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CN114437220B - 一种抗ctla-4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用 - Google Patents

一种抗ctla-4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用 Download PDF

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CN114437220B CN202210077079.2A CN202210077079A CN114437220B CN 114437220 B CN114437220 B CN 114437220B CN 202210077079 A CN202210077079 A CN 202210077079A CN 114437220 B CN114437220 B CN 114437220B
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Abstract

本发明提供了一种抗CTLA‑4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用，属于免疫学技术领域。本发明的抗CTLA‑4的纳米抗体D11针对CTLA‑4的重链设计，抗CTLA‑4的纳米抗体D11包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR。本发明的纳米抗体D11能够特异性识别CTLA‑4抗原。本发明将编码所述抗CTLA‑4的纳米抗体D11的编码基因和人IgG Fc段基因融合表达的重组纳米抗体，能够特异性的识别CTLA‑4抗原，能够应用于肿瘤的分子诊断和/或抗肿瘤药物的制备。

Description

一种抗CTLA-4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种抗CTLA-4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(cytotoxic T lymphocyte associated protein4，CTLA-4)，是T细胞上表达的另一种免疫抑制性受体，与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。阻断CTLA-4分子，可提高T细胞抗肿瘤反应，杀伤肿瘤细胞。
纳米抗体是由比利时科学家于1993年在Nature中首次报道，在羊驼外周血液中存在的一种天然缺失轻链的抗体(VHH)，1995年又在护士鲨、斑纹须鲨、银鲛等软骨鱼中发现，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH分子量只有15KD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。纳米抗体具有独特优势，包括分子量小、可溶性好、稳定性强、亲和力高、免疫原性低、体内组织渗透性好，极易穿过血管或组织到达靶部位等，具有很大发展空间，纳米抗体的应用也非常广泛，临床上既可用于肿瘤治疗，也可作为诊断工具。
目前使用靶向CTLA-4的特异性单克隆抗体治疗性地阻断肿瘤细胞与T淋巴细胞表面受体相结合，利用单一或联合疗法激活宿主自身免疫系统，通过T细胞介导的免疫应答清除肿瘤细胞在非小细胞肺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌以及难治性霍奇金淋巴瘤等肿瘤治疗临床试验当中已经取得可观的成绩，延长了曾经无药可用的晚期肿瘤患者的生存期。
目前还没有关于靶向CTLA-4的纳米抗体的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗CTLA-4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用，本发明的抗CTLA-4的纳米抗体能够特异性识别CTLA-4抗原。
本发明提供了一种抗CTLA-4的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供了所述纳米抗体的编码基因，所述纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种抗CTLA-4的重组纳米抗体，包括上述方案所述的抗CTLA-4的纳米抗体和人IgG Fc段。
优选的，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了上述方案所述重组纳米抗体的编码基因，包括上述方案所述的纳米抗体的编码基因和人IgG Fc段的编码基因；所述纳米抗体的编码基因和人IgG Fc段的编码基因通过连接片段连接，所述连接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，所述重组纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了一种重组载体，包括初始载体，所述初始载体中插入有上述方案所述重组纳米抗体的编码基因。
优选的，所述初始载体为pCZN1质粒载体。
本发明还提供了一种重组菌，包含上述方案所述的重组载体。
本发明还提供了上述方案所述的抗CTLA-4的纳米抗体或者所述的纳米抗体的编码基因或者所述的重组纳米抗体或者所述的重组纳米抗体的编码基因或者所述重组载体或者所述的重组菌株在制备抗肿瘤药物和/或肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明提供了一种抗CTLA-4的纳米抗体D11，本发明的抗CTLA-4的纳米抗体D11针对CTLA-4的重链设计，抗CTLA-4的纳米抗体D11包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR。本发明的纳米抗体D11能够特异性识别CTLA-4抗原。本发明将编码所述抗CTLA-4的纳米抗体D11的编码基因和人IgG Fc段基因融合表达的重组纳米抗体，能够特异性的识别CTLA-4抗原，能够应用于肿瘤的分子诊断和/或抗肿瘤药物的制备。
附图说明
