CN114512184A - 一种用于预测癌症疗效和预后的方法及其装置和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于预测癌症疗效和预后的方法及其装置和应用，涉及生物医学技术领域，本发明通过对样本的基因组特征进行分析和梳理，筛选出了对临床疗效和预后有显著预测作用的分子标志物，通过计算每个样本中分子标志物的状态与治疗方式的匹配度，对治疗方式的疗效和预后进行有效预测，从而使得患者能够及时地选择更有效的治疗方式，在降低治疗成本的情况下，提高了癌症治疗率，延长了患者的生存期限。

Description

一种用于预测癌症疗效和预后的方法及其装置和应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种用于预测癌症疗效和预后的方法及其装置和应用。

背景技术

癌症的传统临床治疗手段包括手术、放疗、化疗及其靶向治疗，但总体生存率有限。越来越多的研究不断证实癌症是一种基因变异导致的疾病，而以手术、化疗和放疗为主的传统治疗方法对患者生存期的延长已进入一个瓶颈期。随着研究的不断深入，对疾病认识的不断加深，新的治疗方式和药物不断涌现，对其的治疗也从以往的经验医学和循证医学逐步发展为如今的精准医疗(precision medicine)。

目前，肺癌中的精准医疗主要包括靶向治疗和免疫治疗。在最新的《NCCNguidelines》2021 V5中，已对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者明确推荐进行EGFR(19del、L858R、Exon 20insertion、T790M)、ALK(Fusion)、ROS1(Fusion)、BRAF(V600E)、NTRK(Fusion)、KRAS(codon 12mutation)、RET(Fusion)、ERBB2(mutation)、RET(amplification and exon 14skipping)等基因变异的检测，并且针对含有这些基因变异的患者，推荐使用对应的靶向治疗药物。以EGFR突变为例，尽管大多数携带EGFR敏感突变的NSCLC患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)反应良好，但仍有20-30％的患者对EGFR-TKIs原发性耐药，提示临床研究者，在使用EGFR-TKIs时，仅考虑EGFR是否具有敏感突变，可能对于存在原发性耐药的肺癌患者来说是不够的。

近十年来，随着肿瘤免疫疗法的蓬勃发展，以程序性死亡受体1(programmed celldeath-1,PD-1)及其配体1(programmed cell death 1ligand 1,PD-L1)PD-1/PD-L1单抗为代表的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)为晚期NSCLC的治疗带来了突破性的进展，已成为目前NSCLC治疗的热点。针对PD-1/PD-L1和T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4,CTLA-4)的单克隆抗体已在多个国家被批准用于NSCLC治疗。目前FDA已经批准了四个不同PD-1/PD-L1单抗用于NSCLC的治疗。PD-L1作为免疫治疗的预测性标志物已在多个免疫治疗临床试验中被证实，并且是目前唯一被证实能够指导免疫治疗的伴随诊断。KEYNOTE-001研究显示针对PD-L1表达≥50％的晚期NSCLC患者中，初治和复治患者的5年生存率分别为29.6％和25％，而PD-L1阴性的人群5年生存率仅为3.5％，可见PD-L1检测可以高效地协助临床筛选免疫治疗获益人群。但以抗PD-1抗体为代表的ICIs在晚期NSCLC中单药的临床客观缓解率(objective responserate,ORR)仅为20％左右，仍有80％的肺癌患者对ICIs产生原发性(定义为无影像学的客观反应和治疗持续时间＜6个月)或获得性(有客观反应或治疗持续时间≥6个月)耐药。可见PD-L1表达远非理想的伴随诊断标志物，原发性和获得性耐药仍是影响免疫治疗疗效的主要因素之一。

在多个临床试验中，肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)作为新兴的疗效预测标记物，受到越来越多的关注。CheckMate026研究的探索性分析中针对PD-L1>1％的患者中，根据TMB三分位数将患者区分为低，中和高TMB三组，高TMB患者的纳武单抗(Nivolumab)临床响应率达到46.8％。基于CheckMate026的探索性分析结果，在CheckMate227研究中TMB已成为与PD-L1表达水平同等重要的分子标志物，在PD-L1>1％的患者中，Nivolumab联合化疗组的ORR达到60.5％。因此2018年TMB正式纳入了最新版非小细胞肺癌NCCN指南。2021年，MD安德森癌症中心将实体瘤划分为肿瘤抗原增加与CD8⁺T细胞增加正相关(I型，包括NSCLC)和不相关(II型)两种，结果显示TMB-高(TMB-H)的NSCLC患者接受免疫治疗存在临床获益，在整个I型的数据中，TMB-H肿瘤对免疫检查点抑制剂的客观缓解率达到39.8％。

随着越来越多临床研究探索性生物指标研究的深入，出现了很多能够预测免疫治疗疗效的生物标志物。然后，现有的生物标志物在指导和预测临床疗效时具有局限性，无法有效地即使有效地基于预测结果选自更有效的治疗方案。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于预测癌症疗效和预后的方法及其装置和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种用于预测癌症疗效和预后的装置，其包括获取模块和计算模块。其中，获取模块用于获取待测样本分子标志物的检测数据；所述分子标志物包括第一标志物和第二标志物；所述第一标志物包括肿瘤突变负荷、HLA基因型、PD-L1蛋白表达；所述第二标志物的获取方式为：针对不同的治疗方式，根据客观缓解率和无进展生存期，对基因组特征进行筛选，将与治疗方式的疗效和预后显著相关的基因组特征标记为第二标志物；所述基因组特征包括：体细胞突变、拷贝数变异、肿瘤新抗原负荷、杂合性缺失、瘤内异质性和基因组不稳定性中的至少一种。计算模块用于通过待测样本分子标志物的检测数据，计算T-index，T-index＝分子标志物状态为对疗效和预后有益的分子标志物的数量/分子标志物的总数。

第二方面，本发明实施例提供了一种用于预测癌症疗效和预后的试剂盒，其包括用于检测分子标志物的试剂，所述分子标志物为如前述实施例所述的分子标志物。

第三方面，本发明实施例提供了检测分子标志物的试剂在制备用于预测癌症疗效和预后的试剂盒中的应用，所述分子标志物为如前述实施例所述的分子标志物。

第四方面，本发明实施例提供了一种癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法，其包括：基于样本分子标志物的检测数据，计算T-index；T-index＝分子标志物状态为对疗效和预后有益的分子标志物的数量/分子标志物的总数；

所述分子标志物包括第一标志物和第二标志物；所述第一标志物包括肿瘤突变负荷、HLA基因型、PD-L1蛋白表达；所述第二标志物的获取方式为：针对特定的治疗方式，根据客观缓解率和无进展生存期，对基因组特征进行筛选，将与该治疗方式的疗效和预后显著相关的基因组特征标记为第二标志物；所述基因组特征包括：体细胞突变、拷贝数变异、肿瘤新抗原负荷、杂合性缺失、瘤内异质性和基因组不稳定性中的至少一种。

第五方面，本发明实施例提供了一种电子设备，其包括：处理器和存储器，所述存储器用于存储一个或多个程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如前述实施例所述的癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法。

第六方面，本发明实施例提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如前述实施例所述的癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过样本的基因组特征进行分析和梳理，筛选出了对临床疗效和预后有显著预测作用的分子标志物，通过计算每个样本中分子标志物的状态(高低、有无等)与治疗方式的匹配度，对治疗方式的疗效和预后进行有效预测，从而使得患者能够及时地选择更有效的治疗方式，在降低治疗成本的情况下，提高了癌症治疗率，延长了患者的生存期限。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中T-index的构建流程示意图；

图2为实施例1中654panel的测序结果；

图3为实施例1中根据ORR使用最小P值法将样本分为T-index高低两类的结果；

图4为实施例2中AUC和c-index的箱线图；

图5为实施例3中各指标对免疫治疗临床疗效和预后的预测效力。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供了一种用于预测癌症疗效和预后的装置，其包括：

获取模块，用于获取待测样本分子标志物的检测数据；所述分子标志物包括第一标志物和第二标志物；所述第一标志物包括肿瘤突变负荷、HLA基因型、PD-L1蛋白表达；所述第二标志物的获取方式为：针对不同的治疗方式，根据客观缓解率和无进展生存期，对基因组特征进行筛选，将与治疗方式的疗效和预后显著相关的基因组特征标记为第二标志物；所述基因组特征包括：体细胞突变、拷贝数变异、肿瘤新抗原负荷、杂合性缺失、瘤内异质性和基因组不稳定性中的至少一种；

