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CN114456241B - 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗 - Google Patents

抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗 Download PDF

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CN114456241B CN202210194653.2A CN202210194653A CN114456241B CN 114456241 B CN114456241 B CN 114456241B CN 202210194653 A CN202210194653 A CN 202210194653A CN 114456241 B CN114456241 B CN 114456241B
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Abstract

本发明涉及抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白及疫苗，属于医药领域。为解决针对SARS‑CoV‑2的突变病毒感染尚缺乏有效预防和治疗药物的问题，本发明提供了抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白，其含有与SARS‑CoV‑2的S蛋白中320‑545位氨基酸相同，或者与320‑545位具有98％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性的氨基酸序列。本发明还提供了用于预防和/或治疗SARS‑CoV‑2感染的疫苗。本发明主要是通过诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断SARS‑CoV‑2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染，特别是对突变病毒有较好的防治效果。

Description

抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗
技术领域
本发明涉及抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗，属于医药领域。
背景技术
SARS-CoV-2是由世界卫生组织而命名的一种新型的β属的冠状病毒。该病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别，是一种以前尚未在人类中发现的新冠状病毒分支。蝙蝠可能是SARS-CoV-2的天然宿主，此外，有研究认为穿山甲也可能是该病毒的动物来源。目前，新型冠状病毒SARS-CoV-2已导致数百万人感染，还没有确切有效的抗病毒药物能够进行预防与治疗，开发针对该病毒的疫苗对于疾病的防治非常重要。
SARS-CoV-2的主要结构蛋白包括刺突蛋白(Spike，S)、信使蛋白(Envelop，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)，其中，S蛋白在病毒的感染和毒力中起着关键作用。血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS冠状病毒的功能性受体，而最近研究发现SARS-CoV-2也是通过与ACE2受体的结合进入宿主细胞，进行病毒的感染和复制。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供抗SARS-CoV-2感染的蛋白。本发明的另一目的在于提供含有所述蛋白的用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗。
本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的蛋白，其含有如SEQ ID No.1所示或者与SEQID No.1具有98％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性的氨基酸序列。
进一步地，所述的蛋白含有与SEQ ID No.1具有98.2％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性的氨基酸序列。
其中，SEQ ID No.1的同源性氨基酸序列满足以下至少一项：SEQ ID No.1中第98位氨基酸由K替换为N；SEQ ID No.1中第165位氨基酸由E替换为K；SEQ ID No.1中第182位氨基酸由N替换为Y；SEQ ID No.1中第219位氨基酸由C替换为S。
进一步地，所述的蛋白还含有如SEQ ID No.2所示或者与SEQ ID No.2具有98％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性的氨基酸序列。
进一步地，所述的蛋白还含有与SEQ ID No.2具有98.8％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性的氨基酸序列。
其中，SEQ ID No.2的同源性氨基酸序列满足以下至少一项：SEQ ID No.2中第50位氨基酸H和第51位氨基酸V缺失；SEQ ID No.2中第398位氨基酸由K替换为N；SEQ ID No.2中第465位氨基酸由E替换为K；SEQ ID No.2中第482位氨基酸由N替换为Y；SEQ ID No.2中第519位氨基酸由C替换为S。
进一步地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示或者与SEQ ID No.1具有98％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性。
进一步地，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1具有98.2％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性。
其中，SEQ ID No.1的同源性氨基酸序列满足以下至少一项：SEQ ID No.1中第98位氨基酸由K替换为N；SEQ ID No.1中第165位氨基酸由E替换为K；SEQ ID No.1中第182位氨基酸由N替换为Y；SEQ ID No.1中第219位氨基酸由C替换为S。
进一步地，所述蛋白的氨基酸序列为：从氮端到碳端依次由SEQ ID No.2或其同源性氨基酸序列与SEQ ID No.1或其同源性氨基酸序列连接而成。
进一步地，所述蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4中至少一种。
本发明提供了所述蛋白的前体：在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签。
优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。
进一步地，所述的前体在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区。
优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。
进一步地，所述前体的氨基酸序列选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9中至少一种。
本发明提供了所述的蛋白和/或所述的前体在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。
本发明提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗，它含有所述的蛋白和/或所述的前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。
进一步地，所述的辅助性成分为免疫佐剂。
