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CN114540504B - 用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物组及系统 - Google Patents

用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物组及系统 Download PDF

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CN114540504B CN202210448091.XA CN202210448091A CN114540504B CN 114540504 B CN114540504 B CN 114540504B CN 202210448091 A CN202210448091 A CN 202210448091A CN 114540504 B CN114540504 B CN 114540504B
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Abstract

本发明属于医疗领域，公开了用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物组及系统。标志物组由长链非编码RNA RP5‑1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA‑DMB组成。通过确定标志物的RNA表达量及其与生存期的COX回归系数值Ci，计算得到疗效预测分值Rscore。可以很好地地指导临床用药，减少副作用，避免不必要的免疫治疗，有利于建立合理的联合治疗方案。通过结合肿瘤突变负荷TMB值，可以更好地确定免疫疗效，可以更好地指导免疫治疗。

Description

用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物组及系统
技术领域
本发明涉及医疗领域，具体涉及用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物组及系统。
背景技术
2018年4月，一项PD-1抗体Keytruda单药一线治疗局部晚期或转移性无突变NSCLC的临床III期研究表明：相比铂类药物化疗，Keytruda可显著延长PD-L1表达阳性（表达水平≥1%）患者的总生存期（OS），副作用也应该更小。至此，无论PD-1/PD-L1单药还是联合化疗均在临床研究中取得了OS获益数据。在非小细胞肺癌的一线治疗中，PD-1相比化疗疗效更佳。
尽管PD1/PD-L1阻断剂已成为临床抗肿瘤治疗一线药物，临床应用的初步成果令人鼓舞。然而该药物价格昂贵。PD-1抑制剂有效的病人，一般疗效持久；但是，目前已经观察到30%左右的患者，出现了疾病的耐药。因此，提高治疗的临床应答率、疗效的预测、用药剂量优化、避免联合用药的毒副作用、提高药物疗效依然是PD1/PD-L1阻断治疗的重大课题。这就需要我们对Ｔ细胞活性调节的PD-1/PD-L1通路机制及重要分子的完整全面理解。PD-1/PD-L1信号通路中lncRNA层次的研究有利于抗肿瘤药物的研发、有利于深入探索治疗抗性发生的机制，疗效的预测，用药剂量优化，提高治疗的临床应答率，建立合理的联合治疗方案，避免用药的毒副作用。
自2014年起，PD-1/PD-L1免疫抑制剂已被批准用来治疗包括恶黑、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈瘤等多种肿瘤。然而，对大部分实体瘤，PD-1/PD-L1单独使用会有60%-80%的无效率，也就意味着还会有不少的患者用药后无效。此外，PD-1/PD-L1免疫抑制剂昂贵的价格进一步限制了其应用范围。尽管科学家和临床医生在PD-L1表达、肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI/MMR状态）、新抗原，新抗原瘤内异质性和MHC抗原等多种角度入手，目前依然找不到高预测性的生物标记物。这些局限性给临床肿瘤学家制定适于个体患者更安全、更经济更有效的PD-1/PD-L1免疫疗法方案带来了挑战。现在免疫疗法的主要判断指标是基于肿瘤突变负荷TMB方法。
lncRNA 通过表观遗传修饰与转录调控、转录后加工、翻译调控等多种机制，在多种生物学过程中发挥重要作用。近年来的研究揭示，lncRNA在免疫系统中起着非常重要的作用，对T细胞、B 细胞、固有免疫细胞和炎症因子亦具有调控作用，其表达异常可以影响多种免疫系统疾病的发生、发展及预后，成为免疫学关注的焦点。现有证据表明lncRNA的表达异常、相应位置的SNP或碱基的突变或许与肿瘤疾病的发生发展高度相关，并可作为肿瘤早期诊断、临床分期、预后、药物疗效的独立预测因子。然而，PD-1/PD-L1信号通路中相关lncRNA研究仍然较少。
鉴于PD-1/PD-L1免疫抑制剂缺乏高预测性生物标记物以及lncRNA在免疫调控中的重要作用，项目拟挖掘与PD-1基因相关的lncRNA及mRNA表达谱，探索预测靶基因表达量与PDCD1/PD-L1抑制剂疗效相关性，开发出PD1/PD-L1免疫治疗敏感性生物标记物试剂盒。
长非编码RNA RP5-1091N2.9转录本（含UTR区域）位置是chrX:71183559-71198175（人类hg38版本），长度为48186bp，位于负链，其对应的Ensembl 转录本ID是ENSG00000228427。其功能研究较少，Mariotti B, Servaas N H, Rossato M, et al. Thelong non-coding RNA NRIR drives IFN-response in monocytes: implication forsystemic sclerosis[J]. Frontiers in immunology, 2019, 10: 100.公开了RP5-1091N2.9 系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)显著高表达，未有数据显示RP5-1091N2.9与肺癌相关。
