CN114478750A - 一种特立帕肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特立帕肽的纯化方法。包括如下步骤：(1)以磷酸盐缓冲液为流动相A1，以乙腈为流动相B对特立帕肽粗肽溶液进行梯度洗脱，收集洗脱组分；(2)将步骤(1)收集的洗脱组分以碳酸盐缓冲溶液为流动相A2，以乙腈为流动相B进行冲洗，置换所述洗脱组分中的磷酸盐；(3)转盐：以醋酸溶液为流动相A3，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，收集洗脱组分得醋酸特立帕肽。本发明通过一步纯化即可将单个杂质控制0.10％以内，避免多次纯化而导致有机溶剂消耗量过大，减少纯化的步骤及废液的排放，整个过程操作简单，生产周期短，环境友好，有利于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽纯化技术领域，尤其涉及一种特立帕肽的纯化方法。
背景技术
特立帕肽(Teriparatide)由美国礼来公司开发，是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素(PTH)具有生物活性的N-末端区域的1-34氨基酸片段(PTH1-34)，分子式为C181H291N55O51S2，分子量4177.77。美国食品药品监督管理局于2002年11月26日批准了特立帕肽用于治疗男人和绝经期妇女的具有高度骨折风险的骨质疏松症，也用于治疗男人的原发和或由于性机能减退造成的具有高骨折风险的骨质疏松。特立帕肽是第一种获得美国食品及药物管理局FDA批准的骨形成剂类新药。目前的常规骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失，而特立帕肽这种甲状旁腺激素的衍生物有增加成骨细胞数目、增强其活性及阻止成骨细胞凋亡的作用。因其可增加成骨细胞的活性及数量，从而可以促进骨生长，用于严重骨质疏松的二线治疗。此外特立帕肽副作用很小，通常只是恶心、眩晕和腿痛性痉挛。因此特立帕肽具有很高的药用价值和广阔的市场前景。其肽序为：
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。
通过固相合成的特立帕肽具有较多的消旋杂质，且因为肽链较长，消旋杂质与主成分的分离难度大，所以在纯化的过程中需要通过多步纯化才能够将杂质降低至可接受的水平，这导致纯化的周期长，样品的损失大。
如：CN 101798334 B中，使用一步纯化加一步转盐得到醋酸特立帕肽，使用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.05％～0.2％的三氟乙酸水溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：20％～40％，将粗肽溶液进行梯度洗脱；而后采用反相高效液相色谱法将人甲状旁腺激素(1-34)的三氟乙酸盐转成醋酸盐。该法所得的特立帕肽纯度为98％，未对消旋杂质进行控制。
CN 102993293 A中，以体积比0.1％～0.4％的硫酸和体积比0.1％～0.4％醋酸水溶液用氨水调pH值5.0～6.0后的溶液为A相，乙腈为B相进行纯化；而后将合格馏分进行盐析；用含3％～10％乙腈的醋酸铵溶液冲洗，用十八烷基硅烷键合硅胶高效液相色谱进行转盐，醋酸水溶液乙腈体系洗脱。在盐析之后使用50％～100％的磷酸水溶液将其溶解后，如此高浓度的磷酸无法进行下一步的转盐，必须用碱中和，中和的过程会出现较多的降解杂质，且溶解的过程会有较大的损失。
CN 106167522 A中，使用醋酸铵进行纯化，而后转为醋酸盐，该方法仅控制纯度为＞99.0％，未对消旋杂质进行控制。
CN 108373499 A中，第一步将粗肽溶液使用碳酸氢铵水溶液的乙腈体系进行第一次纯化；第二步将上述收集的洗脱液使用硫酸钠/硫酸的乙腈体系进行第二次纯化；第三部将收集的洗脱液先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱进行高效液相转盐；第四步将转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸。该方法通过多次纯化，且使用不同的色谱系统，步骤繁琐，纯化的乙腈消耗量大，不利于环保。
发明内容
针对上述背景技术中特立帕肽纯化效果不理想、消旋杂质控制不力或纯化步骤繁琐等技术问题，本发明提供一种特立帕肽的纯化方法，通过一步纯化得到纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的醋酸盐样品。且单次上样量高，生产周期短，废液量少，有利于环保。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供一种特立帕肽的纯化方法，包括以下步骤：
(1)以磷酸盐缓冲液为流动相A1，以乙腈为流动相B对特立帕肽粗肽溶液进行梯度洗脱，收集洗脱组分；
(2)将步骤(1)收集的洗脱组分以碳酸盐缓冲溶液为流动相A2，以乙腈为流动相B进行冲洗置换所述洗脱组分中的磷酸盐；
(3)转盐：以醋酸溶液为流动相A3，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，收集洗脱组分得醋酸特立帕肽。
作为优选地实施方式，步骤(1)中，所述流动相B乙腈的起始体积百分比为15％～25％，截至体积百分比为30％～40％，洗脱时间为60～100min。
优选地，步骤(1)中，所述磷酸盐选自磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的任意一种或任意混合。
优选地，步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液的浓度以磷酸根的浓度计为5～500mmol/L；进一步优选为20～200mmol/L。
在某些具体的实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的浓度以磷酸根的浓度计为5mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L或它们之间任意数值的浓度。
优选地，步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0～8.0。
