CN114457146B - 一种固相介质表面双端扩增测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固相介质表面双端扩增测序的方法，只需要进行一次扩增反应，即可实现双端测序，减少了双端测序所需的步骤，节省了时间；本发明公开的双端扩增测序方法适用于包括荧光发生测序在内的多种测序技术，兼容性更强。
Description
技术领域
本发明涉及一种固相介质表面双端扩增测序的方法，属于基因测序领域。
背景技术
现阶段高通量测序技术发展迅速，已成为目前生命研究的常用的分析方法，它具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低的特点，这种技术需要通过扩增将目的DNA指数性的放大，从而实现同时检测几十万到几百万的DNA分子的目的，因此一种测序技术对应一种扩增方式。目前，在高通量测序领域中较为简单的是单端测序，即只需要一种测序引物，测序时从引物5’-3’的方向进行延伸测序，只能按照一种方向进行读取信号，使用的扩增也较为简单，将目的DNA通过PCR或其他扩增技术扩增一次就可以得到大量待测样品。但是单端测序的质量会随着测序的进行而下降，测序序列越往后越不准确，读长受到一定的限制。
双端测序技术是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-EndModule)引导互补链在原位再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序。这种测序方式提高了样品的利用率，只需要一次建库，就可以实现两次测序；可以得到准确度高、读长较长的测序数据，还能检测出单端测序数据无法检测出的插入缺失变异。目前，可以进行双端测序的公司，如Illumina、华大等，均拥有与其测序技术相对应的双端扩增方法，但是这些方法要么直接与现有的荧光发生测序方法不兼容，要么需要特殊且复杂的文库构建过程，因此需要开发兼容性更强的双端扩增测序方法。
发明内容
发明内容并非意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将从包括在附图和所附权利要求中公开的那些方面的详细描述中显现。
一方面，本发明公开了一种固相介质表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：
(1)提供固定在固相介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸；其中至少部分第一扩增寡核苷酸上含有剪切位点，并且全部第二扩增寡核苷酸上含有剪切位点；
(2)提供单链模板多核苷酸，通过与所述第一扩增寡核苷酸的杂交，单链模板多核苷酸加载至固相介质表面；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；
(3)初始延伸：延伸所述第一扩增寡核苷酸，生成与所述单链模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
(4)扩增：提供扩增反应物，在介质表面进行扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
(5)剪切：通过作用于有剪切位点的第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；
(6)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(7)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；
(8)剪切：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；
(9)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(10)第二链测序：杂交第二测序引物，测序；
所述固相介质表面修饰有化学基团。
根据优选的实施方式，所述固相介质是惰性基底或基质，所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
根据优选的实施方式，所述固相介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
根据优选的实施方式，所述固相介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状可以是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。
根据优选的实施方式，固相介质表面修饰的化学基团包括，氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在固相介质表面。
根据优选的实施方式，所述扩增寡核苷酸包括无剪切位点的第一扩增寡核苷酸，有剪切位点的第一扩增寡核苷酸和全部有剪切位点的第二扩增寡核苷酸，且前述两种剪切位点不相同；所述两种第一扩增寡核苷酸除了剪切位点外，其他序列均相同。
根据优选的实施方式，所述扩增寡核苷酸包括全部含有剪切位点的第一扩增寡核苷酸和全部有剪切位点的第二扩增寡核苷酸，且前述两种剪切位点不相同。
根据优选的实施方式，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。
根据优选的实施方式，其中所述剪切位点是用切口内切核酸酶剪切的位点。
根据优选的实施方式，其中所述剪切包括使所述固相介质与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。
根据优选的实施方式，其中所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基或四氢呋喃修饰的碱基。
根据优选的实施方式，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶-裂合酶内切核酸酶Ⅷ或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。
根据优选的实施方式，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8-氧代鸟嘌呤碱基、脱氧次黄嘌呤碱基、四氢呋喃修饰的碱基、邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫基、偶氮基、叠氮基、肽键、一个或多个核糖核苷酸、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等。
根据优选的实施方式，所述有剪切位点的第一扩增寡核苷酸与无剪切位点的第一扩增寡核苷酸的数量比为1～10，优选为1～5，更优选为1～3。
根据优选的实施方式，对所述第一链测序结束后，所述介质表面有部分未被剪切的所述双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括步骤(8)所述的连接在介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。
根据优选的实施方式，步骤(7)所述测序引物5’端有特定基团修饰；所述基团选自氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基中的一种或多种；所述特定基团可与介质表面的基团发生反应。
根据优选的实施方式，在步骤(7)之后，加入步骤如下：
无需扩增或延伸，生成连接在所述介质表面的与所述第一链互补配对的第二链，具体步骤包括，在第一链测序反应结束后，不进行解旋，将所述测序引物延伸出的单链多核苷酸通过所述测序引物5’端的所述特定基团与介质表面的基团发生反应，固定至固相介质表面，所述单链多核苷酸为固相介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。
根据优选的实施方式，步骤(5)和步骤(8)中所述剪切反应完成后，需要生成可延伸的3’末端，即：若剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，生成可延伸的3’末端。
根据优选的实施方式，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。
根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括聚合酶和dNTPs。
根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括重组酶和单链结合蛋白。
根据优选的实施方式，其中所述模板多核苷酸包含第一索引和第二索引，所述方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。
根据优选的实施方式，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。
本发明提供了一种基因测序方法，其特征在于，将待测的核酸分子片段化，经过文库构建，得到模板多核苷酸，按照前面任一项所述的方法扩增测序。
另一方面，本发明公开了一种固相介质表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供固定在固相介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸；其中第一扩增寡核苷酸上有两个剪切位点，分别是剪切位点1和剪切位点2，所述剪切位点2位于剪切位点1的5’端方向，第二扩增寡核苷酸上有一个剪切位点，且三个剪切位点互不相同；
(2)提供单链模板多核苷酸通过与所述第一扩增寡核苷酸的杂交，单链模板多核苷酸加载至固相介质表面；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；
(3)初始延伸：延伸所述第一扩增寡核苷酸，生成与所述单链模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
(4)第一次扩增：提供扩增反应物，在介质表面进行扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
(5)剪切：通过作用于第一扩增寡核苷酸的剪切位点1，在剪切位点1位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；
(6)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(7)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；
(8)解封端：通过作用于第一扩增寡核苷酸的剪切位点2，在剪切位点2位置打断所述第一扩增寡核苷酸，去除所述封端，并生成可延伸的3’末端；
(9)再次杂交：使第一链与所述第一扩增寡核苷酸重新杂交；
(10)第二次扩增：提供扩增反应物，进行介质表面延伸或扩增；
(11)剪切：通过作用于第二扩增寡核苷酸的剪切位点，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；
(12)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(13)第二链测序：杂交第二测序引物，测序；
所述固相介质表面修饰有化学基团。
根据优选的实施方式，所述固相介质是惰性基底或基质，所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
根据优选的实施方式，所述固相介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
根据优选的实施方式，所述固相介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状可以是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。
根据优选的实施方式，固相介质表面修饰的化学基团包括，氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在介质表面。
根据优选的实施方式，所述媒介材料包括水凝胶微球、磁性微球，所述微球直径小于微反应室的尺寸，且不小于该尺寸的一半，以使微球可进入微反应室，而且一个微反应室内不会进入多于一个微球。
根据优选的实施方式，所述微球的大小为0.2-5微米，优选0.3-3微米，更优选0.35-2.5微米。
根据优选的实施方式，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。
根据优选的实施方式，所述剪切位点是用切口内切核酸酶剪切的位点。
根据优选的实施方式，所述剪切包括使所述固相介质与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。
根据优选的实施方式，所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基或四氢呋喃修饰的碱基。
根据优选的实施方式，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶-裂合酶内切核酸酶Ⅷ或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。
根据优选的实施方式，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8-氧代鸟嘌呤碱基、脱氧次黄嘌呤碱基、四氢呋喃修饰的碱基、邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫基、偶氮基、叠氮基、肽键、一个或多个核糖核苷酸、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等。
根据优选的实施方式，步骤(5)、步骤(8)和步骤(11)中所述剪切反应完成后，需要生成可延伸的3’末端，即：若剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，生成可延伸的3’末端。
根据优选的实施方式，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。
根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括聚合酶和dNTPs。
根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括重组酶和单链结合蛋白。
根据优选的实施方式，其中所述模板多核苷酸包含第一索引和第二索引，所述方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。
根据优选的实施方式，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。
本发明提供一种基因测序方法，其特征在于，将待测的核酸分子片段化，经过文库构建，得到模板多核苷酸，按照前面任一项所述的方法扩增测序。
又一方面，本发明提供了一种固相介质表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：
(1)提供固定在固相介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸；其中，第一扩增寡核苷酸上含有剪切位点，第二扩增寡核苷酸上含有剪切位点，且两种剪切位点不相同；
(2)提供单链模板多核苷酸，通过与所述第一扩增寡核苷酸的杂交，单链模板多核苷酸加载至固相介质表面；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；
(3)初始延伸：延伸所述第一扩增寡核苷酸，生成与所述单链模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
(4)第一次扩增：提供扩增反应物，在介质表面进行扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
(5)剪切：通过作用于第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；
(6)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行可逆封堵；
(7)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；
(8)解封端：加入与所述封端试剂相对应的解封端试剂进行解封端反应，解除封端，并生成可延伸的3’末端；
(9)再次杂交：使第一链与所述第一扩增寡核苷酸重新杂交；
(10)第二次扩增：提供扩增反应物，进行介质表面延伸或扩增；
(11)剪切：通过作用于第二扩增寡核苷酸的剪切位点，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；
(12)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(13)第二链测序：杂交第二测序引物，测序；
所述固相介质表面修饰有化学基团。
根据优选的实施方式，所述固相介质是惰性基底或基质，所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
根据优选的实施方式，所述固相介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