计算模块，用于通过待测样本分子标志物的检测数据，计算T-index，T-index＝分子标志物状态为对疗效和预后有益的分子标志物的数量/分子标志物的总数。

需要说明的是，本文中的“第二标志物”是通过对已知样本(已知治疗方式、疗效和预后)的分子标志物进行检测，基于根据客观缓解率和无进展生存期，从基因组特征中筛选的与治疗方式的疗效和预后显著相关的特征。

本文中“显著相关”中的显著可以指P＜0.05的情况，即具有统计学意义。

T-Index(Therapeutic index)，为治疗指数，范围为[0-1]，是通过计算患者中多个分子标志物的状态与治疗方式的匹配度得到的指标，能够用于预测不同治疗方式对于患者的临床疗效和预后，从而提高患者的癌症治愈率，延长生存期限。

本文中“待测样本分子标志物的检测数据”可以通过WES(全外显子组测序)或者基因检测panel获得。在一些实施例中，基因检测panel的检测范围可能存在不包含所有分子标志物的情况，当基因检测panel中无法对某一个或几个分子标志物进行检测时，计算T-index时，忽略掉无法检测的分子标志物，不将其纳入计算。

在WES的数据中，肿瘤突变负荷TMB＝错义突变的数目/WES的测序范围长度。在基因检测panel中，所述肿瘤突变负荷的计算公式选自TMBa、TMBb、TMBc和TMBd中的任意一种。

TMBa＝错义突变的数目/测序范围的长度；

TMBb＝(错义突变的数目+同义突变的数目)/测序范围长度；

TMBc＝(错义突变的数目-同义突变的数目)/测序范围长度；

TMBd＝(错义突变的数目+同义突变的数目-热点突变的数目)/测序范围长度。

优选地，所述肿瘤突变负荷的计算公式如TMBd所示。结果显示，TMBd与WES中的TMB结果一致性更高，因此，采用TMBd作为基因检测panel的TMB结果。

所述肿瘤新抗原，是在正常组织中不表达，仅在肿瘤组织中表达的抗原。肿瘤新抗原负荷是一项直接反应肿瘤表面抗原免疫原性的指标。本发明中根据体细胞突变产生的多肽与HLA的亲和力预测新抗原，所述肿瘤新抗原负荷TNB＝肿瘤新抗原数目/测序范围长度。

杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)：一对等位基因的其中一条等位基因allele突变或者缺失，导致其只剩下了一个allele，丧失了成为杂合的可能性，就叫做杂合性缺失。

优选地，所述杂合性缺失的检测指标包括：发生LOH的区域占整个基因组的比例(％Genome of LOH region)；和/或，发生在LOH区域的基因突变的数目(Number ofmutations in LOH region)。

瘤内异质性(intra-tumor heterogeneity,ITH)，是指：肿瘤内部的分子生物学或基因方面的差异，使肿瘤各部分的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。瘤内异质性越低，临床治疗的预后越好。

优选地，所述瘤内异质性的检测指标包括(a)～(d)中的至少一种：

(a)等位基因突变的肿瘤异质性(mutant-allele tumor heterogeneity,MATH)，评估每个基因突变的最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)偏离该样本的MAF整体分布的程度，偏离程度越高，MATH越高，瘤内异质性越高；

本发明评估了每个基因突变的最小等位基因频率MAF偏离该样本的MAF整体分布的程度，每个基因突变的癌细胞分数(cancer cell fraction,CCF)偏离样本CCF整体分布的程度，MATH＝100×(median(|CCFi-median(CCF)|)/median(CCF))；

其中，median为一种计算机函数，能够返回给定数值的中值。

(b)晚期突变比例(percentage of Late Mutaions,pLM)，pLM＝亚克隆突变的数目/所有突变的数目；

(c)克隆的数目(No.of Clones)；本发明使用Pyclone对每个样本中的突变进行聚类，每一类归为一种克隆，克隆的数目越多，异质性越高；

(d)样本中的香农-维纳多样性指数(Shannon's Diversity Index,SI)，SI＝∑(Pi)(lnPi)，Pi为每种克隆的CCF，SI越高，瘤内异质性越高。

更优选地，本发明利用4个指标评估每个样本的瘤内异质性的高低。

优选地，所述基因组不稳定性的检测指标包括：肿瘤细胞中包含的染色体组数(也称之为染色体倍性Ploidy)和/或全基因组加倍(whole genome duplication,WGD)。多倍性和WGD使基因组内的所有基因都发生重复。

优选地，所述分子标志物还包括第三标志物，所述第三标志物为现有被报道过的与癌症的疗效和预后相关的分子标志物。

优选地，所述治疗方式选自：免疫治疗、靶向治疗和化疗中的至少一种。

优选地，所述治疗方式为初治或复治。

优选地，所述癌症为肺癌，更优选为非小细胞肺癌。

本发明实施例还提供了一种用于预测癌症疗效和预后的试剂盒，其包括用于检测分子标志物的试剂，所述分子标志物为如前述任意实施例所述的分子标志物。

优选地，所述试剂为检测panel，所述检测panel包括用于检测靶基因中至少300种基因的试剂，基于对靶基因的测序结果，能够获得对样本分子标志物的检测结果。相对于全基因组测序数据而言，检测panel的测序数据同样能够获取用于计算T-index的指标(分子标志物)，且检测速度更快，成本更低。

