CN114457099B - 一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法 - Google Patents
一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114457099B CN114457099B CN202111556110.2A CN202111556110A CN114457099B CN 114457099 B CN114457099 B CN 114457099B CN 202111556110 A CN202111556110 A CN 202111556110A CN 114457099 B CN114457099 B CN 114457099B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide chain
- fusion protein
- core peptide
- lutai
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims abstract description 58
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 4
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims 1
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 abstract 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- CQZDZKRHFWJXDF-WDSKDSINSA-N Gly-Gln-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CN CQZDZKRHFWJXDF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N Ile-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Insulin glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N Tyr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KSCVLGXNQXKUAR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PZTZYZUTCPZWJH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003877 glucagon like peptide 1 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960002869 insulin glargine Drugs 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- MFFMDFFZMYYVKS-SECBINFHSA-N sitagliptin Chemical compound C([C@H](CC(=O)N1CC=2N(C(=NN=2)C(F)(F)F)CC1)N)C1=CC(F)=C(F)C=C1F MFFMDFFZMYYVKS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 229960004034 sitagliptin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，所述核心肽链为Lys26Arg34GLP‑1(9‑37)、Lys26Arg34GLP‑1(10‑37)或Lys26Arg34GLP‑1(11‑37)；具体方法为，通过将核心肽链与融合蛋白所需的内切酶或其突变体耦联获得融合蛋白DNA序列，然后构建融合蛋白的表达载体，载入表达细胞，融合蛋白表达后获得包涵体，复性纯化后酶切获得产物。该方法相较于将酶切与复性同时进行，无需额外添加内切酶，成本低，经济高效，且对环境更加友好。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体领域为一种索马鲁肽核心肽链的制备方法。
背景技术
糖尿病是一种以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病，它是一种由于胰岛β细胞功能下降和胰岛素抵抗而引发的进行性疾病。胰岛β细胞胰岛素分泌缺陷以及α细胞胰高糖素不适当分泌是导致2型糖尿病患者胰岛素及胰升糖素比例失调的重要原因。
索马鲁肽原研公司是诺和诺德，作为最受关注的糖尿病药物，索马鲁肽是全球第七个获批的GLP-1受体激动剂，根据2017年9月12日第53届欧洲糖尿病研究协会年会(EASD2017)上公布的一项对SUSTAIN 1～5研究的事后分析结果，2型糖尿病患者接受每周1次索马鲁肽注射治疗后的降糖和减重效果明显优于安慰剂、西格列汀、甘精胰岛素 U100等其他糖尿病相关药物。
索马鲁肽生物化学结合制备的方法报道较少，原研专利(US9732137)制备方法中，主肽链中Lys26Arg34GLP-1(11-37)/Lys26Arg34GLP-1(9-37)通过酵母发酵制备，再通过外切酶切除冗余氨基酸，获得目的肽链，该方法获得了可溶性表达的肽链，但酵母表达量较低且工具酶外切酶DPP-II需要额外合成，增加了生产成本。
发明人研究团队于专利CN113278061A中报道了一种生物法与化学法相结合的索马鲁肽制备方法，该方法设计了3肽+28肽的路线，其中MII肽链为Lys26Arg34GLP-1(10-37)肽链，通过融合蛋白表达，所述融合蛋白的DNA序列包含含有His-tag基因序列的TrxA DNA序列和MII链DNA序列。该方法新颖，反应操作简单、收率高、杂质较少。但是因该方法需要额外市购内切酶进行酶切获得目标多肽Lys26Arg34GLP-1(10-37)，目前内切酶的市场价格非常昂贵，导致该制备路线的成本较高。
因此，如何寻找一种成本低廉、收率高且杂质少的技术路线成为了本领域亟需解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，所述核心肽链为Lys26Arg34GLP-1(9-37)、 Lys26Arg34GLP-1(10-37)或Lys26Arg34GLP-1(11-37)；具体方法为，通过将核心肽链与融合蛋白所需的内切酶或其突变体耦联获得融合蛋白DNA序列，然后构建融合蛋白的表达载体，载入表达细胞，融合蛋白表达后获得包涵体，复性纯化后酶切获得产物。