图1是纳米抗体的第一轮DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第六道为1000bp的Marker(条带大小依次为：1000、700、500、400、300、200、100bp)，第一、二、三及五道为PCR产物，条带约为700bp，第四道为空；
图2是纳米抗体的第二轮DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为1000bp的Marker(条带大小同上)，第二、四及六道为PCR产物，条带约为400bp，第三及五道为空；
图3是用噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图：其中1是将CTLA-4抗原包被在酶标板上，2是噬菌体上清，3是鼠抗km13107抗体，4是山羊抗鼠IgG(AP)的抗体，5是TMB显色液；
图4是纯化的抗CTLA-4纳米抗体的western blot图；
图5为活化的人T细胞的全蛋白及CTLA-4抗原western blot图；
图6为实施例4中抗CTLA-4纳米抗体与CTLA-4蛋白亲和力检测结果；
图7为实施例5中作用24h下RKO细胞杀伤作用情况；
图8为实施例5中作用48h下RKO细胞杀伤作用情况；
图9为实施例5中作用72h下RKO细胞杀伤作用情况；
图10为实施例6中皮下注射肿瘤细胞后第9天、18天、27天小动物活体成像情况；
图11为实施例6中肿瘤大小变化。
具体实施方式
本发明提供了一种抗CTLA-4的纳米抗体D11，所述纳米抗体D11的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
QVQLQESGGGSVQAGGSLTLACAVSTQPSDIGCLAWYRQTPGTEREGVASIYTLGEIADYKDSVKGRFTISVDVAQSTLYLHMNGLRPEDTATYYCAAGPPLIGGRPCRLDNRYGWHHWGRGTPVTVSS。
在本发明中，所述抗CTLA-4的纳米抗体D11包括框架区FR和抗原决定簇互补区CDR；在本发明中，所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4；具体的氨基酸序列如下：
FR1:QVQLQESGGGSVQAGGSLTLACAV(SEQ ID No.6)
FR2:WYRQTPGTEREGVAS(SEQ ID No.7)
FR3:ADYKDSVKGRFTISVDVAQSTLYLHMNGLRPEDTATYYC(SEQ ID No.8)
FR4:WGRGTPVTVSS(SEQ ID No.9)
对应的核苷酸序列如下：
FR1:caggtccaactgcaggagtctgggggagggtcggtgcaggctggagggtctcttacactcgcctgtgcagtc(SEQ ID No.10)
FR2:tggtaccgccagactccagggacggagcgcgagggggtggcgtcg(SEQ ID No.11)
FR3:gctgactataaagactccgtgaagggccgctttaccatctccgtagatgtcgcccagagcacgctgtatctccatatgaacggcctcagacctgaggacactgccacgtactactgt(SEQ ID No.12)
FR4:tggggtcgggggaccccggtcaccgtctcctca(SEQ ID No.13)。
在本发明中，所述抗原决定簇互补区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3；具体的氨基酸序列如下：
CDR1:STQPSDIGCLA(SEQ ID No.14)
CDR2:IYTLGEI(SEQ ID No.15)
CDR3:AAGPPLIGGRPCRLDNRYGWHH(SEQ ID No.16)。
在本发明中，所述CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列具体如下：
CDR1:tcgactcaacccagtgatattggctgcctggcc(SEQ ID No.17)
CDR2:atttatacactgggcgaaatc(SEQ ID No.18)
CDR3:gcggcaggtcccccgttgatcggtggtaggccgtgccgcttggacaacagatatggctggcaccac(SEQ ID No.19)。
在本发明中，所述抗CTLA-4的纳米抗体D11通过以下方法筛选获得：用噬菌体表面展示技术构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，然后以生物素化的CTLA-4抗原为基础进行筛选，获得CTLA-4特异性的纳米抗体D11基因序列。
在本发明中，所述天然驼源重链抗体噬菌体展示基因库的构建方法，优选的包括以下步骤：1)提取骆驼脾脏组织总RNA、反转录所述总RNA获得cDNA；2)以所述cDNA为模板进行巢式PCR扩增获得重链抗体的可变区片段；3)分别酶切所述重链抗体的可变区片段和pcantab5e噬菌体载体后，进行连接获得连接产物；4)将所述连接产物转入感受态细胞中获得天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库。
在本发明中，提取骆驼脾脏组织总RNA、反转录所述总RNA获得cDNA。本发明对所述骆驼脾脏组织总RNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物组织总RNA的提取方法即可。在本发明中，所述反转录优选的通过Thermo Scientific ReverAid First StrandcDNA Synthesis Kits试剂盒实现。
本发明在获得所述cDNA后，以所述cDNA为模板进行巢式PCR扩增获得重链抗体的可变区片段。在本发明中，所述巢式PCR优选的包括两轮PCR；第一轮PCR用于扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，所述第一轮PCR的引物序列优选的如SEQ ID No.20和SEQ IDNo.21所示；第二轮PCR用于扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段，所述第二轮PCR的引物序列优选的如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示。