具体地，所述靶基因包括：ABL1、CCND2、EP300、GNB1、KLF5、NOTCH3、RAD21、STAT3、ABRAXAS1、CCND3、EP400、GPS2、KLHL6、NOTCH4、RAD50、STAT5B、ACTG1、CCNE1、EPAS1、GREM1、KMT2A、NPM1、RAD51、STK11、ACVR1、CCNQ、EPCAM、GRIN2A、KMT2B、NRAS、RAD51B、SUFU、ACVR1B、CD160、EPHA1、GRM3、KMT2C、NRG1、RAD51C、SUZ12、ACVR2A、CD22、EPHA2、GSK3B、KMT2D、NSD1、RAD51D、SYK、ACVRL1、CD244、EPHA3、GSTM1、KNSTRN、NSD2、RAD52、TAF1、AGO2、CD274、EPHA7、GSTP1、KRAS、NSD3、RAD54B、TAS2R38、AJUBA、CD276、EPHB1、GTF2I、LAG3、NT5C2、RAD54L、TBL1XR1、AKT1、CD28、EPHB4、H3F3A、LATS1、NT5E、RAF1、TBX3、AKT2、CD38、EPHB6、H3F3C、LATS2、NTHL1、RARA、TCF3、AKT3、CD44、EPPK1、HAVCR2、LCK、NTRK1、RASA1、TCF7L2、ALK、CD48、ERBB2、HDAC1、LEF1、NTRK2、RB1、TEK、ALOX12B、CD58、ERBB3、HDAC2、LIFR、NTRK3、RBM10、TENT5C、AMER 1、CD69、ERBB4、HDAC3、LIMK1、NUP93、RECQL、TERT、ANKRD11、CD70、ERCC1、HDAC4、LRRK2、P2RY8、RECQL4、TET1、APC、CD79A、ERCC2、HDAC6、LTK、PAK1、REL、TET2、APEX1、CD79B、ERCC3、HGF、LYN、PAK5、RELN、TGFB1、AR、CD80、ERCC4、HIST1H1B、MAF、PALB2、RET、TGFBR1、ARAF、CD86、ERCC5、HIST1H1C、MAGEA1、PARP1、RHEB、TGFBR2、ARFRP1、CDC73、ERF、HIST1H1D、MAGEA12、PARP2、RHOA、TIAF1、ARHGAP35、CDH1、ERG、HIST1H2BD、MAGEA3、PARP3、RICTOR、TIPARP、ARHGEF12、CDK12、ERRFI1、HLA-A、MAGEA4、PAX5、RIT1、TLR4、ARID1A、CDK4、ESCO2、HLA-B、MAGEC2、PBRM1、RNF43、TMEM127、ARID1B、CDK6、ESR1、HLA-C、MAGOH、PCBP 1、ROBO1、TMPRSS2、ARID2、CDK8、ETNK1、HLA-DMA、MALT1、PCNA、ROS1、TNF、ARID3A、CDKN1A、ETV1、HLA-DMB、MAP2K1、PDCD1、RPA1、TNFAIP3、ARID4A、CDKN1B、ETV6、HLA-DOA、MAP2K2、PDCD1LG2、RPA2、TNFRSF14、ARID4B、CDKN2A、EWSR1、HLA-DOB、MAP2K4、PDGFRA、RPA3、TNFRSF18、ARID5B、CDKN2B、EZH1、HLA-DPA1、MAP3K1、PDGFRB、RPL22、TNFRSF4、ASXL1、CDKN2C、EZH2、HLA-DPB1、MAP3K13、PDK1、RPL5、TNFSF11、ASXL2、CEBPA、FANCA、HLA-DQA1、MAPK1、PHF6、RPS6KB1、TNFSF14、ATM、CFTR、FANCC、HLA-DQA2、MAPK11、PHOX2B、RPTOR、TNFSF18、ATP11B、CHEK1、FANCD2、HLA-DQB1、MAPK3、PIGA、RRAS2、TNFSF4、ATP6AP1、CHEK2、FANCG、HLA-DQB2、MAPK8IP1、PIGF、RTEL1、TOP1、ATP6V1B2、CIC、FANCI、HLA-DRA、MAX、PIK3C2B、RUNX1、TP53、ATR、CIITA、FANCL、HLA-DRB1、MCL1、PIK3C2G、RXRA、TP53BP1、ATRX、COP1、FANCM、HLA-DRB5、MDC1、PIK3CA、RYBP、TP63、ATXN2、CRBN、FAS、HLA-E、MDM2、PIK3CB、SAMHD1、TSC1、AURKA、CREBBP、FAT1、HLA-F、MDM4、PIK3CD、SDHA、TSC2、AURKB、CRKL、FBXO11、HLA-G、MED12、PIK3CG、SDHAF2、TSHR、AXIN1、CRLF2、FBXW7、HNF1A、MEF2B、PIK3R1、SDHB、TSHZ2、AXIN2、CSF1R、FGF10、HOXB13、MEN1、PIK3R2、SDHC、TSHZ3、AXL、CSF3R、FGF12、HRAS、MERTK、PIK3R3、SDHD、TYK2、B2M、CSNK2A1、FGF14、HSD3B1、MET、PIM1、SESN1、TYRO3、B4GALT3、CTAG2、FGF19、ICOS、MGA、PLCG1、SESN2、U2AF1、BACH2、CTCF、FGF23、ICOSLG、MGMT、PLCG2、SESN3、USP9X、BAGE、CTLA4、FGF3、ID3、MITF、PLK1、SETBP1、VAV1、BAP1、CTNNA1、FGF4、IDH1、MKNK1、PMAIP1、SETD2、VEGFA、BARD1、CTNNB1、FGF6、IDH2、MLH1、PMS1、SETD3、VEGFB、BBC3、CUL3、FGFR1、IFITM1、MLH3、PMS2、SF3B1、VEZF1、BCL10、CUL4A、FGFR2、IFITM3、MPL、PNP、SGK1、VHL、BCL11B、CUX1、FGFR3、IGF1R、MRE11、POLD1、SH2B3、VTCN1、BCL2、CXCR4、FGFR4、IGF2、MSH2、POLE、SH2D1A、WT1、BCL2L1、CYLD、FH、IKBKE、MSH3、POLQ、SHOC2、XPO1、BCL2L11、CYP17A1、FLCN、IKZF1、MSH6、POT1、SHQ1、XRCC1、BCL2L2、CYP2D6、FLT1、IKZF3、MST1R、PPARG、SIK1、XRCC2、BCL6、CYSLTR2、FLT3、IL6、MTAP、PPM1D、SIN3A、YAP1、BCL9、DAXX、FLT4、IL7R、MTOR、PPP2R1A、SLAMF7、ZFHX3、BCOR、DCUN1D1、FOXA1、INHA、MUC16、PPP2R2A、SLX4、ZNF217、BCORL1、DDR1、FOXA2、INPP4B、MUTYH、PPP6C、SMAD2、ZNF703、BCR、DDR2、FOXL2、INPPL1、MYC、PRDM1、SMAD3、ZRSR2、BIRC2、DDX3X、FOXO1、INSR、MYCL、PRF1、SMAD4、CD74、BIRC3、DICER1、FOXO3、IRF1、MYCN、PRKAR1A、SMARCA4、CLTC、BLM、DIS3、FOXP1、IRF2、MYD88、PRKCI、SMARCB1、EML4、BMPR1A、DNAJB1、FRK、IRF4、MYO18A、PRKN、SMC1A、ETV4、BRAF、DNMT3A、FUBP1、IRF8、MYOD1、PRSS1、SMC3、ETV5、BRCA1、DNMT3B、GABRA6、IRS2、NAV3、PRX、SMO、EZR、BRCA2、DOT1L、GAGE1、ITK、NBN、PTCH1、SNCAIP、KIF5B、BRD4、DTX1、GALNT12、JAK1、NCOA4、PTEN、SOCS1、MYB、BRIP1、DUSP22、GAS6、JAK2、NCOR1、PTK6、SOS1、NUTM1、BTG1、DUSP4、GATA1、JAK3、NEK11、PTPN1、SOX17、PAX8、BTG2、ECT2L、GATA2、JUN、NF1、PTPN11、SOX2、RSPO2、BTK、EED、GATA3、KDM5A、NF2、PTPN2、SOX9、SLC3A2、BTLA、EGFR、GATA4、KDM5C、NFE2L2、PTPRD、SPATA2、SDC4、CALR、EGR1、GATA6、KDM6A、NFE2L3、PTPRK、SPEN、SLC34A2、CARD11、EGR3、GID4、KDR、NFKBIA、PTPRO、SPINK1、TPM3、CARM1、EIF1AX、GLI1、KEAP1、NKX2-1、PTPRS、SPOP、VAMP2、CASP8、EIF4A2、GNA11、KEL、NKX2-8、PTPRT、SPRED1、PRKACA、CBFB、ELF3、GNA13、KIT、NKX3-1、QKI、SRC、TERC、CBL、EMSY、GNAQ、KITLG、NOTCH1、RAB35、SRSF2、CCND1、EOMES、GNAS、KLF4、NOTCH2、RAC1和STAG2。

优选地，所述检测panel包括检测靶基因中的至少457种基因的试剂；更有选为600种基因的组合，基于600种靶基因的测序数据的检测的指标计算的T-index，能够更加准确的预测癌症的治疗和预后。

本发明实施例还提供了检测分子标志物的试剂在制备用于预测癌症疗效和预后的试剂盒中的应用，所述分子标志物为如前述任意实施例所述的分子标志物。

本发明实施例还提供了一种癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法，其包括：基于样本分子标志物的检测数据，计算T-index；T-index＝分子标志物状态对疗效和预后有益的分子标志物的数量/分子标志物的总数；

所述分子标志物包括第一标志物和第二标志物；所述第一标志物包括肿瘤突变负荷、HLA基因型、PD-L1蛋白表达；所述第二标志物的获取方式为：针对特定的治疗方式，根据客观缓解率和无进展生存期，对基因组特征进行筛选，将与该治疗方式的疗效和预后显著相关的基因组特征标记为第二标志物；所述基因组特征包括：体细胞突变、拷贝数变异、肿瘤新抗原负荷、杂合性缺失、瘤内异质性和基因组不稳定性中的至少一种。本发明实施例还提供了一种电子设备，其包括：处理器和存储器，所述存储器用于存储一个或多个程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如前述实施例所述的癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法。

存储器可以是但不限于，随机存取存储器(Random Access Memory，RAM)，只读存储器(Read Only Memory，ROM)，可编程只读存储器(Programmable Read-Only Memory，PROM)，可擦除只读存储器(Erasable Programmable Read-Only Memory，EPROM)，电可擦除只读存储器(Electric Erasable Programmable Read-Only Memory，EEPROM)等。

处理器可以是一种集成电路芯片，具有信号处理能力。该处理器可以是通用处理器，包括中央处理器(Central Processing Unit，CPU)、网络处理器(Network Processor，NP)等；还可以是数字信号处理器(Digital Signal Processing，DSP)、专用集成电路(Application Specific Integrated Circuit，ASIC)、现场可编程门阵列(Field－Programmable Gate Array，FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。

在实际应用中，该电子设备可以是服务器、云平台、手机、平板电脑、笔记本电脑、超级移动个人计算机(ultra-mobile personal computer，UMPC)、手持计算机、上网本、个人数字助理(personal digital assistant，PDA)、可穿戴电子设备、虚拟现实设备等设备，因此本申请实施例对电子设备的种类不做限制。

本发明实施例还提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如前述实施例所述的癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法。

计算机可读介质包括：U盘、移动硬盘、只读存储器、随机存取存储器、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。

可以理解的是，试剂盒、试剂在制备相关试剂盒中的应用、计算方法、电子设备以及计算机存储介质中所述的癌症均优选为肺癌，具体可以为非小细胞肺癌。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种癌症疗效和预后的治疗指数T-index的计算方法，在本实施例中，所述癌症为肺癌，流程参照附图1，具体包括以下步骤。

