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CN114522179B - 一种基因制剂在制备结直肠癌细胞增殖和转移抑制剂中的应用 - Google Patents

一种基因制剂在制备结直肠癌细胞增殖和转移抑制剂中的应用 Download PDF

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CN114522179B
CN114522179B CN202210144955.9A CN202210144955A CN114522179B CN 114522179 B CN114522179 B CN 114522179B CN 202210144955 A CN202210144955 A CN 202210144955A CN 114522179 B CN114522179 B CN 114522179B
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Guangdong Qimei Pharmaceutical Biotechnology Group Co ltd
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Zhuhai Qimei Stem Cell Bank Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种基因制剂在制备结直肠癌细胞增殖和转移抑制剂中的应用，属于肿瘤细胞生物学技术领域。本发明提供的基因抑制剂为AC092635.1基因的基因抑制剂，该抑制剂能够有效的抑制结直肠癌细胞的增殖，迁移，侵袭和EMT转化，因此，可将该抑制剂用于制备结直肠癌细胞增殖和转移抑制剂。

Description

一种基因制剂在制备结直肠癌细胞增殖和转移抑制剂中的 应用
本案为分案申请，原申请的发明名称为一种结直肠癌靶向治疗药物，原申请的申请日为：2021-02-08，原申请的申请号为：CN202110184373.9。
技术领域
本发明属于肿瘤细胞生物学技术领域，尤其涉及一种基因制剂在制备结直肠癌细胞增殖和转移抑制剂中的应用。
背景技术
结直肠癌是消化系统中最为常见的一种恶性肿瘤，而且结直肠癌具有高发病率和高死亡率的特征。目前，结直肠癌已经成为全球发病率第三高的恶性肿瘤。结直肠癌目前的主要治疗手段是内镜下切除、外科手术、新辅助化疗、辅助化疗、放疗和靶向治疗等，尽管许多的新药在结直肠癌的治疗过程中疗效显著，但是由于晚期患者的复发和转移以及患者对于药物的耐药性，患者的五年生存率依然较差。因此，寻找与结直肠癌发生发展密切相关的生物标志物对于监测肿瘤进展和寻找治疗靶点至关重要。
尽管目前已经有很多的研究已经发现多种因素在结直肠癌发病过程中发挥着重要作用，但是结直肠癌的发生和演变是一个错综复杂的调控过程，目前依然有很多问题需要进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌靶向治疗药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
其一，本发明提供了一种用于结直肠癌治疗的基因，所述基因为AC092635.1基因；通过特异性抑制AC092635.1基因表达能够有效的治疗结直肠癌。
其二，本发明提供了AC092635.1基因抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的用途。
优选地，所述AC092635.1基因抑制剂是指对AC092635.1基因具有抑制效果的分子。
优选地，所述AC092635.1基因抑制剂为降低AC092635.1基因表达量的siRNA，dsRNA、shRNA中的一种。
优选地，所述AC092635.1基因抑制剂为siRNA，所述siRNA包括以下核苷酸序列：正义链序列如SEQ ID NO.6所示，反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
其三，本发明提供了一种结直肠癌治疗药物，所述药物包括有效剂量的AC092635.1基因抑制剂。
优选地，所述AC092635.1基因抑制剂为siRNA，所述siRNA包括以下核苷酸序列：正义链序列如SEQ ID NO.6所示，反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
其四，本发明提供了一种用于结直肠癌治疗的siRNA，所述siRNA包括以下核苷酸序列：正义链序列如SEQ ID NO.6所示，反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
其五，本发明提供了AC092635.1基因抑制剂在制备结直肠癌细胞增殖抑制剂中的用途。
