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CN114486645A - 细胞悬浮液样品成像方法和系统及试剂盒 - Google Patents

细胞悬浮液样品成像方法和系统及试剂盒 Download PDF

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CN114486645A
CN114486645A CN202011266918.2A CN202011266918A CN114486645A CN 114486645 A CN114486645 A CN 114486645A CN 202011266918 A CN202011266918 A CN 202011266918A CN 114486645 A CN114486645 A CN 114486645A
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particles
imaging
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CN202011266918.2A
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王志平
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Shenzhen Anlu Medical Technology Co ltd
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Shenzhen Anlu Medical Technology Co ltd
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Abstract

一种细胞悬浮液样品成像方法和系统中包括用于承载细胞悬浮液样品的载体；细胞悬浮液样品成像方法中，包括将包含细胞和参比粒子的细胞悬浮液样品引入到载体的承载面上的步骤；使所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在载体的承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层的步骤；获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像的步骤。基于参比粒子参与成像的显微图像，能提高图片质量，且参比粒子相关参数可参与成像的细胞悬浮液样品的定量计算，能简化细胞悬浮液样品分析中的细胞计数方法，提高计数准确性；能消除承载面以及系统对细胞计数结果的部分影响。

Description

细胞悬浮液样品成像方法和系统及试剂盒
技术领域
本申请属于细胞悬浮液样品成像方法及系统和装置领域；尤其涉及用于细胞悬浮液样品的细胞悬浮液样品成像方法、细胞悬浮液样品成像系统和试剂盒。
背景技术
生物体细胞悬浮液样品的细胞检测中，为区分细胞悬浮液样品或分泌物中的细胞种类、形态和状态，通常采用细胞染色技术来区分不同种类、不同形态、不同状态的细胞。
用于明场观察检测的常规细胞染色技术中，通常是将待检测样本涂抹在透明载体如载玻片上，等检测样本干燥后，再依次滴入具有不同染色效果的染液及缓冲液，混合均匀完成染色后，再冲洗掉影响观测的染液及缓冲液主体，再等待染色样本干燥后，完成整个染色过程，形成用于明场观测的染色后的样本涂片。
如图2所示，是现有技术中一个血涂片的制作过程示意图，由图可见其包括血涂片制作的步骤和血涂片染色的步骤。
血涂片制作的步骤中包括四个小步骤：分别是，步骤1.1：将血样滴加至载玻片上；步骤1.2：取另一载玻片，按30°～45°角倾斜，匀速向另一边推动；步骤1.3：血膜涂布均匀，呈“火焰”状为合格的涂片；步骤1.4：等待血膜干燥，并准备染色。
涂片染色的步骤中包括五个小步骤：分别是，步骤2.1：铅笔作标记，将血涂片平放在染色架上,蜡笔划线可防液体外溢；步骤2.2：血涂片自然干燥后，滴染液1～2滴覆盖血片,染约1分钟；步骤2.3：滴加稍多体积如2～4滴）的缓冲液，用洗耳球将其与染液吹匀,染约5分钟； 步骤2.4：慢慢摇动玻片，然后用细的自来水流从玻片的一侧冲去染液(注意，需要不要先倒去染液再冲水)，持续约1分钟；步骤2.5：终止冲洗，将血片自然干燥后或用滤纸吸干，即可用于镜检。
用于镜检的涂片上的细胞数量是通过人工在显微镜下进行观察和计数，观察效率极低。不光是在明场镜检的场景中，在一些荧光成像镜检的场景中，也存在明场检测类似的问题，观察和计数都效率低下。且在观察过程中，每次成像图片的放大倍数可能不同，对只能根据经验进行细胞分类和计数；无法对图像中的细胞尺寸进行精确的计算。
