测定中使用作为限制性引物的超选择性引物和ARMS反向引物，用于确定同一基因中的两个不同体细胞突变是否以顺式发生在同一染色体上，或者它们是否以反式发生在两条不同的姐妹染色体上
我们重复了实施例3中描述的方法，使用ARMS引物作为反向引物而代替了反向超选择性引物。这种替代安排如图8所示。扩增反应混合物中的寡核苷酸是：
EGFR T790M超选择性正向引物24-22/13-8:1:0
5’-GCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCA-AAGAATCAACAAGCTACAACTC-GCTCATCAT-3’(SEQID No.9)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR C797S ARMS反向引物19:m1:1:1:0
5’-TCCCGGACATAGTCCAGGAAGG-3’(SEQ ID No.15)，其中3'-末端询问核苷酸加粗，并且引入的错配核苷酸加粗并以斜体显示
引物间特异性分子信标
5’-FAM-CCGTCG-CAGCTCATGCCCTTCGGC-CGACGG-BHQ1-3’(SEQ ID No.14)，其中单链环的核苷酸加下划线
在ARMS引物的序列中，与目标(突变)靶序列和密切相关非目标(野生型)靶序列两者均错配的有意引入的核苷酸加粗并以斜体显示。该核苷酸是从3'末端算起的第三个核苷酸，并且它会相对于目标靶序列和非目标密切相关靶序列两者产生一个A:C错配。
除了用ARMS反向引物替换超选择性反向引物之外，反应混合物与实施例3中描述的相同，热循环条件和荧光检测方式也相同。本实验的设计如图8所示。对于与图7中所示相同的系列扩增，获得了非常相似的结果。
包含ARMS引物的这些实验的结果如图9所示。对于仅含有10,000个野生型模板的反应，来自所有四个重复的荧光信号经过55个循环均未能升至高于背景，因此四个重复的平均Ct值虽然无法确定，但至少大于55。对于含有10,000个野生型模板加上T790M模板和C797S模板各10个拷贝(以反式存在)的反应，来自所有四个重复的荧光信号经过55个循环均未能升至高于背景，因此所有四个重复的平均Ct值虽然无法确定，但至少大于55。对于含有10,000个野生型模板加上10个拷贝的T790M-C797S模板(以顺式存在)的反应，四个重复的平均Ct值为43.31。含有10个顺式模板和10,000个野生型模板的反应与含有10个反式模板和10,000个野生型模板的反应之间的ΔCt值虽然无法精确确定，但因而至少大于11.69。
实施例5：在包含ARMS引物的实时PCR测定中使用超选择性引物作为限制性引物或过量引物的比较，用于在存在大量野生型模板的情况下检测稀有KRAS G12D突变模板
本实施例中的实验使用超选择性引物作为限制性第一引物(此处描述为正向引物)和ARMS引物作为过量第二引物(此处描述为反向引物)；以及超选择性引物作为过量第一引物(此处描述为反向引物)和ARMS引物作为限制性第二引物(此处描述为正向引物)。为了比较，实验还使用了一对超选择性引物。在所有引物对中，正向限制性引物具有一个5'-标签序列，其互补序列是分子信标探针的靶标。其中超选择性引物是反向引物和ARMS引物是正向引物的方法如图10所示，其中ARMS正向引物包含一个5'-标签序列。本实施例中的目标靶标是KRAS G12D突变模板，其与密切相关的野生型模板的不同之处在于单个T:A突变碱基对。每个引物对中的两个引物均具有一个与该碱基对的一个核苷酸互补的3'-末端询问核苷酸。本实施例中使用的寡核苷酸的序列是：
KRAS G12D超选择性正向引物32-28-19/10-8:1:0
5’-ACCTGCCGTCAACACGTGCGCAGTAGACCATC-GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAAC-ACACAGTCTGAGCCCACTC-TGGAGCTGA-3’(SEQ ID No.16)，其中
5'-标签序列中的核苷酸加下划线，且3'-末端询问核苷酸加粗
KRAS G12D超选择性反向引物30-14/11-7:1:0
5’-AAATGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAG-TACCCAGCTACTAA-TACGCCAT-3’(SEQ IDNo.17)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
与超选择性正向引物一起使用的常规分子信标(与5'-标签序列的互补物结合)
5’-Quasar 670-CCGCCTG-ACCTGCCGTCAACACGTGCGCAGTAGACCATC-CAGGCGG-BHQ2-3’(SEQ ID No.4)，其中单链环中的核苷酸加下划线
KRAS G12D ARMS正向引物21-21-m1:1:1:0
5’-CAACACTGGCGCAGTAGACCA-TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGA-3’(SEQ ID No.18)，其中5'-标签序列中的核苷酸加下划线，3'-末端询问核苷酸加粗，且引入的错配核苷酸以斜体显示并加粗
KRAS G12D ARMS反向引物18-m1:1:1:0
5’-AGGCACTCTTGCCTACGCCAT-3’(SEQ ID No.19)，其中3'-末端询问核苷酸加粗，并且引入的错配核苷酸以斜体显示并加粗
与ARMS正向引物一起使用的共享茎分子信标(与5'-标签序列的互补物结合)