其六，本发明提供了 AC092635.1基因抑制剂在制备结直肠癌细胞转移抑制剂中的用途。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现AC092635.1基因在结直肠癌组织中高表达，且AC092635.1基因在结直肠癌和癌旁组织中的表达差异具有优异的诊断价值，因此可将AC092635.1基因用于制备辅助诊断结直肠癌的诊断试剂盒。
同时，本发明发现AC092635.1基因在转移的结直肠癌组织中的表达量显著高于未转移的结直肠癌组织，且差异表达具有优异的诊断价值，因此可将AC092635.1基因用于制备诊断结直肠癌转移的诊断试剂盒。
此外，本发明发现AC092635.1基因在结直肠细胞中高表达，因此，可以提供检测AC092635.1基因在结直肠癌细胞中的表达量来筛选结直肠癌药物。
除此之外，本发明借助于集落形成实验，Transwell小室实验，Western Blot实验发现靶向抑制AC092635.1基因能够有效的抑制结直肠癌细胞的增殖，迁移，侵袭和EMT转化，因此，可将其用于制备治疗结直肠癌的药物。
附图说明
图1 AC092635.1基因在结直肠肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异；
图2 结直肠癌组织和癌旁组织中基因AC092635.1表达差异的ROC曲线；
图3转移结直肠癌组织和非转移结直肠癌组织中的基因AC092635.1表达量差异；
图4 转移癌组织和非转移癌组织中AC092635.1表达差异的ROC曲线；
图5 AC092635.1在结直肠癌细胞中的表达差异；
图6 siAC092635.1的敲减效果的检测结果；
图7 靶向抑制AC092635.1对于SW480细胞克隆形成的调控；
图8 靶向抑制AC092635.1对于SW480细胞的细胞迁移能力的调控；
图9 靶向抑制AC092635.1对于SW480细胞的细胞侵袭能力的调控；
图10靶向抑制AC092635.1对于EMT转化相关蛋白的调控。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
收集青岛市中心医院30例结直肠癌患者的肿瘤组织和对应的癌旁组织，其中发生转移的肿瘤组织为16例，未发生转移的组织为14例。所有结直肠癌患者术前均为进行任何放化疗治疗，样品采集复合医院伦理委员会要求并已征求病人的同意，具体如下：
编号 性别 确诊年龄 样本类型
1 Female 67 Metastasis
2 Female 49 Metastasis
3 Male 24 Metastasis
4 Female 39 Metastasis
5 Male 64 Un-metastasis
6 Female 63 Metastasis
7 Male 24 Un-metastasis
8 Female 22 Un-metastasis
9 Female 43 Metastasis
10 Female 58 Un-metastasis
11 Male 58 Metastasis
12 Female 68 Un-metastasis
13 Female 43 Metastasis
14 Male 65 Metastasis
15 Female 65 Un-metastasis
16 Male 54 Un-metastasis
17 Male 82 Un-metastasis
18 Female 46 Metastasis
19 Male 54 Un-metastasis
20 Male 41 Un-metastasis
21 Female 51 Metastasis
22 Male 59 Metastasis
23 Male 62 Metastasis
24 Male 47 Un-metastasis
25 Female 46 Metastasis
26 Male 63 Metastasis
27 Male 53 Un-metastasis
28 Female 50 Un-metastasis
29 Male 63 Metastasis
30 Female 46 Un-metastasis
实施例1
检测AC092635.1基因在结直肠肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异
1.提取组织中的RNA
（1）将50mg结直肠癌组织和癌旁组织放入到预冷的研钵中，快速研磨为粉末；
（2）在研钵中加入1ml Trizol，充分混匀之后转移至无酶离心管中，室温静置5min；
（3）设定离心机转速为12000rpm，放入离心管离心5min；
（4）在离心管中加入200μl氯仿，颠倒混匀后，在室温下静置10min；
（5）设定离心机转速为12000rpm，放入离心管离心10min；
（6）液体分为三层，将上层的上清液转移至新的无酶离心管中中，加入等体积的预冷的异丙醇混匀，置于冰上静置10min；
（7）设定离心机转速为12000rpm，放入离心管离心10min；
（8）弃去上清液，在沉淀中加入1ml由DEPC水配置的75%乙醇，混匀后放置于离心机中，7500rpm，离心10min；
（9）去除上清，置于超净工作台中干燥RNA白色沉淀，加入50μlDEPC水溶解沉淀，使用微量定量检测仪检测RNA的纯度和浓度。
