CN114432246A - 一种具有神经保护作用的脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有神经保护作用的脂质体及其制备方法与应用，属于功能性脂质体制备技术领域。该脂质体制备主要包括以下步骤：将鱼头预处理后提取总脂，再将磷脂和糖脂进行分离，然后使用乙醇注入法制备复合脂质体，最后通过膜挤出法调节脂质体粒径大小。通过本发明制备的脂质体具有良好的稳定性、生物相容性。本发明还涉及鱼头来源的脂质制备的脂质体在神经保护中的应用，能够保护神经细胞免受氧化损伤，可用于制备预防或治疗阿尔茨海默症的药物。通过本发明回收利用了鱼头，获得了高附加值产物。
Description
技术领域
本发明涉及功能性脂质体制备技术领域，具体涉及一种具有神经保护作用的脂质体及其制备方法与应用。
背景技术
脂质体是一种由磷脂分子构成的人工囊泡，具有良好的生物相容性，可用作多种药物及生理活性物质的载体。构成脂质体的主要成分是磷脂和其他脂类化合物，脂质体的性质与其制备方法、壁材组成密切相关。
糖脂是一类含有糖基的脂类物质的总称，不仅是重要的脂肪酸来源，而且具备抗氧化、抗炎等多种生理活性。糖脂分子中含有疏水性的脂肪酸链和亲水性的糖基，与磷脂结构类似，是脂质体壁材的理想制备材料。
我国是鱼类养殖大国，其中鱼身具有较高的经济价值，但鱼头鱼骨在加工往往被废弃或得不到很好地利用。鱼头中富含各种脂质，包括DHA和EPA在内的多不饱和脂肪酸以及磷脂、糖脂等功能性脂类。鱼头为原料制备脂质体可以将其附加工产物进行高值化转化。但是，目前本领域尚未查到有使用鱼头脂质进行脂质体制备。
因此，需要开发一种从鱼头中提取脂质并制备脂质体的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有神经保护作用的脂质体及其制备方法与应用。通过本发明制备的脂质体具有良好的稳定性、生物相容性。本发明还涉及鱼头来源的脂质制备的脂质体在神经保护中的应用，可用于制备保护神经细胞免受氧化损伤的药物，可用于制备预防或治疗阿尔茨海默症的药物。通过本发明回收利用了鱼头，获得了高附加值产物。
一种具有神经保护作用脂质体，以鱼头为原料提取脂质体制得。该脂质体制备主要包括以下步骤：将鱼头预处理后提取总脂，再分离得到磷脂和糖脂，然后使用乙醇注入法制备复合脂质体，最后通过膜挤出法调节脂质体粒径大小。
本发明脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，鱼头预处理
新鲜鱼头洗净打碎后再用无水乙醇超声萃取，将乙醇粗提液进行抽滤，蒸发除去溶剂后获得乙醇提取物。
步骤2，鱼头总脂的粗提取
鱼头乙醇提取物经萃取、盐析后，真空旋转蒸发浓缩，获得鱼头总脂。
步骤3，鱼头磷脂和糖脂的分离
将鱼头总脂经硅胶柱层析分离、洗脱后干燥得到磷脂和糖脂。
步骤4，乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体
将步骤3中获得的磷脂与糖脂混合，添加其他辅料后采用乙醇注入法制备脂质体。
步骤5，膜挤出法调节脂质体粒径大小
将步骤4中获得的脂质体依次通过脂质体挤出器获得粒径可控的脂质体。
进一步地，本发明脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼头预处理：
取新鲜鱼头去鳃、脸肉后清洗、去杂；将鱼头打碎，离心后，收集下层鱼头浆并称重；在鱼头浆加入无水乙醇，进行超声处理，抽滤，收集乙醇提取液；将乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物；
(2)鱼头总脂的粗提取：
取步骤(1)获得的乙醇粗提物，加入氯仿、甲醇和蒸馏水，充分混匀后，离心，收集下层有机相，将下层有机相与0.5-1.5％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀后于再次离心，弃去上层获得下层有机相；将有机相减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂；
(3)鱼头磷脂和糖脂的分离：
将步骤(2)获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离；洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为70-80mL/min，进样量15-20mL，进样浓度20-30mg/mL，收集甲醇和乙醇洗脱液旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂；
(4)乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体：
按重量份计，取步骤(3)获得的鱼头磷脂1份，加入鱼头糖脂0-1份，混合后，即得混合脂质，向混合脂质中加入胆固醇0.08-0.12份，无水乙醇3-5份，在45-55℃下水浴加热并搅拌溶解；另取质量为混合脂质重量8-12倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.1-0.5g/L，混合均匀，得到混合脂质溶液；将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌10-30min，混合均匀；在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液；
(5)膜挤出法调节脂质体粒径大小：
取步骤(4)获得的脂质体溶液，依次通过聚碳酸酯膜的脂质体挤出器，获得目标粒径的脂质体。
进一步的，步骤(1)中，所述超声处理具体操作为：在鱼头浆中以固液比kg/L1：3-5加入无水乙醇，20-30℃、35-45kHz、60-80W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1-2h，合并乙醇提取液。
进一步的，步骤(1)中，所述离心具体操作为：在3-5℃下4000-5000r/min离心15-20min。
进一步的，步骤(2)中，按重量份计，乙醇粗提物1份，加入2-3份氯仿、1-2份甲醇和0.8-1.2份蒸馏水。