优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、角鲨烯水包油乳剂、重组霍乱毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN。
进一步地，所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种。
进一步地，所述的钙盐为磷酸三钙。
进一步地，所述的植物皂苷为QS–21或ISCOM。
进一步地，所述的植物多糖为黄芪多糖。
进一步地，所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺。
进一步地，所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵。
进一步地，所述的疫苗为注射制剂。
优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂。
本发明提供了多核苷酸，它编码所述的蛋白或所述的前体。
本发明提供了重组载体，它含有所述多核苷酸。
进一步地，所述的重组载体采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。
优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1。
优选地，所述的大肠杆菌表达载体为pET32a。
优选地，所述的酵母表达载体为pPICZaA；
优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体。
进一步优选地，所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。
本发明提供了宿主细胞，它含有所述的重组载体。
进一步地，所述的宿主细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。
优选地，所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种。
优选地，所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。
本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白或前体，然后回收所述的蛋白，即得。
本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建含有所述多核苷酸的重组载体，对人体进行免疫，产生所述的蛋白。
进一步地，所述的载体选自如下至少一种：mRNA、DNA疫苗、腺病毒、安卡拉痘苗病毒vaccinia Ankara virus、腺相关病毒。
SEQ ID No.1：
VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG
SEQ ID No.1与SARS-CoV-2的S蛋白中320-545位氨基酸序列相同。
SEQ ID No.1的同源性氨基酸示例：
VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNG
上述氨基酸序列将SARS-CoV-2的S蛋白中第417位氨基酸K替换为N，第484位氨基酸E替换为K，第501位氨基酸N替换为Y，第538位氨基酸C替换为S，其余位点与S蛋白的320-545位氨基酸相同。
SEQ ID No.2：
TRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG
SEQ ID No.2与SARS-CoV-2的S蛋白中涵盖N端结构域的20-545位氨基酸序列相同。
SEQ ID No.2的同源性氨基酸示例：
TRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNG上述氨基酸序列在SARS-CoV-2的S蛋白中涵盖N端结构域的20-545位氨基酸序列的基础上缺失了69位氨基酸H和70位氨基酸V，同时将第538位氨基酸C替换为S，其余位点不变。
SEQ ID No.3，本发明所述抗SARS-CoV-2感染蛋白的氨基酸序列示例，RBD(320-545+K417N+E484K+N501Y)：
VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG
SEQ ID No.4，本发明所述抗SARS-CoV-2感染蛋白的氨基酸序列示例，NTD_RBD(20-545+69-70del+C538S)-RBD(320-545+K417N+E484K+N501Y+C538S)：
TRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNG
SEQ ID No.5，本发明所述抗SARS-CoV-2感染蛋白前体的氨基酸序列示例，GP67-Trx(wt)-His-EK-RBD(320-545+K417N+E484K+N501Y)：
MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDCIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG
SEQ ID No.6，本发明所述抗SARS-CoV-2感染蛋白前体的氨基酸序列示例，GP67-Trx(Cys-mut)-His-EK-RBD(320-545+K417N+E484K+N501Y)：
MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDSIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG
SEQ ID No.7，本发明所述抗SARS-CoV-2感染蛋白前体的氨基酸序列示例，GP67-RBD(320-545+K417N+E484K+N501Y)-6his：
MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGHHHHHH
SEQ ID No.8，本发明所述抗SARS-CoV-2感染蛋白前体的氨基酸序列示例，GP67-NTD_RBD(20-545+69-70del+C538S)-RBD(320-545+K417N+E484K+N501Y+C538S)-6His：
MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGHHHHHH
SEQ ID No.9，本发明所述抗SARS-CoV-2感染蛋白前体的氨基酸序列示例，GP67-trx(wt)-His-EK-NTD_RBD(20-545+69-70del+C538S)-RBD(320-545+K417N+E484K+N501Y+C538S)：
MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDCIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNGVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKSVNFNFNG
SARS-CoV-2病毒S蛋白的胞外段构成如图1所示，SP，信号肽；NTD，N-端结构域；RBD，受体结构域；FP，融合肽；IFP，內融合肽；HR1，七肽重复区1；HR2，七肽重复区2；PTM，近膜区；TM，跨膜区。
本发明所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白是基于S蛋白320-545位氨基酸以及20-545位氨基酸来设计的抗SARS-CoV-2感染药物。
术语缩写：
单磷酸脂质A(MPL)
角鲨烯水包油乳剂(MF59)、重组霍乱毒素(rCTB)
黄芪多糖(APS)
磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)
(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、阳离子胆固醇(DC-Chol)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、CpG ODN(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列,人工合成的CpG)