2.cDNA逆转录
按照TAKARA反转录试剂盒进行操作
（1）去除基因组DNA
配置10μl反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，TotalRNA 1.0μg，RNase Free dH2O up to 10μl。
PCR仪的反应条件：42℃ 2分钟，4℃保持。
（2）逆转录反应
配置20μl反应体系：步骤（1）的反应液 10μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl，RT Primer Mix 1.0μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μl，RNase Free dH2O 4.0μl。
PCR仪的反应条件：37℃ 15分钟，85℃ 5秒，4℃保持。
3.荧光定量PCR反应
（1）根据AC092635.1基因的序列ENST00000434509.1（SEQ ID NO.1）设计引物
AC092635.1的引物序列如下：
正向引物:5'-ACACACTAAAACTCCCACAGAA-3’(SEQ ID NO.2)
反向引物:5'-TACCTGTTTGTGACACCCGC-3’（SEQ ID NO.3）
以GAPDH为内参，GAPDH的引物序列如下：
正向引物: 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’(SEQ ID NO.4)
反向引物: 5'-CCACCTGGTGCTCAGTGTAG-3’(SEQ ID NO.5)
（2）按照TAKARA荧光定量PCR试剂盒配置反应试剂：
配置反应试剂: SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10μl，正向引物0.4μl，反向引物 0.4μl，cDNA模板 2μl，ddH2O 7.2μl。
设定荧光定量PCR仪的参数为：95℃ 5min；95℃ 15s ，60℃ 40s 38个循环
（3）以GAPDH作为参比基因，采用2-△△Ct方法计算基因AC092635.1的相对表达量。
实验结果如下：
癌旁组织和结直肠癌组织中的基因AC092635.1的表达量差异如图1。其中，结直肠癌组织中的基因AC092635.1的相对表达量为（162.6±55.32）%，可以看出，结直肠癌组织中基因AC092635.1的相对表达量明显高于癌旁组织，且差异具有统计学意义。
同时，本发明绘制了结直肠癌组织和癌旁组织中基因AC092635.1差异的ROC曲线，如图2所示。其中，ROC曲线的AUC值为0.8011，Std.Error为0.0559，95% confidenceinterval为0.6916 to 0.9107，P < 0.0001，显示出优异的诊断价值，因此可以通过检测结直肠癌组织和癌旁组织中的基因AC092635.1的表达量来判断是否患有结直肠癌。
除此之外，本发明统计了结直肠癌组织中，转移癌组织和非转移癌组织中的基因AC092635.1表达量差异，结果如图3所示。其中，相较于非转移癌组织，转移癌组织中的基因AC092635.1的相对表达量为（129.1±10.54）%，可以看出，转移癌组织中基因AC092635.1的相对表达量明显高于非转移癌组织，且差异具有统计学意义。
转移癌组织和非转移癌组织中AC092635.1表达量差异的ROC曲线如图4所示。其中，ROC曲线的AUC值为0.9107，Std.Error为0.0514, 95% confidence interval为0.8099to 1.011，P < 0.001，显示出优异的诊断价值，因此可以通过检测AC092635.1表达量来判断结直肠癌是否发生转移。
实施例2
利用荧光定量PCR检测AC092635.1在结直肠癌细胞中的表达差异
（1）将对数生长期的人正常结肠上皮细胞NCM460和HT29、SW620、SW480和LOVO接种于细胞培养板中；
（2）待细胞密度达到90%后加入Trizol提取RNA，RNA提取，逆转录反应以及荧光定量PCR反应步骤同实施例1。
不同结直肠癌细胞中AC092635.1的表达量差异如图5所示。可以看出，结直肠癌细胞中AC092635.1表达量显著高于人正常结肠上皮细胞NCM460，该结果与组织中的表达量结果相吻合。
实施例3
设计AC092635.1的干扰RNA并验证干扰效果
（1）根据AC092635.1基因的序列ENST00000434509.1设计siRNA，si AC092635.1的序列如下所示：
正义链：AAUUUUCCCCCUUUCUGUGGG，SEQ ID NO.6
反义链：CACAGAAAGGGGGAAAAUUAG, SEQ ID NO.7；
（2）将SW480细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%时，按照LipoFiterTM 3.0说明书转染siNC和siAC092635.1，转染48h后，提取RNA进行荧光定量PCR检测，具体步骤参见实施例1.