其中，所述融合蛋白DNA序列的结构为以下任一种：(1)6xHis-TEVp突变体-TEVsite- 核心肽链；(2)TEV site-核心肽链-TEV site-6xHis-TEVp或TEVp突变体。
进一步的，所述融合蛋白DNA序列为SEQ ID NO：1-3所示。
进一步的，所述融合蛋白的表达载体中操纵子为lac操纵子，并使用Km抗生素标记。
进一步的，所述表达细胞为Escherichia coli。
进一步的，所述表达细胞为E.coli BL21(DE3)。
具体的，本发明所述的索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，包括以下步骤：
1)合成编码基因，所述编码基因包含酶切位点序列和核心肽链序列，还包含TEVp突变体序列或TEVp序列；
2)构建融合蛋白的表达载体，并载入表达细胞，表达细胞为大肠埃希菌；
3)确定阳性菌后，通过发酵培养基进行大肠杆菌发酵，促进融合蛋白的表达；
4)通过超声波破碎或高压匀浆仪等破碎细胞方法获得包涵体，并进行包涵体的洗涤和变性；
5)融合蛋白复性同时进行自酶切反应，将获得的混合多肽进行分离纯化获得所需索马鲁肽核心肽链样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，相较于化学法，反应温和，操作方便，杂质相对较少。相较于专利CN113278061A中的方法，本方法巧妙的利用了TEVp的不溶解特性，重新设计了融合蛋白结构，替代了常用的KSI下沉表达的融合蛋白，通过包涵体方式进行多肽链的表达，方便纯化的同时，在复性后通过融合蛋白直接自酶切获得目的多肽，操作便捷，减少了复性后再进行额外添加TEVp或其他可进行融合蛋白的酶切步骤，在大幅度降低成本的同时也减少了外源蛋白的残留，降低了后期纯化的难度，保证了产品收率。
附图说明
图1为本申请的载体构建示意图；
图2为以Lys26Arg34GLP-1(10-37)为例，本申请的融合蛋白的第一种结构示意图(对应实施例中的融合蛋白A1及对比例中的融合蛋白A2)；
图3为以Lys26Arg34GLP-1(10-37)为例，本申请的融合蛋白的第二种结构示意图(对应实施例中的融合蛋白B1、融合蛋白B2)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1融合蛋白A1的DNA序列合成及质粒的构建
通过上海捷瑞生物进行全合成TEVp 238△mutant-Lys26Arg34GLP-1(10-37)DNA序列，该序列N端添加His tag，C端添加TGA，设计引物F：CATATGCATCATCATCATCATCATGGCGAATCTCTGT，R：CTCGAGTTAGCCCCACGACCACGCA(如SEQ ID NO：6-7所示)，并将该段目的序列连接至载体中，融合蛋白序列详见SEQ ID NO：1所示，其结构详见图2，构建成表达His tag-TEVp238△mutant-TEV protease site-Lys26Arg34GLP-1(10-37)的重组融合表达载体，如图1所示。其中，TEVp 238△mutant为TEVp突变体之一。
实施例2表达工程菌制备及阳性验证
将实施例1中的重组表达载体跑胶验证后，转化至E.coli BL21感受态中，通过Km抗生素筛选出阳性菌落，挑选饱满阳性但菌落，扩培后进行DNA测序验证，确认无误后进行甘油菌保藏。
实施例3融合蛋白A1的表达
将保藏的重组菌株使用15L发酵罐进行发酵，在37℃培养至OD600为20时开始添加IPTG进行诱导，IPTG添加量为0.2mM，诱导0h开始检测菌株OD600，诱导至OD600增加不明显，进行放罐，6000rpm离心10min，收集菌体。
实施例4包涵体的获得
将实施例3获得的菌体通过高压均质破碎菌体，离心收集包涵体沉淀。并通过缓冲液洗涤(Tris-HCl 8.0)3次后，溶解于缓冲液中，加入PMSF进行超声波破碎(300W功率, 运行5s间隔5s共计10min)，后离心(10000rpm,8min)获得包涵体及杂质沉淀，使用去垢剂洗涤纯化沉淀，离心后包涵体收集。
实施例5融合蛋白A1(TEVp 238△)的初步纯化
将实施例4获得的包涵体加入含有终浓度为8M尿素变性缓冲液中，变性缓冲液配比为500mM NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，8M尿素，ddH2O补齐至500mL，pH 7.9, 冰敷30～60min溶解包涵体，上柱镍柱(两倍柱体积缓冲液平衡)，重复上样2～4次，配置洗脱缓冲液：500mM NaCl，20mM Tris-HCl，0.5M咪唑，8M尿素，ddH2O补齐至500mL， pH 7.9，2～5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱获得初步纯化后的融合蛋白。
实施例6融合蛋白A1(TEVp238△)的自酶切反应制备目的肽链Lys26Arg34GLP-1(10-37)
将实施例5获得的初步纯化后的变性融合蛋白溶液稀释至浓度2mg/mL，装入透析袋中，4℃下进行复性酶切缓冲液置换，缓冲液配比为50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA，5％甘油，ddH2O补齐至1L，pH8.0～8.5。16h后，停止酶切反应，检测转化率并通过制备液相或akta纯化系统进行纯化，获得目的肽链A(氨基酸序列详见SEQ ID NO：5)，经液相检测，复性成功后的融合蛋白酶切反应转化率约为48％。
实施例7通过融合蛋白B1(TEVp)制备目的肽链Lys26Arg34GLP-1(11-37)或肽链Lys26Arg34GLP-1(10-37)或肽链Lys26Arg34GLP-1(9-37)
以Lys26Arg34GLP-1(10-37)为例，参考实施例1～5制备变性且初步纯化后的融合蛋白B1(结构详见图3，即TEV site-Lys26Arg34GLP-1(10-37)-TEV site-6xHis-TEVp，序列详见SEQ ID NO：2)，将获得的初步纯化后的变性融合蛋白溶液稀释至浓度2mg/mL，装入低分子截留量透析袋中，4℃下进行复性酶切缓冲液置换，缓冲液配比为50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA，5％甘油，ddH2O补齐至1L，pH8.0～8.5。24h后，停止酶切反应，检测转化率并通过制备液相或akta纯化系统进行纯化，获得目的肽链Lys26Arg34GLP-1 (10-37)，经液相检测，复性成功后的融合蛋白酶切反应转化率约为71％。