有益效果：本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗，主要是针对SARS-CoV-2病毒的S蛋白，特别是通过阻断S蛋白的ACE2受体结合区，诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断SARS-CoV-2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染，特别是对突变病毒有较好的防治效果。
附图说明
图1为本发明SARS-CoV-2病毒S蛋白的胞外段构成说明图；
图2为实施例1中抗SARS-CoV-2感染的蛋白1(对应SEQ ID No.3)的蛋白制备结果图；
图3为实施例1中抗SARS-CoV-2感染的蛋白2(对应SEQ ID No.4)的蛋白制备结果图；
图4为试验例1中小鼠血清的A450-A630吸光度值测量结果图；
图5为试验例2中免疫血清体外阻断S1蛋白与ACE2结合图；
图6为试验例3中免疫血清病毒中和抗体滴度测定结果图；
图7为试验例4中攻毒小鼠肺病毒拷贝数测定结果图；
图8为试验例4中攻毒小鼠肺病理HE染色图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1用昆虫杆状病毒表达系统制备本发明抗SARS-CoV-2感染的蛋白
载体构建：采用如SEQ ID No.1～SEQ ID No 9所示的氨基酸序列。基于pFastBac1载体(氨苄抗性)构建S蛋白的表达载体，使用BamHI，HindIII酶切位点插入到pFast-bacI载体中，按昆虫细胞偏爱密码子优化。
重组杆状病毒的扩增：采用Bac-to-Bac表达系统，利用细菌转座子原理，通过Tn7转座元件产生位点特异性转座，在大肠杆菌(DH10Bac，含bacmid(卡那霉素抗性)和helperplasmid(四环霉素抗性))内完成重组bacmid的构建。提取重组成功的bacmid，用用碧云天的转染试剂Lipoinsect将其转染至sf9昆虫细胞以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。转染72h后收取第一代病毒，然后进行P2到P4代病毒的扩增，利用P3或P4代病毒表达蛋白。
蛋白表达：利用P3或P4代病毒感染Hi5昆虫细胞(sf9细胞)，感染复数(MOI为0.5-10)，培养48-72h后收集上清。最佳收获时间根据毒种病毒量和细胞状态可能每次都有差异，一般以镜检50％左右细胞病变为宜。
蛋白纯化：收获的培养上清4℃高速离心，0.22um滤膜过滤，采用亲合纯化方法(Histrap镍柱)初步纯化重组蛋白，然后利用MonoQ离子柱和Superdex200 10/300GL分子筛精纯重组蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，纯度要求达到95％以上。最终所得重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所得蛋白表达纯化图分别如图2和3所示，经分子排阻层析等手段纯化后，得到了纯度较好、可用于后续免疫保护研究的蛋白抗原。
实施例2本发明抗SARS-CoV-2感染的疫苗的制备
在无菌条件下进行配制。用20mmol/L磷酸缓冲液，250mmol/L氯化钠溶液(pH7.4～7.6)稀释纯化后的重组蛋白抗原(实施例1制备)至浓度为240μg/mL。
将WGa01佐剂(角鲨烯含量是3.12～4.68％)加入到上述抗原溶液中，体积比为(V/V)1:1，使混合液中重组蛋白抗原终浓度为120μg/mL。开启搅拌80～150rpm，搅拌使药液产生轻微旋涡，不产生气泡为宜，室温下搅拌均匀。对吸附后的疫苗制剂进行表征，包括粒径及粒径分布、大乳粒、黏度、无菌检查和细菌内毒素检查。灌装。将疫苗制剂灌装如2mL无菌西林瓶中，0.5mL/瓶。灌装时应不停搅拌，使灌装液均匀。罐装后立即封盖，贴上编号标签，2～8℃避光保存。
以下通过生物实验证明本发明的有益效果。
试验例1在接种过本发明疫苗的小鼠体内诱导出S蛋白Va20-Arg545(简称为S1)的特异性抗体
免疫动物实验：使用BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠或NIH小鼠，分组如图4所示，每组5到10只小鼠。所用的重组蛋白胞外段Va20-Arg545氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，剂量为0.1μg到20.0μg/只不等，具体剂量见图4。实验组小鼠每只注射疫苗(根据实施例2制备)的容积为50μL或者按照给药剂量换算的体积，在小鼠右后腿肌肉注射(im)，以第1、7与21天(共免疫3次)的免疫程序免疫小鼠。
ELISA(酶联免疫吸附试验)测定小鼠血清抗体：在小鼠免疫程序结束后的第7天(首次免疫后第28天)，用毛细管眼眶采血法收集小鼠血浆，每组6只。室温放置1～2h，凝固后于4℃，3000rpm离心10min后，取上层血清保存于-20℃备用。
50mM碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)的配制：称取0.293g NaHCO3和0.15gNa2CO3，用双蒸水溶解后，调节pH到9.6，然后定容至100mL，保存于4℃备用。
1M H2SO4终止液的配制：向47.3mL双蒸水中逐滴加入2.7mL的浓硫酸(98％)。
ELISA测定血清IgG的方法：用50mM碳酸盐包被缓冲液配制1μg/mL的重组蛋白S1溶液，按照100μL/孔加入到96孔包被板中(Thermo Scientific公司，NUNC-MaxiSorp)，4℃包被过夜。次日用含0.1％Tween20的PBS溶液(PBST)洗涤3次后，用含1％BSA或者5％脱脂牛奶的封闭液(配制在PBST中)室温封闭1h后，PBST洗涤1次。将小鼠血清用封闭液稀释成不同比例后，按照100μL/孔的上样量上样，37℃孵育1h-2h(或4℃过夜)，然后用PBST洗涤3次。然后按照100μL/孔加入HRP-山羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释于封闭液中)，37℃孵育1h后，PBST洗涤5次。最后加入100μl/孔3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)，避光显色10-15min后，加入50μl/孔1M H2SO4终止液，并不停搅拌混匀。在酶标仪上450nm波长处读数。
将血清连续不同倍数稀释后用滴定法测量A450合A630吸光度值，以测定重组蛋白诱导的S1特异性抗体的滴度。以450nm～630nm吸光度值为纵坐标，以稀释倍数为横坐标作图。如从图4可以看出，接种PBS的对照组和接种MF59佐剂的对照组的A450光密度值较低，其他接种蛋白组的A450光密度值较对照组都有显著升高，证明本发明重组蛋白激发了明显的S1特异性抗体。进一步地，MF59佐剂显著提高了蛋白疫苗的抗体滴度，且呈重组蛋白剂量依赖关系。以上结果表明，重组S1蛋白疫苗在小鼠体内具有高度的免疫原性。
试验例2本发明S1蛋白与ACE2受体结合的阻断实验
本实验使用了细胞表达的ACE2，该蛋白被认为可以保留天然构象，以便用流式细胞仪检测S1-Fc蛋白结合活性。具体操作如下：
消化并收集体外培养的高表达ACE2细胞株(肺癌A549)到流式管中，106个细胞/管，用PBS/HBSS洗涤数次。向每管细胞中加入终浓度1μg/mL的重组S1-Fc蛋白；再加入免疫的抗S1小鼠的血清(将试验例1中10μg/只剂量免疫获得的小鼠血清稀释50倍)，室温孵育30min。其中阳性对照管不加抗血清，PBS管加入试验例1中PBS免疫的阴性血清。用PBS/HBSS洗涤数次后再加入Anti-Human IgG(Fc specific)-FITC(SIGMA)荧光二抗(1:100-1:200),室温避光孵育30min。用PBS/HBSS洗涤数次后，加入500μl含1％多聚甲醛的PBS固定后，流式上机检测。