本发明在获得所述重链抗体的可变区片段后，分别酶切所述重链抗体的可变区片段和pcantab5e噬菌体载体后，进行连接获得连接产物。在本发明中，所述酶切优选为双酶切，所述酶切优选的采用限制性内切酶SifI和Not I进行。在本发明中，所述酶切的程序优选的如下：37℃酶切1h；50℃酶切1h。在本发明中，所述连接的温度优选为16℃，所述连接的时间优选为4h。
本发明在获得所述连接产物后，将所述连接产物转入感受态细胞中获得天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库。在本发明中，所述感受态细胞优选为大肠杆菌感受态细胞TG1，所述大肠杆菌感受态细胞TG1优选的采用甘油重悬法自制而成；所述转入的方法优选为电转化。在本发明中，所述转化后还包括辅助噬菌体救援的过程，本发明对所述电转化和辅助噬菌体援助的过程没有特殊限定。
本发明对所述生物素化的CTLA-4抗原筛选抗CTLA-4纳米抗体D11的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规纳米抗体筛选方法即可。
本发明还提供了所述纳米抗体的编码基因，所述纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
caggtccaactgcaggagtctgggggagggtcggtgcaggctggagggtctcttacactcgcctgtgcagtctcgactcaacccagtgatattggctgcctggcctggtaccgccagactccagggacggagcgcgagggggtggcgtcgatttatacactgggcgaaatcgctgactataaagactccgtgaagggccgctttaccatctccgtagatgtcgcccagagcacgctgtatctccatatgaacggcctcagacctgaggacactgccacgtactactgtgcggcaggtcccccgttgatcggtggtaggccgtgccgcttggacaacagatatggctggcaccactggggtcgggggaccccggtcaccgtctcctca。
本发明还提供了一种抗CTLA-4的重组纳米抗体，包括上述方案所述的抗CTLA-4的纳米抗体和人IgG Fc段。
在本发明中，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
QVQLQESGGGSVQAGGSLTLACAVSTQPSDIGCLAWYRQTPGTEREGVASIYTLGEIADYKDSVKGRFTISVDVAQSTLYLHMNGLRPEDTATYYCAAGPPLIGGRPCRLDNRYGWHHWGRGTPVTVSSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPGVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
本发明还提供了上述方案所述重组纳米抗体的编码基因，包括上述方案所述的纳米抗体D11的编码基因和人IgG Fc段的编码基因；所述纳米抗体的编码基因和人IgG Fc段的编码基因通过连接片段连接，所述连接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：GGTGGTGGTGGTAGT。
在本发明中，所述重组纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：
caggtccaactgcaggagtctgggggagggtcggtgcaggctggagggtctcttacactcgcctgtgcagtctcgactcaacccagtgatattggctgcctggcctggtaccgccagactccagggacggagcgcgagggggtggcgtcgatttatacactgggcgaaatcgctgactataaagactccgtgaagggccgctttaccatctccgtagatgtcgcccagagcacgctgtatctccatatgaacggcctcagacctgaggacactgccacgtactactgtgcggcaggtcccccgttgatcggtggtaggccgtgccgcttggacaacagatatggctggcaccactggggtcgggggaccccggtcaccgtctcctcaggtggtggtggtagtgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctggggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa。
在本发明中，所述人IgG Fc段基因的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，具体如下：
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctggggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa。
本发明还提供了一种重组载体，包括初始载体，所述初始载体中插入有上述方案所述重组纳米抗体的编码基因。
在本发明中，所述初始载体优选为pCZN1质粒载体。在本发明中，所述重组纳米抗体的基因的插入位点优选的位于所述pCZN1质粒载体的NdeI和XbaI位点。本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组载体制备方法即可。
本发明还提供了一种重组菌，包含上述方案所述的重组载体。在本发明中，所述重组菌的原始菌株优选为大肠杆菌，更优选为大肠杆菌Arctic Express。
在本发明中，优选的通过将所述表达抗CTLA-4的纳米抗体D11的重组载体转入所述大肠杆菌Arctic Express中获得所述重组菌株。本发明对所述重组菌株的具体制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的重组菌株的制备方法即可。
本发明还提供了上述方案所述的抗CTLA-4的纳米抗体或者所述的纳米抗体的编码基因或者所述的重组纳米抗体或者所述的重组纳米抗体的编码基因或者所述重组载体或者所述的重组菌株在制备抗肿瘤药物和/或肿瘤诊断试剂中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