有研究表明CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG、HLA-DMB在某些肿瘤中存在差异表达，但在LUSC中并不具有显著意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物组及系统。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物组，由长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB组成。
本发明的第二个方面，提供：
定量长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量的试剂在制备预测肺鳞癌患者免疫疗效试剂中的应用。
在一些应用的实例中，所述试剂的检测样本为患者的肿瘤组织和/或外周血。
本发明的第三个方面，提供：
一种用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的系统，包括：
长链非编码RNA定量装置：用于确定样本中长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量；
免疫疗效预测装置：基于样本中长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量，预测肺鳞癌患者免疫疗效；
结果输出装置：用于输出免疫疗效预测装置分析得到的预测结果。
在一些系统的实例中，所述样本为患者的肿瘤组织和/或外周血；
在一些系统的实例中，所述长链非编码RNA定量装置选自高通量测序装置、RNA定量芯片、RNA qPCR定量装置。
在一些系统的实例中，所述免疫疗效预测装置的计算方法包括：
S1) 根据FPKM公式计算每个RNA的表达值Fk；
S2) 根据公开免疫治疗疗效数据确定RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量与生存期的COX回归系数值Ci；
S3) 根据以下公式计算疗效预测分值Rscore：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
S4) 基于疗效预测分值Rscore确定免疫疗效。
在一些系统的实例中，使用R software的survival package确定RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量与生存期的COX回归系数值Ci。
在一些系统的实例中，Rscore≤0.70，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效好；Rscore>0.70时，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效差。
在一些系统的实例中，所述长链非编码RNA定量装置选自高通量测序装置，基于高通量测序数据，根据FPKM公式计算每个RNA的表达值Fk，使用R software的survivalpackage确定RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量与生存期的COX回归系数值Ci，Rscore≤0.70，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效好；Rscore>0.70时，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效差。
在一些系统的实例中，还包括结合肿瘤突变负荷TMB值确定免疫疗效。
在一些系统的实例中，肿瘤突变负荷TMB值≥15，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效好；肿瘤突变负荷TMB值<15时，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效差。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的技术，可以有效预测肺鳞癌患者免疫疗效，有利于更好地指导临床用药，减少副作用，避免不必要的免疫治疗，有利于建立合理的联合治疗方案。
本发明一些实例的技术，通过结合肿瘤突变负荷TMB值，可以更好地确定免疫疗效。
附图说明
图1是肺鳞癌中RP5-1091N2.9和6个辅助蛋白的表达量；
图2～图7分别是CD2、CD48、CTSS、GMFG、 HLA-DMB、P2RY10和RP5-1091N2.9的共表达关系；
图8是文库perkinelmer labchip微量芯片分析仪质检的具体出峰图；
图9是30个文库的出峰图；
图10是30个患者的生存期信息；
图11～17是不同标志物单独使用时的生存时间图。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
T细胞分离：按照EasySep™ Human T Cell Isolation Cocktail（货号：17951C）和EasySep™ Dextran RapidSpheres™（货号：50103）的说明书进行操作，采用负选方式。
提取RNA：
