CN114452308B - 一种益生菌保护剂及其制备的微生态制剂和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种益生菌保护剂及其制备的微生态制剂和用途，其成分包括：菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉。本发明将益生菌与益生菌保护剂混合后可以有效保护益生菌，提高益生菌经过胃和肠道后的存活率与定植率，同时提高益生菌的保存时间，缓解和消除腹泻，调节肠道微生态的平衡，抑制肠道有害菌的增殖，并且可以降低慢性肠炎患者体内的炎症因子水平。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌保护剂及其制备的微生态制剂和用途。
背景技术
肠道是人体消化吸收的重要场所，也是人体最大的免疫器官，并有研究称肠道为人体第二个大脑，原因在于肠道内广泛分布的神经系统。
人肠道内的微生物则帮助人完成多种生理生化功能。已知肠道微生物超过1000种，其约占人体微生物量的80%，而其质量仅有1.5-2 kg。
近年来，很多研究表明肠道菌群与人体的健康状况息息相关，密切影响着宿主的营养吸收、物质代谢、免疫以及胃肠道发育等各个方面，宿主自身的基因型、年龄和免疫系统等因素在肠道菌群结构的形成和稳定中起到了重要作用。在此情况下，肠道微生态就显得尤为重要。
人体肠道总长度大约9米，表面积超过300m2，而生活在肠道中的细菌总数约为人体细胞总数的10倍，胃肠道中的细菌的生长繁殖，生存代谢以及整体微生物环境的稳定，都会影响人体的胃肠道乃至全身的健康状态。
研究表明，饮食结构和营养的摄入是塑造肠道菌群结构的最主要因素，一方面其会改变肠道菌群的结构；另一方面食品中难以被人体吸收的成分则通过肠道菌群的作用发挥营养作用。越来越多的研究表明，益生菌对人体的益生作用受到人们的广泛关注，主要体现在益生菌与致病菌竞争结合位点和底物，从而维持人的肠道菌群平衡和肠道健康；而且还会影响肠道内微生物和宿主代谢产物的分泌，从而降低肠道内环境、提供能量、减少细菌易位和减轻内毒素血症等。
尽管很多酵素或益生菌的研究显示可以一定程度改善肠道菌群，减少致病性微生物的比例。但是现有益生菌大多在加工、运输及保质期储存的过程中容易丧失活性，不易维持长期稳定，或进入人体胃肠道，与胃酸、胆汁或消化液等人体内环境接触后，会大量死亡或凋亡，益生菌的效用减弱。
发明内容
本公开提供一种益生菌保护剂，其包括菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉。
在一些实施方式中，其进一步包括余甘子粉。
在一些实施方式中，其进一步包括沙棘粉。
在一些实施方式中，其中菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为1~4:1~4:1~4:1~4。
在一些实施方式中，，所述余甘子粉与菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为1~4:1~4:1~4:1~4:1~4。
在一些实施方式中，所述余甘子粉与菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为3:3:2:2:2或3:2:3:1:3。
在一些实施方式中，所述沙棘粉与余甘子粉、菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为1~4:1~4:1~4:1~4:1~4:1~4。
在一些实施方式中，所述沙棘粉与余甘子粉、菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为2:1:1:4:1:1或1:1:1:1:1:1。
本公开还提供一种微生态制剂，其包括益生菌和上述的益生菌保护剂。
在一些实施方式中，其中所述益生菌为乳杆菌类和/或双岐杆菌类。
在一些实施方式中，其中所述益生菌为选自以下一种或一种以上益生菌及益生菌的组合：嗜热链球菌、布氏乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或短双岐杆菌。
在一些实施方式中，所述的微生态制剂，所述益生菌的制剂中进一步包含果蔬发酵物，所述果蔬发酵物优选自果蔬发酵干粉、果蔬发酵汁、果蔬汁浓缩液、果蔬汁原浆、果蔬发酵颗粒。
在一些实施方式中，所述益生菌与益生菌保护剂的质量配比为1:0.5~100。
在一些实施方式中，所述益生菌与果蔬发酵干粉混合后干粉与益生菌保护剂的质量配比为1:0.5~100，所述益生菌活性大于106CFU/g、大于107CFU/g、大于108CFU/g、大于109CFU/g、大于1010CFU/g或大于1011CFU/g。