进一步的，步骤(2)中，所述离心具体操作为：在20-30℃下4000-6000r/min离心10-20min；所述震荡的时间为0.8-1.2min；所述减压浓缩温度为40-50℃。
进一步的，步骤(3)中，所述洗脱的检测波长205nm，监测波长210nm。
进一步的，步骤(4)中，所述水浴加热的温度为45-55℃。
进一步地，本发明脂质体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，鱼头预处理
取新鲜鱼头去鳃、脸肉后用清水反复冲洗以去尽杂质和血水。将鱼头打碎，在4℃下4000-5000r/min离心15-20min后弃上层油层和血水，收集下层鱼头浆并称重。在鱼头浆中以固液比kg/L1：3-5加入无水乙醇，25℃、40kHz、60-80W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1.5h，合并乙醇提取液。将合并后的乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物。
步骤2，鱼头总脂的粗提取
按重量份计，取步骤1获得的乙醇粗提物1份，加入2-3份氯仿、1-2份甲醇和1份蒸馏水，充分混匀后，在25℃下4000-6000r/min离心10-20min，收集下层有机相，将下层有机相与0.5-1.5％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀1min后于再次离心，弃去上层获得下层有机相。将有机相在45℃下减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂。
步骤3，鱼头磷脂和糖脂的分离
将步骤2获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离。洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为70-80mL/min，进样量15-20mL，进样浓度20-30mg/mL，检测波长205nm，监测波长210nm。收集甲醇和乙醇洗脱液于45℃旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂。
步骤4，乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体
按重量份计，取步骤3获得的鱼头磷脂1份，加入鱼头糖脂0-1份，混合后，即得混合脂质，向混合脂质中加入胆固醇0.08-0.12份，无水乙醇3-5份，在50℃下水浴加热并搅拌溶解。另取质量为混合脂质重量8-12倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.1-0.5g/L，混合均匀，得到混合脂质溶液。将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌10-30min，混合均匀。在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液。
步骤5，膜挤出法调节脂质体粒径大小
取步骤4获得的脂质体溶液1-2mL，依次通过聚碳酸酯膜孔径为1000nm、400nm、200nm和\或100nm的脂质体挤出器，获得粒径不同的脂质体。
本发明任一项所述的脂质体在制备神经保护药物中的应用。
本发明任一项所述的脂质体在制备具有预防或治疗阿尔茨海默症疾病功能药物的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用鱼加工后的废弃物—鱼头为主要原料制备出稳定性较好的脂质体，所制备的脂质体具有良好的生物相容性且粒径可控。同时，所制备的脂质体还具有保护神经细胞的作用，可降低神经细胞受到的氧化损伤，此脂质体可以用于制备预防或治疗阿尔茨海默症等与神经系统氧化损伤有关疾病的药物。通过本发明回收利用了鱼头，获得了高附加值产物。
附图说明
图1是本发明的方法流程图；
图2是鱼头磷脂与糖脂的薄层色谱图；
图3是脂质体的粒径；
图4是脂质体的zeta电位；
图5是脂质体对H2O2诱导的PC12细胞存活率的影响；
图6是脂质体对H2O2诱导的PC12细胞MDA释放量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种鱼头脂质制备的脂质体的制备方法，如图1所示，具体按以下步骤实施：
步骤1，鱼头预处理
取新鲜鱼头去鳃、脸肉后用清水反复冲洗以去尽杂质和血水。将鱼头打碎，在4℃下4000-5000r/min离心15-20min后弃上层油层和血水，收集下层鱼头浆并称重。在鱼头浆中以固液比kg/L1：3-5加入无水乙醇，25℃、40kHz、60-80W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1.5h，合并乙醇提取液。将合并后的乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物。
步骤2，鱼头总脂的粗提取
按重量份计，取步骤1获得的乙醇粗提物1份，加入2-3份氯仿、1-2份甲醇和1份蒸馏水，充分混匀后，在25℃下4000-6000r/min离心10-20min，收集下层有机相，将下层有机相与0.5-1.5％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀1min后于再次离心，弃去上层获得下层有机相。将有机相在45℃下减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂。
步骤3，鱼头磷脂和糖脂的分离
将步骤2获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离。洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为70-80mL/min，进样量15-20mL，进样浓度20-30mg/mL，检测波长205nm，监测波长210nm。收集甲醇和乙醇洗脱液于45℃旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂。
