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CN114460287A - 一种中和抗体的检测方法和试剂盒 - Google Patents

一种中和抗体的检测方法和试剂盒 Download PDF

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CN114460287A CN202210116181.9A CN202210116181A CN114460287A CN 114460287 A CN114460287 A CN 114460287A CN 202210116181 A CN202210116181 A CN 202210116181A CN 114460287 A CN114460287 A CN 114460287A
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antigen
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屈武斐
周丽
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Venture Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及中和抗体的检测方法和试剂盒。本发明提供一种处理碳纳米材料的方法，包括以下步骤：(1)在表面活性剂存在的条件下对溶剂中的碳纳米材料超声，得到纳米碳分散体，任选的(2)分离和/或洗涤纳米碳。本发明还涉及使用所述处理的碳纳米材料制备的纳米碳检测制品和试剂盒。本发明操作简单，结果直观，适合现场快速检测。

Description

一种中和抗体的检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域，具体而言，涉及一种中和抗体的检测方法和试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(以下简称新冠)是一种单链的正义RNA病毒，基因组长度约29.8KB。基因组主要编码四种结构蛋白：刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M及核衣壳蛋白N。其中S蛋白上含有受体结合结构域RBD，可识别宿主细胞受体-血管紧张素转换酶2(ACE2)并介导膜融合，使病毒吸附入侵细胞。针对S-RBD产生的特异性抗体即中和抗体可以阻断新冠病毒与ACE2结合，从而使病毒不能入侵。
疫苗接种被公认为是控制病毒流行最经济、最有效的方法。接种疫苗后，产生的保护效果并不确定，评估疫苗有效性的重要指标之一就是接种者体内中和抗体的水平。
传统评价疫苗的方法是通过中和实验病毒侵染验证法，采用活病毒来验证中和抗体的效能。其对实验室安全性及操作人员技能要求较高，且操作复杂，耗时长。因此，建立快速检测新冠中和抗体的方法十分有意义。基于中和抗体与新冠病毒结合的特点以及病毒侵染机制，市场上已有多种快速检测新冠中和抗体的产品。
其中常用的酶联免疫吸附实验(ELISA)，比如金斯瑞生产的cPassTMsVNT新冠中和抗体检测试剂盒，检测主要过程是将S-RBD蛋白包被到酶标板上，孵育过夜后清洗，加入待测样品和ACE2，孵育后洗涤，再加入HRP标记的二抗，孵育后洗涤再加入显色剂TMB，反应后再加入终止液，最后在酶标仪上读数OD450，通过OD值计算其样品抑制率，来确定是否含有中和抗体。ELISA方法检测过程需要多次洗板、加样，步骤多、时间长，需要仪器辅助且结果还需要计算，对于快速检测结果不是很直观。
还有常用的胶体金免疫层析法，市场上多利用竞争法来检测中和抗体。即将S-RBD蛋白用胶体金标记后固定于结合垫上，ACE2包被在硝酸纤维素膜上为检测线，当待测样品中有新冠中和抗体时，中和抗体会与胶体金标记的RBD抗原特异结合，降低了RBD和ACE2的结合效率，检测线显色会下降。反应结束后，直接肉眼观察与比色卡比较，或通过比较检测线与质控线显色强弱，来判断中和抗体的水平。胶体金竞争法检测中和抗体时，当中和抗体浓度较低时显色下降分辨率低，难以判读。另外由于中和抗体检测多为全血样品，胶体金红色易受到血液的影响。
纳米碳材料在免疫层析行业有所使用，能够克服胶体金的缺点但未能大规模应用，主要是对纳米碳的处理方法有待优化。常规的处理方法在使用纳米碳时，会导致纳米碳作为标记物，溶解度、储存稳定性以及标记稳定性都有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单快捷的病毒中和抗体检测试剂盒和检测方法。
本发明第一方面提供一种处理碳纳米材料的方法，包括以下步骤：
(1)在表面活性剂存在的条件下对溶剂中的碳纳米材料超声，得到纳米碳分散体；
任选的(2)分离和/或洗涤纳米碳。