直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次（加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解RNA）。将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。4 ℃ 12 000rpm离心10min，取上清。加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。4 ℃ 12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。在得到的水相溶液中加入等体积（500ul）的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃ 放置20-30min。4 ℃ 12 000rpm离心10min，去上清。加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。4 ℃ 12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。50℃保温1小时。
文库构建：
根据kapa建库试剂盒的说明书进行操作。试剂盒名称和货号为KAPA RNA-seq文库构建试剂盒+RiboErase核糖体RNA去除（人/大鼠/小鼠） (96个反应) KK货号KK8484，产品货号07962304001。对建立的RNA文库，用perkinelmer labchip微量芯片分析仪或者全自动核酸蛋白分析系统Qsep100进行文库质检，确保条带都在300bp范围附近。
高通量测序：
使用illumina novaseq对上述RNAseq文库进行测序。测序量要求为20M reads/样品。也可使用同类型的其他高通量测序仪。
数据分析：
S1) 使用Cutadapt 3.4和FastQC 0.11.9进行测序下机数据的预处理；
S2) 使用STAR Aligner 2.7.9a进行数据的比对，参考基因组为hg38；
S3) 使用featureCounts v1.5.2计算所有n个RNA的read count；
S4) 根据FPKM公式计算每个RNA的表达值F，并用R software的rank函数计算每个RNA的表达值在该样品n个RNA表达量中的秩R；
S5) 提取RP5-1091N2.9及其6个辅助RNA的F值和R值，6个辅助RNA的基因symbol是CD48，P2RY10，CD2，CTSS，GMFG，HLA-DMB；
S6) 用以下公式计算疗效预测分值Rscore：
Figure 164593DEST_PATH_IMAGE001
式中，Fk、Ci计算方式如下：
S6-1) 建立肿瘤RNAseq数据库，例如整合NCBI、Gtex、TCGA、Encode的公开多种细胞类型多组织的数据，按照以下方式进行数据重分析和归一化；
S6-2) 使用Cutadapt 3.4和FastQC 0.11.9进行所有原始下机数据的预处理；
S6-3) 使用STAR Aligner 2.7.9a进行数据的比对，参考基因组为hg38；
S6-4) 使用featureCounts v1.5.2计算所有n个RNA的read count；
S6-5) 根据FPKM公式计算每个RNA的表达值Fk；
S6-6) 使用R software的correlation参数，计算RP5-1091N2.9与其他人体RNA的相关性Corr值，并挑选Corr值>0.6的RNA进行下一步计算；
S6-7) 使用R software的topGO package和STRING软件（https://cn.string-db.org/），检查RP5-1091N2.9与其他Corr值>0.6的RNA所显著富集的通路是否有与免疫调节密切相关的通路，并确认这些通路的基因群形成明显的蛋白互作网络，同时需要确认6个辅助RNA的Corr值>0.6。如果满足以上所述，则认为该肿瘤RNA表达数据库构库成功；
S6-8) 根据样品的生存期信息，把数据库样品分成长生存期和短生存期两组。使用R software的survival package对数据库中的RP5-1091N2.9与其6个辅助RNA计算COX回归系数值Ci；
S7) 分别对生存期长样品和生存期短样品计算RScore值和TMB值，得到疗效判断的阈值。
肿瘤突变负荷TMB值计算方法如下：
肿瘤突变负荷TMB值可以按现有方法计算得到(www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7710563/)，或按如下方法计算：
S1) 获取基于高通量测序的肿瘤组织DNA测序数据（要求覆盖≥400个基因）；
S2) 获取基于高通量测序的相应患者的外周血白细胞DNA测序数据（要求覆盖≥400个基因）；
S3) 把肿瘤组织DNA+外周血白细胞DNA测序数据进行联合分析：
S4) 使用Cutadapt 3.4和FastQC 0.11.9进行测序数据的预处理；
S5) 使用bwa和samtools 进行数据的比对，参考基因组为hg38，得到外周血正常样品 bam 文件和肿瘤组织样品bam文件；
S6) 使用GATK进行碱基质量重新矫正，使用的软件和命令如下：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
S7) 使用STRELKA2.8.2进行somatic snv和indel检测。使用命令如下configureStrelkaSomaticWorkflow.py --normalBam normal.bam --tumorBam tumor.bam --referenceFasta --runDir –disableEVS –reportEVSFeatures；
S8) 根据TMB定义计算每个样品的肿瘤突变负荷
Figure DEST_PATH_IMAGE003
RScore结果可以与TMB计算结果进行分值校正，两者共同预测为较好疗效的，才更应该被认同为疗效较好，可相互降低假阳性。RScore结果基于T细胞RNAseq计算，TMB基于DNAseq计算，确保在DNA和RNA两个层面同时对疗效进行预测。
实施例1：
建立肺鳞癌数据库，计算RP5-1091N2.9及关联蛋白的相关系数，获取疗效阈值