现有技术中，有利用染色后的细胞悬浮液样品进行细胞计数的场景中，其计数逻辑是通过引入可承载独立细胞的计数承载面网进行细胞计数；承载面网上与单个隔间尺寸相应的细胞才能被很好的承载展示，并用于细胞识别和计数。由于细胞的种类繁多，不同的细胞需要设计适应不同细胞尺寸的承载面网。且其计数的准确性更多依赖于计数板即形成观察层的承载面网的结构和加工精度，尤其是细胞平铺区或分布区域的体积，当加工精度不够时，误差很大，相应地细胞的识别和分类计数误差也大大增加。
迫切需要采用数字化手段进行图像的处理，对图像中的各种信息进行精确处理和分析；在现在智能算法快速发展的背景下，在图像中识别出单一的细胞或进行细胞计数是容易的，但要通过单幅照片获取原始样本中的细胞浓度却并比较困难；最关键的问题是单幅照片所对应的细胞悬浮液样品的量无法准确获取。而在本发明中，由于参比粒子的引入成像环节，可以通过参比粒子在照片中的分布和呈现情况，获取单幅照片对应的细胞悬浮液样品体积，并简化后续的计算逻辑，提升计算结果的准确性。
发明内容
本申请要解决的技术问题在于避免现有技术上述不足之处，提出了一种简单高效的细胞悬浮液样品成像方法和系统，能提供参比粒子和细胞共同参与成像的显微图像，简化计算逻辑，提升计算结果的准确性。
本发明解决上述技术问题的技术方案是一种细胞悬浮液样品成像方法，包括将包含细胞和参比粒子的细胞悬浮液样品引入到载体的承载面上的步骤；使所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在载体的承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层的步骤；获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像的步骤。
参比粒子和细胞同时在一副显微图像中，使每一副图像都具有一个已知参数的参比粒子，因此每一幅显微图像都能借助已知参数的参比粒子进行其他图像信息进行解析。若参比粒子大小已知，则根据参比粒子大小和图像中细胞大小之间的相对关系，进行细胞分析。
所述细胞悬浮液样品中包括动物或人的身体液体样本；所述身体液体样本包括血液、尿液、精液、唾液、痰液、妇科分泌物、乳汁、粪便、腹水液、脑脊液、骨髓、泪液、鼻涕中的任意一种或多种。
由于引入了参比粒子，因此制备细胞悬浮液样品的身体液体样本并无特别限制，只要样本中有需要待显微成像观察的对象即可。进一步地，还可以包括植物或其他环境中需要检测的非身体液体样本，只要其中要待观察的细胞即可。
所述细胞悬浮液样品中,包括稀释液和或染色液；所述细胞悬浮液样品中,身体液体样本和稀释液混合均匀；或所述细胞悬浮液样品中,身体液体样本和染色液混合均匀；或所述细胞悬浮液样品中身体液体样本、稀释液和染色液三者混合均匀。染色液可以是非荧光染色液。
细胞悬浮液样品中可以有稀释液或染色液中的任意一种或多种，只要混合均匀即可。即使没有染色，由于引入参比粒子也有可参考进行细胞分析的基本信息。当然，在有染色液时，会进一步突出细胞特征，或增强细胞核参比粒子的对比，有利于图片信息的分析和提取。
所述染色液包括荧光染色液。荧光染色液对细胞或参比粒子进行荧光染色，使细胞或参比粒子具有荧光特性，从而使细胞悬浮液能在荧光显微镜下能呈现和荧光相关的特征。
所述细胞悬浮液样品中包括微生物。当使用了荧光染色液时，染色的对象还可以包括微生物。
在细胞悬浮液样品中，所述参比粒子浓度CR已知。参比粒子浓度CR已知时，参比粒子浓度CR可以参与后续的显微图像分析。
所述参比粒子实际尺寸DR1已知。参比粒子实际尺寸DR1已知时，参比粒子实际尺寸DR1可以参与后续的显微图像分析。
所述参比粒子包括金粒子、银粒子、碳粒子、四氧化三铁粒子、氧化硅粒子、聚苯乙烯粒子、聚丙烯粒子、聚碳酸酯粒子、陶瓷粒子、壳聚糖粒子、纤维素粒子中的任意一种或多种。
参比粒子的材质可以根据不同的场景进行选择，不同的身体液体样本中所包含的细胞特征不同，如细胞的大小、细胞的电学特性不同。
所述参比粒子的形状包括球体、锥体、长方体中的任意一种或多种。参比粒子的形状可以根据待分析细胞的特征进行选择，可以选择和细胞特征差异大的形状，也可以选择和细胞特征相似的形状。参比粒子的形状和细胞的形状差异大时，可以利用形状差异特征进行细胞分析和鉴别。参比粒子形状和细胞形状相似时，也可以用来进行细胞分析和鉴别。
所述参比粒子为球形，所述球形的直径用作参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是所述球形的直径在图像中的尺寸。