针对于天然驼源纳米抗体基因库的构建：
提取骆驼脾脏组织总RNA，具体步骤如下：
①从-80℃中取出骆驼脾脏组织，加入液氮碾碎样品标本，每100mg研碎的组织加1ml Trizol，玻璃匀浆器匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止。然后移入1.5ml离心管中，室温放置15min。
②按照每1ml Trizol加入0.2ml氯仿的比例，猛烈震荡15s，室温下静置3min。
③将样品12000rpm，4℃离心15min，把上层转移到新的Ep管中。
④加入等体积的异丙醇并在冰上混合放置20min。
⑤将溶液12000rpm，4℃离心10min，弃去上清。
⑥加入1ml DEPC水配制的75％乙醇洗涤沉淀物(每1ml Trizol至少加1ml乙醇)。
⑦4℃下将上一步溶液10000rpm离心10min，弃去上清，再重复上一步复洗一次。
⑧10000rpm，4℃离心10min后，弃去上清，干燥10-15分钟。
⑨加入适量ddH2O溶解RNA沉淀，测定RNA浓度，并保存于-80℃。
利用TIANGEN公司提供的RNA纯化试剂盒纯化，按照Thermo Scientific ReverAidFirst Strand cDNA Synthesis Kits试剂盒反转录得到cDNA。
(2)以cDNA为模板，用巢式PCR扩增得到重链抗体的可变区片段；
第一轮PCR：
上游引物：5’-gtcctggctgctcttctacaaag-3’(SEQ ID No.20)
下游引物：5’-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3’(SEQ ID No.21)
第一轮PCR反应体系
Figure BDA0003484510740000091
第一轮PCR扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min。
扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳条带约为700bp。
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物为模板，
上游引物：
5'-tcgcggcccagccggcccaggtccaactgcaggagtctgggg-3'(SEQ ID No.22)
下游引物：
5'-ataagaatgcggccgctgaggagacggtgacctgggtcccc-3'(SEQ ID No.23)
第二轮PCR反应体系
Figure BDA0003484510740000101
第二轮PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，25个循环；72℃10min。扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)结果显示该片段的大小约为400bp，即纳米抗体基因电泳条带约为400bp。
使用限制性内切酶(购自Takara公司)SifI和Not I酶切pcantab5e噬菌体载体及VHH片段，并用T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接两个片段。具体酶切体系及连接体系如下：
酶切体系
Figure BDA0003484510740000102
酶切条件：37℃酶切1h后，在50℃酶切1h。
连接体系
Figure BDA0003484510740000103
连接条件：16℃连接4h后，在4℃进行过夜连接。
将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，经辅助噬菌体救援后，其库容量达9.0×1013。
其中感受态细胞TG1的制备方法如下：
从-80℃冰箱取出大肠杆菌TG1甘油菌，划线接种于2×YT固体平板上于37℃培养10h，挑取单个菌落接种于3ml 2×YT液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜。次日，按1:100比例将菌液放大培养于含200ml 2×YT培养基的锥形瓶中，继续于37℃培养至OD600约为0.4时，将菌液收集在50ml离心管中，于冰上静置1h，9000rpm，4℃离心10min，弃上清用相同体积冷的纯水重悬菌体沉淀，离心，重复一次。然后用提前预冷的10％的甘油重悬菌体并离心。用1ml 10％的甘油(预冷的纯水配制)混悬菌体沉淀，并分装在提前预冷的1ml Ep管中，每管100μl，后立即转至-80℃冰箱保存，即为感受态细胞TG1。
其中辅助噬菌体救援步骤如下：
①取100μL的文库，接种于50ml的2×YT/Amp/Glu培养基中，37℃，200rpm，震荡培养至对数期OD600约为0.4～0.5。
②向培养液中加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13KO7，混匀后37℃静置30min。
③将培养液在室温，9000rpm，离心10min，弃上清沉淀菌体，用200mL的2×YT/Amp/Kana培养液重悬，37℃200rpm，培养过夜。
④将培养液于4℃，9000rpm，离心10min取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，4℃静置6h。
⑤9000rpm离心20min弃上清，用PBS(1mL)重悬沉淀，得到重组噬菌体抗体库，分装到1.5ml Ep管中，4℃保存。
与此同时，通过菌落PCR检测文库的插入率，引物使用第二轮PCR引物，退火温度55℃，结果显示插入率达到95％以上(目的片段插入率＝含目的片段的菌落数/所有菌落数)。
针对抗CTLA-4纳米抗体D11的筛选过程：
将噬菌体文库(1×1012个噬菌体)与50μl链霉亲和素磁珠在转动台上室温孵育1h后，收集噬菌体抗体；在2个已用2％PBSM封闭过的1ml离心管中，分别加入500μl预先削减的噬菌体抗体，再向一个离心管中加入500μl用PBS稀释的5μg生物素化的CTLA-4抗原，另一个离心管中加入500μl的PBS缓冲液作为阴性对照，在转动台上室温孵育1h，后加入预先封闭的50μl的链霉亲和素磁珠，在转动台上室温孵育30min，收集磁珠。用PBST洗涤磁珠7次，PBSM洗涤2次，PBS洗涤1次。加入pH2.7的Glycine进行洗脱，pH9.1的1mol/LTris-HCl进行中和。将上述中和液加入到5ml处于对数生长期的TG1(OD为0.5)中，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，经过4轮筛选，阳性克隆将不断得到富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛选抗体库中CTLA-4特异性抗体的目的。
噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：
筛选原理模式图如图3所示，具体方法如下：
首先制备VHH噬菌体单克隆上清：从3～4轮筛选后的固体平板上，各挑取90个单个菌落并接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基中，220rpm 37℃培养过夜，次日取50μl菌液至新的96深孔板中，每孔加入800μl含有100μg/ml的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基，生长至对数期后，加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13K07，37℃侵染30min，10000rpm离心5min，弃上清，用800ul含有100ug/ml的氨苄青霉素及50ug/ml的卡那青霉素的新鲜2×YT培养基重悬菌体，37℃，220rpm培养12h，次日，将菌液10000rpm，离心5min，其上清即为VHH噬菌体单克隆上清。
用包被液将CTLA-4抗原稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，4℃包被过夜，并设立阴性和阳性对照。次日，用PBST洗涤三次，用2％PBSM于37℃封闭2h，用PBST洗涤三次，加入200μl预处理的VHH噬菌体单克隆上清，37℃孵育1h。加入1:5000的用0.1％的PBST稀释的鼠源性抗M13KO7/HRP的二抗，37℃孵育1h，洗去未结合的抗体，加入TMB显色液，于酶标仪上在450nm波长处读取吸光度值。当样品孔OD值大于对照孔OD两倍以上时判定为阳性对照孔，取阳性菌液进行基因测序。
使用DNAMAN软件进行序列分析及blast比对，把CDR1,CDR2,CDR3序列相同的菌株视为同一克隆株。
实施例2
纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达及纯化：
(1)将测序分析所获得的的纳米抗体序列连接人源性IgGFc段并亚克隆pCZN1质粒载体中，并转化至大肠杆菌Arctic Express，挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mLAmp的3mLLB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；(2)次日按1:100接种于50μg/mLAmp的30mL LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，20℃220rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达；(3)收集菌体并进行超声破碎，得到包涵体蛋白粗体液，后经Ni柱亲和纯化得到融合蛋白。图4是纯化的抗CTLA-4纳米抗体的westernblot图：其中泳道1为蛋白分子标准，泳道2是纯化的抗CTLA-4纳米抗体D11(其中一抗用鼠源his-tag标签抗体，二抗为羊抗鼠IgG/HRP)。
实施例3
抗CTLA-4纳米抗体D11的特异性验证：
将CTLA-4抗原及活化的人T细胞做westernblot(其中一抗用纯化的抗CTLA-4纳米抗体D11，二抗为抗人IgG Fc/HRP)。图5中泳道1是活化的人T细胞的全蛋白，泳道2是无CTLA-4表达的293T细胞全蛋白，泳道3是CTLA-4抗原。由此说明，说明本发明提供的抗CTLA-4纳米抗体D11可以特异性识别CTLA-4抗原。
实施例4
抗CTLA-4纳米抗体与CTLA-4蛋白亲和力检测：
采用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术检测本发明抗CTLA-4纳米抗体与CTLA-4蛋白亲和力。将抗CTLA-4纳米抗体从浓度50nM起始2倍倍比稀释至0.391nM。将稀释后的抗CTLA-4纳米抗体以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道，结合时间为120s，解离时间为300s。结合解离步骤均在运行试剂中进行。每一个浓度分析后，芯片需要用3M氯化镁以20μL/min的流速冲洗30s。使用Biacore 8K分析软件BiacoreInsight Evaluation Software计算抗体的KD值。检测结果如图6所示，抗CTLA-4纳米抗体的亲和力可达到6.63nM。
实施例5
抗CTLA-4纳米抗体的体外肿瘤细胞杀伤作用验证：
为进行杀伤功能检测，将人结肠癌细胞RKO与人单个核细胞(PBMC)共培养，加入不同浓度的抗CTLA-4纳米抗体，抗CTLA-4单抗组为阳性对照组，无关纳米抗体组为同型对照组，PBMC组为对照组，设置不同效靶比(E:T)，分别作用24h，48h，72h，检测共培养96孔板孔内荧光强度，杀伤率计算公式：[1-(实验孔荧光强度÷RKO细胞孔荧光强度)×100％]。图7～图9为不同作用时间下RKO细胞杀伤作用情况。图7显示，共培养24小时，E:T为40：1，20:1,10:1及5:1时，3个浓度的抗CTLA-4纳米抗体组杀伤作用较对照组均明显增强(P<0.05)，最高可达到50％。图8显示，共培养48小时，E:T为40：1时，高浓度抗CTLA-4纳米抗体组杀伤作用较对照组明显增强(P<0.05)，杀伤率最高可达74％；E:T为20:1,10:1和5:1时，中、高浓度抗CTLA-4纳米抗体组杀伤作用较对照组均增强(P<0.05)。图9显示，共培养72小时，E:T为40：1和10：1时，中、高浓度抗CTLA-4纳米抗体组杀伤作用较对照组明显增强(P<0.05)；E:T为20:1时，3个浓度抗CTLA-4纳米抗体组杀伤作用较对照组均增强(P<0.05)；E:T为5:1时，各种杀伤作用无明显差异。综上，本发明抗CTLA-4纳米抗体具有体外肿瘤细胞杀伤作用，杀伤强度与作用时间、效靶比及药物浓度有关。