在一个或多个实施方案中，所述溶剂是极性溶剂，例如水，优选去离子水。
在一个或多个实施方案中，碳纳米材料在溶剂中的浓度为1-30mg/mL、2-25mg/mL、5-20mg/mL、7-15mg/mL、8-12mg/mL、10mg/mL。
在一个或多个实施方案中，碳纳米材料包括但不限于碳纳米管、碳纳米球，优选多壁碳纳米管。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)中的表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、Tetronic 1307、S17、PEG与PVP；优选为PVP。所述表面活性剂的浓度为0.1-3％、优选为0.1-2％、更优选0.1-0.8％。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)中的超声的功率可以是80-200W、优选为100W。超声时间为1-3小时。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)中的分散体的稳定性可用400nm吸光度来表示。所述分散体在400nm下吸光度可以在10天维持在0.468以上，在20天维持在0.440以上，在30天维持在0.455以上；优选地，可以在60天维持在0.431以上。
在一个或多个实施方案中，所述方法还可在步骤(1)之后包含用400nm吸光度测定分散体稳定性的步骤。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)的分离纳米碳包括离心步骤。离心的转速可以是10000-15000转/分钟。离心的时间可以是10-40min，优选为15min-30min。步骤(2)的洗涤纳米碳包括使用洗涤剂重悬和分离纳米碳的过程。
本发明第二方面提供一种制备纳米碳偶联物的方法，包括以下步骤：
(1)在表面活性剂存在的条件下对溶剂中的碳纳米材料超声，得到纳米碳分散体；
(2)分离和/或洗涤纳米碳；
(3)活化纳米碳；
(4)在偶联液中混合纳米碳和抗原物并孵育，得到偶联物。
步骤(1)、(2)如本文第一方面的步骤(1)、(2)所述。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中使用EDC和NHS活化纳米碳。在一个或多个实施方案中，纳米碳与EDC和NHS的重量比为0.5-2:0.5-2:0.5-2，优选为1:1:1。活化的时间可以是20-50min、优选30min。所述活化可在偶联液中进行。活化前优选进行超声分散以加速活化。
在一个或多个实施方案中，步骤(4)中的偶联液中纳米碳和抗原物的重量比为30:1至10：1，优选20:1。纳米碳和抗原物优选先在偶联液中溶解稀释后再混合。孵育时间可以是20-50min、优选为30min。
在一个或多个实施方案中，所述偶联液含有2-吗啉乙磺酸(MES)。所述偶联液中MES的浓度是1-200mM，优选20-100mM，更优选约50mM。所述偶联液的pH值是5.0-7.0、优选5.5-6.5、更优选约6.0。
在一个或多个实施方案中，与纳米碳偶联(标记)的抗原物可以是任何具有免疫原性的大分子，包括但不限于蛋白、多糖、核酸。
在一个或多个实施方案中，抗原物是抗体，例如IgG、IgM或IgA。
在一个或多个实施方案中，抗原物是病毒抗原，例如病毒的蛋白或多糖。优选地，所述抗原物是冠状病毒的刺突蛋白或其受体结合结构域(例如新冠病毒的S-RBD)或鼠IgG(例如用于对照)。
在一个或多个实施方案中，所述制备纳米碳偶联物的方法还可包含步骤：将偶联液中未偶联的纳米碳封闭。
在一个或多个实施方案中，所述制备纳米碳偶联物的方法还可包含步骤：将纳米碳偶联物悬于纳米碳保存液。
在一个或多个实施方案中，所述纳米碳保存液包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)，优选还含有牛血清白蛋白(BSA)。Tris的浓度为1-200mM，优选20-100mM，更优选约50mM。所述牛血清白蛋白的浓度是0.1-2％、优选0.2-1％，更优选是约0.5％。在一些实施方案中，所述纳米碳保存液的pH值为7-9，优选7.5-8.5，更优选约8。
本发明还提供一种制备纳米碳检测制品的方法，所述方法包括：将本文第二方面任一实施方案所述的方法制备的纳米碳偶联物分布在固相载体上。
在一个或多个实施方案中，固相载体是玻璃纤维。
在一个或多个实施方案中，所述检测制品是检测卡。
在一个或多个实施方案中，所述检测卡包括：样品垫、结合垫、检测垫，其中分布有纳米碳偶联物的固相载体位于结合垫。
在一个或多个实施方案中，所述检测垫含有与待测中和抗体结合的抗原或抗体。
在一个或多个实施方案中，所述结合垫还包含用作对照的纳米碳偶联物，其中所述与纳米碳偶联的抗原物是对照抗体(例如IgG)；所述检测垫还含有与所述对照抗体结合的抗原或抗体。