所述参比粒子的形状为锥体，所述锥体的高度或所述锥体的底面宽度用作参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是所述锥体的高度或所述锥体的底面宽度在图像中的尺寸。
所述参比粒子的形状为长方体，所述长方体任意边长用作的参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是所述长方体在图像中的尺寸。
所述参比粒子实际尺寸DR1的范围是1μm～100μm(微米)。
所述参比粒子实际尺寸DR1的范围是3μm～30μm。
所述参比粒子实际尺寸DR1的范围是3μm～15μm。
参比粒子的大小选择，通常会考虑细胞的大小，需要和被观察细胞的大小，在同一量级上，方便观察，即在同一显微图像中都要能显示，且显示出的大小精度对细胞的分析和计数要足够，不能太小或太大。
在参比粒子浓度已知或固定的情况下，若参比粒子大小太大，会使显微图像中呈现的参比粒子数量太少，甚至没有。因此参比粒子的大小需要综合显微镜的放大特征，需要在显微成像的范围内至少要有一个。若参比粒子太小，会使显微图像中呈现的参比粒子数量太多或太小。因此参比粒子的大小需要考虑细胞的大小特征，和待分析细胞的大小要匹配。在显微图像中，参比粒子太小会让参比粒子的参数获取精度不够，若不能准确获取参比粒子大小的尺寸信息，后续的分析准确性也会受到影响。即在参比粒子浓度设定好的情况下，需要考虑参比粒子尺寸和细胞尺寸之间尽量在可对比的同一量级上或靠近的量级上，不至于尺寸相距太大，而失去参比粒子的参比价值。
本发明解决上述技术问题的技术方案还可以是一种试剂盒，包括用于容置细胞悬浮液样品的载体，所述载体包括承载面；所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层；所述试剂盒能使外部成像装置能获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像。试剂盒中可以包含试剂也包含上述用于观察层形成的承载面。
本发明解决上述技术问题的技术方案还可以是一种细胞悬浮液样品成像系统，用于细胞悬浮液样品成像，包括载体，用于承载血细胞悬浮液样品；载体包括承载面；包括细胞和参比粒子的细胞悬浮液样品进入载体后，细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层；显微图像获取单元，用于获取包括细胞和参比粒子的观察层的至少一幅图像。
所述细胞悬浮液样品成像系统还包括悬浮液样品制备单元，用于制备细胞悬浮液样品。悬浮液样品制备单元使细胞悬浮液样品成像系统同时具备悬浮液样品制备功能和显微图像获取功能。
所述悬浮液样品制备单元和所述载体连通。悬浮液样品制备单元和载体连通，能让细胞悬浮液样品直接从悬浮液样品制备单元进入载体，形成观察层。一体化的系统，使样品制备和观察一体化。
所述悬浮液样品制备单元中包括试剂存储单元和样本混合装置；试剂存储单元用于存储至少一种细胞染色试剂；样本混合装置用于悬浮液样品制备中的样品混合处理，使细胞悬浮液样品中的悬浮颗粒分布均匀。悬浮液样品制备单元中包括剂存储单元和样本混合装置和样本采样装置，使悬浮液样品制备过程也能在细胞悬浮液样品成像系统中完成。
悬浮液样品制备单元中包括样本采样装置；样本采样装置用于待分析样本的采样，并将样本送入试剂存储单元或样本混合装置进行细胞悬浮液样品制备。
所述细胞悬浮液样品成像系统还包括主控制单元；主控制单元用于控制悬浮液样品制备单元。
主控制单元还用于控制悬浮液样品制备单元和载体之间的连通状态。
主控制单元控制显微图像获取单元，获取包括细胞和参比粒子的观察层的多幅显微图像；多幅显微图像中，至少两幅显微图像是在不同的条件下获得的；所述条件包括所述观察层的不同部分和不同的照射条件。
多幅显微图像是不同条件下获得的，不同图像中会包含多个层次的图像信息，可以提取多幅图像中的差异进行综合分析。
所述细胞悬浮液样品成像系统还包括照明单元；用于显微图像获取时承载面的照明；照明单元受控于主控制单元，提供不同的照明条件。
所述细胞悬浮液样品成像系统还包括存储单元和输出端口；存储单元用于存放显微图像；输出端口用于输出显微图像数据；存储单元和输出端口受控于主控制单元。
所述显微图像获取单元还包括焦距调整单元，焦距调整单元用于调整显微图像成像时的物镜焦距；焦距调整单元受控于主控制单元，主控制单元根据显微图像获取单元所获取的显微图像中的参比粒子大小调整物镜焦距。
在实际成像过程中，显微镜的焦距调整是形成清晰图像的基础。在现有技术中，调焦的过程是一个初调和一个精密调整过程的结合。然而在细胞悬浮液中，细胞的大小是实现不知道了，因此调焦时候选择细胞为参考，会让每次调整焦距的略有差异。因此图像的一致性会不同。而引入了参比粒子，参比粒子的大小是已知的，利用已知大小的参比粒子作为焦距调整的参考，能提高不同次焦距调整的一致性，也提高了不同次成像中获取的显微图像的一致性，也有利于后续的更精准的图像分析。