根据优选的实施方式，所述固相介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状可以是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。
根据优选的实施方式，固相介质表面修饰的化学基团包括，氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在固相介质表面。
根据优选的实施方式，所述媒介材料包括水凝胶微球、磁性微球，所述微球直径小于微反应室的尺寸，且不小于该尺寸的一半，以使微球可进入微反应室，而且一个微反应室内不会进入多于一个微球。
根据优选的实施方式，所述微球的大小为0.2-5微米，优选0.3-3微米，更优选0.35-2.5微米。
根据优选的实施方式，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。
根据优选的实施方式，所述剪切位点是用切口内切核酸酶剪切的位点。
根据优选的实施方式，所述剪切包括使所述固相介质与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。
根据优选的实施方式，所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基或四氢呋喃修饰的碱基。
根据优选的实施方式，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶-裂合酶内切核酸酶Ⅷ或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。
根据优选的实施方式，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8-氧代鸟嘌呤碱基、脱氧次黄嘌呤碱基、四氢呋喃修饰的碱基、邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫基、偶氮基、叠氮基、肽键、一个或多个核糖核苷酸、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等。
根据优选的实施方式，步骤(5)和步骤(11)中所述剪切反应完成后，需要生成可延伸的3’末端，即：若剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，生成可延伸的3’末端。
根据优选的实施方式，步骤(6)中的封端试剂是在脱氧核糖或碱基上连接有封端基团的核苷酸类似物以及双脱氧核苷酸，所述封端基团包括：邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫基、偶氮基、叠氮基、肽键、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等。
根据优选的实施方式，步骤(8)中所用的解封端试剂需要与封端试剂相对应，选自：三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、半胱氨酸、连二亚硫酸钠、联氨、高碘酸盐、高锰酸盐，以去除可逆末端保护基团，暴露出可延伸的3’末端。
根据优选的实施方式，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。
根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括聚合酶和dNTPs。
根据优选的实施方式，所述扩增反应物包括重组酶和单链结合蛋白。
根据优选的实施方式，其中所述模板多核苷酸包含第一索引和第二索引，所述方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。
根据优选的实施方式，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。
本发明提供一种基因测序方法，其特征在于，将待测的核酸分子片段化，经过文库构建，得到模板多核苷酸，按照前面任一项所述的方法扩增测序。
有益效果
1.在现有技术中，为了实现双端测序(或配对测序)，需要在第一链测序结束后，再进行一次扩增或延伸反应，以得到足够多用于测序的第二链。本发明公开的方法只需要进行一次扩增反应，即可实现双端测序，减少了双端测序所需的步骤，节省了时间。
2.本发明公开的双端扩增测序方法兼容性更强，不仅解决了现有技术中的双端扩增与荧光发生测序不兼容的问题，还可以应用于Illumina、Ion Torrent所建文库的双端测序。
附图说明
图1.固相介质表面双端扩增测序流程图。
图2.固相介质表面双端扩增测序流程图。
图3.实施例1中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图3A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图3A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图3B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。
图4.实施例2中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图4A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图4A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图4B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。
图5.实施例3中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图5A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图5A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图5B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。
图6.实施例4中第一链和第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度及第二链生成效率图。图6A左图为第一链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度，图6A右图为第二链生成后杂交荧光标记探针时微球的亮度；图6B为MATLAB绘制的第二链生成效率图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。附图中各部分的尺寸和形状不代表真实比例，只用以示意本发明内容。
除非另外定义，否则本文使用的所有科学和技术术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”的使用不是限制性的，应被解释为具有开放式含义，也就是说，其应与短语“至少包括”同义地解释。
本专利阐述的双端扩增测序技术，实现了与荧光发生测序的兼容，同时可以得到比单端测序更多更精确的测序数据。
具体的，本发明公开了一种固相介质表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：
(1)提供固定在固相介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸；其中至少部分第一扩增寡核苷酸上含有剪切位点，并且全部第二扩增寡核苷酸上含有剪切位点；
(2)提供单链模板多核苷酸，通过与所述第一扩增寡核苷酸的杂交，单链模板多核苷酸加载至固相介质表面；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；
(3)初始延伸：延伸所述第一扩增寡核苷酸，生成与所述单链模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
(4)扩增：提供扩增反应物，在介质表面进行扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
(5)剪切：通过作用于有剪切位点的第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；
(6)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(7)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；
(8)剪切：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；
(9)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(10)第二链测序：杂交第二测序引物，测序；
所述固相介质表面修饰有化学基团。
本发明的方法首先将至少两种扩增寡核苷酸固定在所述固相介质表面，术语“固定”指的是寡核苷酸经由共价键或非共价键直接或间接附接至固相介质。例如，所述扩增寡核苷酸可以通过其5’端与固相介质表面修饰的化学基团发生特异性反应附接至其上，所述基团包括氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等。
本发明中，对于两种或两种以上的扩增寡核苷酸，每一种都包括多个；多个包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100个或者更多个群体成员；多个还可以包括200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、lxl05、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、lx106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或更多个成员，多个包括以上示例性群体数目之间的所有整数。
术语“扩增寡核苷酸”指的是包括扩增引物在内的序列，可以全部由天然的或经修饰的核苷酸(例如，8-氧代鸟嘌呤、甲基化核苷酸等)组成，还可以包括必要的非核苷酸化学间隔物，包括但不限于含有二硫基或双羟基或偶氮基团或叠氮基团的单元物等。
本发明中，术语“固相介质”指的是核酸分子可以附接于其上的任何不可溶的惰性基底或基质，包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。表面的形状是可选择的，包括，例如，适合用于特定应用的多孔的、平面的或球形的。优选的，将固相介质安装在流动池的内部，以允许其与多个试剂溶液的相互作用。
根据优选的实施方式，所述固相介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状可以是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。所述微反应室可以是阵列的或非阵列的。每个微反应室都是一个反应的反应室，反馈到测序数据的时候就对应一个数据点。这在测序反应中是常见的事实。
在一些优选的实施方式中，所述固相介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。该媒介材料具有特定化学基团修饰，可以共价附接核酸分子，特殊的，所述媒介材料还可以包括磁性微球，通过磁力将其限制在所述惰性基底或基质表面。
在一些优选的实施方式中，所述媒介材料为微球，包括水凝胶微球、磁性微球，所述微球的直径应与所述微反应室的尺寸相匹配，即微球直径应小于微反应室的尺寸，且不小于该尺寸的一半，以使微球可进入微反应室，而且一个微反应室内不会进入多于一个微球。
在一些优选的实施方式中，本发明中所述媒介材料为聚合物涂层，可用于沉积核酸的聚合物涂层在本领域是熟知的，例如聚丙烯酰胺水凝胶层。该水凝胶层作为中间层可以共价附接所述扩增寡核苷酸，该水凝胶层还可通过非共价作用附接在所述惰性基底或基质上，该惰性基底或基质包括但不限于玻璃、硅片等。
在一些实施方式中，磁性微球是可以考虑的选择。磁性微球可以通过外界的磁场施加作用力，在某些特殊的条件下，能够发挥作用。
本发明中，所述媒介材料可以是水凝胶微球，关于水凝胶微球的制备方法可参见专利CN202010087598.8，特殊的，上述专利的内容可以以引用的形式加入本专利。
根据优选的实施方式，所述微球的大小为0.2-5微米，优选0.3-3微米，更优选0.35-2.5微米。
在一些优选的实施方式中，首先将固载了三种扩增寡核苷酸(包括有剪切位点的第一扩增寡核苷酸、无剪切位点的第一扩增寡核苷酸及有剪切位点的第二扩增寡核苷酸)、且含有特定化学基团修饰的媒介材料(微球)加载到加工出微反应室并修饰好的芯片表面，达到芯片绝大多数的微反应室内都有微球而微反应室外不存在微球的状态。优选的，所述微反应室中至多加载一个微球。
在一些优选的实施方式中，微球表面固载两种扩增寡核苷酸，包括全部有剪切位点的第一扩增寡核苷酸及全部有剪切位点的第二扩增寡核苷酸，且微球上含有特定化学基团修饰，将微球加载到加工出微反应室并修饰好的芯片表面，达到芯片绝大多数的微反应室内都有微球而微反应室外不存在微球的状态。优选的，所述微反应室中至多加载一个微球。
根据优选的实施方式，所述微球表面有用于固定扩增寡核苷酸的官能团，包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等，以进行必要的引物连接。所述多个扩增寡核苷酸载体表面的此类官能团应具备一定密度，例如大于10000个/微球。
根据优选的实施方式，所述微球表面应具备可与微反应室表面可逆结合的官能团，包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。例如，所述微球上有生物素作为固载用化学基团，所述基因测序芯片微反应室内有修饰的链霉亲和素，通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片的微反应室内；所述微球有氨基基团，可以与芯片微反应室内预先连接上的裸露的巯基反应，将微球固载至微反应室内。
扩增的第一步是将扩增模板多核苷酸杂交到载体上。所述模板多核苷酸在杂交前是双链核酸文库或单链核酸文库，在杂交前，需将双链DNA解旋为单链，再与固相扩增寡核苷酸互补配对。单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的，因此可以按照碱基互补配对的原则进行杂交。在杂交结束后，将多余的模板清洗掉并进入含有DNA聚合酶的反应液反应，这样固相的引物会根据杂交上的DNA模板延伸出一条完整的互补配对的模板链。紧接着，加入解旋液反应并将解旋下的DNA清洗走。这样整个芯片内部就不再存在液相的游离核酸文库，所有模板多核苷酸都复制到了固载的载体表面。
根据优选的实施方式，本发明中所述的扩增指的是本领域意义上的扩增。扩增指的是基因扩增，通过一定的技术，使得基因的拷贝数增加。本发明所述的扩增模板，其两端含有公共的接头序列，被称为接头序列1和接头序列2。对于任意的扩增模板，在其两端都连接有相同的接头序列。例如根据3’端和5’端的区别，连接两种不同的接头序列。当然，在存在互补DNA链的情况下，实际上还可以含有接头序列1的互补接头序列以及接头序列2的互补接头序列。这都属于本领域的常规知识。
本发明中，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的。这样在扩增模板杂交的时候，可以通过互补配对的形式杂交。所述的接头序列2和第二扩增引物的至少部分序列是相同的。杂交结束以后，解旋获得的是扩增模板的反向DNA链，或者说获得的是互补配对链，这个时候，其接头序列也是反向或者互补配对的。因此，在后续的扩增反应的时候，该反向接头序列是需要同第二扩增引物结合的。也就是说，接头序列2和第二扩增引物的至少部分序列是相同的。当然，扩增引物一般来说，还需要满足连接到载体的其他要求，比如包含有连接到载体的基团等。部分匹配的要求属于常见的设计方式。
根据优选的实施方式，将所述模板多核苷酸杂交到介质表面时，通过控制条件使单链模板多核苷酸和种植有扩增寡核苷酸的微反应室或种植有扩增寡核苷酸的微球的数量比为1:1，使得大多数微反应室仅杂交上一条模板序列。
根据优选的实施方式，将待测模板多核苷酸分子加载至介质表面以后，进行扩增反应，使DNA模板可以在表面进行扩增，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。
恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。相比传统的PCR技术，恒温扩增具有显著的优势：检测线低、不需要变温、扩增速度快，且通常反应温度较低，降低了对芯片耐高温的要求。常见的恒温扩增技术包括：①依赖核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，主要依赖AMV逆转录酶、RNaseH和T7 RNA聚合酶和两条特别设计的引物来完成恒温扩增；②滚环扩增技术(RCA)，phi29DNA聚合酶是反应重要的组成部分，具有持续DNA合成能力和链置换活性；③环介导恒温扩增(LAMP)，LAMP使用4条或6条引物，特异性强、灵敏度高；④依赖解旋酶扩增技术(HDA)；⑤重组酶聚合酶扩增(RPA),RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右；⑥重组酶介导恒温核酸扩增技术(RAA)，技术原理与RPA相似，不同之处在于RAA的重组酶来源于细菌或真菌，而RPA的重组酶来自T4噬菌体；⑦链置换扩增技术(SDA)，其基本反应系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTPs以及钙、镁离子和缓冲系统。