在一个或多个实施方案中，检测垫包含硝酸纤维素膜，其上固定有与待测中和抗体结合的抗原或抗体和/或与所述对照抗体结合的抗原或抗体。所述方法还包括将所述抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述检测卡还含有滤血膜和/或吸收垫。所述方法还包括制备滤血膜的步骤和/或制备吸收垫的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述中和抗体是新冠病毒中和抗体。
在一个或多个实施方案中，所述方法还可包括组装滤血膜、样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫的步骤，其中，样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫依次相邻，滤血膜位于样品垫之上，并且相邻区域的边缘重叠。
本发明还提供一种用于检测中和抗体的纳米碳检测制品，包含本文第二方面任一实施方案所述的方法制备的纳米碳偶联物。
在一个或多个实施方案中，纳米碳偶联物分布在固相载体上。
在一个或多个实施方案中，所述检测制品是检测卡。
在一个或多个实施方案中，所述检测卡包括：样品垫、结合垫、检测垫，其中分布有纳米碳偶联物的固相载体位于结合垫。
在一个或多个实施方案中，所述检测垫含有与待测中和抗体结合的抗原或抗体。
在一个或多个实施方案中，所述结合垫还包含用作对照的纳米碳偶联物，其中所述与纳米碳偶联的抗原物是对照抗体(例如IgG)；所述检测垫还含有与所述对照抗体结合的抗原或抗体。
在一个或多个实施方案中，检测垫包含硝酸纤维素膜，其上固定有与待测中和抗体结合的抗原或抗体和/或与所述对照抗体结合的抗原或抗体。
在一个或多个实施方案中，所述检测卡还含有滤血膜和/或吸收垫。
在一个或多个实施方案中，所述中和抗体是新冠病毒中和抗体。
在一个或多个实施方案中，所述检测卡包含依次相连的样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫，并且滤血膜位于样品垫之上。其中，相邻区域的边缘重叠。
本文所述的处理碳纳米材料的方法、制备纳米碳偶联物的方法在制备纳米碳检测制品中的用途。所述检测制品是检测卡。
附图说明
图1：碳纳米材料活化前后示意图，左图为活化前，右图为活化后。
图2：阴性样本示意图。
图3：阳性样本示意图。
图4：质控品浓度梯度检测。
图5：国家标准品梯度检测。
图6：实施例1的纳米碳处理前后的效果图，左图为处理前，右图为处理后。
图7：检测卡内部基本结构组成。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本文中，“包含”、“包括”、“含有”以及类似的用语涵盖了“基本由……组成”和“由……组成”的意思，例如，当本文公开了“A包含B和C”时，“A基本由B和C组成”和“A由B和C组成”应当认为已被本文所公开。
在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
本文中，若无特别说明，百分比是指质量百分比，比例是指质量比。
本文中，当描述实施方案或实施例时，应理解，其并非用来将本发明限定于这些实施方案或实施例。相反地，本发明所描述的方法及材料的所有的替代物、改良物及均等物，均可涵盖于权利要求书所限定的范围内。
本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明提供了一种利用标记的抗原检测抗体的方法、装置和装置的制备方法。本发明基于免疫层析技术，采用纳米碳标记夹心法检测抗体。发明人发现，通过对碳纳米材料进行处理，使其表面附着表面活性剂(如图1所示)，可以均匀稳定地分散在水相中，以便于抗原或抗体的标记。分散的纳米碳可用于制备快速检测装置(例如检测卡)，可以在15min内测定中和抗体(例如针对新型冠状病毒S蛋白或S-RBD的中和抗体)的水平。
因此，本发明首先提供一种处理碳纳米材料或制备纳米碳的方法，包括以下步骤：
(1)在表面活性剂存在的条件下对溶剂中的碳纳米材料超声，得到纳米碳分散体；
任选的(2)分离和/或洗涤纳米碳。
本领域中任何形式或形状的碳纳米材料均适用于上述方法，包括但不限于碳纳米管、碳纳米球，优选多壁碳纳米管。碳纳米材料的尺寸不受限制。本文中，经本发明方法处理后的碳纳米材料称为“纳米碳”。
通常，碳纳米材料与溶剂形成混合物，绝大部分碳纳米材料沉淀于溶剂底部。经步骤(1)处理后的纳米碳均匀分散地悬浮于溶剂中，如图6所示。所述溶剂是极性溶剂，例如水，优选去离子水。碳纳米材料在溶剂中的浓度为1-30mg/mL、2-25mg/mL、5-20mg/mL、7-15mg/mL、8-12mg/mL、10mg/mL。