步骤4，乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体
按重量份计，取步骤3获得的鱼头磷脂1份，加入鱼头糖脂0-1份，混合后，即得混合脂质，向混合脂质中加入胆固醇0.08-0.12份，无水乙醇3-5份，在50℃下水浴加热并搅拌溶解。另取质量为混合脂质重量8-12倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.1-0.5g/L，混合均匀，得到混合脂质溶液。将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌10-30min，混合均匀。在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液。
步骤5，膜挤出法调节脂质体粒径大小
取步骤4获得的脂质体溶液1-2mL，依次通过聚碳酸酯膜孔径为1000nm、400nm、200nm和\或100nm的脂质体挤出器，获得粒径不同的脂质体。
实施例1
步骤1，鱼头预处理
取新鲜罗非鱼头去鳃、脸肉后用清水反复冲洗以去尽杂质和血水。将鱼头打碎，在4℃下4000r/min离心15min后弃上层油层和血水，收集下层鱼头浆并称重。在鱼头浆中以固液比kg/L1：5加入无水乙醇，25℃、40kHz、80W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1.5h，合并乙醇提取液。将合并后的乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物。
步骤2，鱼头总脂的粗提取
按重量份计，取步骤1获得的乙醇粗提物1份，加入3份氯仿、1.5份甲醇和1份蒸馏水，充分混匀后，在25℃下4000r/min离心10min，收集下层有机相，将下层有机相与0.9％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀1min后于再次离心，弃去上层获得下层有机相。将有机相在45℃下减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂。
步骤3，鱼头磷脂和糖脂的分离
将步骤2获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离。洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为70mL/min，进样量15mL，进样浓度20mg/mL，检测波长205nm，监测波长210nm。收集甲醇和乙醇洗脱液于45℃旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂。
步骤4，乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体
按重量份计，取步骤3获得的鱼头磷脂1份，向鱼头磷脂中加入胆固醇0.1份，无水乙醇3份，在50℃下水浴加热并搅拌溶解。另取质量为鱼头磷脂重量10倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.15g/L，混合均匀，得到混合脂质溶液。将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌10min，混合均匀。在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液。
步骤5，膜挤出法调节脂质体粒径大小
取步骤4获得的脂质体溶液1mL，依次通过聚碳酸酯膜孔径大小为1000nm，400nm，200nm，100nm的脂质体挤出器，获得脂质体。
实施例2
步骤1，鱼头预处理
取新鲜罗非鱼头去鳃、脸肉后用清水反复冲洗以去尽杂质和血水。将鱼头打碎，在4℃下5000r/min离心20min后弃上层油层和血水，收集下层鱼头浆并称重。在鱼头浆中以固液比kg/L1：3加入无水乙醇，25℃、40kHz、60W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1.5h，合并乙醇提取液。将合并后的乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物。
步骤2，鱼头总脂的粗提取
按重量份计，取步骤1获得的乙醇粗提物1份，加入2份氯仿、2份甲醇和1份蒸馏水，充分混匀后，在25℃下6000r/min离心20min，收集下层有机相，将下层有机相与0.5％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀1min后于再次离心，弃去上层获得下层有机相。将有机相在45℃下减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂。
步骤3，鱼头磷脂和糖脂的分离
将步骤2获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离。洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为80mL/min，进样量20mL，进样浓度20mg/mL，检测波长205nm，监测波长210nm。收集甲醇和乙醇洗脱液于45℃旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂。
步骤4，乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体
按重量份计，取步骤3获得的鱼头磷脂1份，加入鱼头糖脂1份，混合，即得混合脂质，向混合脂质中加入胆固醇0.08份，无水乙醇4份，在50℃下水浴加热并搅拌溶解。另取质量为混合脂质重量8倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.2g/L，混合均匀。将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌15min，混合均匀，得到混合脂质溶液。在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液。