环介导恒温核酸扩增(LAMP)最早是2000年由日本学者Notomi公开的一种新技术，为60～65℃的恒温扩增反应，针对目标核酸分子的6个区域设计4条(或6条)特异性引物，以及一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。其基本原理是模板DNA分子变性后，内外引物在Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。
重组酶聚合酶扩增(RPA)为37～42℃的恒温扩增反应，主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(如扩增引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。在结合到互补序列前，引物会先和重组酶结合形成引物-重组酶纤维。在反应时，引物在重组酶及其相关辅酶的作用下将作为模板的双链DNA打开并进行链交换，在互补配对处结合到打开的单链上。紧接着，单链结合蛋白会结合到被打开的单链上并维持单链结构。之后，引物在具有5’-3’链取代活性的DNA聚合酶的作用下边解旋双链边进行新链的合成，并最终形成一条新的DNA双链和被取代下来的DNA单链。两端的引物均在酶的作用下进行以上反应，整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物，最终可以将模板扩增1011～1012倍。
RAA与RPA反应基本相同，不同之处在于重组酶的来源不同，RPA的重组酶来源于T4噬菌体，而RAA的重组酶来源于细菌或真菌。
恒温扩增技术的影响因素有多种，比如引物的设计，不同的扩增技术对于引物的数量等的要求有所不同；本发明中涉及的恒温扩增反应可以使用至少两种扩增寡核苷酸的形式，例如，RPA的扩增引物不同于常规PCR引物，一般的，其2条引物长度在20-45nt；LAMP的扩增引物设计难度更大，包括4条或6条引物。引物的具体设计是可以变化的。
本发明中，扩增反应中模板多核苷酸的数量可以从纳克至微克的范围内。
根据优选的实施方式，扩增反应液包括DNA聚合酶和dNTPs，DNA聚合酶可以是具有链置换活性的聚合酶，如Bst DNA聚合酶，Sau DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶等。因为聚合酶对于每种碱基的效率可能是不同的，所以在扩增反应液中的dNTPs的浓度可能各不相同。对于有特殊修饰的核苷酸底物，相应的DNA聚合酶应该能够识别此类核苷酸底物。在一些实施方式中，核苷酸底物可以是天然dNTPs；在其他实施方式中，可利用荧光基团等对核苷酸进行修饰。
根据优选的实施方式，扩增反应液还可以包括重组酶和单链结合蛋白，示例性的重组酶包括，例如，RecA蛋白质、T4 uvsX重组酶以及SC-recA、BS-recA、Rad51等同源蛋白质或蛋白质复合物，或其功能的变体。
在进行测序反应之前，需要将双链扩增产物线性化，即将其变为单链，本发明采用的是剪切方式。具体的，在介质表面的三种扩增寡核苷酸中，包括无剪切位点的第一扩增寡核苷酸，有剪切位点的第一扩增寡核苷酸和有剪切位点的第二扩增寡核苷酸，且前述两种剪切位点互不相同；所述两种第一扩增寡核苷酸除了剪切位点不同外，其他序列均相同。在加入第一种剪切液后，作用于有剪切位点的第一扩增寡核苷酸，可将第二链特异性地剪切掉，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉，便暴露出了可以结合测序引物的单链(第一链)。
在一些实施方式中，介质表面连接两种扩增寡核苷酸，包括有剪切位点的第一扩增寡核苷酸和有剪切位点的第二扩增寡核苷酸，且前述两种剪切位点互不相同；在加入第一种剪切液后，作用于第一扩增寡核苷酸，可将第二链特异性地剪切掉，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉，便暴露出了可以结合测序引物的单链(第一链)。
此外，还需尽可能地降低测序反应可能产生的杂信号，这一目的是通过封端反应实现：向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住，无法在DNA聚合酶的作用下延伸产生杂信号。在经过上述处理步骤后，只要杂交测序引物便可以进行第一链的测序反应了。
本发明中，术语“剪切位点”指代的含义较为广泛，任何剪切方法只要满足作用于此位点后使得双链核酸分子在此位点处被切断一条链，从而在固相介质表面只剩下一条多核苷酸链，且该剪切反应不能破坏被切割单链剩余部分与未切割单链的互补杂交，则此位点就可以被称为“剪切位点”。所述剪切方法包括但不限于：光剪切、适合的化学剪切、适合的酶促剪切、核糖核苷酸的剪切、无碱基位点的剪切、具有切口内切核酸酶的酶消化、半甲基化DNA的剪切等方法。
光剪切
本发明中，“光剪切”包括利用光能对待测核酸中的一条单链进行剪切的任何方法。前述剪切位点可以位于待测核酸中的非核苷酸化学间隔物单元中。所述化学间隔物单元包括可购于Glen Research公司(Sterling,VA,USA)的PC间隔物亚磷酰胺(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2--氰基乙基-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺，可以通过暴露于紫外光源来切割间隔物单元。可以使用用于寡核苷酸的化学合成的标准技术将此间隔物单元与允许附着于固体表面的硫代磷酸基团一起附着于核苷酸单链的5’末端。
化学剪切
本发明中，“化学剪切”包括利用化学反应(包括但不限于氧化还原反应、水解反应、酶促反应等)以促进/实现对单链多核苷酸进行剪切的任何方法。通常，单链多核苷酸可以包括一个或多个非核苷酸化学部分和/或非天然核苷酸和/或非天然主链连接，以允许化学剪切反应的进行。
代表性的，所述化学切割位点可以是二硫基，可以使用化学还原剂，例如使用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、巯基乙醇、DTT、半胱氨酸等物质对二硫键进行切割。代表性的，所述化学切割位点可以是肽键，利用包括蛋白酶K等在内的可以促进肽键水解的酶进行酶促反应，完成剪切反应。代表性的，所述化学剪切位点可以是还原剪切型连接基团，包括但不限于含有偶氮基团或叠氮基团的单元物。对于含有偶氮基团的化学连接单元，可以利用连二亚硫酸钠溶液处理完成剪切反应，剪切后的残端是惰性的，无需再进行封端反应，非常便捷；对于含有叠氮基团的化学连接单元，可以利用TCEP或者联氨进行处理，完成剪切反应。可以使用用于自动化化学DNA合成的标准方法将含有偶氮基团或叠氮基团的单元物掺入扩增寡核苷酸中。代表性的，所述化学剪切位点可以是氧化型化学连接基团，包括二醇连接单元，其数量可以是一个或多个；可以利用任何促进二醇切割的物质来进行剪切，优选的是高碘酸盐(例如高碘酸钠水溶液)或高锰酸钾；用切割剂(例如高碘酸盐)处理以切割二醇后，可以用“封端剂”处理切割产物，以中和切割反应中产生的反应性物质。为此目的合适的封端剂包括但不限于乙醇胺、三乙胺、三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、半胱胺等。在优选的实施方式中，可以将封端剂(例如乙醇胺)与切割剂(例如高碘酸盐)混合，使得反应性物质一经形成就被封端。可以使用用于自动化化学DNA合成的标准方法将一种或多种二醇连接单元掺入扩增寡核苷酸中。代表性的，所述化学剪切位点还可以是酸敏感型连接基团，包括但不限于缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等连接方式。可以利用任何促进缩酮、缩醛、碳酸酯、氨基甲酸酯或者二苯基硅氧烷水解的反应物质或者反应体系来进行剪切，优选反应条件是在pH为2～3的酸性缓冲体系中，在室温或者37℃的条件下，反应5～30分钟，即可高效地完成切割。切割后的主产物为尾端各带羟基(或者氨基，对于氨基甲酸酯类来说)的连接单元，副产物为丙酮(或者其他酮类物质)，二苯基硅醇，二氧化碳等惰性物质，副产物不会参与后续的DNA合成反应，无需其他步骤加以去除。
核糖核苷酸的剪切
在扩增寡核苷酸中掺入一个或多个核糖核苷酸，再利用包括核糖核酸酶在内合适的剪切试剂选择性切割脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，从而实现在特定位点将待测核酸分子切割成单链测序模板。例如，待切割的核苷酸单链包含一个核糖核苷酸以提供用剪切位点。所述合适的剪切试剂包括但不限于：金属离子，例如稀土离子也很有效,特别是La3+,Tm3+,Yb3+,Lu3+离子的活性高，或者Fe(3)或Cu(3)或暴露于升高的pH，例如用碱如氢氧化钠处理。需要特别注意的是，所述合适的剪切试剂在相同条件下不能切割两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键。核糖核苷酸的基本组成通常不是重要的，而是可以进行选择以优化化学(或酶促)切割。举例而言，如果要通过暴露于金属离子，特别是稀土金属离子进行切割，则通常优选rUMP或rCMP。为了用核糖核酸酶切割，优选包括两个或更多个连续的核糖核苷酸，例如2～10个或5～10个连续的核糖核苷酸。核糖核苷酸的精确序列通常并不重要，合适的RNA酶包括，例如RNase A，其在C和U残基之后切割。因此，当用RNaseA切割时，剪切位点必须包含至少一个C或U核糖核苷酸。掺入一个或多个核糖核苷酸的扩增寡核苷酸可以使用用于寡核苷酸化学合成的标准技术与合适的核糖核苷酸前体容易地合成。
本发明中，“无碱基位点”指的是核酸分子中已经除去碱基组分的位置。无碱基位点可以在生理条件下通过核苷残基的水解而天然存在于DNA中，同时，也可以在人工条件下(例如通过酶的作用)以化学方式形成。无碱基位点一旦形成，便可以利用合适的剪切方法剪切无碱基位点(例如，通过用内切核酸酶或其他单链切割酶、暴露于热或碱处理)，从而提供用于位点特异性切割捕获核酸的手段。本领域普通技术人员应该认识到，使用热或碱有可能使核酸分子变性，因此，可能并不是优选的实施方式。
在优选的实施方式中，可以在扩增寡核苷酸的预定位置上产生无碱基位点，通过首先在预定的裂解位点掺入脱氧尿苷(U)来切割，然后可以使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)除去尿嘧啶碱基，从而在特定位置产生无碱基位点。然后可以通过用内切核酸酶(例如EndoIV内切核酸酶、AP裂合酶、FPG糖基化酶/AP裂合酶、Endo VIII糖基化酶/AP裂合酶)、热或碱处理，在无碱基位点处剪切包含无碱基位点的链。除了脱氧尿苷，还可以在非天然/修饰的脱氧核糖核苷酸上产生无碱基位点，并通过用内切核酸酶、热或碱处理以类似的方式剪切。例如，可以通过暴露于FPG糖基化酶将8-氧代鸟嘌呤转化为无碱基位点；可以通过暴露于AlkA糖基化酶将脱氧肌苷转化为无碱基位点；然后通常可通过用合适的内切核酸酶(例如，Endo IV、AP裂合酶)处理来切割产生的无碱基位点。需要注意的是，由于非天然/修饰的核苷酸将被掺入扩增寡核苷酸中以用于扩增的用途，所以本发明中的非天然/修饰的核苷酸应该满足能够被用于扩增反应的聚合酶复制反应中。在优选的实施方式中，可以将合适的糖基化酶和一种或多种合适的内切核酸酶混合在一起用于剪切反应。在此类混合物中，糖基化酶和内切核酸酶通常将以至少约2:1的活性比率存在。在一个具体的实施方案中，可购自New England Biola bs的USER试剂用于在扩增寡核苷酸中的尿嘧啶碱基处形成单核苷酸缺口，用内切核酸酶处理在切割位点处产生3’-磷酸部分，有需要时，此3’-磷酸可以被合适的磷酸酶(如碱性磷酸酶)除去。
具有切口内切核酸酶的酶消化
在分子生物学领域中，使用切口内切核酸酶剪切双链核酸分子的一条链是常规使用的技术。切口内切核酸酶是选择性切割双链核酸的一条链的酶，并且在分子生物学领域是公知的。该方法基本上可以使用任何切口内切核酸酶，需要满足在扩增寡核苷酸上存在的剪切位点中包含合适的识别序列。
半甲基化DNA的剪切
所述半甲基化DNA是指寡核苷酸中包含一个或多个甲基化核苷酸，会与互补链上的非甲基化脱氧核糖核苷酸相对，使得两条链的退火产生半甲基化的双链体结构。对于该核酸的剪切，可以通过用内切核酸酶切割实现位点特异性切割；所述内切核酸酶对于包含甲基化核苷酸的识别序列是特异性的。可以使用适当的甲基化核苷酸前体，使用自动DNA合成的标准技术，制备掺入一个或多个甲基化核苷酸的扩增寡核苷酸。
本发明中，在进行剪切反应之后，需要使剪切反应的产物经历变性条件以去除未连接至介质表面的被切割的链的部分。例如可以通入甲酰胺溶液反应使核酸变性。
根据优选的实施方式，所述两种扩增寡核苷酸上含有可被剪切的位点指的是，两种扩增寡核苷酸上的剪切位点是互不相同的，并且剪切的条件也是不一样的。这样在进行剪切的时候，根据具体的需求，选择不同的剪切条件，可控制地进行有利的剪切。例如，剪切位点1是尿嘧啶，剪切位点2是8-氧代鸟嘌呤；或者，剪切位点1是8-氧代鸟嘌呤，剪切位点2是尿嘧啶。其中，所述的将扩增后的双链模板剪切为单链，指的是将第一扩增寡核苷酸或者第二扩增寡核苷酸通过剪切位点剪切为两段，并去除未与固相介质连接的单链，此过程也被称为“线性化”。
根据优选的实施方式，对所述线性化后的单链核酸进行测序，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。荧光发生测序与Illumina等的测序方法的测序原理不同，其测序信号产生的原理是DNA聚合酶按照碱基互补配对原则将5’磷酸上标记了荧光基团的反应底物结合到测序模板上，释放下来的基团会在碱性磷酸酶的作用下进一步分解出荧光发生基团，这样DNA模板发生延伸时就会释放出荧光基团并在特定波长激发光下发出荧光，此信号被采集。由于测序时存在碱性磷酸酶，若步骤(5)和步骤(11)中所述剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则在碱性磷酸酶的作用下此磷酸基团会被切除继续发生延伸反应，从而生成杂信号，严重干扰后续的测序分析。
为了克服上述缺陷，本发明的技术方案是先去除此3’末端磷酸基团，将其封端后进行第一链测序，具体的，当剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团时，需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，再将此末端进行封端。
封端是固相扩增中的常见步骤，常见的封端是指利用末端转移酶TdT等工具酶将ddNTPs等3’端修饰的底物转移到核苷酸链3’端的步骤，此末端不可继续反应，从而降低副反应的发生。所述封端反应在测序反应之前进行。
对于双端测序，在第一链测序反应结束后，需要足够的用于测序的第二链。本发明的巧妙之处在于，通过一次扩增生成足够量的双链扩增子，所述足够量指的是足够用于第一链测序和第二链测序反应。
对于介质表面有3种扩增寡核苷酸的实施方式，由于部分第一扩增寡核苷酸没有剪切位点，由此扩增寡核苷酸生成的双链扩增子不会被剪切，因此，第一链测序反应结束后，不需要再进行扩增，可以直接将介质表面未被剪切的双链分子线性化，对芯片表面的第二链进行测序。
对于介质表面有2种扩增寡核苷酸的实施方式，即第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸上均含有剪切位点，步骤(7)所述测序引物5’端有特定基团修饰；所述基团选自氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基中的一种或多种；所述特定基团可与介质表面的基团发生反应。步骤(8)包括，在第一链测序反应结束后，不进行解旋，将所述测序引物延伸出的单链多核苷酸通过所述测序引物5’端的所述特定基团与介质表面的基团发生反应，固定至固相介质表面，所述单链多核苷酸为固相介质表面的与所述第一链互补配对的第二链。
为了降低测序杂信号，需要在测序之前进行封端，即向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住，在经过上述处理步骤后，杂交测序引物后便可以进行第二链的测序。
本发明中，在扩增测序方法的各个步骤之间加入清洗液进行洗涤可能是有益的。例如，在杂交结束后，加入清洗液将多余的模板清洗掉；利用甲酰胺解旋后，加入清洗液将解旋下的核苷酸单链清洗走；剪切反应或封端反应后，对芯片进行清洗，等等。适当的清洗对于保证反应的正常进行非常重要。
本发明中，所述的模板多核苷酸指的是将待测的核酸分子片段化并经过文库构建得到的核酸片段，也可以称为扩增模板。所述的模板的序列可以是未知的。在测序之前，将长片段的核酸分子打断形成小的片段，然后连接上特定的接头序列，就可以进行所述的扩增测序过程。待测分子的片段化可以使用本领域已知的多种技术的任一种进行，例如，超声处理、雾化、物理剪切、化学裂解或酶解等。整个过程中，对于待测的核酸序列片段是没有限制的，任意的序列都可以进行该操作。这也是完整测序的概念。模板多核苷酸的大小为50～10000bp，也可以是100～1000bp，最长可以是10kb的模板，但此时扩增效果受到显著影响。
需要说明的，一般的，模板多核苷酸是双链分子的形式，在杂交之前，需要将双链解旋为单链；特殊的，模板多核苷酸也可以是单链分子的形式，可以直接用于杂交。
根据优选的实施方式，所述模板多核苷酸包含特定的核苷酸序列标签，以表明该多核苷酸的来源，具体的包含第一索引和第二索引。在实际测序时，为了充分利用高通量测序芯片的测序通量，常常将多个不同来源的样本在一块芯片上进行测序，在测序完成后需要区分序列的来源，就是借助所述的核苷酸序列标签(也叫index)完成的。所述测序方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。具体的测序顺序是可调的，示例性的，可以先测第一链、再测第一索引、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二索引、再测第二链；或者先测第一链、再测第一索引、再测第二索引、再测第二链。