所述显微图像获取单元包括荧光显微镜和或普通光学显微镜。
同现有技术相比较，本申请的有益效果是：1.参比粒子参与成像后，参比粒子可以用作后续各种参数计算的数量标尺，简化后续计算的逻辑，提升准确性；消除了承载面所处空间即细胞核参比粒子平铺区域的深度、视野的大小对细胞计数结果的影响；2.参比粒子参与成像后，可以利用参比粒子作为自动对焦参照物，校正成像质量；参比粒子具有尺寸均一性，在一个样本的检测过程中，会涉及多个视野的观察与计数，此时以具有标准尺寸的参比粒子，作为对焦参考点，实现图像对焦的均一性，从而增强图片质量，提升结果准确性。
附图说明
图1是细胞悬浮液样品成像系统的框架示意图；
图2是现有技术中血涂片制作过程示意图;
图3是包括细胞和参比粒子的观察层获得的照片之一；
图4是包括细胞和参比粒子的观察层获得的照片之二。
具体实施方式
以下结合各附图对本申请的实施方式做进一步详述。
一种细胞悬浮液样品成像方法，包括以下步骤：将包含细胞和参比粒子的细胞悬浮液样品引入到载体的承载面上的步骤；使所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在载体的承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层的步骤；获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像的步骤。
细胞悬浮液样品中包括动物或人的身体液体样本；所述身体液体样本包括血液、尿液、精液、唾液、痰液、妇科分泌物、乳汁、粪便、腹水液、脑脊液、骨髓、泪液、鼻涕中的任意一种或多种。
细胞悬浮液样品中,包括稀释液和或染色液；细胞悬浮液样品中,身体液体样本和稀释液混合均匀；或细胞悬浮液样品中,身体液体样本和染色液混合均匀；或细胞悬浮液样品中身体液体样本、稀释液和染色液三者混合均匀。
染色液包括荧光染色液。细胞悬浮液样品中包括微生物。
参比粒子在细胞悬浮液样品中的浓度CR已知。参比粒子实际尺寸DR1已知。
参比粒子包括金粒子、银粒子、碳粒子、四氧化三铁粒子、氧化硅粒子、聚苯乙烯粒子、聚丙烯粒子、聚碳酸酯粒子、陶瓷粒子、壳聚糖粒子、纤维素粒子中的任意一种或多种。参比粒子中包括磁珠粒子，磁珠粒子中包括四氧化三铁Fe3O4粒子。
参比粒子的形状包括球体、锥体、长方体中的任意一种或多种。参比粒子为球形，所述球形的直径用作参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是所述球形的直径在图像中的尺寸。
参比粒子的形状为锥体，所述锥体的高度或所述锥体的底面宽度用作参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是所述锥体的高度或所述锥体的底面宽度在图像中的尺寸。
参比粒子的形状为长方体，所述长方体任意边长用作的参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是所述长方体在图像中的尺寸。
参比粒子实际尺寸DR1的范围是1μm～100μm。
参比粒子实际尺寸DR1的范围还可以是3μm～30μm。参比粒子实际尺寸DR1的范围还可以是3μm～15μm。
参比粒子的形状包括球体、锥体、长方体中的任意一种或多种。参比粒子的形状是具有一致性的一种或多种形状。参比粒子为球形，球形的直径用作参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是球形的直径在图像中的尺寸。参比粒子的形状为锥体，锥体的高度或所述锥体的底面宽度用作参比粒子的实际尺寸DR1。参比粒子的图像尺寸DR2是锥体的高度或所述锥体的底面宽度在图像中的尺寸。参比粒子的形状为长方体，长方体任意边长用作的参比粒子的实际尺寸DR1；参比粒子的图像尺寸DR2是所述长方体在图像中的尺寸。长方体也包括正方体；当长方体为立方体时，只有一个边长尺寸。
不同形状的参比粒子可以存在于同一次的细胞悬浮液样品中，不同的形状的参比粒子尺寸可以相同也可以不同；不同形状或不同尺寸的参比粒子在同一次的细胞悬浮液样品中用作不同的细胞分类或计数的参比识别。
细胞图像尺寸DC2，是指细胞在图像中显示的大小，不同形态的细胞，可以取平面图像中的最大宽度用作细胞图像尺寸DC2。当然对球形细胞，取图像中圆形投影的直径用作细胞图像尺寸DC2，细胞面积是π×DC2×DC2/4。对其他形态的细胞，取图像中方形投影的边长用作细胞图像尺寸DC2，细胞面积是DC2×DC2。细胞图像的面积可以采用方形面积计算公式也可以采用圆形面积计算公式。