在一些实施方式中，所述微生态制剂为固态或液态。
在一些实施方式中，所述的微生态制剂在制备调节人体肠道微生态平衡的制剂的用途。
在一些实施方式中，，所述调节人体肠道微生态平衡包括抑制肠道有害菌增殖，所述有害菌可选地包括志贺氏菌、沙门氏菌、气荚膜杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等。
在一些实施方式中，所述调节人体肠道微生态平衡包括降低炎性因子水平。所述炎性因子包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、TNFa、CRP等肠道慢性炎症相关炎性因子。
具体实施方式
一. 术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所述的“益生菌”指通过定植在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。在特殊病理状态下，当个别益生菌比例严重失衡时，也可能变成对人体粘膜或免疫功能造成负面影响，甚至带来疾病。
现有益生菌种类主要包括乳杆菌类与双岐杆菌类，包括但不限于嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、短双岐杆菌（Bifidobacterium breve）。
果蔬发酵干粉，指新鲜水果和/或蔬菜，取常规可食用部分粉碎、混合后使用酵母菌或其他益生菌发酵后脱水形成的干粉。果蔬发酵物除可以干粉形式提供外，还可以果蔬发酵颗粒、果蔬汁、果蔬浓缩汁、果蔬原汁等形式存在。果蔬发酵物并非本公开益生菌保护剂或微生态制剂的核心功能成分，其作用是作为为益生菌提供可经口服的载体存在，同时也可以为胃肠道菌群提供一定能量和营养物质。当服用者为糖尿病等不需要增加含糖物质的人群时，微生态制剂中可以不含果蔬发酵物。
新鲜水果和/或蔬菜包括但不限于桃、苹果、梨、猕猴桃、菠萝、柠檬、橙、橘、桔、柳橙、椰子、哈密瓜、木瓜、番茄、山楂、枣、枸杞果、桂圆、荔枝、红毛丹、百香果、枇杷、香蕉、西瓜、草莓、蔓越莓、柑、柚、榴莲、莲雾、石榴、桑葚、蓝莓、葡萄、芒果、山竹、蛇果、树莓胡萝卜、菠菜、刀豆、豇豆、生菜、甜菜、西红柿、黄瓜、银耳、木耳、白菜、芹菜、韭菜等中的一种或多种。
本公开中药提取物是根据炎症反应的体质特征从中医理论中的肝、脾、肾三脏同调为主原则，利用药食两用中草药中的有效成分，一方面调整机体湿因子，另一方面调整微生物平衡，保持肠道有益菌活性。借助中药调整肠道湿因子的功效，同时利用益生菌调整肠道微生态平衡的功效，抑制和清除肠道有害菌，同时清除肠道湿因子，降低肠道炎症因子水平。选取以下几种药物进行配伍：
菊花，辛、甘、苦，微寒，归肺肝经，具有疏风清热，平肝明目，解毒的功效的功效。
余甘子，甘、酸、涩，凉，归肺脾胃经，具有解毒利咽，清热生津，润肺化痰的功效。
竹叶，甘、辛、淡，寒，归心肺胃经，具有清热除烦，生津，利尿的功效。
桔梗，苦、辛，平，归肺经，具有宣肺祛痰利咽，排脓，开提肺气的功效。
桑叶，苦、甘，寒，归肺肝经，具有疏散风热，平肝明目，清肺润燥，凉血止血的功效。
沙棘，酸，涩，温，归肺胃脾心经，具有健脾消食，止咳祛痰，活血祛瘀的的功效。
配伍意义：肠道环境通常湿热。现代人饮食条件好，动物性食物摄入多，脑力劳动更多，久坐，思虑过度等，肠道环境湿热更甚。为辅助调理肠道菌群平衡，使用竹叶、余甘子、桔梗、沙棘、菊花和桑叶提取物，用于调整人体肠道微生态。除作为益生菌保护剂外，中药组合物本身也参与肠道微生物菌群的调和。竹叶祛湿；余甘子、桔梗和沙棘祛痰；菊花、桑叶为风药，以风疏热、以风祛湿。同时兼顾多味药物的寒温平衡，形成完整组方。
菊花粉、桔梗粉、桑叶粉、沙棘粉、竹叶提取物、余甘子粉是上述中药饮片经水100℃煎煮后提取物，经超声干燥后的粉末状颗粒。也可经现有技术常规中药颗粒剂制备工艺进行提取和制备获得。
肠道有害菌指会导致人体疾病的侵入人体肠道的细菌或放线菌或真菌。包括但不限于志贺氏菌、沙门氏菌、气荚膜杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床有测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量（也称作“治疗有效量”）可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案（例如治疗方法或制品）在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验（H检验）、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