在某些具体的实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.7、8.0或它们之间任意数值的pH。
在某些具体的实施方式中，所述磷酸盐缓冲液由磷酸与氨水、氢氧化钠或氢氧化钾混合配制而成。
作为优选地实施方式，步骤(1)中，所述特立帕肽粗肽溶液为将特立帕肽粗肽溶于乙腈和水的混合溶液；所述乙腈的体积百分比为5％～15％。
作为优选地实施方式，步骤(2)中，所述流动相B乙腈的体积百分比为5％～15％，所述冲洗时间为10～30min；
作为优选地实施方式，步骤(2)中，所述碳酸盐选自碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾中的任意一种或几种。
优选地，步骤(2)中，所述碳酸盐缓冲溶液的浓度为5～500mmol/L；进一步优选为20～200mmol/L。
在某些具体的实施方式中，所述碳酸盐缓冲溶液的浓度为5mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L或它们之间的任意数值。
优选地，步骤(2)中，所述碳酸盐缓冲溶液以醋酸调节pH为6.0～8.0。
在某些具体的实施方式中，所述碳酸盐缓冲溶液以醋酸调节pH为6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.7、8.0或它们之间的任意数值。
在某些具体的实施方式中，步骤(2)中，所述冲洗前，需将步骤(1)得到的洗脱组分进行稀释；所述稀释为用水进行稀释，具体为0.8～1.5倍体积的水进行稀释。
作为优选地实施方式，步骤(3)中，所述流动相B乙腈的起始体积百分比为5％～15％，截至体积百分比为50％～70％，洗脱时间为30～60min。
作为优选地实施方式，步骤(3)中，所述醋酸溶液的浓度为0.005％～0.05％。
在某些具体的实施方式中，所述醋酸溶液的浓度为0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％或它们之间的任意数值。
在某些具体的实施方式中，步骤(3)中，所述梯度洗脱还包括前处理，所述前处理为以所述流动相A3和流动相B进行冲洗。
优选地，所述冲洗时间为10～30min。
在本发明的技术方案中，所述纯化方法采用反相制备色谱柱；所述反相制备色谱柱的内装填料选自反相C18、C8和C4中的任意一种；
优选地，所述内装填料的粒径为5～10μm；所述内装填料的孔径为5～30nm。
作为优选地实施方式，步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)中，所述反相制备色谱柱的上样量为其内装填料质量的0.5％～5.0％，进一步优选为1.0％～3.0％。
在某些具体的实施方式中，步骤(1)中，所述梯度洗脱还包括前处理，所述前处理包括过滤和平衡制备色谱柱；所述平衡制备色谱柱为以所述流动相A1和流动相B平衡制备色谱柱，其中流动相B的体积百分比为5％～15％，采用合适的流动相比例使制备色谱柱内的乙腈体积百分比小于初始洗脱梯度，待处理的样品恰好能够吸附在色谱柱又不至于被洗脱。
在某些具体的实施方式中，步骤(3)中，还包括后处理，所述后处理包括减压旋蒸和冻干。
上述技术方案具有如下优点或者有益效果：本发明提供的特立帕肽的纯化方法，以磷酸盐缓冲溶液为流动相A1，乙腈为流动相B对特立帕肽粗肽溶液进行梯度洗脱，一步纯化即可得到纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的合格样品，而后转为醋酸盐。本发明通过一步纯化即可将单个杂质控制0.10％以内，避免多次纯化而导致有机溶剂消耗量过大，减少纯化的步骤及废液的排放，整个过程操作简单，生产周期短，环境友好，有利于大规模工业化生产。
附图说明
图1是实施例1中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
图2是实施例2中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
图3是实施例3中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
图4是实施例4中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
图5是实施例5中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
图6是对比例1中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
图7是对比例2中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
图8是对比例3中转盐冻干后的精肽的RP-HPLC图谱。
具体实施方式
下述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下提供的本发明实施例中的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
下述实施例与对比例中，特立帕肽粗品为通过基因重组、固相合成、液相合成或固液相结合合成制备得到。
实施例1：
称取120.0g特立帕肽粗品(含特立帕肽49.5g)，以3L乙腈的体积百分比为10％的乙腈/水溶解，0.45μm滤膜过滤。制备柱为15cm DAC，内装3.0kg的C18填料(
10μm为粒径、
为孔径，下述同理)。流动相A1为50mmol/L磷酸二氢铵水溶液，以氨水调节pH为7.5，流动相B为乙腈。90％A1+10％B平衡10min，流速500mL/min，上样后进行梯度洗脱，洗脱梯度为25％B-35％B/(100min)，收集纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的馏分，将70.0％≤纯度≤99.0％或纯度≥99.0％，单杂＞0.10％的馏分合并，上样后以A1和B进行梯度洗脱再纯化。
将所有合格馏分收集，加入等体积的水稀释，进行转盐。流动相A2为80mmol/L碳酸氢铵水溶液，以醋酸调节pH为7.0，流动相B为乙腈，流动相A3为0.01％的醋酸水溶液。上样后以90％A2+10％B冲洗10min，流速500mL/min；切换A2为A3(0.01％醋酸水溶液)，以90％A3+10％B冲洗10min，流速500mL/min，而后以A3和B进行梯度洗脱，洗脱梯度为10％B-60％B/(50min)，收集纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的馏分，旋蒸后冻干得醋酸特立帕肽32.0g，纯化回收率为64.6％，纯度为99.92％，最大单杂为0.02％。
