CN114525302B

CN114525302B - OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN114525302B
Application number: CN202011310758.7A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 叶田田; 肖本泽
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2023-10-17
Anticipated expiration: 2040-11-20
Also published as: CN114525302A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用。本发明通过分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高水稻对干旱耐受能力的OsCRKD1基因。所述OsCRKD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。本发明克隆到控制水稻干旱应答基因OsCRKD1，并对候选基因进行CRISPR突变体表型鉴定，通过苗期及成株期干旱胁迫表型鉴定表明，缺失该基因片段时，水稻耐干旱胁迫能力降低，证实了该基因的功能及应用途径。

Description

OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的基因的CDS序列为SEQ ID NO.1所示。

背景技术

植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、冷害和高温会导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白和渗透调节物质以适应不利的生长环境(Xiong等，Cell signaling during cold,drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl),S165–S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到了调控因子的精细调节。

蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的蛋白质可逆磷酸化是信号转导过程中发生的重要事件之一。在磷酸化作用中，蛋白激酶在底物上加上一个磷酸基团；而蛋白激酶酶通过去除底物的磷酸基团行使相反的功能。在一个酶上添加或去除一个磷酸基团一般会导致酶的激活或失活，正是通过这样的方式，蛋白激酶和蛋白磷酸酶在酶的活性调控中发挥着重要的作用，进而调控着酶参与的生物学过程。类受体蛋白激酶(RLKs)定位于细胞质膜上，是一种含有氨基末端胞外结构域和羧基末端胞内激酶结构域的跨膜蛋白，通过其胞外结构域结合信号分子，激活胞内激酶结构域，从而完成信号的转导。植物RLKs与动物Pelle蛋白激酶家族同源，正如动物细胞具有受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶一样，植物RLKs也可分为受体蛋白激酶和非受体蛋白激酶，共同命名为“RLKs家族”。其中，RLKs代表具有细胞外结构域的类受体蛋白激酶，而RLCKs只含有细胞质激酶结构域，不具有胞外结构域。已被证实为细胞受体的RLKs被认为是受体激酶(RKs)。不同的RLKs能够通过其胞外结构域识别并接受不同的配体，所以胞外域的氨基酸序列差异较大，如富含亮氨酸重复序列(LRR)、含有功能未知结构域26(DUF26)、富含脯氨酸序列(Proline-rich)等，根据这一特征，可将RLKs分为不同的亚类。其中，富含半胱氨酸类受体激酶(CRKs)的胞外结构域含有一个或多个DUF26，由于DUF26内含有富含半胱氨酸的重复序列，所以CRKs属于富含半胱氨酸的类受体激酶。

拟南芥含有46个CRKs，目前，关于拟南芥CRKs的研究多集中于生长发育和植物免疫领域。已有研究表明，拟南芥crk突变体普遍存在异常的生长发育表型，包括生长缺陷，早期衰老，花期提前，发芽延迟，子叶细胞密度降低以及根长变长。拟南芥crk2突变体与野生型相比植株矮小，出现明显的生长缺陷；在长日照条件下(16h光照/8h黑暗)，34个crk突变体(crk2，crk3，crk4，crk5，crk28，crk29，crk40等)出现早期衰老的表型，4个crk突变体(crk7，crk16，crk19，crk38)花期提前；通过观察其胚乳破裂情况，发现32个crk突变体(crk2，crk11，crk21，crk25，crk28，crk41，crk45等)出现发芽延迟的现象；11个crk突变体(crk3，crk13，crk25，crk40等)的子叶细胞密度降低；此外，crk28，crk29和crk42突变体还存在根长变长的表型。除了参与植物生长发育调控，拟南芥CRKs也与植物抗病性相关。例如，拟南芥CRK4，CRK5，CRK6，CRK13，CRK20，CRK2，CRK45和CRK36能够参与丁香假单胞杆菌DC3000的免疫；拟南芥CRK36也能够与BIK1互作，调控气孔免疫；拟南芥CRK28能够结合FLS2/BAK1复合体并增强植物免疫应答。除拟南芥外，小麦，大麦和水稻中也存在与抗病相关的CRKs。小麦TaCRK1对丝核菌属的病原菌禾谷丝核菌有抵抗作用，大麦HvCRK1参与白粉病的抗性调控，水稻OsCRK10和OsCRK6参与BTH诱导的免疫反应。

