CN114480276A - 一种提高car-t细胞抗肿瘤效果的方法 - Google Patents
一种提高car-t细胞抗肿瘤效果的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114480276A CN114480276A CN202210147268.2A CN202210147268A CN114480276A CN 114480276 A CN114480276 A CN 114480276A CN 202210147268 A CN202210147268 A CN 202210147268A CN 114480276 A CN114480276 A CN 114480276A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- car
- diazoxonorleucine
- don
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 66
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- YCWQAMGASJSUIP-YFKPBYRVSA-N 6-diazo-5-oxo-L-norleucine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)C=[N+]=[N-] YCWQAMGASJSUIP-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 16
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 9
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 229960005538 6-diazo-5-oxo-L-norleucine Drugs 0.000 description 33
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 11
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 11
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 9
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000981 3-amino-3-oxopropyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- -1 diazoketone compound Chemical class 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000002309 glutamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种提高CAR‑T细胞抗肿瘤效果的方法。所述方法包括采用重氮氧代正亮氨酸处理CAR‑T细胞；所述重氮氧代正亮氨酸的浓度为0.1～10mol/L。本发明研究发现重氮氧代正亮氨酸具备促进T细胞分化为低分化T细胞初始T细胞和中枢记忆T细胞的效果，并进一步将重氮氧代正亮氨酸应用于CAR‑T细胞的制备，发现其可以提高CAR‑T细胞的制备效率并且显著提高其抗肿瘤的效果，这在肿瘤治疗的领域有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种提高CAR-T细胞抗肿瘤效果的方法。
背景技术
重氮氧代正亮氨酸(DON)是一种从链霉菌中分离出来的非蛋白质氨基酸。在分子结构上，DON是由一个碱化基团取代谷氨酰胺侧链氨基形成的重氮酮化合物，是一种谷氨酰胺类似物。DON能够不可逆地抑制一系列谷氨酰胺相关酶活性，阻断谷氨酰胺代谢，具有止痛、抗菌、抗病毒以及抗肿瘤的作用。谷氨酰胺是细胞代谢中重要的氮源和碳源，参与糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等代谢途径。研究表明，阻断谷氨酰胺代谢能够抑制肿瘤细胞的增殖，控制肿瘤生长。2019年，发表在Science上题为“阻断谷氨酰胺诱导不同代谢程序从而抵抗肿瘤免疫逃逸”的文章揭示了T细胞与肿瘤细胞于阻断谷氨酰胺后在能量供应及代谢途径中的差异。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在血液肿瘤，如复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病以及非霍奇金淋巴瘤治疗领域展现出较好的临床治疗效果。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种提高CAR-T细胞抗肿瘤效果的方法，通过重氮氧代正亮氨酸处理CAR-T细胞可以有效提高CAR+T细胞中TN(CD45RA+CCR7+)和TCM(CD45RA-CCR7+)亚群的比例，进而提高其杀伤肿瘤细胞的能力。
本发明所称重氮氧代正亮氨酸为6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)。
本发明研究发现T细胞的分化状态很大程度上决定了其持久性，相较于分化程度更高的效应T细胞(TEFF)和效应记忆T细胞(TEM)，处于低分化状态的初始T细胞(TN)和中枢记忆T细胞(TCM)具有更强的生存能力和抗肿瘤功能。T细胞在免疫应答中的分化过程伴随着代谢途径的改变，因此，本发明通过改变细胞体外培养环境，采用DON对其处理，干预T细胞的代谢过程，能够改变其分化状态，获得更多低分化的T细胞，进而延长CAR-T细胞回输体内后的存活时间，有利于增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果，为肿瘤患者带来福音。
第一方面，本发明提供一种提高CAR-T细胞抗肿瘤效果的方法，包括：
采用重氮氧代正亮氨酸处理CAR-T细胞。
进一步地，所述重氮氧代正亮氨酸的浓度为1～10μmol/L。
进一步地，所述采用重氮氧代正亮氨酸处理CAR-T细胞为：
在制备CAR-T细胞的过程中的培养基中加入1～10μmol/L的重氮氧代正亮氨酸。