结果如图5所示，加入S1-Fc蛋白可与表达ACE2的细胞结合，阳性对照组阳性细胞百分比大于80％；未添加S1-Fc蛋白则仅检测到背景信号(阴性对照)；小鼠抗血清有效地阻断了S1-Fc蛋白与表达ACE2的细胞的结合，阳性细胞百分比小于25％；而相同稀释度的未免疫或免疫前的血清则没有表现出阻断作用，阳性细胞百分比大于80％。
试验例3蛋白免疫血清的假病毒中和实验
将待检测的血清(或血浆)于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min，将上清转移至1.5ml离心管中待用。
取96孔板，于第2列(细胞对照CC，见表1)加入DMEM完全培养基(1％双抗，25mMHEPES，10％FBS)150μl/孔，于第3～11列(第3列为病毒对照VV，第4～11列为样品孔)加入DMEM完全培养基100μl/孔，于B4～B11孔中再加入DMEM完全培养基42.5μl/孔。
于B4和B5孔加入血浆样品1(7.5μl)……以此类推，于B10和B11孔加入血浆样品4(7.5μl)。
将多道移液器调至50μl，对B4～B11孔中液体轻柔的反复吹吸6～8次充
分混匀，然后转移50μl液体至对应的C4～C11孔，轻柔的反复吹吸6～8次后转移至D4～D11孔，以此类推，最后从G4～G11中吸弃50μl液体，加样顺序参照表1。
用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.3×104(1×104～2×104)TCID 50/ml(按提供的稀释倍数稀释)，于第3～11列每孔加50μl，使每孔含假病毒的量为650(500-1000)/孔。
表1试验样本分布表
1CC 2CV 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 150
B 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
C 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
D 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
E 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
F 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
G 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
H 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时。
当孵育时间至半小时，取出培养箱中事先准备好的hACE2-293T细胞(汇合率达80％～90％)，以T75培养瓶为例，吸弃瓶中的培养基，加入5ml PBS缓冲液清洗细胞，倾去PBS后，加入3ml 0.25％胰酶-EDTA，使其浸没细胞消化1分钟，倾去胰酶，置于细胞培养箱中消化5分钟，轻轻拍打培养瓶侧壁使细胞脱落，加入10ml培养基中和胰酶，吹打几次后转移至离心管中，210g离心5分钟，倾去上清，用10ml DMEM完全培养基重悬细胞，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至2×105个/ml。
孵育至1小时，向96孔板中每孔加100μl细胞，使每孔细胞为2×104个。
将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养20～28小时。
20～28小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。
反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150μl液体，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。计算中和抑制率：抑制率＝[1－(样品组的发光强度均值－空白对照CC均值)/(阴性组的发光强度VC均值－空白对照值CC均值)]×100％。
根据中和抑制率结果，利用Reed-Muench法计算IC50。
分别统计注射PBS和S1疫苗小鼠血清中和抗体EC50滴度，结果如图6所示，注射PBS的小鼠血清中仅检测到极低的EC50中和抗体滴度，而在免疫S1疫苗的小鼠血清中检测出较高的EC50中和抗体滴度，其EC50值接近700，具有很好的中和活性功能。
试验例4小鼠SARS-CoV-2病毒感染攻毒试验
小鼠免疫，6至8周龄的hACE2转基因C57BL/6小鼠，以每只10μg剂量肌肉注射重组S1蛋白疫苗(根据实施例2制备)。比如，小鼠在第1、14、21天受一次疫苗注射，对照组小鼠注射MF59免疫佐剂或仅PBS。在免疫后的7天后再次收集血清。在免＝免疫结束后的7天，
SARS-CoV-2病毒攻击(经鼻内感染，剂量为105TCID50)。此外，对照组小鼠注射MF59免疫佐剂或仅PBS感染该病毒的小鼠作为对照。病毒攻击5天后处死小鼠，切取小鼠的肺和其他器官。肺组织用于检测病毒复制。用PowerUp SYBG Green Master Mix试剂盒(Applied Biosystems,USA)进行实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)反应，测定受SARS-COV-2攻击的小鼠肺组织中的病毒RNA拷贝数，并以肺组织的RNA拷贝数/ml表示。用于qRT-PCR的引物序列为针对SARS-cov-2的包膜(E)基因，如下：
前向：5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’(SEQ ID No.10)；
反向：5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’(SEQ ID No.11)。
本实验测试了疫苗接种是否能够阻止小鼠受SARS-CoV-2病毒感染。用SARS-CoV-2病毒攻击人ACE-2转基因小鼠，并于病毒攻击后5天收集小鼠肺组织，测量其接受疫苗或对照的病毒复制情况。如图7所示，用本发明蛋白疫苗免疫小鼠后，定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测到很少量病毒复制，而对照组小鼠肺组织中病毒复制水平较高。
收集部分肺组织并用10％中性福尔马林固定，包埋于石蜡中，切片厚度5μm，并使用苏木精和伊红(HE)染色。光镜观察组织病理学变化。如图8所示，对照组(PBS组和MF59组)小鼠肺组织出现明显的间质性肺炎组织病理学变化，包括肺泡壁明显增厚，充血、间质大量单个核细胞浸润。与此形成对照的是，重组S1蛋白疫苗免疫小鼠未见组织病理学改变。
以上实验结果进一步证实本发明S1蛋白疫苗可以阻断SARS-CoV-2病毒的感染。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
序列表
<110> 成都威斯克生物医药有限公司
<120> 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗
<130> A220067K（序）
<141> 2022-03-01
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
1 5 10 15
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
20 25 30
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
35 40 45
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
50 55 60
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
85 90 95
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
100 105 110
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
115 120 125
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
130 135 140