siAC092635.1的敲减效果如图6所示，其中，siAC092635.1组细胞中的AC092635.1的相对表达量为（27.30±6.02）%，可以看出siAC092635.1能够有效的抑制AC092635.1的表达。
实施例4
靶向抑制AC092635.1对SW480结直肠癌细胞增殖的调控
（1）将转染siNC和siAC092635.1的对数生长期的SW480细胞使用胰酶消化，吹打混匀制成单细胞悬液；
（2）进行细胞计数，调整细胞密度为1×104细胞/ml，之后将100μl细胞悬液加入到培养皿中，加入2ml完全培养液，置于细胞培养箱中进行培养，每组设置3个重复；
（3）当培养皿中出现克隆时，去除培养基，使用PBS进行清洗，之后加入4%多聚甲醛固定15min；
（4）弃去固定液，加入结晶紫染色液进行染色，20min后去除染色液，使用PBS进行清洗，之后对培养皿中的克隆数进行计数和统计。
靶向抑制AC092635.1对于SW480细胞克隆形成的影响如图7所示，可以看出，转染siAC092635.1后，SW480细胞克隆形成的数量显著减少，说明siAC092635.1能够削弱SW480细胞的体外增殖能力，即，靶向抑制AC092635.1能够抑制结直肠癌细胞的体外增殖。
实施例5
靶向抑制AC092635.1对于SW480结直肠癌细胞迁移能力的调控
（1）将转染siNC和siAC092635.1的对数生长期的SW480细胞使用胰酶消化，吹打混匀制成单细胞悬液；
（2）进行细胞计数，调整细胞密度为5×105细胞/ml；
（3）将Transwell小室放入到24孔板中，在24孔板中加入750μl含有10%FBS的完全培养基，在Transwell小室中加入200μl稀释后的细胞悬液，置于细胞培养箱中培养；
（4）培养48h后，取出小室，使用PBS轻轻的清洗，使用棉签擦掉小室内膜的细胞；
（5）在24孔板的新的孔中加入4%多聚甲醛，将小室放入多聚甲醛中固定15min；
（6）取出Transwell小室使用PBS清洗小室5min，之后使用结晶紫染色10min；
（7）去除染色液，使用清水清洗Transwll小室，置于倒置显微镜下进行拍照并选取5个不同的视野进行计数统计。
靶向抑制AC092635.1对于SW480细胞细胞迁移能力的调控如图8所示，可以看出，转染siAC092635.1后，SW480细胞穿过Transwell小室的数量显著减少，说明siAC092635.1能够削弱SW480细胞的细胞迁移能力，即，靶向抑制AC092635.1能够抑制结直肠癌细胞的迁移能力。
实施例6
靶向抑制AC092635.1对于SW480结直肠癌细胞侵袭能力的调控
（1）将Matrigel基质胶置于4℃冰箱中过夜，使Matrigel胶变为液体状态；
（2）使用无血清培养基对Matrigel基质胶按照1:8比例进行稀释，之后将Transwell小室置于24板中；
（3）在Transwell小室中加入100μl稀释的Matrigel基质胶，置于细胞培养箱中待其凝固；
（4）将转染siNC和siAC092635.1的对数生长期的SW480细胞使用胰酶消化，吹打混匀制成单细胞悬液；
（5）进行细胞计数，调整细胞密度为5×105细胞/ml；
（6）将Transwell小室放入到24孔板中，在24孔板中加入750μl含有10%FBS的完全培养基，在Transwell小室中加入200μl稀释后的细胞悬液，置于细胞培养箱中培养；
（7）培养48h后，取出小室，使用PBS轻轻的清洗，使用棉签擦掉小室内膜的细胞；
（8）在24孔板的新的孔中加入4%多聚甲醛，将小室放入多聚甲醛中固定15min；
（9）取出Transwell小室使用PBS清洗小室5min，之后使用结晶紫染色10min；
（10）去除染色液，使用清水清洗Transwll小室，置于倒置显微镜下进行拍照并选取5个不同的视野进行计数统计。
靶向抑制AC092635.1对于SW480细胞细胞侵袭能力的调控如图9所示，可以看出，转染siAC092635.1后，SW480细胞穿过Transwell小室的数量显著减少，说明siAC092635.1能够削弱SW480细胞的细胞侵袭能力，即，靶向抑制AC092635.1能够抑制结直肠癌细胞的侵袭能力。
实施例7
靶向抑制AC092635.1对于EMT转化相关蛋白的调控
（1）将SW480细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%时，按照LipoFiterTM 3.0说明书转染siNC和siAC092635.1；
（2）转染48h后，去除培养基加入适量含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液；
（3）置于摇床上，放置30min后将裂解液转移至1.5ml EP管中，放入4℃预冷的离心机中，1200rpm离心10min；