本发明公开所提供的益生菌保护剂，一方面可以在体内外保护益生菌耐受胃酸、胆盐等机体胃肠内环境，增加益生菌存活率和定植率，使益生菌能够有效发挥平衡肠道菌群的效果；另一方面药物组合物本身也可发挥调理机体肠道湿热环境。益生菌保护剂和益生菌及果蔬发酵粉形成的微生态制剂可以实现减少肠道炎性因子，辅助肠道菌群平衡，实现消除腹泻、便秘等功效。
二. 实施例与测试例
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本发明公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1、制备益生菌保护剂
以12g益生菌保护剂为单位，称取12g粉末状的菊花粉、余甘子粉、淡竹叶提取物、桔梗粉、桑叶粉和/或沙棘粉，混合均匀，具体实验例及对比例组分用量详见表1。
表1 实验例益生菌保护剂组分配比关系表
表1各实验例或对比例益生菌保护剂除菌，封袋密闭4℃保存。
实施例2、益生菌保护剂对益生菌保护率加速验证试验
为验证益生菌保护剂对益生菌的存放保护效果，取2g各例益生菌保护剂与5ml纯净水混合，然后分别与含益生菌的果蔬发酵干粉混合，果蔬发酵干粉包括：
2g含长双歧杆菌（ATCC.55813）的果蔬发酵干粉；
2g含嗜热链球菌（ATCC.19258）的果蔬发酵干粉；
2g含鼠李糖乳杆菌（ATCC.7469）的果蔬发酵干粉；
或1g含发酵乳杆菌（ATCC.11739）的果蔬发酵干粉和1g含瑞士乳杆菌（ATCC.15009）的果蔬发酵干粉。
益生菌保护剂溶液分别与上述含益生菌的果蔬发酵干粉充分混合均匀，再冻干成干粉，无其他杂菌的情况下密封储存。置于37℃干燥温箱环境下，放置3个月，加速模拟益生菌长期存放的环境。每种益生菌设置5个样品，测试前每个益生菌样品经活性测定有9.0×109CFU/g以上活性。最终计算每种实验例对益生菌的活性保护率=（测试后益生菌活性/测试前益生菌活性）×100%，每种益生菌的活性保护率取平均值。最终各实验例对不同益生菌活性保护率详见表2。
表2 各实验例对益生菌活性保护率
通过益生菌保护剂对益生菌保护率的加速验证试验，可知各实验例所加入的中药提取物在干燥保存条件下，较葡聚糖具有更好的保护效率，除实验例1和实验例2的保护率较实验例3-7略低之外，实验例3-7之间并无显著统计学差异。
实施例3、益生菌保护剂在模拟胃酸环境下对益生菌的保护率试验
为验证益生菌保护剂对益生菌在胃酸环境下保护效果，取2g各例益生菌保护剂与4ml纯净水混合，然后分别与2g含副干酪乳杆菌或2g含长双歧杆菌的果蔬发酵干粉充分混合均匀，加入到20ml pH2.0的HCl溶液中，置于37℃温箱环境下，放置2h，模拟益生菌在胃酸环境下的活性保存情况。每种益生菌设置3个样品，测试前每个益生菌样品经活性测定有9.0×109CFU/g以上活性。最终计算每种实验例对益生菌的活性保护率=（测试后益生菌活性/测试前益生菌活性）*100%，每种益生菌的活性保护率取平均值。最终各实验例对不同益生菌活性保护率详见表3。
表3 各实验例在模拟胃酸条件下对益生菌活性保护率
益生菌保护剂对益生菌在模拟胃酸环境下的保护率验证试验，显示出中药提取物构成的益生菌保护剂，较葡聚糖可更有效地抵御胃酸对益生菌活性的影响。
实施例4、小鼠腹泻模型中益生菌保护剂对肠道微生态的影响试验
为验证益生菌保护剂对益生菌的保护和肠道菌群的调节作用，采用小鼠腹泻模型进行验证。
配制益生菌和益生菌保护剂混合物（即微生态混合溶液）：分别取1g含长双歧杆菌，1g含发酵乳杆菌和1g瑞士乳杆菌的果蔬发酵干粉与2g各实验例益生菌保护剂混合，加入10ml的纯净水，充分混匀，形成微生态混合溶液。
参照赵艳玲等（2009）的方法建立小鼠腹泻模型，取腹泻小鼠（SPF级C57BL小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司），设置实验例3-7组和对比例组，及阴性对照组（不饲喂微生态混合溶液）和正常对照组（不进行任何腹泻或微生态溶液干预，仅提供正常饲喂条件），每组10只，雌雄各半，模型建立后第一天和第二天饲喂约109 cells的沙门氏菌，在正常饮食的情况下，从第三天开始分别管饲不同实验例的微生态混合溶液，每只小鼠0.8ml/天，连续饲喂7天，阴性对照组用生理盐水替代微生态混合溶液。
每日观察小鼠活动和粪便性状。在实验第10天处死小鼠，取肠道内容物，阴性对照组如在10天内死亡的，则取肠道内容物，并及时提取内容物DNA。对小鼠肠道微生物相对丰度进行检测，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，按照说明书提取第十天时小鼠小肠内容物DNA。委托金唯智生物科技有限公司进行肠道微生物16S rDNA的检测，对肠道微生物相对丰度进行分析。