1、用于计算T-index的指标来自于全外显子组测序数据和作为对照组的457Panel测序数据，以及PD-L1免疫组化检测数据。

本实施例招募不可手术的IV期非小细胞肺癌NSCLC患者，共分两批患者。

第一批有175例患者，其中有15例样本的治疗方式为最佳支持治疗，根据收集的组织样本和白细胞对照进行WES和457gene panel；参与者中有临床疗效和预后分析的患者数目为160例。

第二批有296例患者，其中有10例样本的治疗方式为最佳支持治疗，同样根据收集的组织样本和白细胞对照进行654gene panel测序(图2)。参与者中有临床疗效和预后分析的患者数目为286例。

之后测序数据进行质控、比对，进行预测指标的分析和计算。两批患者中有16例免疫治疗患者重合用于对比分析两组数据的吻合度。

2、基于WES，457gene panel，654gene panel数据的预测指标(分子标志物)用于T-index的构建和验证。

2.1DNA的提取，捕获及测序。

(1)肿瘤组织中DNA的提取：对于福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed andparaffin-embedded,FFPE)样本需要提前进行处理(玻片：在样本处加2ul DS buffer，用刀片将DS涂抹均匀并刮取放到装有320ul DS buffer的1.5ml离心管中待提取；蜡卷：用200或100μl的枪头挑取部分样本放到1.5ml的EP管中，20000g离心3min后待提取；蜡块：用刀片刮取样本放到1.5ml的EP管中，20000g离心3min待提取)；使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit(50)，严格按照产品说明书操作。提取的终产物DNA溶液体积控制在30μL。(2)白细胞DNA提取：将全血样本按照1600g离心10分钟，吸取上清，吸取约1ml白膜层备用；上清样本再经过16000g离心10分钟取上层血浆，弃沉淀。采用100μL样本提取DNA，使用DNeasy Blood&Tissue Kit，严格按照产品说明书操作，提取的终产物DNA溶液体积在200μL。(3)预文库构建：文库的构建需要提取的终产物DNA溶液17.5μL，进行末端修复，使用末端修复的PCR产物，进行接头连接，构建预文库。连接后使用AMPure XP beads进行纯化，使用80％的乙醇洗脱收集文库。(4)捕获：取500ng体积的预文库到1.5mL的低吸附离心管中，加入Human CotDNA浓缩至干燥状态。使用

Hybridization and Wash Kit相应成分对WES和457genepanel的探针进行预处理，使用DynaBeads^TM M-270Streptavidin进行捕获后进行扩增，后使用Ampure XP Beads进行纯化，并使用80％的乙醇洗脱收集终文库。(5)文库质控：使用KAPALibrary Quantification Kits进行实时荧光定量PCR检测，文库有效浓度≥5nM，判定合格；使用毛细管电泳或普通琼脂糖电泳对文库大小进行判定，文库主峰在230-450bp之间，且无明显Dimer峰，判定合格。(6)上机测序：使用NextSeq CN500测序平台进行双端150bp测序；单样本数据量平均为WES 500X，457gene panel 2000X，654gene panel 2000X。

测序数据进行质控，比对：使用Fastq软件对测序下机数据进行数据过滤，包括减去测序接头序列，去除测序读长小于50bp的DNA片段，去除测序质量较低的DNA片段；使用BWA将过滤后的数据与Hg19参考基因组进行比对。

基于对比数据，获取以下分子标志物的数据。

(1)HLA基因型。HLA基因型全杂合的患者接受免疫治疗的预后更好。

(2)肿瘤突变负荷(TMB)：在WES的数据中，TMB＝错义突变的数目/WES的测序范围长度；在457gene panel和654gene panel中，本发明采用TMBd作为457/654gene panel的TMB结果。

TMBd＝(错义突变的数目+同义突变的数目-热点突变的数目)/457(654)genepanel的测序范围长度。

(3)PD-L1蛋白表达：将PD-L1免疫组化检测结果筛选不同治疗方式疗效和预后的相关分子标志物。

(4)体细胞突变(somatic mutations)和拷贝数变异(copy number variation,CNV)：使用Mutect2和mutloc分别挖掘WES,457gene panel和654gene panel中的体细胞突变，使用CNVkit挖掘拷贝数变异。针对得到的体细胞突变和拷贝数变异结果文件，根据FDA和NCCN等数据库对样本中的体细胞突变和拷贝数变异进行注释，保留注释水平为Level1-4，即被认为是有较强的证据表明其临床意义的体细胞变异以用作T-Index的构建。

(5)肿瘤新抗原负荷(TNB)：根据体细胞突变产生的多肽与HLA的亲和力预测新抗原，TNB＝肿瘤新抗原数目/WES的测序范围长度。

(6)杂合性缺失(LOH)：从两个层面(两个指标)对患者的LOH进行评估，其一，发生LOH的区域占整个基因组的比例(％Genome of LOH region)；其二，发生在LOH区域的基因突变的数目(Number of mutations in LOH region)。需要说明的是，两个指标均参与预后分析，哪个指标显著，则使用哪个指标，后续的瘤内异质性和基因组不稳定性也是如此。

(7)瘤内异质性(ITH)：利用四个指标评估了每个样本的瘤内异质性高低，其一，等位基因突变的肿瘤异质性(mutant-allele tumor heterogeneity,MATH)评估每个基因突变的最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)偏离该样本的MAF整体分布的程度，偏离程度越高，MATH越高，瘤内异质性越高。本发明在此基础上，评估了每个基因突变的癌细胞分数(cancer cell fraction,CCF)偏离样本CCF整体分布的程度，MATH＝100*(median(|CCFi-median(CCF)|)/median(CCF))；其二，晚期突变比例(percentage of LateMutaions,pLM)，pLM＝亚克隆突变的数目/所有突变的数目；其三，克隆的数目(No.ofClones)，使用Pyclone对每个样本中的突变进行聚类，每一类归为一种克隆，克隆的数目越多，异质性越高；其四，在No.of Clones的基础上，计算一个样本中的香农-维纳多样性指数(Shannon's Diversity Index,SI)，SI＝∑(Pi)(lnPi)，Pi为每种克隆的CCF，SI越高，瘤内异质性越高。

(8)基因组不稳定性：利用两个指标评估了在基因组水平的不稳定性，其一，肿瘤细胞中包含的染色体组数，称之为染色体倍性(Ploidy)；其二，全基因组加倍(wholegenome duplication,WGD)。

(9)根据以往的文献报道，筛选每个样本的免疫正相关基因(KRAS,TP53,BRCA1,ATM,BRCA2,MLH1,MSH6,MSH2,PBRM1,POLE,CHEK2,POLD1,PALB2,PMS2,ATR,FANCA,RAD50)，免疫负相关基因(EGFR,ALK,PTEN,CTNNB1,STK11,JAK2,JAK1,MAPK1,APC,B2M)以及免疫超进展基因(DNMT3A,MDM2,MDM4)作为第三分子标志物，参与T-index的计算。