整合Gtex、Gencode、TCGA三个数据库中所有肺鳞癌LUSC样品的基因表达，按照FPKM（Fragment perkilometer, FPKM）的方法对表达量进行样品间和批次间校正，得到RP5-1091N2.9在各个样品的标准化表达量。
然后分析肺鳞癌中RP5-1091N2.9和6个辅助蛋白的表达量，表达量用log(FPKM)展示如图1。
通过R软件的correlation函数计算RP5-1091N2.9与其他人体蛋白的相关性（展示在下表中）。与RP5-1091N2.9高度正向相关（相关系数>0.6）的基因一共486个。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
对486个基因进行Reactome富集分析。对486个相关系数>0.6的蛋白，进行Reactome功能富集分析，发现其功能显著，前5个显著富集通路都是免疫相关通路：ImmuneSystem、Adaptive Immune System、Immunoregulatory interactions between aLymphoid and a non-Lymphoid cell、Innate Immune System和Cytokine Signaling inImmune system。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
注：使用的数据库为Reactome。
从表2前5个免疫富集通路Immune System、Adaptive Immune System、Immunoregulatory interactions between a Lymphoid and a non-Lymphoid cell、Innate Immune System和Cytokine Signaling in Immune system中挑选出与RP5-1091N2.9的共表达关系最强的基因，一共是如下6个，分别为CD2、CD48、CTSS、GMFG、 HLA-DMB、P2RY10 (图2～7)。
根据数据库样品的生存期信息，把数据库样品分成长生存期（Group-L）和短生存期（Group-S）两组。使用R software的survival package进行逐步回归分析，根据AIC值选取最优的回归方程，使用脚本如下：
library(survival)
cox <- coxph(Surv(futime, fustat) ~ ., data = rt)
cox=step(cox)
value <- predict(cox,type="risk",newdata=rt)
coxSummary=summary(cox)
table=as.data.frame(cbind(coxSummary$coefficients,coxSummary$ conf.int))
最终得到数据库中的RP5-1091N2.9与其6个辅助RNA计算COX回归系数值Ci，总结如表3。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
根据技术路线所述，数据库构库成功。对数据库中生存期长样品和生存期短样品分别计算Rscore值和TMB值，得到阈值表(表4)。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
实施例2：30例肺癌患者的RNA检测和治疗效果预测
收集30例肺癌患者的癌组织。
对30个癌组织样品进行如下操作：
制作免疫细胞悬浮液：按照EasySep™ Human T Cell Isolation Cocktail（货号：17951C） 和EasySep™ Dextran RapidSpheres™（货号：50103）的说明书进行操作，采用负选方式。
提取RNA：
直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次（加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解RNA）。将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。4 ℃ 12 000rpm离心10min，取上清。加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。4 ℃ 12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。在得到的水相溶液中加入等体积（500ul）的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃ 放置20-30min。4 ℃ 12 000rpm离心10min，去上清。加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。4 ℃ 12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。50℃保温1小时。
文库构建：
根据kapa建库试剂盒的说明书进行操作。试剂盒名称和货号为KAPA RNA-seq文库构建试剂盒+RiboErase核糖体RNA去除（人/大鼠/小鼠） (96个反应) KK货号KK8484，产品货号07962304001。对建立的RNA文库，用perkinelmer labchip微量芯片分析仪或者全自动核酸蛋白分析系统Qsep100进行文库质检，确保条带都在300bp范围附近。
以P001为例，把文库perkinelmer labchip微量芯片分析仪质检的具体出峰图结果展示如图8。30个文库的情况均类似，峰值条带都在300bp范围附近。
高通量测序：
使用illumina novaseq对上面质检过的30个RNA文库进行测序。测序量为20Mreads/样品。
数据分析：
使用Cutadapt 3.4和FastQC 0.11.9进行测序下机数据的预处理；