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
145 150 155 160
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
165 170 175
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
180 185 190
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
195 200 205
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
210 215 220
Asn Gly
225
<210> 2
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly
1 5 10 15
Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala
35 40 45
Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val
50 55 60
Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn
65 70 75 80
Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys
100 105 110
Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys
115 120 125
Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala
130 135 140
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
145 150 155 160
Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
165 170 175
Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn
180 185 190
Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val
195 200 205
Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala
210 215 220
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
225 230 235 240
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
245 250 255
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
260 265 270
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
275 280 285
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
290 295 300
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
305 310 315 320
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
325 330 335
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
340 345 350
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
355 360 365
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
370 375 380
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
385 390 395 400
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
405 410 415
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
420 425 430
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
435 440 445
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
450 455 460
Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
465 470 475 480
Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
485 490 495
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
500 505 510
Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
515 520 525
<210> 3
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
1 5 10 15
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
20 25 30
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
35 40 45
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
50 55 60
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
85 90 95
Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
100 105 110
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
115 120 125
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
130 135 140
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
145 150 155 160
Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
165 170 175
Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
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Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
195 200 205
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
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Asn Gly
225
<210> 4
<211> 750
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu
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Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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275 280 285
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305 310 315 320
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340 345 350
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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465 470 475 480
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485 490 495
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660 665 670
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<210> 6
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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1 5 10 15
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
385 390
<210> 7
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val
210 215 220
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
225 230 235 240
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245 250 255
Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly His His His His His His
260 265 270
<210> 8
<211> 796
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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1 5 10 15
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165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
245 250 255
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
260 265 270
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
275 280 285
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
290 295 300
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys
305 310 315 320
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
325 330 335
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
340 345 350
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
355 360 365
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
370 375 380
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385 390 395 400
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
405 410 415
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420 425 430
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
435 440 445
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
450 455 460
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465 470 475 480
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
485 490 495
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
500 505 510
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
515 520 525
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
530 535 540
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
545 550 555 560
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565 570 575
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
645 650 655
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660 665 670
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
675 680 685
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
690 695 700
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
705 710 715 720
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
725 730 735
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Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
755 760 765
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770 775 780
Asn Phe Asn Phe Asn Gly His His His His His His
785 790 795
<210> 9
<211> 918
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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1 5 10 15
Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Ser Ile His Ile Lys Asp Ser Asp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Asp Glu Met Ala Asn Glu Met Ser Asp Cys Ile Val Val Leu Lys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe
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195 200 205
Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
210 215 220
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
225 230 235 240
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
245 250 255
Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn
260 265 270
Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
275 280 285
Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe
290 295 300
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln
305 310 315 320
Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu
325 330 335
Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
385 390 395 400
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
405 410 415
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
420 425 430
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435 440 445
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Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
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530 535 540
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545 550 555 560
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
565 570 575
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
580 585 590
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
595 600 605
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
610 615 620
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
625 630 635 640
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
645 650 655
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
660 665 670
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe
675 680 685
Asn Phe Asn Gly Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn
690 695 700
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705 710 715 720
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgtttcgga agagacaggt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgcagtaag gatggctagt 20

Claims (17)

1.抗SARS-CoV-2感染的蛋白，其特征是：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.抗SARS-CoV-2感染的蛋白的前体，其特征是：所述前体的氨基酸序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。
3.预防SARS-CoV-2感染的疫苗，其特征是：含有权利要求1所述的蛋白和/或权利要求2所述的前体，以及药学上可接受的辅助性成分。
4.如权利要求3所述的疫苗，其特征是：所述的辅助性成分为免疫佐剂。
5.如权利要求4所述的疫苗，其特征是：所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、角鲨烯水包油乳剂、细菌毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征是：满足以下至少一项：所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种；所述的钙盐为磷酸三钙；所述的植物皂苷为QS – 21或ISCOM；所述的植物多糖为黄芪多糖；所述的角鲨烯水包油乳剂为MF59；所述的细菌毒素选自重组霍乱毒素、白喉毒素中至少一种；所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺；所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：（2,3-二油氧基丙基）三甲基氯化铵、N-[1-（2,3-二油酰氯）丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-（2-精胺甲酰氨基）乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵。
7.如权利要求3~6任意一项所述的疫苗，其特征是：所述的疫苗为注射制剂。
8.如权利要求7所述的疫苗，其特征是：所述的疫苗为肌肉注射制剂。
9.多核苷酸，其特征是：编码权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的前体。
10.重组载体，其特征是：含有权利要求9所述的多核苷酸。
11.如权利要求10所述的重组载体，其特征是：采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。
12.如权利要求11所述的重组载体，其特征是：所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1；所述的大肠杆菌表达载体为pET32a；所述的酵母表达载体为pPICZaA；所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体。
13.如权利要求12所述的重组载体，其特征是：所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。
14.宿主细胞，其特征是：含有权利要求10~13任一项所述的重组载体。
15.如权利要求14所述的宿主细胞，其特征是：采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其特征是：所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种；所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。
17.权利要求1所述蛋白的制备方法，其特征是：包括如下步骤：培养权利要求14~16任一项所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白或前体，然后回收所述的蛋白，即得。
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