实施例6
抗CTLA-4纳米抗体的体内肿瘤细胞杀伤作用验证：
应用人结直肠细胞癌异种移植动物模型进行抗CTLA-4纳米抗体体内抗肿瘤作用研究。选取6-8周龄大雌性SCID-NOD小鼠，按2:1比例混合RKO细胞与人PBMC，于小鼠右侧腹皮下注射。设空白对照组(仅注射RKO细胞)，抗CTLA-4纳米抗体治疗组(设5mg/kg，3mg/kg，1mg/kg浓度)，无关纳米抗体组及抗CTLA-4单克隆抗体组(3mg/kg)。每隔3天测量小鼠肿瘤大小变化，每9天进行小动物活体成像评估肿瘤变化。第28天麻醉后颈椎脱臼法处死小鼠，剥离肿瘤体外观察。图10为皮下注射肿瘤细胞后第9天、18天、27天小动物活体成像情况。图11为肿瘤大小变化。实验结果显示，与未治疗组相比，PBMC组、不同浓度的抗CTLA-4纳米抗体治疗组及无关抗体组小鼠肿瘤体积较小(P<0.01)；PBMC组与无关抗体组相比肿瘤大小无变化，提示本发明中合成抗体的Fc段不发挥作用；中、高剂量抗CTLA-4纳米抗体治疗组肿瘤体积较PBMC组小(P<0.01)，高剂量抗CTLA-4纳米抗体组肿瘤大小与抗CTLA-4单克隆抗体组无明显差异。综上，抗CTLA-4纳米抗体具有体内抗肿瘤作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东医科大学
宁夏医科大学
<120> 一种抗CTLA-4的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌及其应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ala Cys Ala Val Ser Thr Gln Pro Ser Asp Ile Gly
            20                  25                  30
Cys Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Thr Glu Arg Glu Gly Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Tyr Thr Leu Gly Glu Ile Ala Asp Tyr Lys Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Val Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Met Asn Gly Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Gly Pro Pro Leu Ile Gly Gly Arg Pro Cys Arg Leu Asp Asn
            100                 105                 110
Arg Tyr Gly Trp His His Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210> 2
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggg tcggtgcagg ctggagggtc tcttacactc 60
gcctgtgcag tctcgactca acccagtgat attggctgcc tggcctggta ccgccagact 120
ccagggacgg agcgcgaggg ggtggcgtcg atttatacac tgggcgaaat cgctgactat 180
aaagactccg tgaagggccg ctttaccatc tccgtagatg tcgcccagag cacgctgtat 240
ctccatatga acggcctcag acctgaggac actgccacgt actactgtgc ggcaggtccc 300
ccgttgatcg gtggtaggcc gtgccgcttg gacaacagat atggctggca ccactggggt 360
cgggggaccc cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 3
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ala Cys Ala Val Ser Thr Gln Pro Ser Asp Ile Gly
            20                  25                  30
Cys Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Thr Glu Arg Glu Gly Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Tyr Thr Leu Gly Glu Ile Ala Asp Tyr Lys Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Val Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Met Asn Gly Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Gly Pro Pro Leu Ile Gly Gly Arg Pro Cys Arg Leu Asp Asn
            100                 105                 110
Arg Tyr Gly Trp His His Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
    130                 135                 140
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
145                 150                 155                 160
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                165                 170                 175