此外，457gene panel和654gene panel的检测信息如下。

457gene panel的panel大小为1.2M，检测范围：457个基因(7个融合基因，97个遗传基因，22个CNV基因的检测)，457个基因具体包括：TNFRSF18、FH、CD86、FGFR4、GATA4、WT1、DIS3、CDK12、POLD1、TNFRSF4、AKT3、GATA2、NSD1、EGR3、MAPK8IP1、FGF14、ERBB2、PPP2R1A、TNFRSF14、MYCN、NEK11、FLT4、PPP2R2A、VEGFB、ERCC5、RARA、PCNA、RPL22、DNMT3A、EPHB1、IRF4、ZNF703、MEN1、IRS2、STAT3、FOXA2、ERRFI1、ALK、PIK3CB、HIST1H1C、WHSC1L1、CCND1、CUL4A、BRCA1、BCL2L1、PIK3CD、PIGF、FOXL2、HIST1H2BD、FGFR1、FGF19、PARP2、SPOP、ASXL1、MTOR、EPCAM、ATR、DDR1、SOX17、FGF4、AJUBA、VEZF1、SRC、SPEN、MSH2、TIPARP、TNF、LYN、FGF3、BCL2L2、RNF43、TOP1、EPHA2、MSH6、MECOM、NOTCH4、NBN、EMSY、NFKBIA、RAD51C、PTPRT、SDHB、FANCL、PRKCI、DAXX、RAD21、EED、NKX2-1、PPM1D、SPATA2、ID3、REL、TBL1XR1、CDKN1A、MYC、MRE11A、FOXA1、BRIP1、TSHZ2、ARID1A、XPO1、PIK3CA、PIM1、EPPK1、ATM、FANCM、CD79B、ZNF217、RPA2、PCBP1、SOX2、CCND3、RECQL4、SDHD、RAD51B、GNA13、AURKA、LCK、MERTK、KLHL6、VEGFA、JAK2、KMT2A、MLH3、AXIN2、GNAS、HDAC1、ERCC3、MAP3K13、NT5E、CD274、CBL、TSHR、PRKAR1A、PTK6、CSF3R、CXCR4、EIF4A2、PRDM1、PDCD1LG2、ARHGEF12、DICER1、SOX9、ARFRP1、MYCL、ACVR2A、BCL6、FOXO3、PTPRD、CHEK1、AKT1、RPTOR、BAGE、MPL、PDK1、FGF12、HDAC2、MTAP、KDM5A、GREM1、GATA6、RUNX1、MUTYH、NFE2L2、CRIPAK、FRK、CDKN2A、RAD52、RAD51、SETBP1、ERG、RAD54L、PMS1、FGFR3、ROS1、CDKN2B、CCND2、LTK、SMAD2、U2AF1、MKNK1、SF3B1、WHSC1、PTPRK、TEK、FGF23、TYRO3、SMAD4、SIK1、CDKN2C、CASP8、CD38、SGK1、FANCG、FGF6、B2M、BCL2、ICOSLG、JUN、CD28、PHOX2B、TNFAIP3、PAX5、LAG3、MAP2K1、STK11、CRKL、JAK1、CTLA4、PDGFRA、ESR1、GNAQ、CD69、CD276、DOT1L、MAPK1、FUBP1、ICOS、KIT、PARK2、NTRK2、CDKN1B、SIN3A、GNA11、SMARCB1、RPL5、IDH1、KDR、QKI、SYK、PTPRO、NTRK3、MAP2K2、CHEK2、NRAS、ERBB4、TET2、CARD11、FANCC、PIK3C2G、IDH2、CD70、NF2、VTCN1、BARD1、LEF1、PMS2、PTCH1、RECQL、BLM、TNFSF14、EP300、FAM46C、CUL3、INPP4B、RAC1、GALNT12、KRAS、IGF1R、INSR、MAPK11、HSD3B1、PDCD1、FBXW7、RPA3、TLR4、H3F3C、AXIN1、KEAP1、P2RY8、NOTCH2、VHL、IRF2、ETV1、ABL1、LRRK2、TSC2、SMARCA4、BCOR、CD160、PPARG、SDHA、NFE2L3、TSC1、ARID2、CREBBP、CALR、USP9X、MCL1、RAF1、IL7R、IKZF1、NOTCH1、KMT2D、SOCS1、NOTCH3、KDM6A、NTRK1、EOMES、LIFR、EGFR、GATA3、ACVR1B、ERCC4、BRD4、RBM10、CD48、TGFBR2、RICTOR、LIMK1、RET、ERBB3、PALB2、JAK3、ARAF、SLAMF7、MLH1、FGF10、HGF、NCOA4、CDK4、CBFB、PIK3R2、GATA1、CD244、MYD88、MAP3K1、GRM3、ARID5B、MDM2、CTCF、MEF2B、HDAC6、B4GALT3、CTNNB1、PIK3R1、CDK6、TET1、NAV3、CDH1、CCNE1、GAGE1、SDHC、SETD2、MSH3、EPHB4、PRF1、KITLG、MAF、TSHZ3、KDM5C、DDR2、MST1R、APC、PIK3CG、BMPR1A、BTG1、FANCA、CEBPA、SMC1A、TNFSF18、PARP3、SNCAIP、MET、PTEN、PTPN11、RPA1、CD22、AMER1、TNFSF4、BAP1、RAD50、SMO、FAS、TBX3、TP53、KMT2B、AR、CDC73、PBRM1、CTNNA1、BRAF、SUFU、HNF1A、ALOX12B、AKT2、MED12、ELF3、MITF、HDAC3、TAS2R38、CYP17A1、POLE、AURKB、PRX、TAF1、BTG2、FOXP1、CSF1R、EPHB6、NT5C2、CDK8、MAP2K4、AXL、ATRX、PIK3C2B、EPHA3、PDGFRB、KEL、SMC3、FLT3、NCOR1、TGFB1、BTK、MDM4、BTLA、HAVCR2、EPHA1、FGFR2、FLT1、FLCN、CD79A、STAG2、IKBKE、CD80、ITK、EZH2、MGMT、BRCA2、GID4、CIC、SH2D1A、H3F3A、GSK3B、GABRA6、KMT2C、HRAS、TNFSF11、NF1、ERCC2、BCORL1、PARP1、POLQ、NPM1、XRCC2、IGF2、RB1、RAD51D、ARHGAP35、PHF6、MAGEC2、MAGEA4、MAGEA12、MAGEA3、MAGEA1、CTAG2、NRG1。