使用STAR Aligner 2.7.9a进行数据的比对，参考基因组为hg38；
使用featureCounts v1.5.2计算所有n个RNA的read count；
根据FPKM公式计算每个RNA的表达值F，并用R software的rank函数计算每个RNA的表达值在该样品n个RNA表达量中的秩R (Ci值)；
提取RP5-1091N2.9及其6个辅助RNA的FPKM值(Fk)，30个样品中的FPKM值展示如表6。
根据RP5-1091N2.9及其6个辅助RNA的Fk和Ci值，用以下公式计算疗效预测分值RScore；
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
30个患者的RScore计算结果如表5。根据实施例1数据库的判断，RScore疗效阈值为0.70 （RScore<0.70：疗效较好；RScore>0.70：疗效较差）。根据本计算方法，P001、P013、P019和P026被认为免疫治疗效果可能较好。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
注：表中，Score-H表示预测免疫治疗疗效好，Score-L表示预测免疫治疗疗效差。
提取本实施例的30例患者的RP5-1091N2.9及其6个辅助RNA的FPKM值，把样品按照RP5-1091N2.9 的FPKM值分成两组：
1)RP5-1091N2.9 high expression组---大于RP5-1091N2.9平均FPKM值的样品组；
2)RP5-1091N2.9 low expression组---小于RP5-1091N2.9平均FPKM值的样品组；
然后根据两个组别样品的生存期信息，把数据库样品分成长生存期和短生存期两组。使用R software的survival package对数据库中的RP5-1091N2.9与其6个辅助RNA计算生存期差异p值。可见，如果单独使用这7个基因进行疗效预测并做生存分析，结果并不理想，P值均大于0.05，结果如图11～17所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
实施例3：30例肺癌患者的RNA+DNA并行检测
1、同样的对实施例2相同的30例患者样品，进行RNA+DNA并行检测；
2、收集30例肺癌患者的癌组织*2和外周血*1。
3、对6个癌组织样品进行如下操作：
S1) 制作免疫细胞悬浮液：按照EasySep™ Human T Cell Isolation Cocktail（货号：17951C） 和EasySep™ Dextran RapidSpheres™（货号：50103）的说明书进行操作，采用负选方式。
S2) 提取RNA：直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次（加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解RNA）。将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。4 ℃ 12 000rpm离心10min，取上清。加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。4 ℃ 12000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。在得到的水相溶液中加入等体积（500ul）的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃ 放置20-30min。4 ℃ 12 000rpm离心10min，去上清。加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。4 ℃ 12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。50℃保温1小时。
S3) RNA文库构建：根据kapa建库试剂盒的说明书进行操作。试剂盒名称和货号为KAPA RNA-seq文库构建试剂盒+RiboErase核糖体RNA去除（人/大鼠/小鼠） (96个反应) KK货号KK8484，产品货号07962304001。
S4) 高通量测序：使用illumina novaseq对去核糖体RNA(rRNA)处理后的总RNA样本进行测序。
S5) 数据分析：
S5-1) 使用Cutadapt 3.4和FastQC 0.11.9进行测序下机数据的预处理；
S5-2)使用STAR Aligner 2.7.9a进行数据的比对，参考基因组为hg38；
S5-3)使用featureCounts v1.5.2计算RNA的read count；
S5-4)使用DESeq2 v1.30.1计算差异表达值；
S5-5)提取RP5-1091N2.9及其6个辅助RNA的Fk值和Ci值，用以下公式计算疗效预测分值RScore；
Figure 301307DEST_PATH_IMAGE008
。
4、继续对30个癌组织样品进行如下操作：
S1) 提取DNA：根据石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒(天根生化，货号DP330-02)的说明书进行操作。
S2) DNA文库构建：根据kapa建库试剂盒的说明书进行操作。试剂盒名称为KAPADNA HyperPrep 文库构建试剂盒，货号KK8504。
S3) 特定基因区域捕获：按照IDT xGen® Exome Research Panel或者其他区域捕获试剂盒的说明书进行操作，要求捕获基因数>400个。
S4) 对建立的肿瘤DNA文库，30个文库均用perkinelmer labchip微量芯片分析仪质检，具体出峰图与实施例2类似，30个样品总体情况如图9所示，峰值条带都在300bp范围附近。