对于基因测序方法，常规的，例如Illumina的测序方法，每轮反应只测一个碱基，对于本发明来说，每次反应几个碱基并不是本发明的重点。本发明所述的双端扩增测序方法，更加适用于申请人之前公开的2+2荧光切换类的测序；但是并不排除常规的类似于Illumina类型的测序方法。特殊的，专利CN201510815685.X的内容可以以引用的形式加入本专利。
芯片上的双端扩增测序过程示意图参见图1。载体(例如的，微球)表面带有的生物素可以与芯片表面的链霉亲和素结合，因此首先可以将载体通过离心的方式固载到芯片的微反应室内。载体上固定了3种扩增引物，即：无剪切位点的第一扩增引物(101)，有剪切位点的第一扩增引物(103)，有剪切位点的第二扩增引物(102)，其中，第一扩增寡核苷酸上的剪切位点如103底部白点所示，靠近其5’端，第二扩增寡核苷酸上的一个剪切位点如102底部黑点所示，靠近其5’端，且2个剪切位点互不相同(步骤(1))。在扩增开始前，首先将单链模板与载体表面的第一扩增寡核苷酸杂交(步骤(2))，之后，进行初始延伸(步骤(3))、解旋和液相模板的取出(步骤(4))。然后，利用RPA试剂盒进行模板的扩增(步骤(5)(6))。在RPA结束后，依次进行固相引物的剪切反应(步骤(7))、解旋(步骤(8))和封端反应(步骤(9))，此时载体上的模板为单链(第一链)，以及未被剪切的双链分子(第一链和第二链)，将第一测序引物杂交到载体上即可进行测序(步骤(10))。第一链测序结束后，不需要扩增，加入第二种剪切液，将第一链剪切掉(步骤(11))，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉(步骤(12))，再向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住(步骤(13))。在经过上述处理步骤后，杂交第二测序引物，进行第二链的测序反应(步骤(14))。
本发明的另一方面提供一种固相介质表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供固定在固相介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸；其中第一扩增寡核苷酸上有两个剪切位点，分别是剪切位点1和剪切位点2，所述剪切位点2位于剪切位点1的5’端方向，第二扩增寡核苷酸上有一个剪切位点，且三个剪切位点互不相同；
(2)提供单链模板多核苷酸通过与所述第一扩增寡核苷酸的杂交，单链模板多核苷酸加载至固相介质表面；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；
(3)初始延伸：延伸所述第一扩增寡核苷酸，生成与所述单链模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
(4)第一次扩增：提供扩增反应物，在介质表面进行扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
(5)剪切：通过作用于第一扩增寡核苷酸的剪切位点1，在剪切位点1位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；
(6)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(7)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；
(8)解封端：通过作用于第一扩增寡核苷酸的剪切位点2，在剪切位点2位置打断所述第一扩增寡核苷酸，去除所述封端，并生成可延伸的3’末端；
(9)再次杂交：使第一链与所述第一扩增寡核苷酸重新杂交；
(10)第二次扩增：提供扩增反应物，进行介质表面延伸或扩增；
(11)剪切：通过作用于第二扩增寡核苷酸的剪切位点，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；
(12)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(13)第二链测序：杂交第二测序引物，测序；
所述固相介质表面修饰有化学基团。
本发明的方法首先将至少两种扩增寡核苷酸固定在所述固相介质表面，术语“固定”指的是寡核苷酸经由共价键或非共价键直接或间接附接至固相介质。例如，所述扩增寡核苷酸可以通过其5’端与固相介质表面修饰的化学基团发生特异性反应附接至其上，所述基团包括氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等。
本发明中，对于两种或两种以上的扩增寡核苷酸，每一种都包括多个；多个包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100个或者更多个群体成员；多个还可以包括200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、lxl05、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、lx106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或更多个成员，多个包括以上示例性群体数目之间的所有整数。
术语“扩增寡核苷酸”指的是包括扩增引物在内的序列，可以全部由天然的或经修饰的核苷酸(例如，8-氧代鸟嘌呤、甲基化核苷酸等)组成，还可以包括必要的非核苷酸化学间隔物，包括但不限于含有二硫基或双羟基或偶氮基团或叠氮基团的单元物等。
本发明中，术语“固相介质”指的是核酸分子可以附接于其上的任何不可溶的惰性基底或基质，包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。表面的形状是可选择的，包括，例如，适合用于特定应用的多孔的、平面的或球形的。优选的，将固相介质安装在流动池的内部，以允许其与多个试剂溶液的相互作用。
根据优选的实施方式，所述固相介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状可以是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。所述微反应室可以是阵列的或非阵列的。每个微反应室都是一个反应的反应室，反馈到测序数据的时候就对应一个数据点。这在测序反应中是常见的事实。
在一些优选的实施方式中，所述固相介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。该媒介材料具有特定化学基团修饰，可以共价附接核酸分子，特殊的，所述媒介材料还可以包括磁性微球，通过磁力将其限制在所述惰性基底或基质表面。
在一些优选的实施方式中，所述媒介材料为微球，包括水凝胶微球、磁性微球，所述微球的直径应与所述微反应室的尺寸相匹配，即微球直径应小于微反应室的尺寸，且不小于该尺寸的一半，以使微球可进入微反应室，而且一个微反应室内不会进入多于一个微球。
在一些优选的实施方式中，本发明中所述媒介材料为聚合物涂层，可用于沉积核酸的聚合物涂层在本领域是熟知的，例如聚丙烯酰胺水凝胶层。该水凝胶层作为中间层可以共价附接所述扩增寡核苷酸，该水凝胶层还可通过非共价作用附接在所述惰性基底或基质上，该惰性基底或基质包括但不限于玻璃、硅片等。
在一些实施方式中，磁性微球是可以考虑的选择。磁性微球可以通过外界的磁场施加作用力，在某些特殊的条件下，能够发挥作用。
本发明中，所述媒介材料可以是水凝胶微球，关于水凝胶微球的制备方法可参见专利CN202010087598.8，特殊的，上述专利的内容可以以引用的形式加入本专利。
根据优选的实施方式，所述微球的大小为0.2-5微米，优选0.3-3微米，更优选0.35-2.5微米。
在一些优选的实施方式中，首先将固载了至少两种扩增寡核苷酸、且含有特定化学基团修饰的媒介材料(微球)加载到加工出微反应室并修饰好的芯片表面，达到芯片绝大多数的微反应室内都有微球而微反应室外不存在微球的状态。优选的，所述微反应室中至多加载一个微球。
根据优选的实施方式，所述微球表面有用于固定扩增寡核苷酸的官能团，包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等，以进行必要的寡核苷酸连接。所述多个扩增寡核苷酸载体表面的此类官能团应具备一定密度，例如大于10000个/微球。
根据优选的实施方式，所述微球表面应具备可与微反应室表面可逆结合的官能团，包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。例如，所述微球上有生物素作为固载用化学基团，所述基因测序芯片微反应室内有修饰的链霉亲和素，通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片的微反应室内；所述微球有氨基基团，可以与芯片微反应室内预先连接上的裸露的巯基反应，将微球固载至微反应室内。
扩增的第一步是将单链模板多核苷酸杂交到载体上。所述模板多核苷酸两端含有公共的(或通用的)接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的，因此可以按照碱基互补配对的原则进行杂交。所述模板多核苷酸是双链核酸文库或单链核酸文库，在杂交前，需将双链DNA解旋为单链，再与固相扩增寡核苷酸互补配对。在杂交结束后，将多余的模板清洗掉并进入含有DNA聚合酶的反应液反应，这样固相的引物会根据杂交上的DNA模板延伸出一条完整的互补配对的模板链。紧接着，加入解旋液反应并将解旋下的DNA清洗走。这样整个芯片内部就不再存在液相的游离核酸文库，所有模板多核苷酸都复制到了固载的载体表面。
根据优选的实施方式，本发明中所述的扩增指的是本领域意义上的扩增。扩增指的是基因扩增，通过一定的技术，使得基因的拷贝数增加。本发明所述的扩增模板，其两端含有公共的接头序列，被称为接头序列1和接头序列2。对于任意的扩增模板，在其两端都连接有相同的接头序列。例如根据3’端和5’端的区别，连接两种不同的接头序列。当然，在存在互补DNA链的情况下，实际上还可以含有接头序列1的互补接头序列以及接头序列2的互补接头序列。这都属于本领域的常规知识。
本发明中，所述接头序列1和第一扩增寡核苷酸，至少部分序列是互补配对的。这样在扩增模板杂交的时候，可以通过互补配对的形式杂交。所述的接头序列2和第二扩增寡核苷酸的至少部分序列是相同的。杂交结束以后，解旋获得的是扩增模板的反向DNA链，或者说获得的是互补配对链，这个时候，其接头序列也是反向或者互补配对的。因此，在后续的扩增反应的时候，该反向接头序列是需要同第二扩增寡核苷酸结合的。也就是说，接头序列2和第二扩增寡核苷酸的至少部分序列是相同的。当然，扩增寡核苷酸一般来说，还需要满足连接到载体的其他要求，比如包含有连接到载体的基团等。部分匹配的要求属于常见的设计方式。
根据优选的实施方式，将所述模板多核苷酸杂交到介质表面时，通过控制条件使单链模板多核苷酸和种植有扩增寡核苷酸的微反应室或种植有扩增寡核苷酸的微球的数量比为1:1，使得大多数微反应室仅杂交上一条模板序列。
根据优选的实施方式，将待测模板多核苷酸分子加载至介质表面以后，进行扩增反应，使DNA模板可以在表面进行扩增，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。
恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。相比传统的PCR技术，恒温扩增具有显著的优势：检测线低、不需要变温、扩增速度快，且通常反应温度较低，降低了对芯片耐高温的要求。
环介导恒温核酸扩增(LAMP)最早是2000年由日本学者Notomi公开的一种新技术，为60～65℃的恒温扩增反应，针对目标核酸分子的6个区域设计4条(或6条)特异性引物，以及一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。其基本原理是模板DNA分子变性后，内外引物在Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。
重组酶聚合酶扩增(RPA)为37～42℃的恒温扩增反应，主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(如扩增引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。在结合到互补序列前，引物会先和重组酶结合形成引物-重组酶纤维。在反应时，引物在重组酶及其相关辅酶的作用下将作为模板的双链DNA打开并进行链交换，在互补配对处结合到打开的单链上。紧接着，单链结合蛋白会结合到被打开的单链上并维持单链结构。之后，引物在具有5’-3’链取代活性的DNA聚合酶的作用下边解旋双链边进行新链的合成，并最终形成一条新的DNA双链和被取代下来的DNA单链。两端的引物均在酶的作用下进行以上反应，整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物，最终可以将模板扩增1011～1012倍。
RAA与RPA反应基本相同，不同之处在于重组酶的来源不同，RPA的重组酶来源于T4噬菌体，而RAA的重组酶来源于细菌或真菌。
恒温扩增技术的影响因素有多种，比如引物的设计，不同的扩增技术对于引物的数量等的要求有所不同；本发明中涉及的恒温扩增反应可以使用至少两种扩增寡核苷酸的形式，例如，RPA的扩增引物不同于常规PCR引物，一般的，其2条引物长度在20-45nt；LAMP的扩增引物设计难度更大，包括4条或6条引物。引物的具体设计是可以变化的。
本发明中，扩增反应中模板多核苷酸的数量可以从纳克至微克的范围内。
根据优选的实施方式，扩增反应液包括DNA聚合酶和dNTPs，DNA聚合酶可以是具有链置换活性的聚合酶，如Bst DNA聚合酶，Sau DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶等。因为聚合酶对于每种碱基的效率可能是不同的，所以在扩增反应液中的dNTPs的浓度可能各不相同。对于有特殊修饰的核苷酸底物，相应的DNA聚合酶应该能够识别此类核苷酸底物。在一些实施方式中，核苷酸底物可以是天然dNTPs；在其他实施方式中，可利用荧光基团等对核苷酸进行修饰。
根据优选的实施方式，扩增反应液还可以包括重组酶和单链结合蛋白，示例性的重组酶包括，例如，RecA蛋白质、T4 uvsX重组酶以及SC-recA、BS-recA、Rad51等同源蛋白质或蛋白质复合物，或其功能的变体。
在进行测序反应之前，需要将双链扩增产物线性化，即将其变为单链，本发明采用的是剪切方式。具体的，在介质表面的多种扩增寡核苷酸中，第一扩增寡核苷酸含有两个剪切位点，其中剪切位点1靠近其3’端，剪切位点2靠近其5’端，第二扩增寡核苷酸含有一个剪切位点，且3个剪切位点互不相同。在作用于剪切位点1时，第二链可以被特异性地剪切掉，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉，便暴露出了可以结合测序引物的单链(第一链)。
此外，还需尽可能地降低测序反应可能产生的杂信号，这一目的是通过封端反应实现：向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住，无法在DNA聚合酶的作用下延伸产生杂信号。在经过上述处理步骤后，只要杂交测序引物便可以进行第一链的测序反应了。
本发明中，术语“剪切位点”指代的含义较为广泛，任何剪切方法只要满足作用于此位点后使得双链核酸分子在此位点处被切断一条链，从而在固相介质表面只剩下一条多核苷酸链，且该剪切反应不能破坏被切割单链剩余部分与未切割单链的互补杂交，则此位点就可以被称为“剪切位点”。所述剪切方法包括但不限于：光剪切、适合的化学剪切、适合的酶促剪切、核糖核苷酸的剪切、无碱基位点的剪切、具有切口内切核酸酶的酶消化、半甲基化DNA的剪切等方法。
光剪切
本发明中，“光剪切”包括利用光能对待测核酸中的一条单链进行剪切的任何方法。前述剪切位点可以位于待测核酸中的非核苷酸化学间隔物单元中。所述化学间隔物单元包括可购于Glen Research公司(Sterling,VA,USA)的PC间隔物亚磷酰胺(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰胺基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2--氰基乙基-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺，可以通过暴露于紫外光源来切割间隔物单元。可以使用用于寡核苷酸的化学合成的标准技术将此间隔物单元与允许附着于固体表面的硫代磷酸基团一起附着于核苷酸单链的5’末端。
化学剪切