654gene panel的panel大小为3M；检测范围：a.638致瘤相关基因编码区域全覆盖(1.6Mb+编码区覆盖)；b.500Kb+基因融合高发区域覆盖(42个基因融合致瘤的基因)；c.102肿瘤遗传风险相关基因；d.HLA区域覆盖(HLA分型，肿瘤新抗原)；e.200个微卫星不稳定MSI信息相关区域(200个短重复位点辅助MSI检测)；f.～3900个基因组上均匀分布的SNP位点覆盖。检测的基因具体包括：ABL1、CCND2、EP300、GNB1、KLF5、NOTCH3、RAD21、STAT3、ABRAXAS1、CCND3、EP400、GPS2、KLHL6、NOTCH4、RAD50、STAT5B、ACTG1、CCNE1、EPAS1、GREM1、KMT2A、NPM1、RAD51、STK11、ACVR1、CCNQ、EPCAM、GRIN2A、KMT2B、NRAS、RAD51B、SUFU、ACVR1B、CD160、EPHA1、GRM3、KMT2C、NRG1、RAD51C、SUZ12、ACVR2A、CD22、EPHA2、GSK3B、KMT2D、NSD1、RAD51D、SYK、ACVRL1、CD244、EPHA3、GSTM1、KNSTRN、NSD2、RAD52、TAF1、AGO2、CD274、EPHA7、GSTP1、KRAS、NSD3、RAD54B、TAS2R38、AJUBA、CD276、EPHB1、GTF2I、LAG3、NT5C2、RAD54L、TBL1XR1、AKT1、CD28、EPHB4、H3F3A、LATS1、NT5E、RAF1、TBX3、AKT2、CD38、EPHB6、H3F3C、LATS2、NTHL1、RARA、TCF3、AKT3、CD44、EPPK1、HAVCR2、LCK、NTRK1、RASA1、TCF7L2、ALK、CD48、ERBB2、HDAC1、LEF1、NTRK2、RB1、TEK、ALOX12B、CD58、ERBB3、HDAC2、LIFR、NTRK3、RBM10、TENT5C、AMER1、CD69、ERBB4、HDAC3、LIMK1、NUP93、RECQL、TERT、ANKRD11、CD70、ERCC1、HDAC4、LRRK2、P2RY8、RECQL4、TET1、APC、CD79A、ERCC2、HDAC6、LTK、PAK1、REL、TET2、APEX1、CD79B、ERCC3、HGF、LYN、PAK5、RELN、TGFB1、AR、CD80、ERCC4、HIST1H1B、MAF、PALB2、RET、TGFBR1、ARAF、CD86、ERCC5、HIST1H1C、MAGEA1、PARP1、RHEB、TGFBR2、ARFRP1、CDC73、ERF、HIST1H1D、MAGEA12、PARP2、RHOA、TIAF1、ARHGAP35、CDH1、ERG、HIST1H2BD、MAGEA3、PARP3、RICTOR、TIPARP、ARHGEF12、CDK12、ERRFI1、HLA-A、MAGEA4、PAX5、RIT1、TLR4、ARID1A、CDK4、ESCO2、HLA-B、MAGEC2、PBRM1、RNF43、TMEM127、ARID1B、CDK6、ESR1、HLA-C、MAGOH、PCBP1、ROBO 1、TMPRSS2、ARID2、CDK8、ETNK1、HLA-DMA、MALT1、PCNA、ROS 1、TNF、ARID3A、CDKN1A、ETV1、HLA-DMB、MAP2K1、PDCD1、RPA1、TNFAIP3、ARID4A、CDKN1B、ETV6、HLA-DOA、MAP2K2、PDCD1LG2、RPA2、TNFRSF14、ARID4B、CDKN2A、EWSR1、HLA-DOB、MAP2K4、PDGFRA、RPA3、TNFRSF18、ARID5B、CDKN2B、EZH1、HLA-DPA1、MAP3K1、PDGFRB、RPL22、TNFRSF4、ASXL1、CDKN2C、EZH2、HLA-DPB1、MAP3K13、PDK1、RPL5、TNFSF11、ASXL2、CEBPA、FANCA、HLA-DQA1、MAPK1、PHF6、RPS6KB1、TNFSF14、ATM、CFTR、FANCC、HLA-DQA2、MAPK11、PHOX2B、RPTOR、TNFSF18、ATP11B、CHEK1、FANCD2、HLA-DQB1、MAPK3、PIGA、RRAS2、TNFSF4、ATP6AP1、CHEK2、FANCG、HLA-DQB2、MAPK8IP1、PIGF、RTEL1、TOP1、ATP6V1B2、CIC、FANCI、HLA-DRA、MAX、PIK3C2B、RUNX1、TP53、ATR、CIITA、FANCL、HLA-DRB1、MCL1、PIK3C2G、RXRA、TP53BP1、ATRX、COP1、FANCM、HLA-DRB5、MDC1、PIK3CA、RYBP、TP63、ATXN2、CRBN、FAS、HLA-E、MDM2、PIK3CB、SAMHD1、TSC1、AURKA、CREBBP、FAT1、HLA-F、MDM4、PIK3CD、SDHA、TSC2、AURKB、CRKL、FBXO11、HLA-G、MED12、PIK3CG、SDHAF2、TSHR、AXIN1、CRLF2、FBXW7、HNF1A、MEF2B、PIK3R1、SDHB、TSHZ2、AXIN2、CSF1R、FGF10、HOXB13、MEN1、PIK3R2、SDHC、TSHZ3、AXL、CSF3R、FGF12、HRAS、MERTK、PIK3R3、SDHD、TYK2、B2M、CSNK2A1、FGF14、HSD3B1、MET、PIM1、SESN1、TYRO3、B4GALT3、CTAG2、FGF19、ICOS、MGA、PLCG1、SESN2、U2AF1、BACH2、CTCF、FGF23、ICOSLG、MGMT、PLCG2、SESN3、USP9X、BAGE、CTLA4、FGF3、ID3、MITF、PLK1、SETBP1、VAV1、BAP1、CTNNA1、FGF4、IDH1、MKNK1、PMAIP1、SETD2、VEGFA、BARD1、CTNNB1、FGF6、IDH2、MLH1、PMS1、SETD3、VEGFB、BBC3、CUL3、FGFR1、IFITM1、MLH3、PMS2、SF3B1、VEZF1、BCL10、CUL4A、FGFR2、IFITM3、MPL、PNP、SGK1、VHL、BCL11B、CUX1、FGFR3、IGF1R、MRE11、POLD1、SH2B3、VTCN1、BCL2、CXCR4、FGFR4、IGF2、MSH2、POLE、SH2D1A、WT1、BCL2L1、CYLD、FH、IKBKE、MSH3、POLQ、SHOC2、XPO1、BCL2L11、CYP17A1、FLCN、IKZF1、MSH6、POT1、SHQ1、XRCC1、BCL2L2、CYP2D6、FLT1、IKZF3、MST1R、PPARG、SIK1、XRCC2、BCL6、CYSLTR2、FLT3、IL6、MTAP、PPM1D、SIN3A、YAP1、BCL9、DAXX、FLT4、IL7R、MTOR、PPP2R1A、SLAMF7、ZFHX3、BCOR、DCUN1D1、FOXA1、INHA、MUC16、PPP2R2A、SLX4、ZNF217、BCORL1、DDR1、FOXA2、INPP4B、MUTYH、PPP6C、SMAD2、ZNF703、BCR、DDR2、FOXL2、INPPL1、MYC、PRDM1、SMAD3、ZRSR2、BIRC2、DDX3X、FOXO1、INSR、MYCL、PRF1、SMAD4、CD74、BIRC3、DICER1、FOXO3、IRF1、MYCN、PRKAR1A、SMARCA4、CLTC、BLM、DIS3、FOXP1、IRF2、MYD88、PRKCI、SMARCB1、EML4、BMPR1A、DNAJB1、FRK、IRF4、MYO18A、PRKN、SMC1A、ETV4、BRAF、DNMT3A、FUBP1、IRF8、MYOD1、PRSS1、SMC3、ETV5、BRCA1、DNMT3B、GABRA6、IRS2、NAV3、PRX、SMO、EZR、BRCA2、DOT1L、GAGE1、ITK、NBN、PTCH1、SNCAIP、KIF5B、BRD4、DTX1、GALNT12、JAK1、NCOA4、PTEN、SOCS1、MYB、BRIP1、DUSP22、GAS6、JAK2、NCOR1、PTK6、SOS1、NUTM1、BTG1、DUSP4、GATA1、JAK3、NEK11、PTPN1、SOX17、PAX8、BTG2、ECT2L、GATA2、JUN、NF1、PTPN11、SOX2、RSPO2、BTK、EED、GATA3、KDM5A、NF2、PTPN2、SOX9、SLC3A2、BTLA、EGFR、GATA4、KDM5C、NFE2L2、PTPRD、SPATA2、SDC4、CALR、EGR1、GATA6、KDM6A、NFE2L3、PTPRK、SPEN、SLC34A2、CARD11、EGR3、GID4、KDR、NFKBIA、PTPRO、SPINK1、TPM3、CARM1、EIF1AX、GLI1、KEAP1、NKX2-1、PTPRS、SPOP、VAMP2、CASP8、EIF4A2、GNA11、KEL、NKX2-8、PTPRT、SPRED1、PRKACA、CBFB、ELF3、GNA13、KIT、NKX3-1、QKI、SRC、TERC、CBL、EMSY、GNAQ、KITLG、NOTCH1、RAB35、SRSF2、CCND1、EOMES、GNAS、KLF4、NOTCH2、RAC1、STAG2。

由于457gene panel测序范围不覆盖HLA位点，且在基因组上分布严重不均匀，因此，缺失TNB指标，HLA基因型，LOH指标和基因组不稳定性指标。而654gene panel的测序范围覆盖用于构建T-index所需的数据。

用于构建T-index的分子标志物包括第一标志物、第二标志物和第三标志物。第一标志物包括上述(1)-(3)所述的标志物：肿瘤突变负荷、HLA基因型和PD-L1蛋白表达。第三标志物包括(9)所述的分子标志物。

第二标志物的获取方式为：把第一批样本根据治疗方式分为免疫治疗组、靶向治疗组和化疗组，根据客观缓解率(objective response rate,ORR)和无进展生存期(progress-free survival,PFS)筛选上述基因组特征中分别与三种治疗方式临床疗效和预后显著相关的分子标志物，并将与治疗方式的疗效和预后显著相关的基因组特征标记为第二标志物。

本实施例中，根据治疗方式把第一批样本分为免疫治疗(32例)、靶向治疗(83例)和化疗(45例)对于全外显子组测序数据中挖掘的分子标志物进行疗效和预后相关分子标志物的筛选，选择与疗效和预后相关的分子标志物。对于筛选得到的特征和文章报道的特征进行综合匹配得分，在全外显子组测序数据和457gene panel测序数据中计算每个样本的T-index，对样本的疗效和预后进行预测。并同时把第二批样本分为免疫治疗(64例)，靶向治疗(129例)和化疗(94例)，根据在第一批样本中建立的T-index计算规则计算T-index，验证其对于临床预后的预测效力。

在临床治疗中，之前是否接受过其他治疗对患者的ORR和PFS有很大的影响，因此，本实施例进一步把不同治疗方式中的患者根据初治/复治分为两组后，分别去筛选疗效和预后相关分子标志物。

针对不同的治疗方式(免疫治疗、靶向治疗或化疗)，列出与该种治疗方式相关的分子标志物(第一标志物、第二标志物和第三标志物)参与T-index的计算。

在每一个患者中，统计分子标志物状态(高/低，有/无)对疗效和预后有益的分子标志物数目作为分子，参与该种临床治疗(免疫/靶向/化疗)T-index计算的所有分子标志物作为分母，该比例即为T-index；范围为0-1。本发明实施例使用最小P值法，根据ORR划定T-index阈值，将样本分为高低两组(图3)。

在第一批样本中，除了WES的测序数据挖掘到的各个分子标志物外，还有457genepanel的测序数据挖掘到的分子标志物。但是局限于457gene panel的测序范围和在基因组分布上的不均衡，TNB，LOH，ITH和HLA等指标无法计算。根据同样的计算方式，忽略在457gene panel中无法计算的分子标志物，同样计算每一位患者的T-index，并且根据ORR使用最小P值法将样本分为T-index高低两类(图3)。

本发明实施例对第二批样本进行654gene panel测序，涉及的DNA提取，捕获及测序同上。本发明从654gene panel的测序数据中挖掘计算T-index所需的分子标志物，计算每一个样本的T-index，根据ORR使用最小P值法将样本分为T-index高低两类(图3)。