实施例8通过融合蛋白B2(TEVp238△)制备目的肽链Lys26Arg34GLP-1(11-37) 或肽链Lys26Arg34GLP-1(10-37)或肽链Lys26Arg34GLP-1(9-37)
以Lys26Arg34GLP-1(10-37)为例，参考实施例1～5制备变性且初步纯化后的融合蛋白B2(结构详见图3，即TEV site-Lys26Arg34GLP-1(10-37)-TEV site-6xHis-TEVp238△mutant，SEQ ID NO：3)，将获得的初步纯化后的变性融合蛋白溶液稀释至浓度2mg/mL，装入低分子截留量透析袋中，4℃下进行复性酶切缓冲液置换，缓冲液配比为50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA，5％甘油，ddH2O补齐至1L，pH8.0～8.5。24h后，停止酶切反应，检测转化率并通过制备液相或akta纯化系统进行纯化，获得目的肽链Lys26Arg34GLP-1 (10-37)，经液相检测，复性成功后的融合蛋白酶切反应转化率约为74％。
为突出本发明融合蛋白结构的有益效果，例举以下对比例实验。
对比例通过融合蛋白A2(TEVp)制备目的肽链Lys26Arg34GLP-1(10-37)
以Lys26Arg34GLP-1(10-37)为例，参考实施例1～5制备变性且初步纯化后的融合蛋白A2(内切酶为TEVp，结构详见图2，即6xHis-TEVp-TEV site-Lys26Arg34GLP-1(10-37)，序列详见SEQ ID NO：4)，将获得的初步纯化后的变性融合蛋白溶液稀释至浓度2mg/mL，装入透析袋中，4℃下进行复性酶切缓冲液置换，缓冲液配比为50mM Tris-HCl、0.5mM EDTA，5％甘油，ddH2O补齐至1L，pH8.0～8.5。16h后，停止酶切反应，检测转化率并通过制备液相或akta纯化系统进行纯化，获得目的肽链A，经液相检测，复性成功后的融合蛋白酶切反应转化率约为39％。
通过以上实施例和对比例可以看出，本发明不仅无需额外添加内切酶，成本低，经济高效；而且本发明设计的“6xHis-TEVp突变体-TEV site-核心肽链”、“TEV site-核心肽链-TEV site-6xHis-TEVp”或“TEV site-核心肽链-TEV site-6xHis-TEVp突变体”，这三种结构的融合蛋白酶切反应转化率均优于“6xHis-TEVp-TEV site-核心肽链”结构的融合蛋白酶切反应转化率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcatcatc atcatcatca tggcgaatct ctgtttaaag gtccgcgtga ttataatccg 60
attagttcta ccatttgtca tctgaccaat gaatcagatg gccataccac ctcactgtat 120
ggcattggct ttggcccgtt tattattacc aataaacatc tgtttcgtcg taataatggc 180
accctgttag ttcagtcact gcatggtgtg tttaaagtta aaaataccac caccttacag 240
cagcatctga ttgatggtcg cgatatgatt attattcgta tgccgaaaga ttttccgccg 300
tttccgcaga aactgaaatt tcgcgaaccg cagcgtgaag aacgcatttg tctggtgacc 360
accaattttc agaccaaatc tatgtcttct atggtgagtg atacctcttg tacctttccg 420
agtagcgatg gtattttttg gaaacattgg attcagacca aagatggcca ggcaggctct 480
ccgttagtgt caacccgcga tggctttatt gtgggcattc atagcgcaag taattttacc 540
aataccaata attattttac ctcagtgccg aaaaatttta tggaactgct gaccaatcag 600
gaagcacagc agtgggtgag cggttggcgc ctgaatgccg atagcgtgct gtggggcggc 660
cataaagtgt ttatggttaa accggaagaa ccgtttcagc cggttaaaga agcaacccag 720
ctgatgaatg aactggaagc ggcggcgaaa gaagcggcag cgaaagaggc tgcggctaaa 780
gaaaacctgt atttccaagg tacctttacc agcgatgtta gcagctacct ggagggtcaa 840
gcggcgaagg agttcattgc gtggctggtg cgtggtcgtg gctaa 885
<210> 2
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaaaacc tgtatttcca aggtaccttt accagcgatg ttagcagcta cctggagggt 60
caagcggcga aggagttcat tgcgtggctg gtgcgtggtc gtggcgaaaa cctgtatttc 120
caaggtcatc atcatcatca tcatgaagcg gcggcgaaag aagcggcagc gaaagaggct 180
gcggctaaag gcgaatctct gtttaaaggt ccgcgtgatt ataatccgat tagttctacc 240
atttgtcatc tgaccaatga atcagatggc cataccacct cactgtatgg cattggcttt 300
ggcccgttta ttattaccaa taaacatctg tttcgtcgta ataatggcac cctgttagtt 360
cagtcactgc atggtgtgtt taaagttaaa aataccacca ccttacagca gcatctgatt 420
gatggtcgcg atatgattat tattcgtatg ccgaaagatt ttccgccgtt tccgcagaaa 480