本发明涉及的OsCRKD1基因属于水稻CRKs家族，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻CRKs被报道。

发明内容

本发明的目的是提供OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性改良中的应用，所述OsCRKD1基因编码的氨基酸序列为SEQ NO.2所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

OsCRKD1基因在调控水稻抗旱性中的应用，所述的应用过程包括利用本发明的常规方案，通过控制OsCRKD1基因的表达，以控制水稻的抗旱性，所述的OsCRKD1基因的序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示；

以上所述的应用中，优选的是通过CRISPR/Cas9的方法，在OsCRKD1基因内选取靶位点将该基因敲除，获得的水稻突变体为干旱敏感型水稻；

以上所述的应用中，优选的是通过转基因方法，使OsCRKD1基因在水稻中超表达，以提高水稻对干旱胁迫耐受能力。

以上所述的应用中，优选的所述的干旱敏感型水稻包含SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

携带有本发明OsCRKD1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射或电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

本发明OsCRKD1基因的表达载体可以转化的宿主是包括水稻等多种植物宿主，用于培育抗旱植物新品种。

本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提高植物抗旱性。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明涉及的OsCRKD1基因，属于水稻CRKs家族，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻CRKs被报道。

附图说明

图1为水稻oscrkd1 CRISPR突变体基因编辑情况；

oscrkd1-24和oscrkd1-51为2个oscrkd1 CRISPR突变体纯合无Cas9家系。

图2为水稻oscrkd1 CRISPR突变体苗期干旱胁迫表型；

oscrkd1-24和oscrkd1-51为2个oscrkd1 CRISPR突变体纯合无Cas9家系，中花11(ZH11)作为对照；

其中A图和B图为oscrkd1-24家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态；C图和D图为oscrkd1-51家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态。

图3为水稻oscrkd1 CRISPR突变体苗期干旱胁迫存活率统计；

其中：A图为oscrkd1-24家系苗期干旱胁迫存活率统计情况；B图为oscrkd1-51家系苗期干旱胁迫存活率统计情况。

图4为水稻oscrkd1 CRISPR突变体成株期干旱胁迫表型；

oscrkd1-24和oscrkd1-51为oscrkd1 CRISPR突变体纯合无Cas9家系，中花11(ZH11)作为对照；

A图为oscrkd1-24家系和对照ZH11在干旱处理前的生长状态；B图为oscrkd1-24家系和对照ZH11在干旱处理下的生长状态；C图为oscrkd1-51家系和对照ZH11在干旱处理前的生长状态；D图为oscrkd1-51家系和对照ZH11在干旱处理下的生长状态。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：

OsCRKD1基因的分离和克隆

设计引物OsCRKD1-FL-F：5’-ATGTCCCTTCTCGTCGTCTTGTTCT-3’、OsCRKD1-FL-R：5’-TTATCTCCCTTCCTCGATGGTGGTG-3’。以水稻品种日本晴叶片cDNA作为模板，使用引物OsCRKD1-FL-F和OsCRKD1-FL-R扩增OsCRKD1基因编码的CDS序列，扩增的序列为SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，33个循环；72℃延伸5min。

将扩增获得的PCR产物通过TA克隆的方法连入pGEM-T Easy载体，筛选阳性克隆并测序确认，获得OsCRKD1的CDS序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，该克隆命名为pGEM-OsCRKD1质粒。

实施例2：

OsCRKD1基因超量表达载体的构建

将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsCRKD1质粒用引物OsCRKD1-OE-F：5’-tacgaacgatagccggtaccATGTCCCTTCTCGTCGTCTTGTTCT-3’和OsCRKD1-OE-R：5’-ttgcggactctagaggatccTTATCTCCCTTCCTCGATGGTGGTG-3’扩增出包含OsCRKD1基因完整编码区段的DNA片段；

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。将获得的PCR产物通过Gibson Assembly的方法连入经限制性内切酶KpnI和BamHI消化的pU1301载体，对载体进行测序确认，最终获得可用于遗传转化的OsCRKD1基因超量表达载体。