本发明中，“化学剪切”包括利用化学反应(包括但不限于氧化还原反应、水解反应、酶促反应等)以促进/实现对单链多核苷酸进行剪切的任何方法。通常，单链多核苷酸可以包括一个或多个非核苷酸化学部分和/或非天然核苷酸和/或非天然主链连接，以允许化学剪切反应的进行。代表性的，所述化学切割位点可以是二硫基，可以使用化学还原剂，例如使用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、巯基乙醇、DTT、半胱氨酸等物质对二硫键进行切割。代表性的，所述化学切割位点可以是肽键，利用包括蛋白酶K等在内的可以促进肽键水解的酶进行酶促反应，完成剪切反应。代表性的，所述化学剪切位点可以是还原剪切型连接基团，包括但不限于含有偶氮基团或叠氮基团的单元物。对于含有偶氮基团的化学连接单元，可以利用连二亚硫酸钠溶液处理完成剪切反应，剪切后的残端是惰性的，无需再进行封端反应，非常便捷；对于含有叠氮基团的化学连接单元，可以利用TCEP或者联氨进行处理，完成剪切反应。可以使用用于自动化化学DNA合成的标准方法将含有偶氮基团或叠氮基团的单元物掺入扩增寡核苷酸中。代表性的，所述化学剪切位点可以是氧化型化学连接基团，包括二醇连接单元，其数量可以是一个或多个；可以利用任何促进二醇切割的物质来进行剪切，优选的是高碘酸盐(例如高碘酸钠水溶液)或高锰酸钾；用切割剂(例如高碘酸盐)处理以切割二醇后，可以用“封端剂”处理切割产物，以中和切割反应中产生的反应性物质。为此目的合适的封端剂包括但不限于乙醇胺、三乙胺、三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、半胱胺等。在优选的实施方式中，可以将封端剂(例如乙醇胺)与切割剂(例如高碘酸盐)混合，使得反应性物质一经形成就被封端。可以使用用于自动化化学DNA合成的标准方法将一种或多种二醇连接单元掺入扩增寡核苷酸中。代表性的，所述化学剪切位点还可以是酸敏感型连接基团，包括但不限于缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等连接方式。可以利用任何促进缩酮、缩醛、碳酸酯、氨基甲酸酯或者二苯基硅氧烷水解的反应物质或者反应体系来进行剪切，优选反应条件是在pH为2～3的酸性缓冲体系中，在室温或者37℃的条件下，反应5～30分钟，即可高效地完成切割。切割后的主产物为尾端各带羟基(或者氨基，对于氨基甲酸酯类来说)的连接单元，副产物为丙酮(或者其他酮类物质)，二苯基硅醇，二氧化碳等惰性物质，副产物不会参与后续的DNA合成反应，无需其他步骤加以去除。
核糖核苷酸的剪切
在扩增寡核苷酸中掺入一个或多个核糖核苷酸，再利用包括核糖核酸酶在内合适的剪切试剂选择性切割脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，从而实现在特定位点将待测核酸分子切割成单链测序模板。例如，待切割的核苷酸单链包含一个核糖核苷酸以提供用剪切位点。所述合适的剪切试剂包括但不限于：金属离子，例如稀土离子也很有效,特别是La3+,Tm3+,Yb3+,Lu3+离子的活性高，或者Fe(3)或Cu(3)或暴露于升高的pH，例如用碱如氢氧化钠处理。需要特别注意的是，所述合适的剪切试剂在相同条件下不能切割两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键。核糖核苷酸的基本组成通常不是重要的，而是可以进行选择以优化化学(或酶促)切割。举例而言，如果要通过暴露于金属离子，特别是稀土金属离子进行切割，则通常优选rUMP或rCMP。为了用核糖核酸酶切割，优选包括两个或更多个连续的核糖核苷酸，例如2～10个或5～10个连续的核糖核苷酸。核糖核苷酸的精确序列通常并不重要，合适的RNA酶包括，例如RNase A，其在C和U残基之后切割。因此，当用RNaseA切割时，剪切位点必须包含至少一个C或U核糖核苷酸。掺入一个或多个核糖核苷酸的扩增寡核苷酸可以使用用于寡核苷酸化学合成的标准技术与合适的核糖核苷酸前体容易地合成。
本发明中，“无碱基位点”指的是核酸分子中已经除去碱基组分的位置。无碱基位点可以在生理条件下通过核苷残基的水解而天然存在于DNA中，同时，也可以在人工条件下(例如通过酶的作用)以化学方式形成。无碱基位点一旦形成，便可以利用合适的剪切方法剪切无碱基位点(例如，通过用内切核酸酶或其他单链切割酶、暴露于热或碱处理)，从而提供用于位点特异性切割捕获核酸的手段。本领域普通技术人员应该认识到，使用热或碱有可能使核酸分子变性，因此，可能并不是优选的实施方式。
在优选的实施方式中，可以在扩增寡核苷酸的预定位置上产生无碱基位点，通过首先在预定的裂解位点掺入脱氧尿苷(U)来切割，然后可以使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)除去尿嘧啶碱基，从而在特定位置产生无碱基位点。然后可以通过用内切核酸酶(例如EndoIV内切核酸酶、AP裂合酶、FPG糖基化酶/AP裂合酶、Endo VIII糖基化酶/AP裂合酶)、热或碱处理，在无碱基位点处剪切包含无碱基位点的链。除了脱氧尿苷，还可以在非天然/修饰的脱氧核糖核苷酸上产生无碱基位点，并通过用内切核酸酶、热或碱处理以类似的方式剪切。例如，可以通过暴露于FPG糖基化酶将8-氧代鸟嘌呤转化为无碱基位点；可以通过暴露于AlkA糖基化酶将脱氧肌苷转化为无碱基位点；然后通常可通过用合适的内切核酸酶(例如，Endo IV、AP裂合酶)处理来切割产生的无碱基位点。需要注意的是，由于非天然/修饰的核苷酸将被掺入扩增寡核苷酸中以用于扩增的用途，所以本发明中的非天然/修饰的核苷酸应该满足能够被用于扩增反应的聚合酶复制反应中。
在优选的实施方式中，可以将合适的糖基化酶和一种或多种合适的内切核酸酶混合在一起用于剪切反应。在此类混合物中，糖基化酶和内切核酸酶通常将以至少约2:1的活性比率存在。在一个具体的实施方案中，可购自New England Biola bs的USER试剂用于在扩增寡核苷酸中的尿嘧啶碱基处形成单核苷酸缺口，用内切核酸酶处理在切割位点处产生3’-磷酸部分，有需要时，此3’-磷酸可以被合适的磷酸酶(如碱性磷酸酶)除去。
具有切口内切核酸酶的酶消化
在分子生物学领域中，使用切口内切核酸酶剪切双链核酸分子的一条链是常规使用的技术。切口内切核酸酶是选择性切割双链核酸的一条链的酶，并且在分子生物学领域是公知的。该方法基本上可以使用任何切口内切核酸酶，需要满足在扩增寡核苷酸上存在的剪切位点中包含合适的识别序列。
半甲基化DNA的剪切
所述半甲基化DNA是指寡核苷酸中包含一个或多个甲基化核苷酸，会与互补链上的非甲基化脱氧核糖核苷酸相对，使得两条链的退火产生半甲基化的双链体结构。对于该核酸的剪切，可以通过用内切核酸酶切割实现位点特异性切割；所述内切核酸酶对于包含甲基化核苷酸的识别序列是特异性的。可以使用适当的甲基化核苷酸前体，使用自动DNA合成的标准技术，制备掺入一个或多个甲基化核苷酸的扩增寡核苷酸。
本发明中，在进行剪切反应之后，需要使剪切反应的产物经历变性条件以去除未连接至介质表面的被切割的链的部分。例如可以通入甲酰胺溶液反应使核酸变性。
根据优选的实施方式，所述两种扩增寡核苷酸上含有可被剪切的位点指的是，两种扩增寡核苷酸上的剪切位点是互不相同的，并且剪切的条件也是不一样的。这样在进行剪切的时候，根据具体的需求，选择不同的剪切条件，可控制地进行有利的剪切。例如，剪切位点1是尿嘧啶，剪切位点2是8-氧代鸟嘌呤；或者，剪切位点1是8-氧代鸟嘌呤，剪切位点2是尿嘧啶。其中，所述的将扩增后的双链模板剪切为单链，指的是将第一扩增寡核苷酸或者第二扩增寡核苷酸通过剪切位点剪切为两段，并去除未与固相介质连接的单链，此过程也被称为“线性化”。
根据优选的实施方式，对所述线性化后的单链核酸进行测序，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。荧光发生测序与Illumina等的测序方法的测序原理不同，其测序信号产生的原理是DNA聚合酶按照碱基互补配对原则将5’磷酸上标记了荧光基团的反应底物结合到测序模板上，释放下来的基团会在碱性磷酸酶的作用下进一步分解出荧光发生基团，这样DNA模板发生延伸时就会释放出荧光基团并在特定波长激发光下发出荧光，此信号被采集。由于测序时存在碱性磷酸酶，若步骤(5)和步骤(11)中所述剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则在碱性磷酸酶的作用下此磷酸基团会被切除并继续发生延伸反应，从而生成杂信号，严重干扰后续的测序分析。
为了克服上述缺陷，本发明的技术方案是先去除此3’末端磷酸基团，将其封端后进行第一链测序，测序后再通过剪切的方式直接剪切掉此封端，使该3’末端重新变为可以延伸的状态，从而用于第二链的生成，这个设计是非常巧妙的，避免了荧光发生测序时杂信号的产生，在现有技术中是不存在所述设计的。
具体的，当步骤(5)、步骤(8)和步骤(11)中所述剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团时，需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，再将此末端进行封端。
封端是固相扩增中的常见步骤，常见的封端是指利用末端转移酶TdT等工具酶将ddNTPs等3’端修饰的底物转移到核苷酸链3’端的步骤，此末端不可继续反应，从而降低副反应的发生。所述封端反应在测序反应之前进行。
对于双端测序，在第一链测序反应结束后，此时介质表面只有第一链，需要反应生成足够的用于测序的第二链。因此，需要将上述已封端的扩增寡核苷酸再次变为可以延伸的状态，这是通过作用于所述第一扩增寡核苷酸的剪切位点2实现的，加入剪切液，把3’末端的封端位点剪切掉，暴露出可以延伸的3’末端，之后进行第二链的再生延伸或扩增。
所述第二链扩增完成后，作用于第二扩增寡核苷酸上的剪切位点，将第一链剪切掉，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋，暴露出可以结合测序引物的单链，之后同样向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住，在经过上述处理步骤后，杂交第二测序引物后便可以进行第二链的测序了。
根据优选的实施方式，若能产生足够的用于第二链测序反应的分子，则第二次扩增反应可以只进行延伸反应。
本发明中，在扩增测序方法的各个步骤之间加入清洗液进行洗涤可能是有益的。例如，在杂交结束后，加入清洗液将多余的模板清洗掉；利用甲酰胺解旋后，加入清洗液将解旋下的核苷酸单链清洗走；剪切反应或封端反应后，对芯片进行清洗，等等。适当的清洗对于保证反应的正常进行非常重要。
本发明中，所述的模板多核苷酸指的是将待测的核酸分子片段化并经过文库构建得到的核酸片段，也可以称为扩增模板。所述的模板的序列可以是未知的。在测序之前，将长片段的核酸分子打断形成小的片段，然后连接上特定的接头序列，就可以进行所述的扩增测序过程。待测分子的片段化可以使用本领域已知的多种技术的任一种进行，例如，超声处理、雾化、物理剪切、化学裂解或酶解等。整个过程中，对于待测的核酸序列片段是没有限制的，任意的序列都可以进行该操作。这也是完整测序的概念。模板多核苷酸的大小为50～10000bp，也可以是100～1000bp，最长可以是10kb的模板，但此时扩增效果受到显著影响。
需要说明的，一般的，模板多核苷酸是双链分子的形式，在杂交之前，需要将双链解旋为单链；特殊的，模板多核苷酸也可以是单链分子的形式，可以直接用于杂交。
根据优选的实施方式，所述模板多核苷酸包含特定的核苷酸序列标签，以表明该多核苷酸的来源，具体的包含第一索引和第二索引。在实际测序时，为了充分利用高通量测序芯片的测序通量，常常将多个不同来源的样本在一块芯片上进行测序，在测序完成后需要区分序列的来源，就是借助所述的核苷酸序列标签(也叫index)完成的。所述测序方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。示例性的，可以先测第一链、再测第一索引、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二索引、再测第二链；或者先测第一链、再测第一索引、再测第二索引、再测第二链；所述索引序列的测序顺序是可调的，可根据实际测序进行选择。
对于基因测序方法，常规的，例如Illumina的测序方法，每轮反应只测一个碱基，大部分测序方法每次都是测一个碱基的信号。对于本发明来说，每次反应几个碱基并不是本发明的重点。本发明所述的双端扩增测序方法，更加适用于申请人之前公开的2+2荧光发生测序；但是并不排除常规的类似于Illumina类型的测序方法，特殊的，专利CN201510815685.X的内容可以以引用的形式加入本专利，以具体说明荧光发生测序。
芯片上的双端扩增测序过程示意图参见图2。载体表面带有的生物素可以与芯片表面的链霉亲和素结合，因此首先可以将载体通过离心的方式固载到芯片的微反应室内。载体上固定了两种扩增寡核苷酸，两种扩增寡核苷酸上均带有剪切位点，其中，灰色的短片段为第一扩增寡核苷酸，其上有两个不同的剪切位点，即剪切位点1和剪切位点2，黑色的短片段为第二扩增寡核苷酸，其上有一个剪切位点，且3个剪切位点互不相同(步骤(1))。在扩增开始前，首先将单链模板与载体表面的第一扩增寡核苷酸杂交(步骤(2))，之后，进行初始延伸(步骤(3))、解旋和液相模板的取出(步骤(4))。然后，利用RPA试剂盒进行模板的扩增(步骤(5)(6))。在RPA结束后，依次进行固相引物的剪切反应(步骤(7))、去除磷酸基团(步骤(8))、解旋(步骤(9))和封端反应(步骤(10))，此时载体上的模板为单链(第一链)，将第一测序引物杂交到载体上即可进行测序(步骤(11))。第一链测序结束后，第二链测序之前需要将封端去除或者解封端，通过剪切掉第一扩增寡核苷酸的剪切位点2，以将封端切除(步骤(12))，用T4PNK处理，暴露出可以延伸的3’末端(步骤(13))，之后采用恒温扩增或普通PCR进行再生延伸或扩增(步骤(14)(15))。扩增完成后，加入第三种剪切液，将第一链剪切掉(步骤(16))，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉(步骤(17))，再向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住(步骤(18))。在经过上述处理步骤后，杂交第二测序引物，进行第二链的测序反应(步骤(19))。
本发明的又一方面提供了一种固相介质表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：
(1)提供固定在固相介质表面的至少两种扩增寡核苷酸，即至少提供第一扩增寡核苷酸以及第二扩增寡核苷酸；其中，第一扩增寡核苷酸上含有剪切位点，第二扩增寡核苷酸上含有剪切位点，且两种剪切位点不相同；
(2)提供单链模板多核苷酸，通过与所述第一扩增寡核苷酸的杂交，单链模板多核苷酸加载至固相介质表面；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；
(3)初始延伸：延伸所述第一扩增寡核苷酸，生成与所述单链模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
(4)第一次扩增：提供扩增反应物，在介质表面进行扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
(5)剪切：通过作用于第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；
(6)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行可逆封堵；
(7)第一链测序：杂交第一测序引物，测序；
(8)解封端：加入与所述封端试剂相对应的解封端试剂进行解封端反应，解除封端，并生成可延伸的3’末端；
(9)再次杂交：使第一链与所述第一扩增寡核苷酸重新杂交；
(10)第二次扩增：提供扩增反应物，进行介质表面延伸或扩增；
(11)剪切：通过作用于第二扩增寡核苷酸的剪切位点，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；
(12)封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
(13)第二链测序：杂交第二测序引物，测序；
所述固相介质表面修饰有化学基团。
本发明的方法首先将至少两种扩增寡核苷酸固定在所述固相介质表面，术语“固定”指的是寡核苷酸经由共价键或非共价键直接或间接附接至固相介质。例如，所述扩增寡核苷酸可以通过其5’端与固相介质表面修饰的化学基团发生特异性反应附接至其上，所述基团包括氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等。
本发明中，对于两种或两种以上的扩增寡核苷酸，每一种都包括多个；多个包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100个或者更多个群体成员；多个还可以包括200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、lxl05、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、lx106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或更多个成员，多个包括以上示例性群体数目之间的所有整数。
术语“扩增寡核苷酸”指的是包括扩增引物在内的序列，可以全部由天然的或经修饰的核苷酸(例如，8-氧代鸟嘌呤、甲基化核苷酸等)组成，还可以包括必要的非核苷酸化学间隔物，包括但不限于含有二硫基或双羟基或偶氮基团或叠氮基团的单元物等。
本发明中，术语“固相介质”指的是核酸分子可以附接于其上的任何不可溶的惰性基底或基质，包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。表面的形状是可选择的，包括，例如，适合用于特定应用的多孔的、平面的或球形的。优选的，将固相介质安装在流动池的内部，以允许其与多个试剂溶液的相互作用。
根据优选的实施方式，所述固相介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状可以是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、类六方柱结构，或者其组合。所述微反应室可以是阵列的或非阵列的。每个微反应室都是一个反应的反应室，反馈到测序数据的时候就对应一个数据点。这在测序反应中是常见的事实。