5’-FAM-TGGTCT-CAACACTGGCGCAGT-AGACCA-BHQ1-3’(SEQ ID No.20)，其中单链环中的核苷酸加下划线
每个ARMS引物从3'末端算起的第三个核苷酸加粗并以斜体显示，因为它与突变序列和野生型序列两者均错配。这种错配在序列命名中用“m”表示。
含有KRAS G12D突变或相应KRAS野生型序列任一者的靶质粒购自Integrated DNATechnologies，并通过将390个碱基对的基因片段插入pUCIDT载体来制备。用限制性内切酶Dra I(New England Biolabs)消化突变型和野生型质粒DNA。消化混合物在含有50mM乙酸钾、20mM Tris-乙酸盐(pH 7.9)、10mM乙酸镁和100μg/ml牛血清白蛋白的20μL体积中含有10单位的Dra I和4μg突变型或野生型质粒DNA。反应在37℃下温育120分钟，然后在65℃下温育20分钟以使核酸内切酶失活。
PCR测定在30μL体积中进行，所述30μL体积含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、2.5mM MgCl2、50mM四甲基氯化铵(Sigma-Aldrich)、0.5％Tween 20(Sigma-Aldrich)、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)、250μM ATP、250μM CTP、250μM GTP、250μM TTP、60nM正向引物、300nM反向引物和与超选择性正向引物一起使用的300nM常规分子信标或与ARMS正向引物一起使用的300nM共享茎分子信标。使用0.2ml白色聚丙烯管(USA Scientific)在Bio-Rad CFX-96 Touch荧光光谱热循环仪中进行扩增。热循环程序为95℃ 2分钟，然后是55个循环，每个循环为95℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 20秒。在每个60℃退火阶段结束时测量分子信标荧光强度。
反应混合物含有10,000个拷贝的野生型靶模板和10个或0个拷贝的突变靶模板。扩增反应一式三份地运行。得到的实时荧光结果如图11所示，其中上小图A显示了超选择性引物的引物对获得的结果，左下小图B显示了包含超选择性正向限制性引物和过量ARMS反向引物的引物对获得的结果，且右下小图C显示了包含限制性ARMS正向引物和过量超选择性反向引物的引物对获得的结果。在任何小图中均没有野生型样品的荧光经过55个循环后升至高于背景，而所有具有10个拷贝的突变模板的样品的Ct值均低于45。
实施例6：双重测定(duplex assay)：在实时PCR测定中使用一对超选择性引物，用于在存在大量的正常人类基因组DNA模板的情况下检测稀有EGFR G719C突变模板，以及同时使用不同的超选择性引物和常规引物检测β-肌动蛋白参考基因
这些用于检测G719C的PCR测定的设计如图12所示。位于人表皮生长因子受体(EGFR)基因的外显子21中的G719C靶突变是一个代替G:C碱基对的T:A碱基对，前者发生在其他方面相同的野生型基因序列中。所述测定使用含有突变靶序列的线性化质粒，并且所述测定使用含有野生型EGFR基因序列的片段化正常人基因组DNA来模拟从液体活检样品中的血浆中分离的无细胞DNA片段。
在本实施例中，用于检测G719C的限制性正向引物含有一个独特的“5'-标签序列”。当正向等位基因分辨引物与突变(-)模板结合并开始合成时，得到的(+)扩增子链含有整个正向引物序列，包含其5'末端的5'-标签序列。随后，这些(+)扩增子用作反向等位基因分辨引物的模板。产生的(-)扩增子含有在其3'末端的5'-标签序列的互补物。它是5'-标签序列的3'互补物，所述5'-标签序列是FAM标记的常规分子信标探针结合的靶标。正向超选择性引物以有限浓度存在，且反向超选择性引物以过量浓度存在，这确保了分子信标探针将能够结合过量的(-)扩增子靶标而没有来自有限浓度的(+)扩增子的显著竞争。
此外，测定中还包含对发生在正常人DNA(含有野生型EGFR基因)中的β-肌动蛋白参考基因序列的检测，以提供反映样品中DNA量的参考阈值(Ct)。使用Quasar 705标记的引物间特异性分子信标检测扩增子，所述分子信标与超选择性引物序列的互补物和常规引物序列之间的过量β-肌动蛋白(-)扩增子结合。
本实施例中使用的寡核苷酸序列为：
EGFR G719C超选择性正向引物32-28-20/13-8:1:0
5’-ACGTGCCCTCAATACGAGCCCCCTTCACCAAC-TCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAA-CCTCTCCAACGAATCTCGAA-AAGTGCTGT-3’(SEQ ID No.21)，其中
5'-标签的核苷酸加下划线，并且3'-末端询问核苷酸加粗
EGFR G719C超选择性反向引物24-18/10-7:1:0
5’-CCAGGGACCTTACCTTATACACCG-GATCCTAACTGAGGTCCA-ACCGGAGCA-3’(SEQ IDNo.2)，其中3'-末端询问核苷酸加粗
常规分子信标(与5'-标签序列的互补物结合)
5’-FAM-CGCCTG-ACGTGCCCTCAATACGAGCCCCCTTCACCAAC-CAGGCG-BHQ1-3’，(SEQ IDNo.22)，其中单链环中的核苷酸加下划线β-肌动蛋白超选择性正向引物24-18/14-9:0