实施例3：

构建oscrkd1 CRISPR突变体

从水稻基因数据库Rice Data(http://www.ricedata.cn/gene/)中获得OsCRKD1基因的基因序列。根据CRISPR-P v2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)挑取两个靶位点。CRISPR突变体株系的载体OsCRKD1-CRISPR构建可参照相关文献(谢卡斌等.Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.PNAS.2015,112:3570-3575.)。

在CRISPR-P v2.0网站中选取的靶位点如下：

靶位点1：CCCCTCCGTGAAGTTGCCCC

靶位点2：GGTCCCGGCCGCAGAGCGCG。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将构建好的CRISPR载体OsCRKD1-CRISPR转入到水稻品种“中花11”(一个常规水稻品种，来自中国农业科学院水稻科学研究所)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6:271-282，1994)基础上进行。

本实施例的具体遗传转化步骤如下：

(1)电转化：将最终CRISPR目标载体OsCRKD1-CRISPR，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。

(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的CRISPR载体OsCRKD1-CRISPR)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，培养温度19-20℃。

(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。

(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

根据上述基因编辑靶位点，设计引物，对突变体中OsCRKD1基因的编辑情况进行检测。用引物(OsCRKD1-CR-F：5’-AGAAACACGCACTAATCAAACAATC-3’和OsCRKD1-CR-R：5’-CACTCACAGATGTCTCACGAAAA-3’)。对OsCRKD1基因进行特异的PCR扩增，将扩增出来的PCR产物进行测序，同时检测是否含有Cas9。测序结果显示(图1)，在oscrkd1-24 CRISPR纯合无Cas9突变体家系(包含SEQ ID NO.3所示序列)中，OsCRKD1基因内部缺失224个碱基，在oscrkd1-51 CRISPR纯合无Cas9突变体家系(包含SEQ ID NO.4所示序列)中，OsCRKD1基因在靶位点1处插入1个碱基，在靶位点2处插入1个碱基，即两个突变体家系中OsCRKD1基因发生突变。

实施例4：

oscrkd1 CRISPR突变体苗期干旱胁迫表型的鉴定

将已鉴定好基因型的纯合突变体oscrkd1(oscrkd1-24和oscrkd1-51)和对照野生型(即，非转基因，下同)水稻品种中花11(ZH11)催芽后直播到小圆桶中，小圆桶一半种植突变体材料，另一半种植对照野生型水稻品种中花11，各12株。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的水稻植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。与ZH11对照相比，CRISPR纯合突变体植株表现为干旱敏感表型(图2)。干旱复水后小圆桶中oscrkd1突变体和对照ZH11的存活率统计结果表明，oscrkd1突变体在干旱复水后，存活率显著低于对照野生型ZH11(图3)。

实施例5：鉴定oscrkd1 CRISPR突变体成株期干旱胁迫表型

为了鉴定突变体成株期的表型，将突变体及其对照种植于上面有可移动遮雨棚的沙土大田中，南方水稻土与粗沙按体积比为1:2混合而成，每行10株每家系种植2行，试验设3次生物学重复做严重干旱胁迫实验。干旱胁迫是对健康生长的成株期植株进行断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)，再复水生长。与ZH11对照相比，纯合突变体植株oscrkd1-24和oscrkd1-51表现为干旱敏感表型(图4)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcccttc tcgtcgtctt gttcttcttc ttcctctcgc cgccgctcgc cgccgccgcc 60