ctgaaatttc gcgaaccgca gcgtgaagaa cgcatttgtc tggtgaccac caattttcag 540
accaaatcta tgtcttctat ggtgagtgat acctcttgta cctttccgag tagcgatggt 600
attttttgga aacattggat tcagaccaaa gatggccagg caggctctcc gttagtgtca 660
acccgcgatg gctttattgt gggcattcat agcgcaagta attttaccaa taccaataat 720
tattttacct cagtgccgaa aaattttatg gaactgctga ccaatcagga agcacagcag 780
tgggtgagcg gttggcgcct gaatgccgat agcgtgctgt ggggcggcca taaagtgttt 840
atggttaaac cggaagaacc gtttcagccg gttaaagaag caacccagct gatgaatgaa 900
ctggtgtata gccagtaa 918
<210> 3
<211> 906
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaaaacc tgtatttcca aggtaccttt accagcgatg ttagcagcta cctggagggt 60
caagcggcga aggagttcat tgcgtggctg gtgcgtggtc gtggcgaaaa cctgtatttc 120
caaggtcatc atcatcatca tcatgaagcg gcggcgaaag aagcggcagc gaaagaggct 180
gcggctaaag gcgaatctct gtttaaaggt ccgcgtgatt ataatccgat tagttctacc 240
atttgtcatc tgaccaatga atcagatggc cataccacct cactgtatgg cattggcttt 300
ggcccgttta ttattaccaa taaacatctg tttcgtcgta ataatggcac cctgttagtt 360
cagtcactgc atggtgtgtt taaagttaaa aataccacca ccttacagca gcatctgatt 420
gatggtcgcg atatgattat tattcgtatg ccgaaagatt ttccgccgtt tccgcagaaa 480
ctgaaatttc gcgaaccgca gcgtgaagaa cgcatttgtc tggtgaccac caattttcag 540
accaaatcta tgtcttctat ggtgagtgat acctcttgta cctttccgag tagcgatggt 600
attttttgga aacattggat tcagaccaaa gatggccagg caggctctcc gttagtgtca 660
acccgcgatg gctttattgt gggcattcat agcgcaagta attttaccaa taccaataat 720
tattttacct cagtgccgaa aaattttatg gaactgctga ccaatcagga agcacagcag 780
tgggtgagcg gttggcgcct gaatgccgat agcgtgctgt ggggcggcca taaagtgttt 840
atggttaaac cggaagaacc gtttcagccg gttaaagaag caacccagct gatgaatgaa 900
ctgtga 906
<210> 4
<211> 897
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcatcatc atcatcatca tggcgaatct ctgtttaaag gtccgcgtga ttataatccg 60
attagttcta ccatttgtca tctgaccaat gaatcagatg gccataccac ctcactgtat 120
ggcattggct ttggcccgtt tattattacc aataaacatc tgtttcgtcg taataatggc 180
accctgttag ttcagtcact gcatggtgtg tttaaagtta aaaataccac caccttacag 240
cagcatctga ttgatggtcg cgatatgatt attattcgta tgccgaaaga ttttccgccg 300
tttccgcaga aactgaaatt tcgcgaaccg cagcgtgaag aacgcatttg tctggtgacc 360
accaattttc agaccaaatc tatgtcttct atggtgagtg atacctcttg tacctttccg 420
agtagcgatg gtattttttg gaaacattgg attcagacca aagatggcca ggcaggctct 480
ccgttagtgt caacccgcga tggctttatt gtgggcattc atagcgcaag taattttacc 540
aataccaata attattttac ctcagtgccg aaaaatttta tggaactgct gaccaatcag 600
gaagcacagc agtgggtgag cggttggcgc ctgaatgccg atagcgtgct gtggggcggc 660
cataaagtgt ttatgaataa accggaagaa ccgtttcagc cggttaaaga agcaacccag 720
ctgatgaatg aactggtgta tagccaggaa gcggcggcga aagaagcggc agcgaaagag 780
gctgcggcta aagaaaacct gtatttccaa ggtaccttta ccagcgatgt tagcagctac 840
ctggagggtc aagcggcgaa ggagttcatt gcgtggctgg tgcgtggtcg tggctaa 897
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
1 5 10 15