Gly Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
            180                 185                 190
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        195                 200                 205
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    210                 215                 220
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
225                 230                 235                 240
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                245                 250                 255
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            260                 265                 270
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        275                 280                 285
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    290                 295                 300
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
305                 310                 315                 320
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                325                 330                 335
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            340                 345                 350
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        355                 360                 365
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggtggtg gtagt 15
<210> 5
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggg tcggtgcagg ctggagggtc tcttacactc 60
gcctgtgcag tctcgactca acccagtgat attggctgcc tggcctggta ccgccagact 120
ccagggacgg agcgcgaggg ggtggcgtcg atttatacac tgggcgaaat cgctgactat 180
aaagactccg tgaagggccg ctttaccatc tccgtagatg tcgcccagag cacgctgtat 240
ctccatatga acggcctcag acctgaggac actgccacgt actactgtgc ggcaggtccc 300
ccgttgatcg gtggtaggcc gtgccgcttg gacaacagat atggctggca ccactggggt 360
cgggggaccc cggtcaccgt ctcctcaggt ggtggtggta gtgagcccaa atcttgtgac 420
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 480
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctgg ggtcacatgc 540
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 660
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 780
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 840
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gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 960
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1020
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1080
tccctgtctc cgggtaaa 1098
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ala Cys Ala Val
            20
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Thr Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser
1               5                   10                  15
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Asp Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp
1               5                   10                  15
Val Ala Gln Ser Thr Leu Tyr Leu His Met Asn Gly Leu Arg Pro Glu
            20                  25                  30
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
        35
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggtccaac tgcaggagtc tgggggaggg tcggtgcagg ctggagggtc tcttacactc 60
gcctgtgcag tc 72
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggtaccgcc agactccagg gacggagcgc gagggggtgg cgtcg 45
<210> 12
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctgactata aagactccgt gaagggccgc tttaccatct ccgtagatgt cgcccagagc 60
acgctgtatc tccatatgaa cggcctcaga cctgaggaca ctgccacgta ctactgt 117
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ser Thr Gln Pro Ser Asp Ile Gly Cys Leu Ala
1               5                   10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ile Tyr Thr Leu Gly Glu Ile
1               5
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ala Ala Gly Pro Pro Leu Ile Gly Gly Arg Pro Cys Arg Leu Asp Asn
1               5                   10                  15
Arg Tyr Gly Trp His His
            20
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgactcaac ccagtgatat tggctgcctg gcc 33
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atttatacac tgggcgaaat c 21
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcggcaggtc ccccgttgat cggtggtagg ccgtgccgct tggacaacag atatggctgg 60
caccac 66
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtcctggctg ctcttctaca aag 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgcggccca gccggcccag gtccaactgc aggagtctgg gg 42
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ataagaatgc ggccgctgag gagacggtga cctgggtccc c 41
<210> 24
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgggg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696

Claims (10)

1.一种抗CTLA-4的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述纳米抗体的编码基因，所述纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
3.一种抗CTLA-4的重组纳米抗体，包括权利要求1所述的抗CTLA-4的纳米抗体和人IgGFc段。
4.根据权利要求3所述的重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
5.权利要求3或4所述重组纳米抗体的编码基因，包括权利要求2所述的纳米抗体的编码基因和人IgG Fc段的编码基因；所述纳米抗体的编码基因和人IgG Fc段的编码基因通过连接片段连接，所述连接片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.根据权利要求5所述重组纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述重组纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
7.一种重组载体，包括初始载体，其特征在于，所述初始载体中插入有权利要求5或6所述重组纳米抗体的编码基因。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体为pCZN1质粒载体。
9.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求7或8所述的重组载体。
10.权利要求1所述的抗CTLA-4的纳米抗体或者权利要求2所述的纳米抗体的编码基因或者权利要求3或4所述的重组纳米抗体或者权利要求5或6所述的重组纳米抗体的编码基因或者权利要求7或8所述重组载体或者权利要求9所述的重组菌株在制备抗肿瘤药物和/或肿瘤诊断试剂中的应用。
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