本发明把WES中计算的T-index与457gene panel计算的T-index对临床疗效和预后的预测结果评价指标AUC和c-index的箱线图(box-plot)绘制到同一坐标中，并且将第二批样本中654gene panel计算的T-index对临床疗效和预后的预测结果评价指标AUC和c-index绘制到同一坐标中，以直观地鉴别预测效能差异。同时，在接受免疫治疗的样本中，将WES中计算的T-index和单个分子标志物对临床疗效和预后的预测结果评价指标AUC和c-index的箱线图绘制到同一坐标中，AUC和c-index最高的指标的预测效力最高。

目前现有的研究多使用单个指标对临床疗效和预后进行预测，例如TMB之于免疫治疗，PD-L1之于免疫治疗，驱动基因EGFR/ALK/ROS1等之于靶向治疗，很少全面地综合考虑多个指标进行联合预测。本发明从多个方面对数据进行挖掘，筛选疗效/预后相关的分子标志物，建立了一种新的二代测序数据进行预测临床疗效和预后的方法，并且指出预测性能比较的方法(AUC和c-index)。对不同的治疗方式，针对涉及基因组改变各方面的分子标志物进行临床疗效和预后是否相关的筛选，在WES测序数据和457gene panel测序数据中，计算每个患者中多个指标的状态(包括高低、有无等)与其治疗方式的匹配度，建立T-index，最后使用专门设计的测序范围广，在基因组上均匀分布的654gene panel验证T-index对临床疗效和预后的预测性能。

实施例2

针对第一批样本进行WES和457gene panel靶向测序，对第二批样本进行654genepanel靶向测序。457gene panel和654gene panel同实施例1。

采用WES和457gene panel的数据分别计算(同实施例1)获得对应的T-index，并将两者的预测结果绘制成AUC和c-index的箱线图进行比较，同时，将第二批样本中654genepanel的数据计算的T-Index绘制在同一坐标系进行比较。

结果如图4所示，将样本根据指标方式分为化疗组(cytotoxic chemotherapy,CCT)和非化疗组(靶向治疗targeted therapy,TT；和免疫治疗immune checkpointinhibitors,ICIs)，WES T-index的AUC和c-index显著高于457gene panel T-index的AUC和c-index(AUC:P＝1.78e-12；c-index:P＝1.00e-24)，说明在WES中联合使用更多分子标志物综合评估的T-index对临床疗效和预后的预测效果更好。同样，在使用重新设计并优化的654gene panel进行测序的验证集数据中，AUC也显著高于457gene panel(P＝4.80e-34)，但是c-index差别不显著(P＝0.152)，可能是因为第二批样本的随访时间不够，部分样本未达到临床终点。该结果证实在临床上，使用成本更低、测序深度更深的654gene panel测序数据计算的T-index，同样可以达到WES的预测效果(P＝1.78e-12)，有效地降低了临床成本。

实施例3

本实施例在接受免疫治疗的样本中，使用WES的数据计算的多分子标志物综合匹配得分的指标T-index与多次报道与免疫治疗疗效和预后相关的分子标志物(TMB,TNB,PD-L1和HLA genotype)的预测结果绘制AUC和c-index的箱线图，比较各指标对免疫治疗临床疗效和预后的预测效力。

如图5所示，T-index的AUC和c-index都显著高于各个单分子指标，从结果中可以看出，多分子标志物综合匹配后的T-index指标的疗效和预后预测效力明显优于各个单分子，进一步突出了本发明的方法对疗效和预后预测效力的提升。

本发明提供了一种多分子指标整合预测疗效和预后的新思路，通过本发明的方法对疗效和预后的预测效力要优于单分子的预测效力，在第二批样本的654gene panel的测序数据中验证了本发明的有效性，大幅度降低了临床应用上的测序成本。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于预测癌症疗效和预后的装置，其特征在于，其包括：

获取模块，用于获取待测样本分子标志物的检测数据；所述分子标志物包括第一标志物和第二标志物；所述第一标志物包括肿瘤突变负荷、HLA基因型和PD-L1蛋白表达；所述第二标志物的获取方式为：针对不同的治疗方式，根据客观缓解率和无进展生存期，对基因组特征进行筛选，将与治疗方式的疗效和预后显著相关的基因组特征标记为第二标志物；所述基因组特征包括：体细胞突变、拷贝数变异、肿瘤新抗原负荷、杂合性缺失、瘤内异质性和基因组不稳定性中的至少一种；

计算模块，用于通过待测样本分子标志物的检测数据，计算T-index，T-index＝分子标志物状态为对疗效和预后有益的分子标志物的数量/分子标志物的总数。

2.根据权利要求1所述的用于预测癌症疗效和预后的装置，其特征在于，所述肿瘤突变负荷的计算公式选自TMBa、TMBb、TMBc和TMBd中的任意一种：

TMBa＝错义突变的数目/测序范围的长度；

TMBb＝(错义突变的数目+同义突变的数目)/测序范围长度；

TMBc＝(错义突变的数目-同义突变的数目)/测序范围长度；

TMBd＝(错义突变的数目+同义突变的数目-热点突变的数目)/测序范围长度。

3.根据权利要求1所述的用于预测癌症疗效和预后的装置，其特征在于，所述肿瘤新抗原负荷＝肿瘤新抗原数目/测序范围长度；

优选地，所述杂合性缺失的检测指标包括：发生LOH的区域占整个基因组的比例；和/或，发生在LOH区域的基因突变的数目；

优选地，所述瘤内异质性的检测指标包括(a)～(d)中的至少一种：

(a)等位基因突变的肿瘤异质性MATH；

(b)晚期突变比例pLM；

(c)克隆的数目；所述克隆为：对每个样本中的突变进行聚类，每一类归为一种克隆；

(d)样本中的香农-维纳多样性指数(Shannon's Diversity Index,SI)，SI＝∑(Pi)(lnPi)，Pi为每种克隆的CCF；

优选地，所述基因组不稳定性的检测指标包括：肿瘤细胞中包含的染色体组数和/或全基因组加倍。

4.根据权利要求1～3任一项所述的用于预测癌症疗效和预后的装置，其特征在于，所述分子标志物还包括第三标志物，所述第三标志物为现有被报道过的与癌症的疗效和预后相关的分子标志物。