步骤(1)中的表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、Tetronic 1307、S17、PEG与PVP；优选为PVP。所述表面活性剂的浓度为0.1-3％，例如0.2-2.5％、0.3-2.0、0.4-1.5％、0.5-1.0％、0.6-0.8％、2％-3％或0.1-1％。
步骤(1)中的超声的功率可以是80-200W、优选为100W。超声时间为1-3小时。超声可以是持续超声或循环超声。对于循环超声，超声开时间可以是1-3s、优选为1s；超声关时间可以是1-3s、优选为2s；循环超声总时长可以是1-10h；优选为2-8h，例如2h、4h、5h、6h、8h。
步骤(1)中的分散体的稳定性可用400nm吸光度来表示。所述分散体在400nm下吸光度可以在10天维持在0.468以上，在20天维持在0.440以上，在30天维持在0.455以上；优选地，可以在60天维持在0.431以上。因此，为了确定分散体的质量，纳米碳处理方法还可在步骤(1)之后包含用400nm吸光度测定分散体稳定性的步骤。
步骤(2)的分离纳米碳包括任何利用纳米碳的化学或物理特性将其与溶液中的其他组分分离的过程。示例性方法例如离心。离心的转速可以是10000-15000转/分钟。优选为13000转/分钟。离心的时间可以是10-40min，优选为15min-30min。步骤(2)的洗涤纳米碳包括使用洗涤剂重悬和分离纳米碳的过程。洗涤剂包括但不限于：Triton X-100、Tween-20、Tetronic 1307、S17、S9、PVA、PEG、PVP，优选为步骤(1)的溶剂。其中分离纳米碳的方法如上所述，优选离心。步骤(2)中洗涤的次数可以是多次，优选为至少两次。
制备得到的纳米碳可用于偶联抗原物。本发明还提供制备纳米碳偶联物的方法，包括
(1)在表面活性剂存在的条件下对溶剂中的碳纳米材料超声，得到纳米碳分散体；
(2)分离和/或洗涤纳米碳；
(3)活化纳米碳；
(4)在偶联液中混合纳米碳和抗原物并孵育，得到偶联物。
步骤(1)、(2)如本文处理碳纳米材料的方法所述。
通常，纳米碳经活化以提高抗原偶联效率。所述活化指活化纳米碳上的基团，例如羧基。示例性地，EDC和NHS是用来偶联抗原物氨基和纳米碳羧基的常用试剂。纳米碳与EDC和NHS的重量比为0.5-2:0.5-2:0.5-2，优选为1:1:1。活化的时间可以是20-50min、优选30min。所述活化可在偶联液中进行。活化前优选进行超声分散以加速活化。
步骤(4)中的偶联液中纳米碳和抗原物的重量比为30:1至10：1，优选20:1。纳米碳和大分子优选先在偶联液中溶解稀释后再混合。孵育时间可以是20-50min、优选为30min。可根据抗原物上的氨基含量确定其与纳米碳比例和孵育时间。步骤(4)获得的碳纳米偶联物可离心与液体分离。
所述偶联液可以是2-吗啉乙磺酸(MES)，所述偶联液中MES的浓度可以是约50mM，所述偶联液的pH值可以是约6.0。
本文的纳米碳偶联物中，与纳米碳偶联(标记)的抗原物可以是任何具有免疫原性的大分子，包括但不限于蛋白、多糖、核酸。抗原物本身可以是抗体，例如IgG、IgM或IgA。抗原物优选是病毒抗原，例如病毒的蛋白或多糖，特别是病毒表面蛋白或其受体结合结构域(RBD)，优选冠状病毒的S蛋白或其RBD。在优选实施方案中，抗原物是新冠病毒S-RBD(新冠病毒S蛋白受体结合结构域)或鼠IgG(用于对照)。
为了不影响检测，所述制备纳米碳偶联物的方法还可包含步骤：将偶联液中未偶联的纳米碳封闭。封闭剂可以是任何适用于封闭纳米碳的试剂，例如BSA、Tween20或多种封闭剂联合使用。BSA封闭剂的用量可以是封闭液总量的2％，Tween20封闭液的浓度可以是封闭液总质量的1％。例如为50mM的Tris中的2％BSA，或者为10％的Tween 20。封闭时间可以是20-40min、优选为30min。封闭获得的纳米碳偶联物可离心与液体分离。
所述制备纳米碳偶联物的方法还可包含步骤：将纳米碳偶联物悬于纳米碳保存液，纳米碳保存液可以是任何适用于保存纳米碳偶联物的试剂，例如三羟甲基氨基甲烷(Tris)。纳米碳保存液中可以含有牛血清白蛋白(BSA)。示例性纳米碳保存液为50mM的Tris中的0.5％BSA。为了混合均匀，可振荡、超声、搅拌所得液体。该步骤可进行多次，每次离心后再次加入保存液，保存液用量依次递减。保存液中的纳米碳偶联物可以溶液的形式直接用于检测或分布在干燥固相载体上。
在具体实施方式中，制备纳米碳偶联物的方法包括如下步骤：
(1)将偶联液中的制备好的纳米碳超声分散，置于离心管中；
(2)用偶联液现配EDC和NHS，分别添加到含有纳米碳备用液的离心管中，混匀，静置室温活化；
(3)将待标记抗体于偶联液中稀释，加入活化好的纳米碳溶液，混匀，室温偶联；
(4)添加封闭液，混匀室温封闭；
(5)离心，弃上清；
(6)加入纳米碳保存液，超声均匀，离心，弃上清；
(7)加入纳米碳保存液，超声均匀；