在一些附图中未显示的一种试剂盒实施例中，包括用于容置细胞悬浮液样品的载体，所述载体包括承载面；所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层；所述试剂盒能使外部成像装置能获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像。
在一些附图中未显示的一种细胞悬浮液样品成像系统实施例中，细胞悬浮液样品中包括细胞和参比粒子；载体，用于承载血细胞悬浮液样品；载体包括承载面；细胞悬浮液样品进入载体后，细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层；显微图像获取单元，用于获取包括细胞和参比粒子的观察层的至少一幅图像。
如图1所示的细胞悬浮液样品成像系统的框架示意图中，一种细胞悬浮液样品成像系统包括悬浮液样品制备单元，用于制备细胞悬浮液样品；细胞悬浮液样品中包括细胞和参比粒子；载体，用于承载血细胞悬浮液样品；载体包括承载面；悬浮液样品制备单元和载体连通，细胞悬浮液样品进入载体后，细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层；显微图像获取单元，用于获取包括细胞和参比粒子的观察层的至少一幅图像。
如图1所示的细胞悬浮液样品成像系统的框架示意图中，悬浮液样品制备单元中包括试剂存储单元和样本混合装置；试剂存储单元用于存储至少一种细胞染色试剂；样本混合装置用于悬浮液样品制备中的样品混合处理，使细胞悬浮液样品中的悬浮颗粒分布均匀。悬浮液样品制备单元中包括样本采样装置；样本采样装置用于待分析样本的采样，并将样本送入试剂存储单元或样本混合装置进行细胞悬浮液样品制备。
在一些附图中未显示的一种细胞悬浮液样品成像系统实施例中，悬浮液样品制备单元和载体连通。
如图1所示的细胞悬浮液样品成像系统的框架示意图中，还包括主控制单元；主控制单元用于控制悬浮液样品制备单元。主控制单元还用于控制悬浮液样品制备单元和载体之间的连通状态。主控制单元控制显微图像获取单元，获取包括细胞和参比粒子的观察层的多幅显微图像；多幅显微图像中，至少两幅显微图像是在不同的条件下获得的；所述条件包括所述观察层的不同部分和不同的照射条件。
如图1所示的细胞悬浮液样品成像系统的框架示意图中，还包括照明单元；用于显微图像获取时承载面的照明；照明单元受控于主控制单元，提供不同的照明条件。
如图1所示的细胞悬浮液样品成像系统的框架示意图中，还包括存储单元和输出端口；存储单元用于存放显微图像；输出端口用于输出显微图像数据；存储单元和输出端口受控于主控制单元。
在一些附图中未显示的一种细胞悬浮液样品成像系统实施例中，显微图像获取单元还包括焦距调整单元，焦距调整单元用于调整显微图像成像时的物镜焦距；焦距调整单元受控于主控制单元，主控制单元根据显微图像获取单元所获取的显微图像中的参比粒子大小调整物镜焦距。
在一些附图中未显示的一种细胞悬浮液样品成像系统实施例中，所述显微图像获取单元包括荧光显微镜或普通光学显微镜。
参比粒子参与成像后，参比粒子可以用作后续计算的数量标尺，简化了计算逻辑和计算的准确性。在固定体积的细胞悬浮液样品中，细胞悬浮液样品中包括了试剂，样本和参比粒子，三者充分混匀后，参比粒子在观察层的平铺、分布规律与待测样本中的细胞一致，可直接通过计数显微图片中参比粒子与细胞的之间的尺寸、面积或数量关系，来计算原始样本中的细胞浓度或数量，无需考虑其它因素，如观察区的容积和面积；即承载面所处空间即细胞核参比粒子平铺区域的深度、视野的大小对成像以及后续计算的影响大大降低。
参比粒子参与成像后，利用成像图片进行细胞计数时，提升了计数准确性。在传统计数逻辑中，更多依赖于计数板的加工精度，尤其是平铺、分布区域体积。平铺、分布区域体积的工艺误差直接影响细胞的数量，从而计数结果；而加入内标的参比粒子，使细胞计数逻辑已与平铺、分布区域体积的体积无关。
参比粒子参与成像后，可利用参比粒子作为自动对焦参照物，校正成像质量；参比粒子具有尺寸均一性，在一个样本的检测过程中，会涉及多个视野的观察与计数，此时以具有标准尺寸的参比粒子，作为对焦参考点，实现图像对焦的均一性，从而增强图片质量，提升结果准确性。
图3和图4是包括细胞和参比粒子的观察层获得的两幅图像，图3和图4中正方形选框中的为红细胞；圆形选框中的为参比粒子。图3中的圆形选框中有两个参比粒子。图4中椭圆形选框中是白细胞。
形成图3的样本为猫静脉全血样本，参比粒子为直径为3微米的磁性微米球形颗粒。将10ul(微升)上述血液样本，与10ul的包括参比粒子的原始参比粒子溶液，加入到980ul总体积的染色试剂中，颠倒混匀1分钟，然后将混合液加入到观察载体上，用光学显微镜成像后进行拍照即获得一定数量的显微照片即显微图像，图3为其中之一。