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catatgcatc atcatcatca tcatggcgaa tctctgt 37
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcgagttag ccccacgacc acgca 25
Claims (6)
1.一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，其特征在于：所述核心肽链为Lys26Arg34GLP-1（10-37）；具体方法为，通过将核心肽链与融合蛋白所需的内切酶或其突变体耦联获得融合蛋白DNA序列，然后构建融合蛋白的表达载体，载入表达细胞，融合蛋白表达后获得包涵体，复性纯化后酶切获得产物；所述融合蛋白DNA序列为SEQ ID NO：1-3所示。
2.根据权利要求1所述的索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，其特征在于：所述融合蛋白DNA序列的结构为以下任一种：（1）6xHis-TEVp突变体-TEV site-核心肽链；（2）TEVsite-核心肽链- TEV site-6xHis-TEVp；（3）TEV site-核心肽链- TEV site-6xHis-TEVp突变体。
3.根据权利要求2所述的索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，其特征在于：所述融合蛋白的表达载体中操纵子为lac操纵子，并使用Km抗生素标记。
4.根据权利要求3所述的索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，其特征在于：所述表达细胞为Escherichia coli。
5.根据权利要求4所述的索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，其特征在于：所述表达细胞为E.coli BL21（DE3）。
6.根据权利要求1-5任一所述的索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）合成编码基因，所述编码基因包含酶切位点序列和核心肽链序列，还包含TEVp突变体序列或TEVp序列；
2）构建融合蛋白的表达载体，并载入表达细胞，表达细胞为大肠埃希菌；
3）确定阳性菌后，通过发酵培养基进行大肠杆菌发酵，促进融合蛋白的表达；
4）通过超声波破碎或高压匀浆仪等破碎细胞方法获得包涵体，并进行包涵体的洗涤和变性；
5）融合蛋白复性同时进行自酶切反应，将获得的混合多肽进行分离纯化获得所需索马鲁肽核心肽链样品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111556110.2A CN114457099B (zh) | 2021-12-18 | 2021-12-18 | 一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111556110.2A CN114457099B (zh) | 2021-12-18 | 2021-12-18 | 一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114457099A CN114457099A (zh) | 2022-05-10 |
| CN114457099B true CN114457099B (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=81406092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111556110.2A Active CN114457099B (zh) | 2021-12-18 | 2021-12-18 | 一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114457099B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108912221A (zh) * | 2018-07-31 | 2018-11-30 | 成都英普博集生物科技有限公司 | 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 |
| CN109879970A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-14 | 美药星（南京）制药有限公司 | 一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法 |
| CN110498849A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-11-26 | 南京迪维奥医药科技有限公司 | 一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法 |
| CN111019926A (zh) * | 2018-10-10 | 2020-04-17 | 上饶市康可得生物科技有限公司 | Tev蛋白酶变体、其融合蛋白及制备方法和用途 |
| WO2020190757A1 (en) * | 2019-03-15 | 2020-09-24 | Novetide Ltd. | Improved processes for the preparation of semaglutide |
| CN113278061A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-08-20 | 南京林业大学 | 一种生物化学法制备索马鲁肽的方法 |
| WO2021249564A1 (zh) * | 2020-06-11 | 2021-12-16 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法和应用 |
| CN113801234A (zh) * | 2020-06-11 | 2021-12-17 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种索玛鲁肽衍生物及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR20140100479A (el) * | 2014-09-23 | 2016-05-05 | Novetide, Ltd., | Συνθεση λιραγλουτιδης |