(8)将标记好的纳米碳稀释(1:12-1:20，优选为1:15)铺于结合垫上，37℃烘干过夜，裁切干燥封存。所述结合垫材质可以为玻璃纤维。
基于本文所述的纳米碳偶联物的制备方法，本发明还提供制备纳米碳检测制品的方法，所述方法包括：将由本文所述制备纳米碳偶联物的方法制备的纳米碳偶联物分布在固相载体上。优选的固相载体是玻璃纤维。所述检测制品的优选示例是检测卡。
在一些实施方案中，检测卡包括：样品垫(或样品区)、结合垫(或接合区)、检测垫(或检测区)，其中分布有纳米碳偶联物的固相载体位于结合垫。
所述样品垫用于接受样品。制备样品垫的步骤包括：用40ml的样品垫处理液浸润样品垫基材至表面无气泡，37℃烘干过夜。样品垫裁切后干燥封存。样品垫处理液的组成本领域周知，例如可以是四硼酸钠缓冲液。所述样品垫处理液的使用量可以是30-50ml、优选为40ml。可使用本领域周知的任何样品垫基材，例如：聚酯纤维膜、玻璃纤维8955、8964、Z90B、Z60B、KB50等，优选为玻璃纤维8964。
样品垫上可覆盖或部分覆盖有滤血膜。滤血膜用于在样品移动经过时将血液中的红细胞等干扰组分截留。所述方法还包括制备滤血膜的步骤。制备滤血膜的步骤可包括：用滤血膜处理液浸润滤血膜基材至表面无气泡，37℃烘干过夜。滤血膜裁切后干燥封存。滤血膜处理液的组成本领域周知，例如可以使用含0.1-1.0mg/ml RBC抗体的5-10mg/ml柠檬酸三钠溶液。所述滤血膜处理液的使用量根据滤血膜尺寸而定，可以是30-50ml、优选为40ml。可使用本领域周知的任何滤血膜基材，例如Whatman的LF1、VF1、VF2、MF1，科百特RB0.45、RB1.1、PSM0180-B等，优选科百特RB0.45。
所述结合垫含有固相载体，其上分布有纳米碳偶联物，其中与纳米碳偶联的抗原物是能与中和抗体特异结合的抗原(例如新冠病毒的S-RBD)。固相载体可以是任何可附着纳米碳偶联物的材料，例如玻璃纤维。附着的纳米碳偶联物在接触样品后会脱离附体载体并伴随样品的毛细作用向前移动。例如纳米碳可附着在玻璃纤维上，并在接触样品后溶解并和样品一起移动。所述结合垫(例如其中的固相载体上)还可包含用作对照的纳米碳偶联物，其中所述与纳米碳偶联的抗原物是对照抗体(例如IgG)。用于检测样品中和抗体的纳米碳偶联物和用作对照的纳米碳偶联物可以混合分布于结合垫，或者可以分别位于不同的结合垫。含有纳米碳偶联物的结合垫优选是邻近的。结合垫的制备步骤包括：将检测中和抗体的纳米碳偶联物和用作对照的纳米碳偶联物按合适比例(优选1:15)铺于结合垫基材上，37度烘干，制备得到结合垫。具体地，结合垫的制备步骤包括：将用于检测样品中和抗体的纳米碳偶联物和用作对照的纳米碳偶联物均按合适比例(优选1:15)用结合垫处理液稀释，用稀释物14ml处理结合垫基材至表面无气泡，37℃烘干过夜，结合垫裁切后干燥封存。结合垫处理液的组成本领域周知，例如可以是TRIS缓冲液。所述结合垫处理液的使用量可以是12-15ml、优选为14ml。可使用本领域周知的任何结合垫基材，例如：玻璃纤维8955、8964、Z90B、Z60B、KB50等，优选为玻璃纤维KB50。
所述检测垫含有与待测中和抗体结合的抗原或抗体(本文还称为T线)。所述抗原优选新冠病毒的S-RBD。检测垫是用于固定所述抗原或抗体的固相载体，例如硝酸纤维素膜。因此，所述方法还包括将所述抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上的步骤。此外，所述检测垫还含有(例如固定在硝酸纤维素膜上)与所述对照抗体结合的抗原或抗体(本文还称为C线)。固定在检测垫上的抗原或抗体不会随着样品的移动而移动。
含有硝酸纤维素膜的检测垫的制备步骤包括：(1)质控线(C线)、检测线(T线)包被液的配制；(2)采用喷金划膜仪，将C线抗体、T线抗原分别包被在固定于PVC底板的硝酸纤维素膜上。所述检测线(T线)包被液的配制为用缓冲液将S-RBD稀释至约1.5mg/ml；所述质控线(C线)包被液的配制为用缓冲液将羊抗鼠IgG稀释至约2.0mg/ml。所述稀释所用的稀释液本领域周知，例如包括约10mM PBS、约1％蔗糖和约0.1％proclin 300的缓冲液(pH为7.4)。
所述检测卡还可含有吸收垫，用于提供液体在检测卡中流动通过结合垫和检测垫的吸力。吸收垫的材料为具有快速爬速以及具有很高水吸附能力的厚纤维素材料。所述方法还包括制备吸收垫的步骤。
制备检测制品的方法还可包括组装滤血膜、样品区、结合区、检测区和/或吸收垫的步骤，相邻区域或部件的边缘重叠。具体地，所述组装可以是：将制备好的检测垫粘贴吸水纸(即吸收垫)，粘贴于底板(例如PVC底板)上，然后按照顺序依次粘贴：结合垫(IgG)、结合垫(S-RBD)、样品垫、滤血膜，得到所述检测卡(如图6所示)。所述方法还包括将检测卡切割成宽3-4mm的试剂条的步骤。