（4）离心结束后，取上清至新的1.5ml EP管中，使用BCA法测定蛋白浓度，添加Loading Buffer，95℃煮5min制得蛋白样品；
（5）配置12%的分离胶和5%的浓缩胶，凝固后备用；
（6）安装电泳架，进行上样，上样后，电压设定为80V，30min后调整电压为120V至溴酚蓝跑出；
（7）电泳结束后，按照“三明治”模型安装电转夹，250mA电转90min；
（8）电转结束后，将膜放入5%的脱脂奶粉中室温封闭1h；
（10）使用BSA按照抗体说明书稀释E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，GAPDH一抗，并根据蛋白大小孵育相应的一抗，4℃孵育过夜；
（11）使用TBST缓冲液洗膜3次，共30min，孵育相应的二抗，摇床常温孵育1h；
（12）去除二抗，使用TBST将PVDF膜清洗3次，共30min，置于显影仪上进行显影。
靶向抑制AC092635.1对于EMT转化相关蛋白的调控如图10所示，可以看出，转染siAC092635.1后，E-cadherin的表达量明显上调，而N-cadherin和Vimentin的表达量明显下调，说明siAC092635.1能够削弱SW480细胞的EMT转化，即，靶向抑制AC092635.1能够抑制结直肠癌细胞的EMT转化。
序列表
<110> 青岛市中心医院
<120> 一种基因制剂在制备结直肠癌细胞增殖和转移抑制剂中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 455
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
acacactaaa actcccacag aaagggggaa aattagaaaa ggggtgatat aatttgactc 60
tgtgtcacca cccaaatctc atcttgaatt gtaatccccg taatttctca cctggcaaga 120
gtgggaccag gtggagacaa ttggatcatg ggggcagttt tccccatgct cttctcgtga 180
taatgattga gtctcatggg atctgatgat tctataagtg tctggctttt ctcctacttg 240
cactcactcc atcctgccac cctgcgagga aggtgcctgc ttcttctttg ccttccgccg 300
tgagtgtgag tctcctgagg cctccccagc aatgtggaac tggatacgtc atggaacaga 360
gggcaacctg cctcctggaa atgtggagtg tctagggagt cacagctgag atcttccttg 420
gattaaaggc tgcgggtgtc acaaacaggt aggaa 455
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acacactaaa actcccacag aa 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacctgtttg tgacacccgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcaccacca tggagaaggc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccacctggtg ctcagtgtag 20
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aauuuucccc cuuucugugg g 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacagaaagg gggaaaauua g 21

Claims (2)

1. AC092635.1基因抑制剂在制备结直肠癌细胞增殖抑制剂中的用途, 其特征在于，所述AC092635.1基因抑制剂为siRNA，所述siRNA包括以下核苷酸序列：正义链序列如SEQID NO.6所示，反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
2. AC092635.1基因抑制剂在制备结直肠癌细胞转移抑制剂中的用途, 其特征在于，所述AC092635.1基因抑制剂为siRNA，所述siRNA包括以下核苷酸序列：正义链序列如SEQID NO.6所示，反义链序列如SEQ ID NO.7所示。
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