模型小鼠经微生态混合溶液饲喂后，腹泻现象有显著的改善，阴性对照组有5只小鼠在实验第10天之前死亡，对比例组有1只小鼠在实验第7天死亡，其他组无小鼠死亡。第5天是，阴性对照组小鼠平均体重显著低于各实验组、对比例组以及正常对照组。
通过小鼠肠道微生物相对丰度的分析来看，益生菌的加入可以显著抑制肠道内沙门氏菌的增殖，并通过病原菌的抑制来消除腹泻的症状。而含有不同组合中药提取物的各实验例组中，益生菌保护剂较葡聚糖能够更有效地保护益生菌在模型小鼠肠道的生存和定植。
表4 实验第10天各组小鼠肠道微生物相对丰度表
实施例5、微生态混合溶液在消除慢性肠炎患者体内炎症因子的效应研究
为验证益生菌保护剂对益生菌在人体的保护和微生态混合溶液在人体肠道炎症反应的调节作用，对有慢性肠炎的志愿者的炎症因子及腹泻调理效果进行验证。
招募15名有慢性肠炎并处于活动期的志愿者，签署知情同意书和保密协议后开展此项研究。15名志愿者中均长期性腹泻，每日排便4-6次。淡红或淡紫舌苔白腻，运脉濡。
配制益生菌和益生菌保护剂混合物（即微生态混合溶液）：每人每剂分别取0.5g含长双歧杆菌，0.5g副干酪乳杆菌，和0.5g瑞士乳杆菌的果蔬发酵干粉与15g实验例5或实验例7益生菌保护剂混合，加入15ml的温水（45℃左右），充分混匀，形成微生态混合溶液。其中7名志愿者服用包含实验例5的微生态混合溶液（实验例5组），8名志愿者服用包含实验例7的微生态混合溶液（实验例7组）。
每人每日早晚服用一剂微生态混合溶液，连续服用14天。问询患者大便、睡眠、乏力感，分别于第一次服用微生态混合溶液的第0天和第14天采集静脉血，分离血清，检测患者血清中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、CRP等炎症因子水平。
表5 慢性肠炎患者血清炎症因子水平比较（x±s）
注：*与第0天比较，P<0.05，#与实验例5组第14天比较，P<0.05。
经过14天的调理，两组慢性肠炎患者的腹泻症状均得到有效缓解，大便次数变为1-2次/天。实验例5组和实验例7组分别各有5名患者自述乏力感得到改善，实验例5组有3名患者自述睡眠质量改善，实验例7组有5名患者自述睡眠质量改善。
虽然为了清楚的理解，已经借助于实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本公开的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。
Claims (6)
1.一种益生菌保护剂，其包括：菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉、桑叶粉和余甘子粉，所述菊花粉、桔梗粉、桑叶粉、竹叶提取物、余甘子粉是菊花、桔梗、桑叶、竹叶、余甘子中药饮片经水100℃煎煮后提取物，经超声干燥后的粉末状颗粒，其中所述余甘子粉与菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为下列中的一种：1~4:1~4:1~4:1~4:1~4。
2.根据权利要求1所述的益生菌保护剂，其中所述余甘子粉与菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为下列中的一种：3:3:2:2:2或3:2:3:1:3。
3.根据权利要求1所述的益生菌保护剂，其进一步包括：沙棘粉，其中所述菊花粉、桔梗粉、桑叶粉、竹叶提取物、余甘子粉、沙棘粉是菊花、桔梗、桑叶、竹叶、余甘子、沙棘中药饮片经水100℃煎煮后提取物，经超声干燥后的粉末状颗粒，所述沙棘粉与余甘子粉、菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为下列中的一种：1~4:1~4:1~4:1~4:1~4:1~4。
4.根据权利要求3所述的益生菌保护剂，其中所述沙棘粉与余甘子粉、菊花粉、竹叶提取物、桔梗粉和桑叶粉的质量配比关系为下列中的一种：2:1:1:4:1:1或1:1:1:1:1:1。
5.一种微生态制剂，其包括：益生菌和权利要求1至4任一所述的益生菌保护剂，其中所述益生菌选自：嗜热链球菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌。
6.一种如权利要求5所述微生态制剂的用途，其中所述微生态制剂用于制备调节人体肠道微生态平衡的制剂的用途。
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