gcctacacgg agtactcgtg caatggcacc cggggcaact tcacggaggg gagcgcgttc 120

gggctcaacc tggagctcct cgcggcggag ctccccgcca acgcgtcgtc gtcgcggtcg 180

ctgttcgcgt cggcggccgt gggcgccgcc gcggcgccgg aggacagggt gttcggcctg 240

gcgctgtgcc gcggcgacat gagggacgcc gccgcgtgcg cggggtgcgt ctccggcgcg 300

ttccagcgcc tccgcgcgct ctgcggccgg gaccgcgacg cgacgtacta ccacgacctg 360

tgcgtggtgc gctactccgg cgacgacttc ctgtcgcggc cggacgacaa ctcgccggtg 420

atcaacgcgc tggacgcgaa cgcgtccacc tactacgggt gggacgggcg gaacgcgacg 480

acgcggagct tcttcctgtc gctggtgggg acgctgttcg gggagatggc catgtacggg 540

tcgtacaact cgtcggcgcg gcggtacgcg agcgccgtga tgtatgtgaa cccgcagctg 600

ccgacggtgt acgggctggc gcagtgcacg ccggacctgt cgccggcgca gtgctggcac 660

tgcttccagg ggctccagga gcagaaccgg cagtggtacg acggccggca gggcggccgg 720

atcctcggcg tccggtgcaa cttccggtac gagagctacc agttctacgc cggcacgccg 780

gacgtcagga tcggcctgca agacgtcgca ccctcaccaa ccgcaaacaa tggaaccaac 840

cacaggaaga ccttagttat cgttctatcc gtgtcaatca cggtcttctg tttcatgctg 900

gtcggctgcc tcctactgat aaaaaaacta cggaaaggag acgggaggaa gtcgaatcgg 960

cagctggaag cacattccag gaacagctcc aagacagagg aggcactgaa gctgtggagg 1020

accgaggaga gcagcaccga tttcacgctc tacgacttcg gcgatcttgc cgctgccacg 1080

gacaacttct ctgaagatca caggctcggc acaggcggat ttggacctgt ctacaggggt 1140

gagttgtctg atggagccga gattgcggtg aagaggctgg cagcgcagtc cgggcagggg 1200

ctgaaggaat tcaagaacga gatccagctc attgccaagc tgcagcacac caacctcgtc 1260

aggctcgttg gctgctgtgt tcaggaggag gagaagatgc tggtctacga gtacatgccc 1320

aacagaagcc tggacttctt catcttcgac caggagcaag ggccattgct ggactggaag 1380

aaacggctgc acataatcga gggcgtcgtg caggggctcc tctaccttca caagcactca 1440

cgtgtacgca tcatccaccg cgatctcaag gccagcaaca tactcctcga caaggacctc 1500

aatcctaaga tctccgactt cggcatggcc aggatcttcg gctccaacat gactgaagcc 1560

aacaccaaca gagtcgtcgg cacctatgga tacatggctc ctgagtacgc atcggagggc 1620

attttctcgg tcaagtccga cgtgttcagc ttcggcgtgc tgctgctgga gatcgtcagc 1680

ggcaagagga acagcggcca ccagcactac ggcgaattcg tcaacctcct cggatacgcg 1740

tggcagctgt ggagagaaga gagagggtgc gagctgatcg acccgacgct gggcgagtgc 1800

agcggcagcg aggcggcggc cataatccgg tgcgtgaagg tggcgttgct gtgcgtgcag 1860

gacaacgcga cggaccggcc gacgatgacg gacgtggcgg cgatgctcgg cagcgacggc 1920

gtccccctgc cggacccgct gccgccgccg cactaccagc tgagggtctc cggcgacgac 1980

tacgacgacg gcggccgcgg gtcgccggcc ggcggcggct tccggccgtc gcggtggcgc 2040

ttcaccgact cgtgcagcac caacgacgtc accatcacca ccatcgagga agggagataa 2100

<210> 2

<211> 699

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Leu Leu Val Val Leu Phe Phe Phe Phe Leu Ser Pro Pro Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Thr Glu Tyr Ser Cys Asn Gly Thr Arg Gly

20 25 30

Asn Phe Thr Glu Gly Ser Ala Phe Gly Leu Asn Leu Glu Leu Leu Ala

35 40 45

Ala Glu Leu Pro Ala Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Leu Phe Ala Ser

50 55 60

Ala Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Pro Glu Asp Arg Val Phe Gly Leu

65 70 75 80

Ala Leu Cys Arg Gly Asp Met Arg Asp Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys

85 90 95

Val Ser Gly Ala Phe Gln Arg Leu Arg Ala Leu Cys Gly Arg Asp Arg

100 105 110

Asp Ala Thr Tyr Tyr His Asp Leu Cys Val Val Arg Tyr Ser Gly Asp

115 120 125

Asp Phe Leu Ser Arg Pro Asp Asp Asn Ser Pro Val Ile Asn Ala Leu

130 135 140

Asp Ala Asn Ala Ser Thr Tyr Tyr Gly Trp Asp Gly Arg Asn Ala Thr

145 150 155 160

Thr Arg Ser Phe Phe Leu Ser Leu Val Gly Thr Leu Phe Gly Glu Met

165 170 175

Ala Met Tyr Gly Ser Tyr Asn Ser Ser Ala Arg Arg Tyr Ala Ser Ala

180 185 190

Val Met Tyr Val Asn Pro Gln Leu Pro Thr Val Tyr Gly Leu Ala Gln

195 200 205

Cys Thr Pro Asp Leu Ser Pro Ala Gln Cys Trp His Cys Phe Gln Gly

210 215 220

Leu Gln Glu Gln Asn Arg Gln Trp Tyr Asp Gly Arg Gln Gly Gly Arg

225 230 235 240

Ile Leu Gly Val Arg Cys Asn Phe Arg Tyr Glu Ser Tyr Gln Phe Tyr

245 250 255

Ala Gly Thr Pro Asp Val Arg Ile Gly Leu Gln Asp Val Ala Pro Ser

260 265 270

Pro Thr Ala Asn Asn Gly Thr Asn His Arg Lys Thr Leu Val Ile Val

275 280 285

Leu Ser Val Ser Ile Thr Val Phe Cys Phe Met Leu Val Gly Cys Leu

290 295 300

Leu Leu Ile Lys Lys Leu Arg Lys Gly Asp Gly Arg Lys Ser Asn Arg

305 310 315 320

Gln Leu Glu Ala His Ser Arg Asn Ser Ser Lys Thr Glu Glu Ala Leu

325 330 335

Lys Leu Trp Arg Thr Glu Glu Ser Ser Thr Asp Phe Thr Leu Tyr Asp

340 345 350

Phe Gly Asp Leu Ala Ala Ala Thr Asp Asn Phe Ser Glu Asp His Arg

355 360 365

Leu Gly Thr Gly Gly Phe Gly Pro Val Tyr Arg Gly Glu Leu Ser Asp

370 375 380

Gly Ala Glu Ile Ala Val Lys Arg Leu Ala Ala Gln Ser Gly Gln Gly

385 390 395 400

Leu Lys Glu Phe Lys Asn Glu Ile Gln Leu Ile Ala Lys Leu Gln His

405 410 415

Thr Asn Leu Val Arg Leu Val Gly Cys Cys Val Gln Glu Glu Glu Lys

420 425 430

Met Leu Val Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Arg Ser Leu Asp Phe Phe Ile

435 440 445

Phe Asp Gln Glu Gln Gly Pro Leu Leu Asp Trp Lys Lys Arg Leu His

450 455 460

Ile Ile Glu Gly Val Val Gln Gly Leu Leu Tyr Leu His Lys His Ser

465 470 475 480

Arg Val Arg Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Ala Ser Asn Ile Leu Leu

485 490 495

Asp Lys Asp Leu Asn Pro Lys Ile Ser Asp Phe Gly Met Ala Arg Ile

500 505 510

Phe Gly Ser Asn Met Thr Glu Ala Asn Thr Asn Arg Val Val Gly Thr

515 520 525

Tyr Gly Tyr Met Ala Pro Glu Tyr Ala Ser Glu Gly Ile Phe Ser Val

530 535 540

Lys Ser Asp Val Phe Ser Phe Gly Val Leu Leu Leu Glu Ile Val Ser

545 550 555 560

Gly Lys Arg Asn Ser Gly His Gln His Tyr Gly Glu Phe Val Asn Leu

565 570 575

Leu Gly Tyr Ala Trp Gln Leu Trp Arg Glu Glu Arg Gly Cys Glu Leu

580 585 590

Ile Asp Pro Thr Leu Gly Glu Cys Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ile

595 600 605

Ile Arg Cys Val Lys Val Ala Leu Leu Cys Val Gln Asp Asn Ala Thr

610 615 620

Asp Arg Pro Thr Met Thr Asp Val Ala Ala Met Leu Gly Ser Asp Gly

625 630 635 640

Val Pro Leu Pro Asp Pro Leu Pro Pro Pro His Tyr Gln Leu Arg Val

645 650 655

Ser Gly Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Gly Arg Gly Ser Pro Ala Gly Gly