本发明还提供了一种纳米碳标记免疫层析法检测中和抗体(例如新型冠状病毒的中和抗体)的试剂盒，所述试剂盒包括含有本文所述的检测制品，例如检测卡。所述试剂盒操作简单，结果直观，适合现场快速检测，可用于新型冠状病毒感染疑似人群和新型冠状病毒疫苗免疫者的血清、血浆或全血中的新型冠状病毒中和抗体的检测。所述试剂盒还包括使用检测制品检测中和抗体的操作说明书、试剂条外壳、任选的血液预处理试剂(例如10mM的PBS)等。本发明中，所述试剂盒的检测灵敏度高，检测限低至500ng/ml。
检测原理
本试剂盒采用纳米碳免疫层析技术，双抗原夹心法检测新冠中和抗体的含量。试剂条采用硝酸纤维素(NC)膜作为基质，固定的S-RBD(检测线T线)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C线)作为检测线。结合垫采用S-RBD和鼠IgG纳米碳标记，检测时当取接种疫苗后的血清或全血滴在试纸条加样区(样品垫)，样品会在毛细作用下向前层析，结合垫上的纳米碳会溶解，然后和样品一起向前移动。样品到达检测区后，纳米碳标记的S-RBD、样品中的中和抗体与检测线上包被的S-RBD形成复合物，表现为检测线显灰色或黑色，样品中的抗体含量与检测线显色强度成正相关。反应结束后，直接肉眼观察显色情况进行测试，通过检测线上胶体碳显色强弱，可判断RBD抗体的含量。无论检测线显色强度如何，质控线都应当显黑色。质控线上没有显色信号意味着测试无效，样品必须重新测试。
本发明的有益效果如下：
本发明采用了胶体碳标记方法制备一种新冠中和抗体试剂盒，纳米碳原材料廉价且环保，与硝酸纤维素膜黑白颜色对比更易分辨，解决了胶体金竞争法在中和抗体浓度较低时分辨率低，难以判读的问题；通过滤血膜处理全血样本，使用微量样本，滴加样本缓冲液，15min内快速检测人血清、血浆、全血样本中的新型冠状病毒中和抗体的含量；同时克服了采用荧光免疫层析竞争法检测中技术复杂、成本高等缺点。本发明操作简单，特异性高、灵敏度高，结果直观，安全廉价，是一种简单、准确而又经济的现场检测方法。
本发明采用了夹心法检测新冠总中和抗体，选用高特异性的新冠病毒S蛋白的S-RBD，能对人体产生的总中和抗体，包括IgA、IgM和IgG进行有效检测。
实施例
实施例1，纳米碳处理
纳米碳处理过程：
1、取10mg多壁碳纳米管添加到1mL去离子水中；
2、将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)添加到步骤1中的液体并进行超声，PVP浓度为0.6％。超声参数：超声功率：100W；超声开时间：1s；超声关时间：2s；超声总时间：2-8h。
PVP含量 0 0.1 0.3 0.6 0.8 1.0 2.0
400nm吸光度 / 0.476 0.482 0.492 0.432 0.401 0.368
3、通过在初始分散后第10、20、30和60天测量吸光度，研究了分散体的稳定性。数据显示，经处理后纳米碳体系保持基本稳定；
分散天数(天) 0 10 20 30 60
400nm吸光度 0.489 0.468 0.440 0.455 0.431
4、对超声好的纳米碳进行离心，纯水洗涤2次，洗去多余的表面活性剂；
5、去上清。用偶联液进行第三次离心(离心参数：转速：13000转/分钟，离心30min)；
6、去上清，用偶联液5ml重悬混匀，待用。
实施例2，制备检测卡
滤血膜的制备
滤血膜处理液为柠檬酸三钠(8mg/ml)、RBC抗体(0.5mg/ml，广州格瑞林，货号G0093R)，每张滤血膜(科百特RB0.45，250mm*300mm)用40ml的滤血膜处理液浸润至表面无气泡，37℃烘干过夜；裁切后干燥封存。
样品垫的制备
样品垫处理液为四硼酸钠缓冲液，每张样品垫(玻璃纤维8964，254mm*300mm)用40ml的样品垫处理液浸润至表面无气泡，37℃烘干过夜；裁切后干燥封存。
碳垫(结合垫)的制备
首先是S-RBD纳米碳的标记，具体步骤如下：
(1)超声仪将实施例1制备的纳米碳分散，取400ul纳米碳于1.5ml离心管中；
(2)用偶联液现配0.8mg/ml的EDC和0.8mg/ml的NHS；
(3)400ul纳米碳中加100ul的0.8mg/ml的EDC和100ul的0.8mg/ml的NHS，混匀，静置室温活化30min；
(4)40ug新冠病毒S-RBD(或对照鼠IgG)稀释至100ul的偶联液中，加入到活化好的纳米碳溶液中混匀，室温偶联30min；
(5)加封闭液1#(50mM的Tris(三羟甲基氨基甲烷)，2％的BSA(牛血清白蛋白)，pH8.0)300ul，再加封闭液2#(10％Tween20)100ul，混匀室温封闭30min；
(6)离心13000rpm，15min后，弃上清；
(7)加400ul的碳保存液(50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.5％的牛血清白蛋白(BSA)，pH 8.0)，超声均匀，再离心13000rpm，15min后，弃上清；