图1为本实施例中的，转盐后精肽的测试图谱。
实施例2：
称取122.0g特立帕肽粗品(含特立帕肽50.3g)，以3L乙腈的体积百分比为10％的乙腈/水溶解，0.45μm滤膜过滤。制备柱为15cm DAC，内装3.0kg的C8填料
流动相A1为50mmol/L磷酸二氢钠水溶液，以50mmol/L的氢氧化钠水溶液调节pH为6.0，流动相B为乙腈。90％A1+10％B平衡10min，流速500mL/min，上样后进行梯度洗脱，洗脱梯度为25％B-35％B/(100min)，收集纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的馏分，将70.0％≤纯度≤99.0％或纯度≥99.0％，单杂＞0.10％的馏分合并，上样后以A1和B进行梯度洗脱再纯化。
将所有合格馏分收集，加入等体积的水稀释，进行转盐。流动相A2为80mmol/L碳酸氢钠水溶液，以醋酸调节pH为7.0，流动相B为乙腈，流动相A3为0.02％的醋酸水溶液。上样后以90％A2+10％B冲洗10min，流速500mL/min；切换A2为A3(0.01％醋酸水溶液)，再以90％A3+10％B冲洗10min，流速500mL/min，而后以A3和B进行梯度洗脱，洗脱梯度为10％B-60％B/(50min)，收集纯度≥99.0％，单杂≤0.10％的馏分，旋蒸后冻干得醋酸特立帕肽32.3g，纯化回收率为64.2％，纯度为99.95％，最大单杂为0.04％。
图2为本实施例中的，转盐后精肽的测试图谱。
实施例3-5、对比例1-3
申请人同时进行了以下的实施例和对比例，制备柱均为15cm DAC，内装3.0kg的C18填料
与上述实施例1和实施例2不同之处，汇总列于表1。
表1
实施例3-5中，转盐冻干后的精肽测试图谱分别见图3-5；对比例1-3中的转盐冻干后的精肽测试图分别由图6-8所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种特立帕肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以磷酸盐缓冲液为流动相A1，以乙腈为流动相B对特立帕肽粗肽溶液进行梯度洗脱，收集洗脱组分；
(2)将步骤(1)收集的洗脱组分以碳酸盐缓冲溶液为流动相A2，以乙腈为流动相B进行冲洗置换所述洗脱组分中的磷酸盐；
(3)转盐：以醋酸溶液为流动相A3，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，收集洗脱组分得醋酸特立帕肽。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述流动相B乙腈的起始体积百分比为15％～25％，截至体积百分比为30％～40％，洗脱时间为60～100min；
优选地，步骤(1)中，所述磷酸盐选自磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的任意一种或任意混合；
优选地，步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液的浓度以磷酸根的浓度计为5～500mmol/L；进一步优选为20～200mmol/L；
优选地，步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0～8.0。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述特立帕肽粗肽溶液为将特立帕肽粗肽溶于乙腈和水的混合溶液；所述乙腈的体积百分比为5％～15％。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述流动相B乙腈的体积百分比为5％～15％，所述冲洗时间为10～30min。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碳酸盐选自碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾中的任意一种或几种；
优选地，步骤(2)中，所述碳酸盐缓冲溶液的浓度为5～500mmol/L；进一步优选为20～200mmol/L；
优选地，步骤(2)中，所述碳酸盐缓冲溶液以醋酸调节pH为6.0～8.0；
优选地，步骤(2)中，所述冲洗前，需将步骤(1)得到的洗脱组分进行稀释；所述稀释为用水进行稀释，具体为0.8～1.5倍体积的水进行稀释。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述流动相B乙腈的起始体积百分比为5％～15％，截至体积百分比为50％～70％，洗脱时间为30～60min；
优选地，步骤(3)中，所述醋酸溶液的浓度为0.005％～0.05％。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法采用反相制备色谱柱；所述反相制备色谱柱的内装填料选自反相C18、C8和C4中的任意一种；
优选地，所述内装填料的粒径为5～10μm；所述内装填料的孔径为5～30nm。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)中，所述反相制备色谱柱的上样量为其内装填料质量的0.5％～5.0％，进一步优选为1.0％～3.0％。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述梯度洗脱还包括前处理，所述前处理包括过滤和平衡制备色谱柱；所述平衡制备色谱柱为以所述流动相A1和流动相B平衡制备色谱柱，其中流动相B的体积百分比为5％～15％。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，还包括后处理，所述后处理包括减压旋蒸和冻干。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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