形成图4的样本为猫静脉全血样本，参比粒子为直径为5微米的聚苯乙烯球形颗粒。将10ul上述血液样本，与10ul的包括参比粒子的原始参比粒子溶液，加入到980ul总体积的染色试剂中，颠倒混匀1分钟，然后将混合液加入到观察载体上，用光学显微镜成像后进行拍照即获得一定数量的显微照片即显微图像，图4为其中之一。
一种细胞悬浮液样品成像系统和试剂盒中包括用于承载细胞悬浮液样品的载体；细胞悬浮液样品成像方法中，包括将包含细胞和参比粒子的细胞悬浮液样品引入到载体的承载面上的步骤；使所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在载体的承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层的步骤；获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像的步骤。 基于参比粒子参与成像的显微图像，能提高图片质量，且参比粒子相关参数可参与成像的细胞悬浮液样品的定量计算，能简化细胞悬浮液样品分析中的细胞计数方法，提高计数准确性；能消除承载面以及系统对细胞计数结果的部分影响。
以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (28)

1.一种细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，包括：
将包含细胞和参比粒子的细胞悬浮液样品引入到载体的承载面上的步骤；
使所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在载体的承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层的步骤；
获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像的步骤。
2.根据权利要求1所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述细胞悬浮液样品中包括动物或人的身体液体样本；
所述身体液体样本包括血液、尿液、精液、唾液、痰液、妇科分泌物、乳汁、粪便、腹水液、脑脊液、骨髓、泪液、鼻涕中的任意一种或多种。
3.根据权利要求2所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述细胞悬浮液样品中,包括稀释液和或染色液；
所述细胞悬浮液样品中,身体液体样本和稀释液混合均匀；
或所述细胞悬浮液样品中,身体液体样本和染色液混合均匀；
或所述细胞悬浮液样品中身体液体样本、稀释液和染色液三者混合均匀。
4.根据权利要求3所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述染色液包括荧光染色液。
5.根据权利要求4所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述细胞悬浮液样品中包括微生物。
6.根据权利要求1所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
在细胞悬浮液样品中，所述参比粒子浓度CR已知。
7.根据权利要求1所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子实际尺寸DR1已知。
8.根据权利要求1所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子包括金粒子、银粒子、碳粒子、四氧化三铁粒子、氧化硅粒子、聚苯乙烯粒子、聚丙烯粒子、聚碳酸酯粒子、陶瓷粒子、壳聚糖粒子、纤维素粒子中的任意一种或多种。
9.根据权利要求1所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子的形状包括球体、锥体、长方体中的任意一种或多种。
10.根据权利要求9所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子为球形，所述球形的直径用作参比粒子的实际尺寸DR1；
参比粒子的图像尺寸DR2是所述球形的直径在图像中的尺寸。
11.根据权利要求9所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子的形状为锥体，所述锥体的高度或所述锥体的底面宽度用作参比粒子的实际尺寸DR1；
参比粒子的图像尺寸DR2是所述锥体的高度或所述锥体的底面宽度在图像中的尺寸。