5.根据权利要求1～3任一项所述的用于预测癌症疗效和预后的装置，其特征在于，所述治疗方式选自：免疫治疗、靶向治疗和化疗中的至少一种；

优选地，所述治疗方式为初治或复治；

优选地，所述癌症为肺癌，更优选为非小细胞肺癌。

6.一种用于预测癌症疗效和预后的试剂盒，其特征在于，其包括用于检测分子标志物的试剂，所述分子标志物为如权利要求1～5任一项所述的分子标志物；

优选地，所述试剂为检测panel，所述检测panel包括用于检测靶基因中至少300种基因的试剂，所述靶基因包括：ABL1、CCND2、EP300、GNB1、KLF5、NOTCH3、RAD21、STAT3、ABRAXAS1、CCND3、EP400、GPS2、KLHL6、NOTCH4、RAD50、STAT5B、ACTG1、CCNE1、EPAS1、GREM1、KMT2A、NPM1、RAD51、STK11、ACVR1、CCNQ、EPCAM、GRIN2A、KMT2B、NRAS、RAD51B、SUFU、ACVR1B、CD160、EPHA1、GRM3、KMT2C、NRG1、RAD51C、SUZ12、ACVR2A、CD22、EPHA2、GSK3B、KMT2D、NSD1、RAD51D、SYK、ACVRL1、CD244、EPHA3、GSTM1、KNSTRN、NSD2、RAD52、TAF1、AGO2、CD274、EPHA7、GSTP1、KRAS、NSD3、RAD54B、TAS2R38、AJUBA、CD276、EPHB1、GTF2I、LAG3、NT5C2、RAD54L、TBL1XR1、AKT1、CD28、EPHB4、H3F3A、LATS 1、NT5E、RAF1、TBX3、AKT2、CD38、EPHB6、H3F3C、LATS2、NTHL1、RARA、TCF3、AKT3、CD44、EPPK1、HAVCR2、LCK、NTRK1、RASA1、TCF7L2、ALK、CD48、ERBB2、HDAC1、LEF1、NTRK2、RB1、TEK、ALOX12B、CD58、ERBB3、HDAC2、LIFR、NTRK3、RBM10、TENT5C、AMER1、CD69、ERBB4、HDAC3、LIMK1、NUP93、RECQL、TERT、ANKRD11、CD70、ERCC1、HDAC4、LRRK2、P2RY8、RECQL4、TET1、APC、CD79A、ERCC2、HDAC6、LTK、PAK1、REL、TET2、APEX1、CD79B、ERCC3、HGF、LYN、PAK5、RELN、TGFB1、AR、CD80、ERCC4、HIST1H1B、MAF、PALB2、RET、TGFBR1、ARAF、CD86、ERCC5、HIST1H1C、MAGEA1、PARP1、RHEB、TGFBR2、ARFRP1、CDC73、ERF、HIST1H1D、MAGEA12、PARP2、RHOA、TIAF1、ARHGAP35、CDH1、ERG、HIST1H2BD、MAGEA3、PARP3、RICTOR、TIPARP、ARHGEF12、CDK12、ERRFI1、HLA-A、MAGEA4、PAX5、RIT1、TLR4、ARID1A、CDK4、ESCO2、HLA-B、MAGEC2、PBRM1、RNF43、TMEM127、ARID1B、CDK6、ESR1、HLA-C、MAGOH、PCBP 1、ROBO1、TMPRSS2、ARID2、CDK8、ETNK1、HLA-DMA、MALT1、PCNA、ROS1、TNF、ARID3A、CDKN1A、ETV1、HLA-DMB、MAP2K1、PDCD1、RPA1、TNFAIP3、ARID4A、CDKN1B、ETV6、HLA-DOA、MAP2K2、PDCD1LG2、RPA2、TNFRSF14、ARID4B、CDKN2A、EWSR1、HLA-DOB、MAP2K4、PDGFRA、RPA3、TNFRSF18、ARID5B、CDKN2B、EZH1、HLA-DPA1、MAP3K1、PDGFRB、RPL22、TNFRSF4、ASXL1、CDKN2C、EZH2、HLA-DPB1、MAP3K13、PDK1、RPL5、TNFSF11、ASXL2、CEBPA、FANCA、HLA-DQA1、MAPK1、PHF6、RPS6KB1、TNFSF14、ATM、CFTR、FANCC、HLA-DQA2、MAPK11、PHOX2B、RPTOR、TNFSF18、ATP11B、CHEK1、FANCD2、HLA-DQB1、MAPK3、PIGA、RRAS2、TNFSF4、ATP6AP1、CHEK2、FANCG、HLA-DQB2、MAPK8IP1、PIGF、RTEL1、TOP1、ATP6V1B2、CIC、FANCI、HLA-DRA、MAX、PIK3C2B、RUNX1、TP53、ATR、CIITA、FANCL、HLA-DRB1、MCL1、PIK3C2G、RXRA、TP53BP1、ATRX、COP1、FANCM、HLA-DRB5、MDC1、PIK3CA、RYBP、TP63、ATXN2、CRBN、FAS、HLA-E、MDM2、PIK3CB、SAMHD1、TSC1、AURKA、CREBBP、FAT1、HLA-F、MDM4、PIK3CD、SDHA、TSC2、AURKB、CRKL、FBXO11、HLA-G、MED12、PIK3CG、SDHAF2、TSHR、AXIN1、CRLF2、FBXW7、HNF1A、MEF2B、PIK3R1、SDHB、TSHZ2、AXIN2、CSF1R、FGF10、HOXB13、MEN1、PIK3R2、SDHC、TSHZ3、AXL、CSF3R、FGF12、HRAS、MERTK、PIK3R3、SDHD、TYK2、B2M、CSNK2A1、FGF14、HSD3B1、MET、PIM1、SESN1、TYRO3、B4GALT3、CTAG2、FGF19、ICOS、MGA、PLCG1、SESN2、U2AF1、BACH2、CTCF、FGF23、ICOSLG、MGMT、PLCG2、SESN3、USP9X、BAGE、CTLA4、FGF3、ID3、MITF、PLK1、SETBP1、VAV1、BAP1、CTNNA1、FGF4、IDH1、MKNK1、PMAIP1、SETD2、VEGFA、BARD1、CTNNB1、FGF6、IDH2、MLH1、PMS1、SETD3、VEGFB、BBC3、CUL3、FGFR1、IFITM1、MLH3、PMS2、SF3B1、VEZF1、BCL10、CUL4A、FGFR2、IFITM3、MPL、PNP、SGK1、VHL、BCL11B、CUX1、FGFR3、IGF1R、MRE11、POLD1、SH2B3、VTCN1、BCL2、CXCR4、FGFR4、IGF2、MSH2、POLE、SH2D1A、WT1、BCL2L1、CYLD、FH、IKBKE、MSH3、POLQ、SHOC2、XPO1、BCL2L11、CYP17A1、FLCN、IKZF1、MSH6、POT1、SHQ1、XRCC1、BCL2L2、CYP2D6、FLT1、IKZF3、MST1R、PPARG、SIK1、XRCC2、BCL6、CYSLTR2、FLT3、IL6、MTAP、PPM1D、SIN3A、YAP1、BCL9、DAXX、FLT4、IL7R、MTOR、PPP2R1A、SLAMF7、ZFHX3、BCOR、DCUN1D1、FOXA1、INHA、MUC16、PPP2R2A、SLX4、ZNF217、BCORL1、DDR1、FOXA2、INPP4B、MUTYH、PPP6C、SMAD2、ZNF703、BCR、DDR2、FOXL2、INPPL1、MYC、PRDM1、SMAD3、ZRSR2、BIRC2、DDX3X、FOXO1、INSR、MYCL、PRF1、SMAD4、CD74、BIRC3、DICER1、FOXO3、IRF1、MYCN、PRKAR1A、SMARCA4、CLTC、BLM、DIS3、FOXP1、IRF2、MYD88、PRKCI、SMARCB1、EML4、BMPR1A、DNAJB1、FRK、IRF4、MYO18A、PRKN、SMC1A、ETV4、BRAF、DNMT3A、FUBP1、IRF8、MYOD1、PRSS1、SMC3、ETV5、BRCA1、DNMT3B、GABRA6、IRS2、NAV3、PRX、SMO、EZR、BRCA2、DOT1L、GAGE1、ITK、NBN、PTCH1、SNCAIP、KIF5B、BRD4、DTX1、GALNT12、JAK1、NCOA4、PTEN、SOCS1、MYB、BRIP1、DUSP22、GAS6、JAK2、NCOR1、PTK6、SOS1、NUTM1、BTG1、DUSP4、GATA1、JAK3、NEK11、PTPN1、SOX17、PAX8、BTG2、ECT2L、GATA2、JUN、NF1、PTPN11、SOX2、RSPO2、BTK、EED、GATA3、KDM5A、NF2、PTPN2、SOX9、SLC3A2、BTLA、EGFR、GATA4、KDM5C、NFE2L2、PTPRD、SPATA2、SDC4、CALR、EGR1、GATA6、KDM6A、NFE2L3、PTPRK、SPEN、SLC34A2、CARD11、EGR3、GID4、KDR、NFKBIA、PTPRO、SPINK1、TPM3、CARM1、EIF1AX、GLI1、KEAP1、NKX2-1、PTPRS、SPOP、VAMP2、CASP8、EIF4A2、GNA11、KEL、NKX2-8、PTPRT、SPRED1、PRKACA、CBFB、ELF3、GNA13、KIT、NKX3-1、QKI、SRC、TERC、CBL、EMSY、GNAQ、KITLG、NOTCH1、RAB35、SRSF2、CCND1、EOMES、GNAS、KLF4、NOTCH2、RAC1和STAG2；

优选地，所述检测panel包括检测靶标基因中的至少300种基因的试剂；

优选地，所述检测panel包括检测靶标基因中的至少457种基因的试剂。

7.检测分子标志物的试剂在制备用于预测癌症疗效和预后的试剂盒中的应用，其特征在于，所述分子标志物为如权利要求1～5任一项所述的分子标志物。

8.一种癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法，其特征在于，其包括：基于样本分子标志物的检测数据，计算T-index；T-index＝分子标志物状态为对疗效和预后有益的分子标志物的数量/分子标志物的总数；

所述分子标志物包括第一标志物和第二标志物；所述第一标志物包括肿瘤突变负荷、HLA基因型和PD-L1蛋白表达；所述第二标志物的获取方式为：针对特定的治疗方式，根据客观缓解率和无进展生存期，对基因组特征进行筛选，将与该治疗方式的疗效和预后显著相关的基因组特征标记为第二标志物；所述基因组特征包括：体细胞突变、拷贝数变异、肿瘤新抗原负荷、杂合性缺失、瘤内异质性和基因组不稳定性中的至少一种。

9.一种电子设备，其特征在于，其包括：处理器和存储器，所述存储器用于存储一个或多个程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现如权利要求8所述的癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法。

10.一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时实现如权利要求8所述的癌症疗效和预后的治疗指数的计算方法。

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