进一步地，所述方法包括：
采用包含有CAR核苷酸序列的慢病毒在T细胞培养基中感染T细胞；
所述T细胞培养基中含有2.5～5μmol/L的重氮氧代正亮氨酸。
进一步地，所述慢病毒的MOI为(5～15)：1。
进一步地，所述T细胞培养基还包括：OKT3和CD28抗体。
进一步地，所述T细胞培养基可以采用本领域常规的用于制备CAR-T细胞的T细胞培养基，其中为了激活T细胞，均含有OKT3和CD28抗体，例如包括：X-VIVO 15无血清培养基、IL2、IL-7、IL-15、OKT3抗体和CD28抗体。
更进一步地，所述T细胞培养基以X-VIVO 15无血清培养基为基础，还包括IL2 10～100U/mL、IL-7 1～20ng/ml、IL-151～20ng/ml、OKT3抗体10～100ng/ml和CD28抗体0.1～10μg/ml。
作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种提高CAR-T细胞抗肿瘤效果的方法，包括：
(1)构建携带靶向肿瘤细胞的CAR核苷酸序列的慢病毒载体；
(2)将所述慢病毒载体转染293FT细胞制备得到携带靶向肿瘤细胞的CAR核苷酸序列的慢病毒；
(3)采用所述慢病毒于T细胞培养基中感染T细胞48～96小时，MOI＝(5～15)：1。
所述T细胞培养基以X-VIVO 15无血清培养基为基础，还包括IL210～100U/mL、IL-7 1～20ng/ml、IL-151～20ng/ml、OKT3抗体10～100ng/ml和CD28抗体0.1～10μg/ml。
本发明进一步提供重氮氧代正亮氨酸在促进T细胞分化为低分化T细胞中的应用。
进一步地，所述低分化T细胞包括：初始T细胞和/或中枢记忆T细胞。
本发明进一步提供重氮氧代正亮氨酸在提高CAR-T细胞制备效率中的应用。
本发明进一步提供重氮氧代正亮氨酸在这制备用于提高CAR-T细胞的肿瘤杀伤效率的药物中的应用。
本发明具备如下有益效果：
现有技术中，常规制备CAR-T细胞的过程中一般都需要CD3和CD28抗体的刺激，使得获得的CAR-T细胞中TEM和TEFF比例较高，本发明发现在体外培养的培养基中加入DON可以提高获得的CAR-T细胞中TN和TCM的比例，进而增强其体内持久性，从而提高其杀伤肿瘤细胞的能力，因此DON体外处理的CAR-T具有更好的治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的DON处理组和对照组中TN(CD45RA+CCR7+)和TCM(CD45RA-CCR7+)亚群的统计结果示意图；其中A为TN亚群的统计结果，B为TCM亚群的统计结果。
图2为本发明实施例2提供的DON对于CAR-T细胞的影响的统计结果示意图；其中A为感染72小时后，CAR-T细胞所占比例示意图，B为感染72小时后TN(CD45RA+CCR7+)亚群所占比例,C为感染72小时后，TCM(CD45RA-CCR7+)亚群所占比例示意图。
图3为本发明实施例2提供的针对Raji细胞，在不同效靶比的情况下，DON处理组和未经DON处理组的CAR-T细胞分泌的IFN-γ蛋白表达量对比示意图。
图4位本发明实施例2提供的针对Raji细胞，在不同效靶比的情况下，DON处理组和未经DON处理组的CAR-T细胞特异性识别并杀伤靶细胞能力对比示意图。
图5为本发明实施例2提供的针对淋巴瘤小鼠模型，DON处理组和未经DON处理组的识别和杀伤靶细胞功能对比示意图。
图6为本发明实施例2提供的针对肿瘤复发的情况下，DON处理组和未经DON处理组抵抗肿瘤复发的功能对比示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:aLaboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
慢病毒包装质粒(pMDL,VSV-G,REV)、载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司。XbaI和SalI内切酶购自New England Biolabs(Beijing)LTD.。PEI购自Sigma公司。CD19-Fc融合蛋白购自ACRO Biosystems有限公司。X-VIVO15培养基购自Lonza公司。IL-2,IL-7,IL-15细胞因子购自Peprotech公司。OKT3购自ACROBiosystems有限公司。CD28抗体购自同立海源公司。293FT细胞、Raji细胞购自ATCC。Raji-Luciferase细胞购自苏州东岭生物技术有限公司。CD45RA,CCR7,CFSE,PI等流式抗体购自BD公司。NOG免疫缺陷小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1
本实施例验证DON对于T细胞分化的影响，具体流程如下：
1、PBMC培养
无菌收集肿瘤患者外周静脉血，用Ficoll-Paque PLUS(GE,USA)淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，分离得到外周血单个核细胞(PBMC)，加入T细胞培养基进行培养。
T细胞培养基包含：X-VIVO 15无血清培养基(Lonza,USA)以及IL2(50U/ml；Peprotech,USA),IL-7(10ng/ml；Peprotech,USA),IL-15(10ng/ml,Peprotech,USA),OKT3antibody(50ng/ml；ACRO,USA)and anti-CD28 antibody(1μg/ml；T&L Biotechnology,China).。
2、DON处理的PBMC分化情况
将分离得到的PBMC分成两组：
对照组(Control)经T细胞培养基培养7天；
DON处理组经含DON(2.5μM)(Sigma-Aldrich,USA)的T细胞培养基培养7天。
本发明通过流式抗体对两组PBMC进行染色并进行数据分析，数据分写结果显示DON处理组组PBMC的TN(CD45RA+CCR7+)和TCM(CD45RA-CCR7+)亚群的比例显著增高(图1中的A和B)，即低分化的T细胞占比显著增多。
实施例2
本实施例验证DON对于CAR-T细胞的影响，具体流程如下：
1、靶向CD19的CAR-T细胞的慢病毒载体的构建
(1)参照专利(US 10,633,442B2)合成靶向CD19的CAR核苷酸序列，并在这段核苷酸序列的两端分别添加XbaI和NotI酶切位点，并克隆到pUC57载体上；