S5) 高通量测序：使用illumina novaseq对DNA文库进行测序。
5、对30个外周血样品进行如下操作：
S1) 分离血液白细胞层；
S2) 提取DNA：根据血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化，货号DP304-02)的说明书进行操作。
S3) DNA文库构建：根据kapa建库试剂盒的说明书进行操作。试剂盒名称为KAPADNA HyperPrep 文库构建试剂盒，货号KK8504。
S4) 特定基因区域捕获：按照IDT xGen® Exome Research Panel或者其他区域捕获试剂盒的说明书进行操作，要求捕获基因数>400个。文库如实施例2和肿瘤组织一样，也用labchip进行文库质检，通过后进行高通量测序。
S5) 高通量测序：使用illumina novaseq对DNA文库进行测序。
、每个患者的肿瘤突变负荷计算：
S1) 把第3步和第4步的测序数据进行联合分析：
i.使用Cutadapt 3.4和FastQC 0.11.9进行测序下机数据的预处理；
ii. 使用bwa和samtools 进行数据的比对，参考基因组为hg38；
iii. 使用bamdst 1.0.9软件进行捕获区域的捕获质量鉴定---计算基因覆盖数，捕获特异性等参数，以P001的肿瘤组织和外周血的测序结果为例，TargetRegion为400肿瘤基因，展示结果如表7；
iv. 使用GATK进行somatic snv和indel检测；
v. 根据TMB定义计算每个样品的肿瘤突变负荷（TMB被定义为每百万碱基中被检测出的somatic snv和indel总数，公式如下）
Figure 549886DEST_PATH_IMAGE003
S2) 30个患者的肿瘤突变负荷计算结果如表8。根据实施例1数据库的判断，单纯依据TMB进行判断的疗效阈值为15（TMB≥15：TMB-High疗效较好；TMB<15：TMB-L疗效较差）。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
表8、30例患者的肿瘤突变负荷TMB计算结果
Figure DEST_PATH_IMAGE012
注：表中，TMB-High表示预测免疫治疗疗效好，TMB-L表示预测免疫治疗疗效差。
与实施例2的计算结果进行整合，只有同时满足Rscore<0.70和TMB≥15的样品，才能在DNA和RNA两个层面同时判定为疗效较好。因此只有P001和P026两个样品被认为可推荐使用免疫治疗。
后期经临床追踪反馈，这两个患者的免疫治疗效果均好于其他28个患者，图10是30个患者的生存期信息，具有显著差异性（t检验，P.value=5.451E-07）。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的标志物，其特征在于：由长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB组成。
2.定量长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量的试剂在制备预测肺鳞癌患者免疫疗效试剂中的应用。
3.一种用于预测肺鳞癌患者免疫疗效的系统，其特征在于：包括：
长链非编码RNA定量装置：用于确定样本中长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量；
免疫疗效预测装置：基于样本中长链非编码RNA RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量，预测肺鳞癌患者免疫疗效；
结果输出装置：用于输出免疫疗效预测装置分析得到的预测结果；
所述免疫疗效预测装置的计算方法包括：
根据FPKM公式计算每个RNA的表达值Fk；
根据公开免疫治疗疗效数据确定RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量与生存期的COX回归系数值Ci；
根据以下公式计算疗效预测分值Rscore：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
基于疗效预测分值Rscore确定免疫疗效。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：所述样本为患者的肿瘤组织和/或外周血；和/或
所述长链非编码RNA定量装置选自高通量测序装置、RNA定量芯片、RNA qPCR定量装置。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：使用R software的survival package确定RP5-1091N2.9、CD48、P2RY10、CD2、CTSS、GMFG和HLA-DMB表达量与生存期的COX回归系数值Ci。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：Rscore≤0.70，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效好；Rscore>0.70时，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效差。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：还包括结合肿瘤突变负荷TMB值确定免疫疗效。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：肿瘤突变负荷TMB值≥15，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效好；肿瘤突变负荷TMB值<15时，判定为肺鳞癌患者免疫治疗疗效差。
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