(8)加200ul的碳保存液，超声均匀；
(9)铺垫。将标记好的用于检测样品中和抗体的纳米碳偶联物和用作对照的纳米碳偶联物按1：15用结合垫处理液稀释，然后取14ml稀释物铺于玻璃纤维KB50上(200mm*280mm，通晟(福州)纸业有限公司)，至表面无气泡；
(10)37度烘干过夜，制备得到结合垫(RBD碳垫)。
同样的方法用纳米碳标记鼠IgG。
将烘干的鼠IgG和RBD碳垫，裁切成5mm宽，干燥封存。
检测垫(含硝酸纤维素膜)的制备
首先是C、T线包被液的配制：
(1)T线包被液的配制：用缓冲液将S-RBD稀释至1.5mg/ml(缓冲液pH值为7.4，包括10mM PBS、1％蔗糖和0.1％proclin300)；
(2)C线包被液配制：用缓冲液(同T线)将羊抗鼠IgG稀释至2.0mg/ml；
(3)硝酸纤维素膜的粘贴：使用PVC底板，撕掉中间处的保护纸，将硝酸纤维素膜沿上面保护纸的下边缘粘贴；
(4)采用喷金划膜仪，将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜上；
(5)将划好的PVC板37℃烘干过夜，加入干燥剂封存备用。
大卡组装：烘好的硝酸纤维素膜，先贴吸水纸(吸收垫)17mm于PVC底板上，按照顺序依次粘贴，碳垫鼠IgG、碳垫RBD蛋白、样品垫、滤血膜；
组成大板后，切割成4mm宽的试纸条，安装到外壳上，加干燥剂于常温下密封保存，即为所述的检测卡。
实施例3，检测卡的检测方法
阴性样本：选择未接种疫苗的人体静脉血全血、血浆、血清以及指尖血作为阴性样本；
按照试剂盒说明书操作：加入阴性样本25μl，滴加3滴样本稀释液，15min判读结果。测试结果如图1所示，阴性样本测试质控线正常，且阴性全血、阴性指尖血、阴性血清和阴性血浆无明显差异，均为阴性，全血和指尖血测试背景干净；
阳性样本：使用未接种疫苗的人体静脉血全血、血浆、血清阴性样本及样本稀释液(稀释液为10mM的PBS，pH值为7.4)，分别100倍稀释国家新冠中和抗体标准品为阳性样本测试。
按照试剂盒说明书操作：加入阳性样本25μl，滴加3滴样本稀释液，15min判读结果。测试结果如图2所示，阳性样本测试中均有C、T线，显色均一，且使用阴性全血、阴性血清、阴性血浆和样本稀释液稀释的阳性质控品无明显差异，不影响实验结果。
梯度检测
用样本稀释液对中和抗体质控品进行不同浓度稀释20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.1ug/ml，及对国家新冠中和抗体标准品进行梯度稀释：1:10、1:20、1:50、1:100、1:200、1:400，结果如图3所示，本发明试剂盒检测质控品灵敏度达500ng/ml，国家中和抗体标准品灵敏度达1:100即10U/ml；对国家标准品1:50、1:100重复性检测(如图4所示)，结果显色一致，实验结果稳定，检测数据如下：
表1：梯度检测结果
质控品浓度 0.1ug/ml 0.25ug/ml 0.5ug/ml 1ug/ml 2.5ug/ml 5ug/ml
比色结果 C1 C1 C3.5 C4 C5 C7
标准品稀释比 1:400 1:200 1:100 1:50 1:20 1:10
比色结果 C1 C3 C3.5 C4 C5+ C6+
实施例4，真实样本检测
按照试剂盒说明书操作：取指尖血25ul，滴加3滴样本稀释液，15min判读结果。
通过检测125个临床样本：64个阴性样本未接种新冠疫苗且未感染者，7个未接种疫苗感染者，31个接种辉瑞疫苗，18个接种莫德纳疫苗，5个接种强生疫苗。检测结果如下：
所有测试者检测背景干净，可以检测出不同含量的中和抗体水平。
表2：真实样本检测结果
Figure BDA0003494192100000171
从实施例1试剂盒检测卡的制备和实施例2检测方法的验证，本专利提供的一种检测新型冠状病毒中和抗体的纳米碳标记免疫层析法和试剂盒，操作简单，灵敏度高，结果直观，是一种简单、准确而又经济的现场快速检测方法。

Claims (10)

1.一种处理碳纳米材料的方法，包括以下步骤：
(1)在表面活性剂存在的条件下对溶剂中的碳纳米材料超声，得到纳米碳分散体，
任选的(2)分离和/或洗涤纳米碳；
优选地，所述溶剂是极性溶剂，例如水，
优选地，所述表面活性剂选自以下的一种或多种：Triton X-100、Tween-20、Tetronic1307、S17、PEG与PVP，
优选地，碳纳米材料包括碳纳米管、碳纳米球。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包含选自以下的一项或多项特征，
所述表面活性剂的浓度为0.1-3％，
碳纳米材料在溶剂中的浓度为1-30mg/mL，
步骤(1)中的超声的功率是80-200W，
步骤(1)中的超声的时间为1-3小时，
所述方法还在步骤(1)之后包含用400nm吸光度测定分散体稳定性的步骤，