-
2021
- 2021-12-18 CN CN202111556110.2A patent/CN114457099B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108912221A (zh) * | 2018-07-31 | 2018-11-30 | 成都英普博集生物科技有限公司 | 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法 |
| CN111019926A (zh) * | 2018-10-10 | 2020-04-17 | 上饶市康可得生物科技有限公司 | Tev蛋白酶变体、其融合蛋白及制备方法和用途 |
| CN109879970A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-14 | 美药星（南京）制药有限公司 | 一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法 |
| WO2020190757A1 (en) * | 2019-03-15 | 2020-09-24 | Novetide Ltd. | Improved processes for the preparation of semaglutide |
| CN110498849A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-11-26 | 南京迪维奥医药科技有限公司 | 一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法 |
| WO2021249564A1 (zh) * | 2020-06-11 | 2021-12-16 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种索玛鲁肽衍生物及其制备方法和应用 |
| CN113801234A (zh) * | 2020-06-11 | 2021-12-17 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种索玛鲁肽衍生物及其应用 |
| CN113278061A (zh) * | 2021-06-22 | 2021-08-20 | 南京林业大学 | 一种生物化学法制备索马鲁肽的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胰高血糖素样肽-1融合蛋白在原核系统中的表达;桑延霞;张军军;;生物技术(04);第35-39页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114457099A (zh) | 2022-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2020182229A1 (zh) | 一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法 | |
| WO2024087761A1 (zh) | 一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用 | |
| CN110724187B (zh) | 一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用 | |
| CN111072783A (zh) | 一种采用大肠杆菌表达串联序列制备glp-1或其类似物多肽的方法 | |
| CN113105536B (zh) | 一种新甘精胰岛素原及其制备甘精胰岛素的方法 | |
| US12202874B2 (en) | Fusion protein and its preparation method for intermediate polypeptide of Semaglutide | |
| WO2012028523A2 (en) | Prokaryotic expression construct | |
| CN112979781B (zh) | 一种许氏平鲉IL-1β重组蛋白及其制备方法和应用 | |
| Kim et al. | Large-scale refolding and enzyme reaction of human preproinsulin for production of human insulin | |
| CN110938151B (zh) | 用于表达甲状旁腺素pth的融合蛋白及重组质粒、重组工程菌 | |
| CN114381471B (zh) | 一种辅助蛋白在重组蛋白生产中的应用及融合表达系统 | |
| CN114107353A (zh) | 一种高效表达多肽毒素的质粒及其制备方法与应用 | |
| CN114457099B (zh) | 一种索马鲁肽核心肽链的生物发酵制备方法 | |
| CN113388009B (zh) | 一种标签蛋白及其编码基因、重组载体与应用 | |
| CN107629129B (zh) | 生产和纯化多肽的方法 | |
| CN101886068B (zh) | 一种固相化sumo化系统及固相化去sumo化系统 | |
| CN114380903B (zh) | 一种胰岛素或其类似物前体 | |
| CN114933658B (zh) | 一种短肽元件及其应用方法 | |
| CN114686504B (zh) | Lpp或其突变体作为分子伴侣在大肠杆菌中分泌表达重组蛋白的应用 | |
| CN114807205B (zh) | 表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN100523172C (zh) | 高效表达人α1-胸腺肽的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN102277327B (zh) | 过表达RimL的大肠杆菌及其在制备N-乙酰化胸腺素α中的应用 | |
| CN102250938A (zh) | 一种海葵强心肽的制备方法 | |
| TWI591177B (zh) | 一種胰高血糖素胜肽－２（ｇｌｐ－２）類似物的製備方法 | |
| CN114774397B (zh) | 牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |