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CN114456983B - 一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114456983B CN202210203271.1A CN202210203271A CN114456983B CN 114456983 B CN114456983 B CN 114456983B CN 202210203271 A CN202210203271 A CN 202210203271A CN 114456983 B CN114456983 B CN 114456983B
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acinetobacter
strain
solanine
isoffii
degrading
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王文倩
孙淦琳
张栩
杨宝云
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Abstract

本发明公开了一种降解α‑茄碱的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffiiAL202103菌株及其制备方法和应用，本发明的一种降解α‑茄碱的洛菲不动杆菌，该菌株为AL202103，保藏名称为洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffiiAL202103；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCCNo.NO22637。本发明的菌株是一种能用于降解α‑茄碱的细菌，具有对α‑茄碱的降解能力强、环境安全的特点，可以用于生物降解α‑茄碱和食品安全生产。

Description

一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株及其制备方法和应用。
背景技术
茄碱(Solanine)，又名龙葵碱、龙葵素等，是一种分布于茄科植物中的次生代谢物，总称为糖苷生物碱(Steroidal Glycoalkaloids，SGAs)，主要分布于马铃薯、番茄和茄子等茄科植物的根、茎、叶和果实等组织中，其中在马铃薯中茄碱的含量较为丰富(Friedman and McDonald，1997；赵雪淞等，2007)。马铃薯中的α-茄碱具有杀虫活性(Zhenget al.，2020)，对人畜具有较高的毒性(季宇彬，2009；谭继君，2018)。
将有毒的α-茄碱降解为无毒的物质是食品安全的重要要求，当前主要通过酸水解或活性酶水解的方式对α-茄碱进行降解(Weltring et al.，1997；Nikolic andStankovic，2005；Dahlin et al.，2017)。然而，酸水解法或酶降解法降解茄碱不仅操作繁琐、费力费时、成本高，还存在污染环境危险。因此，探索新颖、高效的茄碱降解菌将为马铃薯食品领域及其他食品上茄碱清除提供重要途径。由此，从环境中分离茄碱降解菌已引起了许多科研工作者的重视，主要在国外有一些研究报道，包括Jensen et al.(2009)从地下水中获得了能使α-茄碱发生水解而使其毒性降低的微生物，然而遗憾的是他们没有弄清具有降解作用微生物的具体种类；Hennessy et al.(2018，2020)从绿皮马铃薯周围土壤中分离获得了对马铃薯中α-茄碱具有高效降解作用的节杆菌属Arthrobacter和沙雷氏菌属Serratia细菌。然而，目前国内外还未见到有关洛菲不动杆菌降解α-茄碱的报道，更为遗憾的是国内关于茄碱降解菌的资源的挖掘还鲜有报道。
洛菲不动杆菌属于变形菌门Proteobacteria莫拉氏菌科Moraxellaceae的不动杆菌属Acinetobacter。据报道，洛菲不动杆菌在重金属污染环境修复方面具有重要的应用潜力，其胞内的质粒和染色体均携带砷、铬、铜、锌和汞等金属元素的抗性决定基因，其可表达大量的相应蛋白质吸附环境中的重金属(Sofia et al.,2016；Veress et al.,2020；Walter et al.,2021)。不动杆菌属在很多昆虫肠道内都为优势菌属(Sevim et al.，2016；郑亚强等，2017；蒋宇等，2018)，该属的一些菌株，如鲍曼不动杆菌A.baumannii是昆虫重要的病原体，对许多抗生素具有耐药性(Antunes et al.,2014)。舞毒蛾肠道的未知分类地位的不动杆菌属菌株Acinetobacter sp.R7-1能够降解山杨分泌的对昆虫有毒性的酚苷类化合物(phenolic glycosides)，从而保护其宿主在进食后不受毒性影响(Mason et al.,2016)。郑亚强等人(2017)从马铃薯块茎蛾肠道内分离到了同属的琼氏不动杆菌A.junii。樊清艳等(2020)从马铃薯块茎蛾肠道内分离到了同属的乙酸钙不动杆菌A.calcoaceticus，可产生纤维素酶。然而，目前国内外关于该菌的其他功能方面的报道还较少。而本研究从马铃薯块茎蛾分离到的洛菲不动杆菌AL202103对α-茄碱具有高效降解作用，其降解效率高达99.61％。
马铃薯块茎蛾Phthorimaea operculell(Zeller)，隶属于鳞翅目麦蛾科块茎蛾属昆虫，是一种世界性的马铃薯、烟草、番茄和辣椒等茄科作物重要害虫。马铃薯块茎蛾肠道内含有丰富的肠道细菌(郑亚强等，2017；樊清艳等，2020；Zheng et al.,2020)。我们研究发现，马铃薯块茎蛾肠道内共生细菌洛菲不动杆菌具有降解马铃薯中α-茄碱的作用。利用从马铃薯块茎蛾幼虫肠道中分离获得的洛菲不动杆菌AL202103菌株，降解α-茄碱，这对以马铃薯为原料开发的食品中茄碱安全、有效的清除，提供可供选择的菌株，具有重要的实际应用价值。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明提供一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株及其制备与应用。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株，所述的菌株为洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii，保藏名称为洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No.22637。
进一步地，所述的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株的16SrDNA的基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的菌株经革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌，细胞形态为短杆状，经LB平板划线纯化培养发现，洛菲不动杆菌AL202103菌株菌落圆形，边缘整齐，乳白色，湿润，中央高凸，四周扁平。
本发明所述的降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株制备的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株的发酵液初提物；
(b)所得洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株细胞的超声裂解上清；
(c)所得洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)从马铃薯块茎蛾幼虫肠道中分离获得洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffiiAL202103菌株，采用LB培养基培养；
(2)然后在LB培养基上纯化，得到纯化的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffiiAL202103菌株；
(3)采用高效降解菌株菌液进行α-茄碱降解能力的测定，菌液对α-茄碱的降解率达99.61％。
本发明所述的洛菲不动杆菌AcinetobacterIsoffii AL202103菌株在制备α-茄碱降解制剂中的应用。
有益效果：本发明提供的洛菲不动杆菌AL202103菌株是一种能用于降解茄科植物中有毒的α-茄碱的降解菌，具有降解能力强、环境安全的特点，可以用于生物降解α-茄碱。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)分离获得的洛菲不动杆菌AL202103菌株是对α-茄碱具有强降解作用的细菌菌株。
(2)洛菲不动杆菌AL202103菌株培养简单，生长快速，易于在室内大量培养繁殖。
(3)本发明提供的洛菲不动杆菌AL202103菌株是一种能用于绿色降解α-茄碱的害虫肠道细菌，能提高马铃薯块茎蛾幼虫对茄科植物的适应性，还能高效降解α-茄碱，具有降解作用强、环境无污染的特点，可以广泛用于生物降解α-茄碱。
附图说明
图1为本发明的洛菲不动杆菌AL202103菌株的细胞形态图。
图2为本发明的洛菲不动杆菌AL202103菌株生长曲线图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
本发明的一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株，该菌株为洛菲不动杆菌，保藏名称为洛菲不动杆菌AL202103菌株；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No.22637。
所述的降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株的16S rDNA的基因序列为SEQID No.1所示的核苷酸序列。
该菌株经LB平板划线纯化培养发现，洛菲不动杆菌AL202103菌株菌落圆形，边缘整齐，乳白色，湿润，中央高凸，四周扁平。经革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌，细胞形态为短杆状。
本发明所述的AcinetobacterIsoffii制备的洛菲不动杆菌GH202103菌株菌剂。其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的洛菲不动杆菌AL202103菌株的发酵液初提物；
(b)所得洛菲不动杆菌AL202103菌株细胞的超声裂解上清；
(c)所得洛菲不动杆菌AL202103菌株细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的洛菲不动杆菌AL202103菌株菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)从马铃薯块茎蛾幼虫肠道中分离获得野生型加洛菲不动杆菌AL202103菌株，在LB培养基上培养，将菌体转接到新配制的LB培养基上进行纯化；
(2)然后纯化培养获得纯化的洛菲不动杆菌AL202103菌株；
(3)采用高效降解菌株胞外酶进行α-茄碱降解能力测定，菌株的胞外酶对α-茄碱的降解率达99.61％。
本发明所述的洛菲不动杆菌AL202103菌株菌剂在α-茄碱降解方面的应用。
试验例1
洛菲不动杆菌AL202103菌株的分离及鉴定
本发明发明人于2021年3月25日从马铃薯块茎蛾幼虫肠道中分离到洛菲不动杆菌AL202103菌株。本发明发明人发现该菌对α-茄碱具有较强降解作用。
下面给出的是本发明提供的洛菲不动杆菌SC202103及其在α-茄碱降解方面的应用的试验例。
1.1材料
1.1.1供试菌株
菌株于2021年3月25日分离自云南省昆明市黑龙潭云南农业大学马铃薯块茎蛾蛾幼虫肠道。
1.1.2菌株的分离培养
取大小一致、健康的马铃薯块茎蛾3龄幼虫50头，重复3次，共150头，置于无菌培养皿中饥饿处理8h。先将超净工作台台面用酒精清洗干净，再把所有供用的解剖器具用75％酒精进行消毒，再经紫外灯照射处理30min以上，完成消毒处理。取经饥饿处理的马铃薯块茎蛾幼虫于-20℃冷冻处理2-3min，使虫体麻痹，再用无菌水冲洗2次，每次1min，75％酒精消毒90s，最后用无菌水冲洗2次，每次1min。处理完成后放置于无菌洁净的培养皿中，在超净工作台环境下解剖处理后的马铃薯块茎蛾幼虫，用无菌镊子从虫体尾部取出肠道，将内容物溶于装有1mL无菌PBS缓冲液的离心管中，再进行充分匀浆。纯化的菌株采用LB斜面培养基保存于4℃冰箱。
1.1.3菌株鉴定
形态鉴定：挑取上述筛选获得的高效降解菌株单菌落在LB培养基上进行划线，于25℃下培养72h，观察记录单菌落形态、颜色、隆起度、边缘形状和干湿等特征。用革兰氏染色法对菌株进行染色，观察细胞形态和颜色，紫色代表阳性菌，红色代表阴性菌。再参照按《常用细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》的鉴定方法，进行形态鉴定。
分子鉴定：采用冻溶法提取培养细菌的DNA(冯广达等，2013；郑亚强等，2017)。具体操作蝇方法和步骤如下：将菌株接种于LB液体培养基中，置于25℃、180r/min的摇床上振荡培养48h。取2mL菌液于离心管中，在12000r/min条件下离心2min，弃上清。在上述沉淀中加入500μL无菌水，再进行涡旋振荡1min，使其菌体完全悬浮混匀。然后用液氮冰冻10min，沸水浴5min，于12000r/min条件下离心2min，取上清液作为PCR模板DNA备用。运用细菌通用引物27f和1492r扩增16S rRNA基因。反应体系为25μL：引物各1μL，模板DNA1μL，
Figure BDA0003530419770000071
PCRmastermix 12.5μL，dd H2O 9.5μL。反应条件:94℃热变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，32个循环，72℃延伸10min。取3μLPCR产物进行凝胶电泳检测。鉴定好的PCR产物送生工生物工程(昆明)股份有限公司测序。运用Contigexpress软件对测序结果进行拼接，将拼接好的16S rDNA序列，通过NCBI Blast程序与NCBI数据库中的数据进行比对，查找相似性最高的典型菌株并下载序列。运用MEGA7软件，采用国际通用的邻接法(Neighbor-Joining)和Kimura双参数矫正模型构建系统进化树。以重复抽样1000次进行Bootstrap验证，分析评估系统进化树拓扑结构的稳定性。
洛菲不动杆菌AL202103菌株的16S序列号：
GGCTTACCATGCAGTCGAGCGGGGAAGAGTAGCTTGCTACTTGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATCTCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTTGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACCGAGATTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGCCAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTGGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCGGGTTAAGCCGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTCGCGAGAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCCTAGGGAGGACGCTACCACGG。
1.2结果
经LB平板划线纯化培养发现，AL202103菌株菌落圆形，边缘整齐，乳白色，湿润，中央高凸，四周扁平。经革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌，细胞形态为短杆状(图1)。
该菌培养过程中未发现迟缓期，0-12h为对数生长期，其中0-4h生长最快；12-20h为稳定期，18h到达最大生长量后缓慢下降；20-48h为衰亡期(图2为本发明的洛菲不动杆菌AL202103的生长曲线)。
试验例2
洛菲不动杆菌AL202103菌株对α-茄碱的降解作用测定
1材料
利用本发明的洛菲不动杆菌AL202103菌株。先挑取5mL洛菲不动杆菌AL202103的单克隆菌落，接入LB液体培养基中，再于25℃、180rpm条件下振荡培养，使OD600nm＝1.0。
诱导：取体积为100mL的三角瓶，再取1ml洛菲不动杆菌培养液添加到9ml的LB培养基中(使最终OD600nm＝0.1)，补充酸性磷酸盐缓冲液(对照)或5μg/mL的α-茄碱，在180rpm、25℃条件下震荡培养20h。将菌液在25℃4000×g条件下离心20min，上清液即为洛菲不动杆菌胞外酶粗提液。重复3次。
胞外酶降解体系：取100μLpH 5.5的50mM醋酸钠缓冲液，400μLpH 5.0100mM醋酸钠缓冲液(0.2mM的α-茄碱)底物，450μL胞外酶粗提液，共计950μL，在25℃条件下孵育35h。再于90℃加热10min终止酶促反应，然后在17000×g条件下离心10min，转移上清液。用LC-MS分析降解过程中所产生的代谢物质。
2.结果
通过对该菌株胞外酶进行α-茄碱降解能力测定。结果表明，洛菲不动杆菌AL202103菌株对α-茄碱的降解率达99.61％。洛菲不动杆菌AL202103菌株对α-茄碱的降解作用如表1所示：
表1洛菲不动杆菌AL202103菌株对α-茄碱的降解能力
Figure BDA0003530419770000101
由此表明，洛菲不动杆菌AL202103菌株对α-茄碱具有很强的降解能力。根据洛菲不动杆菌AL202103胞外酶对α-茄碱降解能力的测定，结果表明洛菲不动杆菌AL202103菌株胞外酶对α-茄碱的降解率高达99.61％。
综上所述，本发明的洛菲不动杆菌AL202103菌株是一株能用于降解α-茄碱的细菌，且具有降解能力强、无环境污染的优点，因而可以用于生物降解α-茄碱。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 云南农业大学
<120> 一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株及其制备方法和应用
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(洛菲不动杆菌菌株的16S rDNA的基因序列)
<400> 1
ggcttaccat gcagtcgagc ggggaagagt agcttgctac ttgacctagc ggcggacggg 60
tgagtaatgc ttaggaatct gcctattagt gggggacaac atctcgaaag ggatgctaat 120
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ctaagtcgga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ctgtagcggg 240
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gaagtaggta gtctaaccct agggaggacg ctaccacgg 1419

Claims (5)

1.一种降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株，其特征在于：所述的菌株为洛菲不动杆菌Acinetobacter Isoffii，保藏名称为洛菲不动杆菌Acinetobacter Isoffii；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年5月31日；保藏编号：CGMCC No. 22637。
2.根据权利要求1所述的降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株，其特征在于：所述的洛菲不动杆菌Acinetobacter Isoffii AL202103菌株的16S rDNA的基因序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的降解α-茄碱的洛菲不动杆菌AL202103菌株制备的洛菲不动杆菌Acinetobacter Isoffii AL202103菌株菌剂。
4.权利要求3所述的洛菲不动杆菌Acinetobacter Isoffii AL202103菌株菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将权利要求1所述的获得洛菲不动杆菌Acinetobacter Isoffii AL202103菌株，采用LB培养基培养；
（2）然后在LB培养基上纯化，得到纯化的洛菲不动杆菌Acinetobacter IsoffiiAL202103菌株；
（3）采用高效降解菌株菌液进行α-茄碱降解能力的测定，菌液对α-茄碱的降解率达99.61%。
5.权利要求1所述的洛菲不动杆菌Acinetobacter Isoffii AL202103菌株在制备α-茄碱降解制剂中的应用。
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