在一些优选的实施方式中，所述固相介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。该媒介材料具有特定化学基团修饰，可以共价附接核酸分子，特殊的，所述媒介材料还可以包括磁性微球，通过磁力将其限制在所述惰性基底或基质表面。
在一些优选的实施方式中，所述媒介材料为微球，包括水凝胶微球、磁性微球，所述微球的直径应与所述微反应室的尺寸相匹配，即微球直径应小于微反应室的尺寸，且不小于该尺寸的一半，以使微球可进入微反应室，而且一个微反应室内不会进入多于一个微球。
在一些优选的实施方式中，本发明中所述媒介材料为聚合物涂层，可用于沉积核酸的聚合物涂层在本领域是熟知的，例如聚丙烯酰胺水凝胶层。该水凝胶层作为中间层可以共价附接所述扩增寡核苷酸，该水凝胶层还可通过非共价作用附接在所述惰性基底或基质上，该惰性基底或基质包括但不限于玻璃、硅片等。
在一些实施方式中，磁性微球是可以考虑的选择。磁性微球可以通过外界的磁场施加作用力，在某些特殊的条件下，能够发挥作用。
本发明中，所述媒介材料可以是水凝胶微球，关于水凝胶微球的制备方法可参见专利CN202010087598.8，特殊的，上述专利的内容可以以引用的形式加入本专利。
根据优选的实施方式，所述微球的大小为0.2-5微米，优选0.3-3微米，更优选0.35-2.5微米。
在一些优选的实施方式中，首先将固载了至少两种扩增寡核苷酸、且含有特定化学基团修饰的媒介材料(微球)加载到加工出微反应室并修饰好的芯片表面，达到芯片绝大多数的微反应室内都有微球而微反应室外不存在微球的状态。优选的，所述微反应室中至多加载一个微球。
根据优选的实施方式，所述微球表面有用于固定扩增寡核苷酸的官能团，包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等，以进行必要的寡核苷酸连接。所述多个扩增寡核苷酸载体表面的此类官能团应具备一定密度，例如大于10000个/微球。
根据优选的实施方式，所述微球表面应具备可与微反应室表面可逆结合的官能团，包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环炔基，环氧乙基等。例如，所述微球上有生物素作为固载用化学基团，所述基因测序芯片微反应室内有修饰的链霉亲和素，通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片的微反应室内；所述微球有氨基基团，可以与芯片微反应室内预先连接上的裸露的巯基反应，将微球固载至微反应室内。
扩增的第一步是将扩增模板多核苷酸杂交到载体上。所述模板多核苷酸两端含有公共的(或通用的)接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的，因此可以按照碱基互补配对的原则进行杂交。所述模板多核苷酸是双链核酸文库或单链核酸文库，在杂交前，需将双链DNA解旋为单链，再与固相扩增寡核苷酸互补配对。在杂交结束后，将多余的模板清洗掉并进入含有DNA聚合酶的反应液反应，这样固相的引物会根据杂交上的DNA模板延伸出一条完整的互补配对的模板链。紧接着，加入解旋液反应并将解旋下的DNA清洗走。这样整个芯片内部就不再存在液相的游离核酸文库，所有模板多核苷酸都复制到了固载的载体表面。
根据优选的实施方式，本发明中所述的扩增指的是本领域意义上的扩增。扩增指的是基因扩增，通过一定的技术，使得基因的拷贝数增加。本发明所述的扩增模板，其两端含有公共的接头序列，被称为接头序列1和接头序列2。对于任意的扩增模板，在其两端都连接有相同的接头序列。例如根据3’端和5’端的区别，连接两种不同的接头序列。当然，在存在互补DNA链的情况下，实际上还可以含有接头序列1的互补接头序列以及接头序列2的互补接头序列。这都属于本领域的常规知识。
本发明中，所述接头序列1和第一扩增寡核苷酸，至少部分序列是互补配对的。这样在扩增模板杂交的时候，可以通过互补配对的形式杂交。所述的接头序列2和第二扩增寡核苷酸的至少部分序列是相同的。杂交结束以后，解旋获得的是扩增模板的反向DNA链，或者说获得的是互补配对链，这个时候，其接头序列也是反向或者互补配对的。因此，在后续的扩增反应的时候，该反向接头序列是需要同第二扩增寡核苷酸结合的。也就是说，接头序列2和第二扩增寡核苷酸的至少部分序列是相同的。当然，扩增寡核苷酸一般来说，还需要满足连接到载体的其他要求，比如包含有连接到载体的基团等。部分匹配的要求属于常见的设计方式。
根据优选的实施方式，将所述模板多核苷酸杂交到介质表面时，通过控制条件使单链模板多核苷酸和种植有扩增寡核苷酸的微反应室或种植有扩增寡核苷酸的微球的数量比为1:1，使得大多数微反应室仅杂交上一条模板序列。
根据优选的实施方式，将待测模板多核苷酸分子加载至介质表面以后，进行扩增反应，使DNA模板可以在表面进行扩增，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。
恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。相比传统的PCR技术，恒温扩增具有显著的优势：检测线低、不需要变温、扩增速度快，且通常反应温度较低，降低了对芯片耐高温的要求。常见的恒温扩增技术包括：①依赖核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，主要依赖AMV逆转录酶、RNaseH和T7 RNA聚合酶和两条特别设计的引物来完成恒温扩增；②滚环扩增技术(RCA)，phi29DNA聚合酶是反应重要的组成部分，具有持续DNA合成能力和链置换活性；③环介导恒温扩增(LAMP)，LAMP使用4条或6条引物，特异性强、灵敏度高；④依赖解旋酶扩增技术(HDA)；⑤重组酶聚合酶扩增(RPA),RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右；⑥重组酶介导恒温核酸扩增技术(RAA)，技术原理与RPA相似，不同之处在于RAA的重组酶来源于细菌或真菌，而RPA的重组酶来自T4噬菌体；⑦链置换扩增技术(SDA)，其基本反应系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTPs以及钙、镁离子和缓冲系统。
恒温扩增技术的影响因素有多种，比如引物的设计，不同的扩增技术对于引物的数量等的要求有所不同；本发明中涉及的恒温扩增反应可以使用至少两种引物的形式，例如，RPA的扩增引物不同于常规PCR引物，一般的，其2条引物长度在20-45nt；LAMP的扩增引物设计难度更大，包括4条或6条引物。引物的具体设计是可以变化的。
本发明中，扩增反应中模板多核苷酸的数量可以从纳克至微克的范围内。
根据优选的实施方式，扩增反应液包括DNA聚合酶和dNTPs，DNA聚合酶可以是具有链置换活性的聚合酶，如Bst DNA聚合酶，Sau DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶等。因为聚合酶对于每种碱基的效率可能是不同的，所以在扩增反应液中的dNTPs的浓度可能各不相同。对于有特殊修饰的核苷酸底物，相应的DNA聚合酶应该能够识别此类核苷酸底物。在一些实施方式中，核苷酸底物可以是天然dNTPs；在其他实施方式中，可利用荧光基团等对核苷酸进行修饰。
根据优选的实施方式，扩增反应液还可以包括重组酶和单链结合蛋白，示例性的重组酶包括，例如，RecA蛋白质、T4 uvsX重组酶以及SC-recA、BS-recA、Rad51等同源蛋白质或蛋白质复合物，或其功能的变体。
在进行测序反应之前，需要将双链扩增产物线性化，即将其变为单链，本发明采用的是剪切方式。具体的，在介质表面的多种扩增寡核苷酸中，第一扩增寡核苷酸含有一个剪切位点，第二扩增寡核苷酸含有一个剪切位点，且两个剪切位点互不相同。在加入第一种剪切液后第二链可以被特异性地剪切掉，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋掉，便暴露出了可以结合测序引物的单链(第一链)。
此外，还需尽可能地降低测序反应可能产生的杂信号，这一目的是通过封端反应实现：向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住，无法在DNA聚合酶的作用下延伸产生杂信号。在经过上述处理步骤后，只要杂交测序引物便可以进行第一链的测序反应了。
本发明中，术语“剪切位点”指代的含义较为广泛，任何剪切方法只要满足作用于此位点后使得双链核酸分子在此位点处被切断一条链，从而在固相介质表面只剩下一条多核苷酸链，且该剪切反应不能破坏被切割单链剩余部分与未切割单链的互补杂交，则此位点就可以被称为“剪切位点”。所述剪切方法包括但不限于：光剪切、适合的化学剪切、适合的酶促剪切、核糖核苷酸的剪切、无碱基位点的剪切、具有切口内切核酸酶的酶消化、半甲基化DNA的剪切等方法。
在本发明的前一方面具体实施部分中所讨论的剪切方式特征中的每个特征(包括光剪切、化学剪切、核糖核苷酸的剪切、具有切口内切核酸酶的酶消化、半甲基化DNA的剪切等)同样适用于本方面的具体实施。如上所示，所有其他特征在此处不再重复，并且应被视为以引用方式重复。本领域普通技术人员将理解在这些具体实施中识别的特征可如何容易地与在其他具体实施中识别的基本特征组组合。
本发明中，在进行剪切反应之后，需要使剪切反应的产物经历变性条件以去除未连接至介质表面的被切割的链的部分。例如可以通入甲酰胺溶液反应使核酸变性。
根据优选的实施方式，所述两种扩增寡核苷酸序列上含有可被剪切的位点指的是，两种扩增寡核苷酸上的剪切位点是互不相同的，并且剪切的条件也是不一样的。这样在进行剪切的时候，根据具体的需求，选择不同的剪切条件，可控制地进行有利的剪切。例如，剪切位点1是尿嘧啶，剪切位点2是8-氧代鸟嘌呤；或者，剪切位点1是8-氧代鸟嘌呤，剪切位点2是尿嘧啶。其中，所述的将扩增后的双链模板剪切为单链，指的是将第一扩增寡核苷酸或者第二扩增寡核苷酸通过剪切位点剪切为两段，并去除未与固相介质连接的单链，此过程也被称为“线性化”。
根据优选的实施方式，对所述线性化后的单链核酸进行测序，所述测序为边合成边测序或连接法测序，优选为荧光发生测序。荧光发生测序与Illumina等的测序方法的测序原理不同，其测序信号产生的原理是DNA聚合酶按照碱基互补配对原则将5’磷酸上标记了荧光基团的反应底物结合到测序模板上，释放下来的基团会在碱性磷酸酶的作用下进一步分解出荧光发生基团，这样DNA模板发生延伸时就会释放出荧光基团并在特定波长激发光下发出荧光，此信号被采集。由于测序时存在碱性磷酸酶，若步骤(5)和步骤(11)中所述剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则在碱性磷酸酶的作用下此磷酸基团会被切除并继续发生延伸反应，从而生成杂信号，严重干扰后续的测序分析。
为了克服上述缺陷，本发明的技术方案是先去除此3’末端磷酸基团，将其用封端试剂进行可逆封端后进行第一链测序，测序后再用对应的解封端试剂解除此可逆封端，使该3’末端重新变为可以延伸的状态，从而用于第二链的生成，这个设计是非常巧妙的，避免了荧光发生测序时杂信号的产生，在现有技术中是不存在所述设计的。
具体的，当步骤(5)和步骤(11)中所述剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团时，需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，再将此末端进行封端。
封端是固相扩增中的常见步骤，常见的封端是指利用末端转移酶TdT等工具酶将ddNTPs等3’端修饰的底物转移到核苷酸链3’端的步骤，此末端不可继续反应，从而降低副反应的发生。本发明中，步骤(6)中的封端试剂是在脱氧核糖或碱基上连接有封端基团的核苷酸类似物以及双脱氧核苷酸，所述封端基团包括：邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫基、偶氮基、叠氮基、肽键、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯、氨基甲酸酯等。所述封端反应在测序反应之前进行。
对于双端测序，在第一链测序反应结束后，此时介质表面只有第一链，需要反应生成足够的用于测序的第二链。因此，需要将上述已封端的扩增寡核苷酸再次变为可以延伸的状态，这是通过作用于所述扩增寡核苷酸的封端实现的，具体的，加入与封端试剂相对应的解封端试剂进行解封端反应，所用的解封端试剂选自：三(2-羧乙基)膦、二硫苏糖醇、半胱氨酸、连二亚硫酸钠、联氨、高碘酸盐、高锰酸盐，以去除可逆末端保护基团，暴露出可延伸的3’末端。例如的，当封端试剂具有邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点时，可以使用高碘酸钠水溶液或高锰酸钾处理以切割二醇；当封端试剂为基于二硫键连接单元的可逆终止子时，二硫键在温和的还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)的作用下发生裂解，实现可逆封端高效快捷的剪切，而断裂后的核苷酸片段可以在聚合酶的作用下继续延伸。
之后，可以进行第二链的再生延伸或扩增。所述第二链扩增完成后，加入第二种剪切液，作用于第二扩增寡核苷酸上的剪切位点，将第一链剪切掉，加入解旋液反应将被剪切的序列解旋，暴露出可以结合测序引物的单链，之后同样向芯片内加入封端液，使得所有固相DNA的3’端都被封住，在经过上述处理步骤后，杂交第二测序引物后便可以进行第二链的测序了。
根据优选的实施方式，若能产生足够的用于第二链测序反应的分子，则第二次扩增反应可以只进行延伸反应。
本发明中，在扩增测序方法的各个步骤之间加入清洗液进行洗涤可能是有益的。例如，在杂交结束后，加入清洗液将多余的模板清洗掉；利用甲酰胺解旋后，加入清洗液将解旋下的核苷酸单链清洗走；剪切反应或封端反应后，对芯片进行清洗，等等。适当的清洗对于保证反应的正常进行非常重要。
本发明中，所述的模板多核苷酸指的是将待测的核酸分子片段化并经过文库构建得到的核酸片段，也可以称为扩增模板。所述的模板的序列可以是未知的。在测序之前，将长片段的核酸分子打断形成小的片段，然后连接上特定的接头序列，就可以进行所述的扩增测序过程。待测分子的片段化可以使用本领域已知的多种技术的任一种进行，例如，超声处理、雾化、物理剪切、化学裂解或酶解等。整个过程中，对于待测的核酸序列片段是没有限制的，任意的序列都可以进行该操作。这也是完整测序的概念。模板多核苷酸的大小为50～10000bp，也可以是100～1000bp，最长可以是10kb的模板，但此时扩增效果受到显著影响。
需要说明的，一般的，测序时的模板多核苷酸是双链分子的形式，在杂交之前，需要将双链解旋为单链；特殊的，模板多核苷酸也可以是单链分子的形式，可以直接用于杂交。
根据优选的实施方式，所述模板多核苷酸包含特定的核苷酸序列标签，以表明该多核苷酸的来源，具体的包含第一索引和第二索引。在实际测序时，为了充分利用高通量测序芯片的测序通量，常常将多个不同来源的样本在一块芯片上进行测序，在测序完成后需要区分序列的来源，就是借助所述的核苷酸序列标签(也叫index)完成的。所述测序方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。示例性的，可以先测第一链、再测第一索引、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二链、再测第二索引；或者先测第一索引、再测第一链、再测第二索引、再测第二链；或者先测第一链、再测第一索引、再测第二索引、再测第二链；所述索引序列的测序顺序是可调的，可根据实际测序进行选择。
对于基因测序方法，常规的，例如Illumina的测序方法，每轮反应只测一个碱基，大部分测序方法每次都是测一个碱基的信号。对于本发明来说，每次反应几个碱基并不是本发明的重点。本发明所述的双端扩增测序方法，更加适用于申请人之前公开的2+2荧光发生测序；但是并不排除常规的类似于Illumina类型的测序方法，特殊的，专利CN201510815685.X的内容可以以引用的形式加入本专利，以具体说明荧光发生测序。
实施例1
1.将修饰了固载基团和两种扩增引物的微球加载至芯片表面微反应室：
1)用含有0.01％Tween20的1xPBS溶液将微球载体稀释至约3M/μL，并振荡混匀。
2)在芯片进样口，通入稀释好的微球溶液300μL。
3)将芯片进行离心。
2.模板预杂交：
1)根据扩增反应最终加入的模板浓度，对模板继续稀释并加入合适体积的0.1MNaOH进行解旋。模板稀释及解旋均取用1.5ml DNA Lobind EP管；若稀释后的模板不需要长期保存可用超纯水稀释，如需长期保存，可用TE稀释。下表为常用模板浓度及加入的0.1MNaOH的体积。
| 模板终浓度 | 加入的模板和0.1M NaOH体积 |
| 1pM | 4μL NaOH+4μL 100pM模板 |
2)加入0.1M NaOH后，震荡混匀，快速离心2s，室温放置5min。
3)解旋结束后，根据解旋液体积加入5x SSC溶液，使得溶液终体积为400μL，用移液枪缓慢吹打10次混匀立即放置在冰上待用，切记不能震荡混匀。
4)取待扩增芯片，用500μL seq buffer进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL seq buffer进行清洗。
5)取模板溶液加入芯片中，每张芯片加入200μL反应液，用kimtech将芯片出入口处的液体擦干净，用封口膜封口，放入平板PCR仪中，选择anneal程序：96℃，30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。
6)反应完后取出，放置在冰上待用。
3.初始延伸反应