5’-CCAACCGCGAGAAGATGACCCAGG-CATAGCCAGCTAATGACC-CCTCTTCTG-3’(SEQ IDNo.23)
β-肌动蛋白常规反向引物
5’-CGGCTA-AGAGAACCAGTGAGAAAGGGC-3’(SEQ ID No.24)，具有一个5'尾序列
引物间特异性分子信标(在扩增子的引物间区域中结合)
5’-Quasar 705-CCGCTC-CCTCCTTCCTGGCCTCCC-GAGCGG-BHQ2-3’,(SEQ IDNo.25)，其中单链环中的核苷酸加下划线
含有EGFR G719C突变的靶质粒购自Integrated DNA Technologies，并且其通过将211个碱基对的基因片段插入pUCIDT载体中来制备。用限制性内切酶Dra I(New EnglandBiolabs)消化突变质粒DNA。消化混合物在含有50mM乙酸钾、20mM Tris-乙酸盐(pH 7.9)、10mM乙酸镁和100μg/ml牛血清白蛋白的20μL体积中含有10个单位的Dra I和4μg突变质粒DNA。反应在37℃下温育120分钟，然后在65℃下温育20分钟以使核酸内切酶失活。
野生型人类DNA(来自多个匿名供体)，目录号G1521，购自Promega Corporation(Madison,WI)。将约9μg的这种DNA在37℃下在含有10单位的限制性核酸内切酶Mse I(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)的由New England Biolabs提供的含有100μg/mL牛血清白蛋白、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾和20mM Tris-乙酸盐(pH 7.9)的50μL缓冲液中消化120分钟；然后在65℃下温育20分钟以使酶失活。
PCR测定在30μL体积中进行，所述30μL体积含有50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、2.5mM MgCl2、60mM四甲基氯化铵(Sigma-Aldrich)、0.5％Tween 20(Sigma-Aldrich)、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)、250μM ATP、250μM CTP、250μM GTP、250μM TTP、两个不同的超选择性正向引物各60nM、500nM EGFRG719C超选择性反向引物、500nMβ-肌动蛋白常规反向引物、300nM用于检测EGFR G719C突变扩增子的常规分子信标以及用于检测β-肌动蛋白扩增子的500nM引物间特异性分子信标。
使用0.2ml白色聚丙烯管(USA Scientific)在Bio-Rad CFX-96 Touch荧光光谱热循环仪中进行扩增。热循环程序为95℃ 2分钟，然后是55个循环，每个循环为95℃ 20秒、60℃ 20秒和72℃ 20秒。在每个60℃退火阶段结束时在FAM通道和Quasar 705通道中测量分子信标荧光强度。
图13显示了相对于热循环的荧光强度读数。
第一组10个反应(其结果显示在左上小图A中)含有10,000个拷贝的野生型基因组DNA加上500个拷贝的突变质粒DNA；第二组10个反应(其结果显示在右上小图B中)含有10,000个拷贝的野生型基因组DNA拷贝加上50个拷贝的突变质粒DNA；第三组10个反应(其结果显示在左下小图C中)含有10,000个拷贝的野生型基因组DNA加上5个拷贝的突变质粒DNA；并且第四组10个反应(其结果显示在右下小图D中)仅含有10,000个拷贝的野生型基因组DNA，并且不含突变质粒DNA拷贝。
上述实施例和优选实施方案的描述应视为说明而不是限制如权利要求所定义的本发明。容易理解的是，在不背离如权利要求中所述的本发明的情况下，可以使用上述特征的许多变化和组合。此类变化不被视为背离本发明的范围，并且所有此类变化旨在包括在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 鲁特格斯生物医药和健康科学（Rutgers Biomedical and Health Sciences，PHRI）
F·R·克雷默（Kramer, Fred R.）
D·R·瓦尔加斯-戈尔德（Vargas-Gold, Diana R.）
<120> 检测稀有序列变体的测定方法和试剂盒
<130> 096747.00422
<150> 62/909,483
<151> 2019-10-02
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 1
acctgccgtc aacacgtgcg cagtagacca tctctcttga ggatcttgaa ggaaactgaa 60
cctctccaac gaatctcgaa aagtgctgt 89
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 2
ccagggacct taccttatac accggatcct aactgaggtc caaccggagc a 51
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 3
ccagggacct taccttatac accg 24
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 4
ccgcctgacc tgccgtcaac acgtgcgcag tagaccatcc aggcgg 46
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 5
cgcctgctgg gcatctgcct cacccaacac gtgcgcagta gaccacgctc atcat 55
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 6
tttgtgttcc cggacatagt ccaatcttcg gtggagctgc a 41
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 7
tttgtgttcc cggacatagt cca 23
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 8
tggtctcaac acgtgcgcag tagacca 27
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 9
gccgcctgct gggcatctgc ctcaaagaat caacaagcta caactcgctc atcat 55
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 10
ctgcctcacc tccaccgtgc aagcactcgc agaaccttcg gctc 44
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 11
caccagttga gcaggtactg g 21
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 12
ccgtggctgg actatgtccg ggaacacacc acgg 34
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 13
ttgagcaggt actgggagcc aatattgtct gtcctttaca agcacgagtg ccaggaggg 59
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 14
ccgtcgcagc tcatgccctt cggccgacgg 30
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 15
tcccggacat agtccaggaa gg 22
<210> 16
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 16
acctgccgtc aacacgtgcg cagtagacca tcggcctgct gaaaatgact gaatataaac 60
acacagtctg agcccactct ggagctga 88
<210> 17
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 17
aaatgattct gaattagctg tatcgtcaag tacccagcta ctaatacgcc at 52
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 18
caacactggc gcagtagacc ataaacttgt ggtagttgga gcgga 45
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 19
aggcactctt gcctacgcca t 21
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 20
tggtctcaac actggcgcag tagacca 27
<210> 21
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 21
acgtgccctc aatacgagcc cccttcacca actctcttga ggatcttgaa ggaaactgaa 60
cctctccaac gaatctcgaa aagtgctgt 89
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 22
cgcctgacgt gccctcaata cgagccccct tcaccaacca ggcg 44
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 23
ccaaccgcga gaagatgacc caggcatagc cagctaatga cccctcttct g 51
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 24
cggctaagag aaccagtgag aaagggc 27
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的（Artificial）
<220>
<223> 合成的
<400> 25
ccgctccctc cttcctggcc tcccgagcgg 30

Claims (26)

1.一种引物依赖性的扩增和检测方法，所述方法能够扩增并检测样品中少至十个拷贝的至少一种稀有DNA目标靶序列(“稀有靶序列”)，所述稀有靶序列处于含有对于每种稀有靶序列而言10,000个拷贝的与所述稀有靶序列的不同之处在于少至一或两个碱基对的密切相关的非目标靶序列(“密切相关序列”或“非目标靶序列”)的混合物中，所述方法包括：