(2)用XbaI和NotI双酶切包含目的基因的pUC57载体，切胶回收目的基因片段；
(3)用XbaI和NotI双酶切原始载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro，切胶回收约6.5kb的载体片段；
(4)用DNA连接酶连接回收的目的基因片段和载体片段，即得携带CD19 CAR的重组慢病毒载体。
2、CD19 CAR慢病毒的制备
将步骤1得到的重组慢病毒载体通过转染试剂(PEI)转染293FT细胞产生慢病毒。具体方法包括：
包装质粒混合物(pMDL:VSV-G:REV＝5:3:2，质量比)和CD19 CAR慢病毒载体按1:1的质量比加入500μl无血清培养基Opti-MEM中，涡旋至充分混匀。将32g PEI加入500μl无血清培养基Opti-MEM中，涡旋至充分混匀。然后将500μl质粒混合物与500μl PEI混合，并将其加入汇合度约90％的293FT细胞中，48小时后收集病毒上清，超速离心后，对病毒进行100倍浓缩，进而获得浓缩后病毒。
3、CD19 CAR-T细胞的制备
分离外周血T细胞，在T细胞培养基中培养，用浓缩后病毒感染激活的T细胞，MOI＝10:1(T细胞培养基成分中的OKT3和CD28抗体能激活T细胞)。感染的同时，分为两组：
DON处理组(dCAR-T)在T细胞培养基中加入DON(2.5μM)；
未经DON处理组(CAR-T)不加DON。
本发明以FITC偶联的CD19-Fc融合蛋白检测CD19 CAR表达，结果显示：感染72小时之后，dCAR-T组CD19 CAR感染效率显著高于CAR-T组(图2中的A)。同时，dCAR-T组的TN(CD45RA+CCR7+)和TCM(CD45RA-CCR7+)亚群的比例明显增高(图2中的B和C)。
4、CD19 CAR-T细胞体内外功能鉴定
将步骤3中的dCAR-T组和CAR-T组细胞分别与5x104个Burkitt's淋巴瘤细胞(Raji细胞)以2:1的效靶比共孵育24小时之后检测上清IFN-γ浓度。结果表明，DON处理的CAR-T细胞分泌的IFN-γ高于未处理组(图3)。
将步骤3中的dCAR-T组和CAR-T组细胞分别与CFSE预标记的Raji细胞以1:20,1:10,1:5,1:2,1:1,2:1的效靶比共孵育，流式鉴定CFSE标记的靶细胞中细胞死亡比例(PI+靶细胞百分比)。结果显示，降低效靶比时，DON处理的CAR-T细胞特异性识别并杀伤靶细胞功能显著高于未经DON处理的CAR-T细胞(图4)。
将步骤3中的dCAR-T组和CAR-T组细胞(1x106)回输Raji-Luciferase细胞株构建的淋巴瘤小鼠模型，结果显示，DON处理的CAR-T细胞体内杀伤对应肿瘤细胞能力显著强于未经DON处理的CAR-T细胞(图5)。对肿瘤完全消退的小鼠二次注射Raji-Luciferase细胞模拟肿瘤复发，结果显示，DON处理的CAR-T细胞抵抗肿瘤复发的能力显著强于未经DON处理的CAR-T细胞(图6)，即DON处理的CAR-T细胞在体内扩增能力更强，持久性更好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种提高CAR-T细胞抗肿瘤效果的方法，其特征在于，包括：
采用重氮氧代正亮氨酸处理CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重氮氧代正亮氨酸的浓度为1～10μmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用重氮氧代正亮氨酸处理CAR-T细胞为：
在制备CAR-T细胞的过程中的培养基中加入1～10μmol/L的重氮氧代正亮氨酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用包含有CAR核苷酸序列的慢病毒在T细胞培养基中感染T细胞；
所述T细胞培养基中含有2.5～5μmol/L的重氮氧代正亮氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述慢病毒的MOI为(5～15)：1。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述T细胞培养基还包括OKT3和CD28抗体。
7.重氮氧代正亮氨酸在促进T细胞分化为低分化T细胞中的应用。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述低分化T细胞包括：初始T细胞和/或中枢记忆T细胞。
9.重氮氧代正亮氨酸在提高CAR-T细胞制备效率中的应用。
10.重氮氧代正亮氨酸在这制备用于提高CAR-T细胞的肿瘤杀伤效率的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210147268.2A CN114480276A (zh) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 一种提高car-t细胞抗肿瘤效果的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210147268.2A CN114480276A (zh) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 一种提高car-t细胞抗肿瘤效果的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114480276A true CN114480276A (zh) | 2022-05-13 |
Family
ID=81481457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210147268.2A Pending CN114480276A (zh) | 2022-02-17 | 2022-02-17 | 一种提高car-t细胞抗肿瘤效果的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114480276A (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373113A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-09-10 | 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) | 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法 |