步骤(2)的分离纳米碳包括离心步骤，
步骤(2)的洗涤纳米碳包括使用洗涤剂重悬和分离纳米碳的过程。
3.一种制备纳米碳偶联物的方法，包括以下步骤：
(1)在表面活性剂存在的条件下对溶剂中的碳纳米材料超声，得到纳米碳分散体；
(2)分离和/或洗涤纳米碳；
(3)活化纳米碳；
(4)在偶联液中混合纳米碳和抗原物并孵育，得到偶联物，
所述方法还包含选自以下的一项或多项特征，
所述溶剂是极性溶剂，例如水，
所述表面活性剂选自以下的一种或多种：Triton X-100、Tween-20、Tetronic 1307、S17、PEG与PVP，
所述表面活性剂的浓度为0.1-3％，
所述碳纳米材料包括碳纳米管、碳纳米球，
碳纳米材料在溶剂中的浓度为1-30mg/mL，
步骤(1)中的超声的功率是80-200W，
步骤(1)中的超声的时间为1-3小时，
步骤(2)的分离纳米碳包括离心，
步骤(2)的洗涤纳米碳包括使用洗涤剂重悬和分离纳米碳的过程。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(3)中使用EDC和NHS活化纳米碳，
纳米碳与EDC和NHS的重量比为0.5-2:0.5-2:0.5-2，
活化的时间是20-50min，
所述活化在偶联液中进行。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(4)中的偶联液中纳米碳和抗原物的重量比为30:1至10:1，
步骤(4)中的孵育时间是20-50min，
所述偶联液含有2-吗啉乙磺酸，
所述偶联液中2-吗啉乙磺酸的浓度是1-200mM，
所述偶联液的pH值是5.0-7.0，
与纳米碳偶联的抗原物是具有免疫原性的蛋白、多糖或核酸；优选地，所述抗原物是抗体或病毒抗原；更优选地，所述抗原物是新冠病毒的S-RBD或鼠IgG。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述方法还包含步骤：将偶联液中未偶联的纳米碳封闭，
所述方法还包含步骤：将纳米碳偶联物悬于纳米碳保存液中，
所述纳米碳保存液含有Tris，优选还含有牛血清白蛋白。
7.一种制备纳米碳检测制品的方法，所述方法包括：将权利要求3-5中任一项所述的方法制备的纳米碳偶联物分布在固相载体上，
所述检测制品用于检测中和抗体，所述中和抗体优选是新冠病毒的中和抗体，
所述固相载体是玻璃纤维，
所述检测制品是检测卡，
所述检测卡包括：样品垫、结合垫、检测垫，其中分布有纳米碳偶联物的固相载体位于结合垫。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述检测垫含有与待测中和抗体结合的抗原或抗体，所述方法还包括将所述抗原或抗体固定在检测垫上的步骤；优选地，所述抗原是新冠病毒S-RBD，
所述纳米碳偶联物中与纳米碳偶联的抗原物是新冠病毒S-RBD；所述结合垫还包含用作对照的纳米碳偶联物，其中与纳米碳偶联的抗原物是对照抗体，并且所述检测垫还含有与所述对照抗体结合的抗原或抗体，所述方法还包括将与所述对照抗体结合的抗原或抗体固定在检测垫上的步骤，
所述检测卡还含有滤血膜和/或吸收垫，所述方法还包括制备滤血膜的步骤和/或制备吸收垫的步骤，
所述方法还可包括组装滤血膜、样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫的步骤，其中，样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫依次相连，滤血膜位于样品垫之上，并且相邻区域的边缘重叠。
9.一种用于检测中和抗体的纳米碳检测制品，包含权利要求3-5中任一项所述的方法制备的纳米碳偶联物，
优选的，
所述中和抗体是新冠病毒的中和抗体，
纳米碳偶联物分布在固相载体上，
所述检测制品是检测卡，
所述检测卡包括：样品垫、结合垫、检测垫，其中分布有纳米碳偶联物的固相载体位于结合垫，
所述检测垫含有与待测中和抗体结合的抗原或抗体，优选地，所述抗原是新冠病毒S-RBD，
所述纳米碳偶联物中与纳米碳偶联的抗原物是新冠病毒S蛋白或新冠病毒S-RBD；所述结合垫还包含用作对照的纳米碳偶联物，其中所述与纳米碳偶联的抗原物是对照抗体，并且所述检测垫还含有与所述对照抗体结合的抗原或抗体，
检测垫包含硝酸纤维素膜，其上固定有与待测中和抗体结合的抗原或抗体和/或与所述对照抗体结合的抗原或抗体，
所述检测卡还含有滤血膜和/或吸收垫，
所述检测卡包含依次相连的样品垫、结合垫、检测垫和吸收垫，并且滤血膜位于样品垫之上，其中，相邻区域的边缘重叠。
10.权利要求1或2所述的处理碳纳米材料的方法、权利要求3所述的制备纳米碳偶联物的方法在制备纳米碳检测制品中的用途，优选地，所述检测制品是检测卡。
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