660 665 670

Gly Phe Arg Pro Ser Arg Trp Arg Phe Thr Asp Ser Cys Ser Thr Asn

675 680 685

Asp Val Thr Ile Thr Thr Ile Glu Glu Gly Arg

690 695

<210> 3

<211> 1876

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcccttc tcgtcgtctt gttcttcttc ttcctctcgc cgccgctcgc cgccgccgcc 60

gcctacacgg agtactcgtg caatggcacc cgggctctgc ggccgggacc gcgacgcgac 120

gtactaccac gacctgtgcg tggtgcgcta ctccggcgac gacttcctgt cgcggccgga 180

cgacaactcg ccggtgatca acgcgctgga cgcgaacgcg tccacctact acgggtggga 240

cgggcggaac gcgacgacgc ggagcttctt cctgtcgctg gtggggacgc tgttcgggga 300

gatggccatg tacgggtcgt acaactcgtc ggcgcggcgg tacgcgagcg ccgtgatgta 360

tgtgaacccg cagctgccga cggtgtacgg gctggcgcag tgcacgccgg acctgtcgcc 420

ggcgcagtgc tggcactgct tccaggggct ccaggagcag aaccggcagt ggtacgacgg 480

ccggcagggc ggccggatcc tcggcgtccg gtgcaacttc cggtacgaga gctaccagtt 540

ctacgccggc acgccggacg tcaggatcgg cctgcaagac gtcgcaccct caccaaccgc 600

aaacaatgga accaaccaca ggaagacctt agttatcgtt ctatccgtgt caatcacggt 660

cttctgtttc atgctggtcg gctgcctcct actgataaaa aaactacgga aaggagacgg 720

gaggaagtcg aatcggcagc tggaagcaca ttccaggaac agctccaaga cagaggaggc 780

actgaagctg tggaggaccg aggagagcag caccgatttc acgctctacg acttcggcga 840

tcttgccgct gccacggaca acttctctga agatcacagg ctcggcacag gcggatttgg 900

acctgtctac aggggtgagt tgtctgatgg agccgagatt gcggtgaaga ggctggcagc 960

gcagtccggg caggggctga aggaattcaa gaacgagatc cagctcattg ccaagctgca 1020

gcacaccaac ctcgtcaggc tcgttggctg ctgtgttcag gaggaggaga agatgctggt 1080

ctacgagtac atgcccaaca gaagcctgga cttcttcatc ttcgaccagg agcaagggcc 1140

attgctggac tggaagaaac ggctgcacat aatcgagggc gtcgtgcagg ggctcctcta 1200

ccttcacaag cactcacgtg tacgcatcat ccaccgcgat ctcaaggcca gcaacatact 1260

cctcgacaag gacctcaatc ctaagatctc cgacttcggc atggccagga tcttcggctc 1320

caacatgact gaagccaaca ccaacagagt cgtcggcacc tatggataca tggctcctga 1380

gtacgcatcg gagggcattt tctcggtcaa gtccgacgtg ttcagcttcg gcgtgctgct 1440

gctggagatc gtcagcggca agaggaacag cggccaccag cactacggcg aattcgtcaa 1500

cctcctcgga tacgcgtggc agctgtggag agaagagaga gggtgcgagc tgatcgaccc 1560

gacgctgggc gagtgcagcg gcagcgaggc ggcggccata atccggtgcg tgaaggtggc 1620

gttgctgtgc gtgcaggaca acgcgacgga ccggccgacg atgacggacg tggcggcgat 1680

gctcggcagc gacggcgtcc ccctgccgga cccgctgccg ccgccgcact accagctgag 1740

ggtctccggc gacgactacg acgacggcgg ccgcgggtcg ccggccggcg gcggcttccg 1800

gccgtcgcgg tggcgcttca ccgactcgtg cagcaccaac gacgtcacca tcaccaccat 1860

cgaggaaggg agataa 1876

<210> 4

<211> 2102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtcccttc tcgtcgtctt gttcttcttc ttcctctcgc cgccgctcgc cgccgccgcc 60