1)取400μL 2x phusion混合液放置在冰上，再加入400μL超纯水，稀释一倍，震荡混匀，放置在冰上。
2)将上述混合液加入芯片中，每张芯片加入400μL，将芯片放置在平板PCR仪上72℃加热2min。
3)反应结束后向芯片内加入400μL甲酰胺，常温反应5min后用清洗液清洗干净芯片。
4.重组酶聚合酶扩增反应
1)根据下表进行反应液的配制。
| 试剂 | V/μL |
| 水化液 | 180 |
| 醋酸镁 | 15 |
| 超纯水 | 105 |
| 总体积 | 300 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。
3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL异丙醇赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的扩增反应液加入芯片中，将芯片置于PCR仪上，拧紧盖子，选择加热程序：40℃，60min；4℃，forever。
5.剪切液(USER enzyme mix)反应，作用于剪切位点1
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。
| 试剂 | V/μL |
| USER酶 | 4 |
| Cutsmart | 40 |
| 超纯水 | 356 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将扩增反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的剪切反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择剪切液反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
6.去除磷酸末端反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制反应液。
| 试剂 | V/μL |
| T4PNK酶 | 16 |
| PNK buffer | 40 |
| 超纯水 | 344 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将剪切反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择反应程序：37℃，60min；4℃，forever。
7.解旋
1)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
2)每张芯片加入200μL的甲酰胺，室温(25℃)反应10min。
3)反应结束后，加入1ml 1xTE进行清洗，如果不立即测序，则用封口膜封口，放入4℃冰箱的存储盒中保存。
8.封端液(TdT enzyme mix)反应
1)取1.5mL DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
| 试剂 | V/μL |
| TdT酶 | 4 |
| 10x buffer | 40 |
| CoCl2 | 40 |
| ddNTP(10mM，each) | 8 |
| 超纯水 | 308 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端液反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
9.第一链测序
1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第一轮测序。
10.剪切液(Fpg enzyme mix)反应，作用于剪切位点2
1)取1.5mL DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。
| 试剂 | V/μL |
| Fpg酶 | 10 |
| 10x NEB buffer | 40 |
| BSA | 4 |
| 超纯水 | 346 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将测序后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择剪切液反应程序：37℃，60min；4℃，forever。
11.去除磷酸末端反应
1)取1.5mL DNA Lobind EP管按照下表配制反应液。
| 试剂 | V/μL |
| T4PNK酶 | 16 |
| PNK buffer | 40 |
| 超纯水 | 344 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将剪切反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择反应程序：37℃，60min；4℃，forever。
12.重组酶聚合酶扩增反应
1)根据下表进行反应液的配制。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。
3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL异丙醇赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的扩增反应液加入芯片中，将芯片置于PCR仪上，拧紧盖子，选择加热程序：40℃，60min；4℃，forever。
13.剪切液(高碘酸钠)反应，作用于第二扩增引物
1)取1.5mL DNA Lobind EP管按照下表配制反应液。
| 试剂 | V/μL |
| 高碘酸钠 | 20 |
| 磷酸盐buffer | 40 |
| 超纯水 | 340 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将扩增后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择剪切液反应程序：25℃，30min；4℃，forever(避光)。
14.解旋
1)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
2)每张芯片加入200μL的甲酰胺，室温(25℃)反应10min。
3)反应结束后，加入1mL1xTE进行清洗，如果不立即测序，则用封口膜封口，放入4℃冰箱的存储盒中保存。
15.封端液(TdT enzyme mix)反应
1)取1.5mL DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
| 试剂 | V/μL |
| TdT酶 | 4 |
| 10x buffer | 40 |
| CoCl2 | 40 |
| ddNTP(10mM，each) | 8 |
| 超纯水 | 308 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端液反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
16.杂交第二测序引物
1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第二轮测序。
17.数据分析
第二链生成效率
图3A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图3A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图3B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的78％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。
实施例2
步骤1-7与实施例1相同，见上。
8.含可逆末端保护碱基的封端液(TdT enzyme mix)反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
| 试剂 | V/ul |
| TdT酶 | 4 |
| 10x buffer | 40 |
| CoCl2 | 40 |
| 可逆dTTP | 4 |
| Ultrapure water | 302 |
| 稳定剂 | 10 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将RPA反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ulIPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端液反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
9.杂交测序引物
1)将溶解于1x TE内的浓度为100uM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2uM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将解旋反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ulIPA赶出气泡后再用500ul杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500uL清洗进行清洗。然后进行第一轮测序。
10.TCEP脱保护反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制解封端反应液。
| 试剂 | V/ul |
| TCEP | 40 |
| Tris base | 40 |
| NaCl | 40 |
| 抗坏血酸钠 | 20 |
| 10％Tween 20 | 2 |
| Ultrapure water | 258 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将测序后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul IPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的反应液加入芯片中，，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端液反应程序：65℃，30min；4℃，forever。
11.重组酶聚合酶反应
1)根据下表进行反应液的配制。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。
3)将芯片用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul异丙醇赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的扩增反应液加入芯片中，将芯片置于PCR仪上，拧紧盖子，选择加热程序：40℃，60min；4℃，forever。
12.剪切液(fpg enzyme mix)反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
| 试剂 | V/ul |
| Fpg酶 | 10 |
| 10x NEBbuffer | 40 |
| BSA | 4 |
| 稳定剂 | 10 |
| Ultrapure water | 336 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将测序后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul IPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的反应液加入芯片中，，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端液反应程序：37℃，60min；4℃，forever。
13.解旋
1)将封端液反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ulIPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。
2)每张芯片加入200ul的甲酰胺，室温(25℃)反应10min。
3)反应结束后，加入1ml 1xTE进行清洗，。如果不立即测序，则用封口膜封口，放入4℃冰箱的存储盒中保存。
14.封端液(TdT enzyme mix)反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
| 试剂 | V/ul |
| TdT酶 | 4 |
| 10x buffer | 40 |
| CoCl2 | 40 |
| ddNTP(10mM，each) | 8 |
| Ultrapure water | 308 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将RPA反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ulIPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端液反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
15.杂交测序引物
1)将溶解于1x TE内的浓度为100uM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2uM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将解旋反应后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ulIPA赶出气泡后再用500ul杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500uL清洗进行清洗。然后进行第二轮测序。
16.数据分析
第二链生成效率
图4A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图4A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图4B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的86％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。
实施例3
步骤1-8与实施例1相同，见上。
9.第一链测序
1)将溶解于1xTE内的浓度为100μM的扩增引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将封端反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的扩增引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第一轮测序。
10.固相连接反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制固相连接反应液。
| 试剂 | V/ul |
| B3T | 283 |
| 催化剂 | 17 |
| Total | 300 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。
3)将测序后的芯片，用500ul清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200ul IPA赶出气泡后再用500ul清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的反应液加入芯片中，室温放置1h。
11.剪切液(Fpg enzyme mix)反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。
| 试剂 | V/μL |
| Fpg酶 | 10 |
| 10x NEB buffer | 40 |
| BSA | 4 |
| ultrapure water | 346 |
| Total | 400 |
2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
3)将剪切反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。
4)剪切结束后，用1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
5)向芯片中加入1ml解旋液，室温放置3min，解旋。
6)加入1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
12.切磷酸反应
1)取1.5ml EP管按以下体系配制切磷酸反应液。
| 试剂 | V/ul |
| T4PNK酶 | 16 |
| 10x NEB buffer | 40 |
| Ultrapure water | 344 |
| Total | 400 |
2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
3)将切磷酸反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。