-
2022
- 2022-02-17 CN CN202210147268.2A patent/CN114480276A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373113A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-09-10 | 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) | 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ROBERT D. LEONE ET AL: "Glutamine blockade induces divergent metabolic programs to overcome tumor immune evasion", 《SCIENCE》, pages 1013 * |
| 金玉坤;陆伟;罗雁;: "不平衡氨基酸的研究进展", 医学综述, no. 11, pages 1647 - 1649 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klingemann | The NK-92 cell line—30 years later: its impact on natural killer cell research and treatment of cancer | |
| DE69128476T2 (de) | Adoptive immuntherapie mit interleukin-7 | |
| CN107922925A (zh) | 用于自然杀伤细胞扩增的方法 | |
| CN107034235A (zh) | 联合靶向pd‑1及egfr的嵌合性抗原t细胞肿瘤免疫方法 | |
| CN103635573A (zh) | 包含γδT细胞的淋巴细胞系、其组合物及生产方法 | |
| CA3001507C (en) | Cxcr6-transduced t cells for targeted tumor therapy | |
| WO2009139413A1 (ja) | サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法 | |
| CN114574446A (zh) | 一种目的基因可调控的工程化免疫细胞及其制备方法和应用 | |
| AU2020242520B2 (en) | Method for the expansion and differentiation of T lymphocytes and NK cells in adoptive transfer therapies | |
| JP6687246B2 (ja) | 改変型免疫細胞、改変型免疫細胞の製造方法、およびこれらの利用 | |
| Kasuya et al. | High CD62L expression predicts the generation of chimeric antigen receptor T cells with potent effector functions | |
| US11359012B1 (en) | Specific chimeric antigen receptor cells targeting human CLDN18A2, preparation method and application thereof | |
| CN114250198A (zh) | 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法 | |
| CN114480276A (zh) | 一种提高car-t细胞抗肿瘤效果的方法 | |
| CN116063556B (zh) | Ips来源的car-nk细胞及其治疗癌症的用途 | |
| WO2023086642A2 (en) | Engineering or inducing pdgf and/or pdgfr signaling to enhance nk cell therapy | |
| CN115925974A (zh) | 一种针对实体瘤的通用性的ips来源的car-nk细胞的制备方法 | |
| CN115960909B (zh) | 提高car-nk细胞阳性率的表达方法及ldl受体应用 | |
| CN114773474B (zh) | Nk细胞的制备方法及其抗癌的应用 | |
| Oyer et al. | PM21-particle stimulation augmented with cytokines enhances NK cell expansion and confers memory-like characteristics with enhanced survival | |
| Jiang et al. | IL-9 as a naturally orthogonal cytokine with optimal JAK/STAT signaling for engineered T cell therapy | |
| US20240316106A1 (en) | Methods for generating primary immune cells | |
| CN114957441B (zh) | 转基因nk细胞及其在抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN117535324A (zh) | 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 | |
| CN116059329A (zh) | 溶瘤病毒与car t细胞联合治疗血液肿瘤的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220513 |