gcctacacgg agtactcgtg caatggcacc cgggtgcaac ttcacggagg ggagcgcgtt 120

cgggctcaac ctggagctcc tcgcggcgga gctccccgcc aacgcgtcgt cgtcgcggtc 180

gctgttcgcg tcggcggccg tgggcgccgc cgcggcgccg gaggacaggg tgttcggcct 240

ggcgctgtgc cgcggcgaca tgagggacgc cgccgcgtgc gcggggtgcg tctccggcgc 300

gttccagcgc ctccgcgctg ctctgcggcc gggaccgcga cgcgacgtac taccacgacc 360

tgtgcgtggt gcgctactcc ggcgacgact tcctgtcgcg gccggacgac aactcgccgg 420

tgatcaacgc gctggacgcg aacgcgtcca cctactacgg gtgggacggg cggaacgcga 480

cgacgcggag cttcttcctg tcgctggtgg ggacgctgtt cggggagatg gccatgtacg 540

ggtcgtacaa ctcgtcggcg cggcggtacg cgagcgccgt gatgtatgtg aacccgcagc 600

tgccgacggt gtacgggctg gcgcagtgca cgccggacct gtcgccggcg cagtgctggc 660

actgcttcca ggggctccag gagcagaacc ggcagtggta cgacggccgg cagggcggcc 720

ggatcctcgg cgtccggtgc aacttccggt acgagagcta ccagttctac gccggcacgc 780

cggacgtcag gatcggcctg caagacgtcg caccctcacc aaccgcaaac aatggaacca 840

accacaggaa gaccttagtt atcgttctat ccgtgtcaat cacggtcttc tgtttcatgc 900

tggtcggctg cctcctactg ataaaaaaac tacggaaagg agacgggagg aagtcgaatc 960

ggcagctgga agcacattcc aggaacagct ccaagacaga ggaggcactg aagctgtgga 1020

ggaccgagga gagcagcacc gatttcacgc tctacgactt cggcgatctt gccgctgcca 1080

cggacaactt ctctgaagat cacaggctcg gcacaggcgg atttggacct gtctacaggg 1140

gtgagttgtc tgatggagcc gagattgcgg tgaagaggct ggcagcgcag tccgggcagg 1200

ggctgaagga attcaagaac gagatccagc tcattgccaa gctgcagcac accaacctcg 1260

tcaggctcgt tggctgctgt gttcaggagg aggagaagat gctggtctac gagtacatgc 1320

ccaacagaag cctggacttc ttcatcttcg accaggagca agggccattg ctggactgga 1380

agaaacggct gcacataatc gagggcgtcg tgcaggggct cctctacctt cacaagcact 1440

cacgtgtacg catcatccac cgcgatctca aggccagcaa catactcctc gacaaggacc 1500

tcaatcctaa gatctccgac ttcggcatgg ccaggatctt cggctccaac atgactgaag 1560

ccaacaccaa cagagtcgtc ggcacctatg gatacatggc tcctgagtac gcatcggagg 1620

gcattttctc ggtcaagtcc gacgtgttca gcttcggcgt gctgctgctg gagatcgtca 1680

gcggcaagag gaacagcggc caccagcact acggcgaatt cgtcaacctc ctcggatacg 1740

cgtggcagct gtggagagaa gagagagggt gcgagctgat cgacccgacg ctgggcgagt 1800

gcagcggcag cgaggcggcg gccataatcc ggtgcgtgaa ggtggcgttg ctgtgcgtgc 1860

aggacaacgc gacggaccgg ccgacgatga cggacgtggc ggcgatgctc ggcagcgacg 1920

gcgtccccct gccggacccg ctgccgccgc cgcactacca gctgagggtc tccggcgacg 1980

actacgacga cggcggccgc gggtcgccgg ccggcggcgg cttccggccg tcgcggtggc 2040

gcttcaccga ctcgtgcagc accaacgacg tcaccatcac caccatcgag gaagggagat 2100

aa 2102

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccctccgtg aagttgcccc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtcccggcc gcagagcgcg 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtcccttc tcgtcgtctt gttct 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttatctccct tcctcgatgg tggtg 25

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tacgaacgat agccggtacc atgtcccttc tcgtcgtctt gttct 45

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttgcggactc tagaggatcc ttatctccct tcctcgatgg tggtg 45

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agaaacacgc actaatcaaa caatc 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cactcacaga tgtctcacga aaa 23

Claims

1.OsCRKD1基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的OsCRKD1基因编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示，其应用过程是通过CRISPR/Cas9的方法，将OsCRKD1基因敲除，获得干旱敏感型水稻。

2. 权利要求1所述的应用，所述的OsCRKD1基因的序列为SEQ ID NO.1所示。

3. 根据权利要求1所述的应用，所述的干旱敏感表型水稻含有SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的序列。