(a)制备引物依赖性扩增反应混合物，其包含样品、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、扩增缓冲液、用于检测扩增产物的同类荧光检测工具，以及针对每种稀有靶序列的对所述稀有靶序列特异但与密切相关序列错配的第一引物和第二引物的引物对，
(b)通过所述引物依赖性的扩增方法重复循环所述引物依赖性扩增反应混合物以扩增所述样品中存在的每种稀有靶序列，和
(c)通过测量来自同类荧光检测工具的荧光强度来检测该稀有靶序列；
其中(i)所述第一引物是等位基因分辨多部分引物，其从5'端到3'端包含第一锚定序列、第一桥序列和与所述密切相关序列在至少其3'-末端或3'-倒数第二个核苷酸上错配的第一足序列，和(ii)所述第二引物是等位基因分辨引物。
2.如权利要求1所述的方法，其中每个第一引物是超选择性引物。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第二引物是与所述密切相关序列在至少其3'-末端或3'-倒数第二个核苷酸上错配的超选择性引物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中每个引物均含有与所述稀有靶序列互补但与所述非目标靶序列错配的3'-末端询问核苷酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述循环包括在非对称聚合酶链式反应(PCR)方法中的温度循环。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述检测包括实时检测。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述PCR方法是数字PCR方法，并且所述检测包括终点检测。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述至少一种稀有靶序列包含至少两种不同的稀有靶序列，并且所述同类荧光检测工具包含分别针对所述至少两种不同稀有靶序列的至少两个不同的同类荧光检测探针。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述至少两种稀有靶序列包含一组稀有靶序列，并且针对所述组中的所述稀有靶序列的所述探针用相同的颜色标记。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述探针是颜色编码的。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中每种不同的非目标靶序列与其对应的稀有靶序列的不同之处在于单个碱基对，并且所述第一和第二引物两者均与该单个碱基对错配。
12.如权利要求11所述的方法，其中每个第二引物是从5'端到3'端包含第二锚定序列、第二桥序列和第二足序列的多部分引物。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述同类荧光检测工具包含针对每种稀有靶序列的探针。
14.如权利要求13所述的方法，其中针对每种稀有靶序列的所述第一或第二引物含有5'-标签序列，并且其中每种5'-标签序列的互补物是所述探针的靶标。
15.如权利要求8或13所述的方法，其中每个探针均包含与所述第一桥序列或所述第二桥序列的互补物互补的序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述探针是共享茎分子信标。
17.如权利要求8所述的方法，其中所述引物依赖性扩增反应混合物包含有效量的选择性增强试剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述选择性增强试剂是霍夫迈斯特盐。
19.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述至少一种稀有靶序列与其对应的非目标靶序列的不同之处在于以顺式发生的第一碱基对和第二碱基对，并且其中所述第一引物与所述第一碱基对互补，且所述第二引物与所述第二碱基对互补。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述样品中的所述至少一种稀有靶序列包含两种或更多种稀有靶序列，并且所述同类荧光检测工具包含针对每种稀有靶序列的至少一个同类荧光检测探针。
21.如权利要求19或权利要求20所述的方法，其中针对每种稀有靶序列的同类荧光检测工具包含引物间特异性分子信标探针。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述引物依赖性扩增反应混合物包含有效量的选择性增强试剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述选择性增强试剂是霍夫迈斯特盐。
24.如权利要求18或权利要求23所述的方法，其中所述霍夫迈斯特盐包括四甲基氯化铵(TMAC)。
25.一种用于实施权利要求1-24中任一项所述的方法的试剂盒。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述同类荧光检测工具包含针对每种稀有靶序列的分子信标探针。
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