12.根据权利要求9所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子的形状为长方体，所述长方体任意边长用作的参比粒子的实际尺寸DR1；
参比粒子的图像尺寸DR2是所述长方体在图像中的尺寸。
13.根据权利要求10至12任意一项所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子实际尺寸DR1的范围是1μm～100μm。
14.根据权利要求10至12任意一项所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子实际尺寸DR1的范围是3μm～30μm。
15.根据权利要求10至12任意一项所述细胞悬浮液样品成像方法，其特征在于，
所述参比粒子实际尺寸DR1的范围是3μm～15μm。
16.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
用于容置细胞悬浮液样品的载体，所述载体包括承载面；
所述细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层；
所述试剂盒能使外部成像装置能获取观察层部分或全部的至少一幅显微图像。
17.一种细胞悬浮液样品成像系统，用于细胞悬浮液样品成像，其特征在于，包括：
载体，用于承载血细胞悬浮液样品；载体包括承载面；
包括细胞和参比粒子的细胞悬浮液样品进入载体后，细胞悬浮液样品中的细胞和参比粒子沉降在承载面上形成包括细胞和参比粒子的观察层；
显微图像获取单元，用于获取包括细胞和参比粒子的观察层的至少一幅图像。
18.根据权利要求17所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
还包括悬浮液样品制备单元，用于制备细胞悬浮液样品。
19.根据权利要求18所述的细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
所述悬浮液样品制备单元和所述载体连通。
20.根据权利要求18所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
所述悬浮液样品制备单元中包括试剂存储单元和样本混合装置；
试剂存储单元用于存储至少一种细胞染色试剂；
样本混合装置用于悬浮液样品制备中的样品混合处理，使细胞悬浮液样品中的悬浮颗粒分布均匀。
21.根据权利要求20所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
悬浮液样品制备单元中包括样本采样装置；
样本采样装置用于待分析样本的采样，并将样本送入试剂存储单元或样本混合装置进行细胞悬浮液样品制备。
22.根据权利要求18所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
还包括主控制单元；
主控制单元用于控制悬浮液样品制备单元。
23.根据权利要求22所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
主控制单元还用于控制悬浮液样品制备单元和载体之间的连通状态。
24.根据权利要求22所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
主控制单元控制显微图像获取单元，获取包括细胞和参比粒子的观察层的多幅显微图像；
多幅显微图像中，至少两幅显微图像是在不同的条件下获得的；所述条件包括所述观察层的不同部分和不同的照射条件。
25.根据权利要求22所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
还包括照明单元；用于显微图像获取时承载面的照明；
照明单元受控于主控制单元，提供不同的照明条件。
26.根据权利要求22所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
还包括存储单元和输出端口；存储单元用于存放显微图像；
输出端口用于输出显微图像数据；
存储单元和输出端口受控于主控制单元。
27.根据权利要求22所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
所述显微图像获取单元还包括焦距调整单元，焦距调整单元用于调整显微图像成像时的物镜焦距；
焦距调整单元受控于主控制单元，主控制单元根据显微图像获取单元所获取的显微图像中的参比粒子大小调整物镜焦距。
28.根据权利要求17所述细胞悬浮液样品成像系统，其特征在于，
所述显微图像获取单元包括荧光显微镜和或普通光学显微镜。
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