13.封端反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
| 试剂 | V/μL |
| TdT酶 | 4 |
| 10x buffer | 40 |
| CoCl2 | 40 |
| dTTP | 4 |
| ultrapure water | 312 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
14.第二链测序
1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第二链测序。
15.数据分析
第二链生成效率：
图5A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图5A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图5B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的81％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。
实施例4
1.微球固载，所述微球表面连接有3种扩增引物：有剪切位点的第一扩增引物，无剪切位点的第一扩增引物，以及有剪切位点的第二扩增引物；
1)用含有0.01％Tween20的1xPBS溶液将微球载体稀释至约3M/μL，并振荡混匀。
2)在芯片进样口，通入稀释好的微球溶液300μL。
3)将芯片进行离心。
2.模板预杂交
1)根据扩增反应最终加入的模板浓度，对模板继续稀释并加入合适体积的0.1MNaOH进行解旋。模板稀释及解旋均取用1.5ml DNA Lobind EP管；若稀释后的模板不需要长期保存可用ultrapure water稀释，如需长期保存，可用TE稀释。下表为常用模板浓度及加入的0.1M NaOH的体积。
| 模板终浓度 | 加入的模板和0.1M NaOH体积 |
| 1pM | 4μL 100pM模板+4μL NaOH |
2)加入0.1M NaOH后，震荡混匀，快速离心2s，放置室温5min。
3)解旋结束后，根据解旋液体积加入5x SSC溶液，使得溶液终体积为400μL，用移液枪缓慢吹打10次混匀立即放置在冰上待用，切记不能震荡混匀。
4)取待扩增芯片，用500μL seq buffer进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL seq buffer进行清洗。
5)取模板溶液加入芯片中，每张芯片加入200μL反应液，用kimtech将芯片出入口处的液体擦干净，用封口膜封口，放入平板PCR仪中，选择anneal程序：96℃，
30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。
6)反应完后取出，放置在冰上待用。
3.初始延伸反应
1)取400μL 2x phusion混合液放置在冰上，再加入400μL超纯水，稀释一倍，震荡混匀，放置在冰上。
2)将上述混合液加入芯片中，每张芯片加入400μL，将芯片放置在平板PCR仪上72℃加热2min。
3)反应结束后向芯片内加入400μL甲酰胺，常温反应5min后用清洗液清洗干净芯片。
4.重组酶聚合酶扩增反应
1)根据下表进行反应液的配制。
| 试剂 | V/μL |
| 水化液 | 180 |
| 醋酸镁 | 15 |
| 超纯水 | 105 |
| 总体积 | 300 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s。
3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL异丙醇赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的扩增反应液加入芯片中，将芯片置于PCR仪上，拧紧盖子，选择加热程序：40℃，60min；4℃，forever。
5.剪切液(USER enzyme mix)反应，剪切第一扩增引物
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。
| 试剂 | V/μL |
| USER酶 | 4 |
| Cutsmart | 40 |
| ultrapure water | 356 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将扩增反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的剪切反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择剪切反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
6.解旋
1)将剪切液反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
2)每张芯片加入200μL的甲酰胺，室温(25℃)反应10min。
3)反应结束后，加入1ml 1xTE进行清洗，如果不立即测序，则用封口膜封口，放入4℃冰箱的存储盒中保存。
7.封端液(TdT enzyme mix)反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
| 试剂 | V/μL |
| TdT酶 | 4 |
| 10x buffer | 40 |
| CoCl2 | 40 |
| dTTP | 4 |
| ultrapure water | 312 |
| Total | 400 |
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
8.第一链测序
1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将封端反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μLIPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第一轮测序。
9.剪切液(Fpg enzyme mix)反应，剪切第二扩增引物
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制剪切反应液。
| 试剂 | V/μL |
| Fpg酶 | 10 |
| 10x NEB buffer | 40 |
| BSA | 4 |
| ultrapure water | 346 |
| Total | 400 |
2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
3)将剪切反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。
4)剪切结束后，用1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
5)向芯片中加入1ml解旋液，室温放置3min，解旋。
6)加入1ml清洗液清洗芯片。如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
10.切磷酸反应
1)取1.5ml EP管按以下体系配制切磷酸反应液。
| 试剂 | V/ul |
| T4PNK酶 | 16 |
| 10x NEB buffer | 40 |
| Ultrapure water | 344 |
| Total | 400 |
2)用1ml清洗液清洗芯片，如果有气泡，可用1ml IPA将气泡赶出。
3)将切磷酸反应液加入到芯片中，封口后，置于平板PCR仪上，选择剪切程序：37℃，1h。
11.封端反应
1)取1.5ml DNA Lobind EP管按照下表配制封端反应液。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将芯片用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL清洗液进行清洗。
4)将配制混合好的封端反应液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择封端反应程序：37℃，30min；4℃，forever。
12.第二链测序
1)将溶解于1x TE内的浓度为100μM的测序引物在EP管内用杂交液稀释至2μM。
2)配制完成后，震荡混匀，快速离心2s，放置冰上待用。
3)将反应后的芯片，用500μL清洗液进行清洗，如果有气泡，可以加入200μL IPA赶出气泡后再用500μL杂交液进行清洗。
4)将配制混合好的测序引物溶液加入芯片中，将芯片置于平板PCR仪上，拧紧盖子，选择测序引物杂交程序：60℃，7min；40℃，3min。
5)反应结束后，加入500μL清洗液进行清洗。然后进行第二链测序。
13.数据分析
第二链生成效率
图6A左图展示了第一链生成后杂交荧光标记探针时微球亮度，图6A右图展示了新生成的第二链产物杂交荧光标记探针时微球亮度，因第一链和第二链使用的探针为同一种荧光素标记，所以微球亮度的高低可反映出对应产物数量的多少。图6B为使用MATLAB软件根据微球亮度绘制的第二链生成效率图，其中X-轴为杂交第一链荧光标记探针时微球亮度，Y-轴为杂交第二链荧光标记探针时微球亮度，散点图的斜率表示第二链生成效率。从图中可以看出，第二链生成效率为第一链的84％，第二链生成效率较高，满足第二链测序要求。
以上为本发明较佳的实施方式，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改，因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (24)
1.一种固相介质表面双端扩增测序的方法，其特征在于，包括：
（1） 提供固定在固相介质表面的三种扩增寡核苷酸，所述扩增寡核苷酸包括无剪切位点的第一扩增寡核苷酸，有剪切位点的第一扩增寡核苷酸和全部有剪切位点的第二扩增寡核苷酸，且前述两种剪切位点不相同；所述两种第一扩增寡核苷酸除了剪切位点外，其他序列均相同；
（2） 提供单链模板多核苷酸，通过与所述第一扩增寡核苷酸的杂交，单链模板多核苷酸加载至固相介质表面；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增寡核苷酸至少部分序列是相同的；
（3） 初始延伸：延伸所述第一扩增寡核苷酸，生成与所述单链模板多核苷酸互补的延伸产物；解旋，得到介质表面带有与模板多核苷酸互补配对的多核苷酸单链；
（4） 扩增：提供扩增反应物，在介质表面进行扩增，生成多个固定在介质表面的双链多核苷酸，所述双链多核苷酸包括第一链和第二链；
（5） 剪切：通过作用于有剪切位点的第一扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第一扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第二链，并生成可延伸的3’末端；
（6） 封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
（7） 第一链测序：杂交第一测序引物，测序；
（8） 剪切：通过作用于第二扩增寡核苷酸，在剪切位点位置打断所述第二扩增寡核苷酸，选择性去除所述双链多核苷酸中的第一链，并生成可延伸的3’末端；
（9） 封端：加入封端试剂，对介质表面的多核苷酸链或寡核苷酸的3’端进行封堵；
（10） 第二链测序：杂交第二测序引物，测序；
所述固相介质表面修饰有化学基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相介质包括惰性基底或基质以及媒介材料，所述媒介材料直接附接扩增寡核苷酸，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；所述媒介材料包括水凝胶层、水凝胶微球或磁性微球；所述惰性基底或基质的材料包括玻璃、硅、光纤、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯或聚氨酯。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相介质表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，形状为圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形或类六方柱结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固相介质表面修饰的化学基团包括氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺或巯基；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在固相介质表面。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，固相介质表面修饰的化学基团为环炔基；所述扩增寡核苷酸通过与所述化学基团发生反应固定在固相介质表面。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点允许酶促剪切、化学剪切或光化学剪切。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述剪切位点是用切口内切核酸酶剪切的位点。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述剪切包括使所述固相介质与包含至少一种酶的组合物接触以在所述剪切位点处产生无碱基位点，其中所述剪切在所述剪切位点处发生。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述扩增寡核苷酸包含尿嘧啶碱基或8-氧代鸟嘌呤碱基或脱氧次黄嘌呤碱基。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述扩增寡核苷酸包含四氢呋喃修饰的碱基。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于，其中所述至少一种在所述剪切位点处产生无碱基位点的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和选自DNA糖基化酶-裂合酶内切核酸酶Ⅷ或Fpg糖基化酶的内切核酸酶或核酸内切酶Ⅳ。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点选自尿嘧啶碱基、8-氧代鸟嘌呤碱基、脱氧次黄嘌呤碱基、邻位双羟基修饰的亚磷酰胺位点、二硫键、偶氮基、叠氮基、肽键、缩酮、缩醛、二苯基硅氧烷、碳酸酯或氨基甲酸酯。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点是四氢呋喃修饰的碱基。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剪切位点是多个核糖核苷酸。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有剪切位点的第一扩增寡核苷酸与无剪切位点的第一扩增寡核苷酸的数量比为1～10。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有剪切位点的第一扩增寡核苷酸与无剪切位点的第一扩增寡核苷酸的数量比为1～5。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有剪切位点的第一扩增寡核苷酸与无剪切位点的第一扩增寡核苷酸的数量比为1～3。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）和步骤（8）中所述剪切反应完成后，需要生成可延伸的3’末端，即：若剪切反应后在3’末端形成的是磷酸基团，则需要用包括T4多聚核苷酸激酶在内的磷酸激酶或磷酸酶处理，将剪切后形成的3’末端磷酸基团切除，生成可延伸的3’末端。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增是环介导的等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、重组酶介导等温核酸扩增（RAA）、切刻内切酶恒温扩增（NEAR）、滚环扩增（RCA）、依赖核酸序列的扩增（NASBA）、解旋酶依赖性扩增（HDA）、链置换扩增（SDA）或桥式PCR中的一种。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述模板多核苷酸包含第一索引和第二索引，所述方法进一步包括对所述第一索引和第二索引进行测序。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序为边合成边测序或连接法测序。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序为荧光发生测序。
23.一种基因测序方法，其特征在于，将待测的核酸分子片段化，经过文库构建，得到单链模板多核苷酸，按照权利要求1-10或12-22中任一项所述的方法进行扩增测序。
24.一种基因测序方法，其特征在于，将待测的核酸分子片段化，经过文库构建，得到单链模板多核苷酸，按照权利要求11所述的方法进行扩增测序。
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