步骤5，膜挤出法调节脂质体粒径大小
取步骤4获得的脂质体溶液1.5mL，依次通过聚碳酸酯膜孔径大小为1000nm，400nm，200nm，100nm的脂质体挤出器，获得脂质体。
实施例3
步骤1，鱼头预处理
取新鲜金鲳鱼头去鳃、脸肉后用清水反复冲洗以去尽杂质和血水。将鱼头打碎，在4℃下5000r/min离心17min后弃上层油层和血水，收集下层鱼头浆并称重。在鱼头浆中以固液比kg/L1：4加入无水乙醇，25℃、40kHz、70W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1.5h，合并乙醇提取液。将合并后的乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物。
步骤2，鱼头总脂的粗提取
按重量份计，取步骤1获得的乙醇粗提物1份，加入2份氯仿、1份甲醇和1份蒸馏水，充分混匀后，在25℃下5000r/min离心17min，收集下层有机相，将下层有机相与1％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀1min后于再次离心，弃去上层获得下层有机相。将有机相在45℃下减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂。
步骤3，鱼头磷脂和糖脂的分离
将步骤2获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离。洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为70mL/min，进样量15mL，进样浓度20mg/mL，检测波长205nm，监测波长210nm。收集甲醇和乙醇洗脱液于45℃旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂。
步骤4，乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体
按重量份计，取步骤3获得的鱼头磷脂1份，加入鱼头糖脂1份，混合，即得混合脂质，向混合脂质中加入胆固醇0.08份，无水乙醇3份，在50℃下水浴加热并搅拌溶解。另取质量为混合脂质重量12倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.2g/L，混合均匀，得到混合脂质溶液。将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌5min，混合均匀。在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液。
步骤5，膜挤出法调节脂质体粒径大小
取步骤4获得的脂质体溶液2mL，依次通过聚碳酸酯膜孔径大小为1000nm，200nm的脂质体挤出器，获得脂质体。
一、对实施例1和实施例2中制备得到的鱼头脂质体进行粒径分析，结果如图3所示。结果显示实施例1和实施例2脂质体平均粒径分别为84.72±0.80nm和97.72±1.31nm，均获得了理想的单峰分布，粒径均小于100nm，分散度较好。
二、对实施例1和实施例2中制备得到的鱼头脂质体进行zeta电位分析，结果如图4所示，实施例1和实施例2脂质体电位分别为-24.47±2.15mV和-45.83±1.55mV，脂质体稳定性较好。
三、实施例1和实施例2中脂质体对H2O2诱导的神经元样PC12细胞氧化损伤的抑制作用测定：取对数生长期的PC12细胞以3×104/mL密度接种于96孔，每孔100μL，在37℃含5％CO2下培养24h。每孔加入实施例1或实施例2中脂质体(25、50、100、200μg/mL)培养48h，再给予H2O2(350μM)刺激4h，最后加入MTT溶液(5mg/mL)20μL放入培养箱中继续培养，4h后吸走各个孔中的液体，加入DMSO(120μL/孔)，37℃下振荡混匀10min，用酶标仪于490nm波长处测定其吸光度。计算细胞生存率，重复三次。
实验结果如图5所示，脂质体对350μM H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤均有保护作用，且呈剂量依赖，，能够显著提高细胞存活率，可用于阿尔茨海默症的预防与治疗。
四、实施例1和实施例2对H2O2诱导的神经元样PC12细胞丙二醛(MDA)释放量：取对数生长期的PC12细胞以3×104/mL密度接种于6孔，每孔2.5mL，在37℃含5％CO2下培养24h。每孔加入实施例1或实施例2中脂质体(50μg/mL)培养48h，再给予H2O2(350μM)刺激4h。结束后用细胞裂解液处理后，12000g离心收集上清液，用BCA法测定蛋白浓度，用试剂盒测定MDA释放量。
实验结果如图6所示，与H2O2损伤组相比能显著降低氧化损伤细胞中MDA的释放，因此可以证明脂质体可以进入到细胞内，表现出明显抗脂质氧化活性。
综上所述，本发明方法可以制备出一种新型脂质体，稳定性好，能够很好地被细胞摄取，且能够保护神经细胞免受氧化损伤，可应用于制备神经保护药物中的应用，进一步地，可应用于制备具有预防或治疗阿尔茨海默症疾病功能药物的应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，并非对本发明做任何形式上的限制，在不脱离本发明的精神和原则的前提下，依本发明权利要求所作的等同变化，这些均应该包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种具有神经保护作用脂质体，其特征在于，以鱼头为原料提取脂质体制得。
2.根据权利要求1所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鱼头预处理：
取新鲜鱼头去鳃、脸肉后清洗、去杂；将鱼头打碎，离心后，收集下层鱼头浆并称重；在鱼头浆加入无水乙醇，进行超声处理，抽滤，收集乙醇提取液；将乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物；
(2)鱼头总脂的粗提取：
取步骤(1)获得的乙醇粗提物，加入氯仿、甲醇和蒸馏水，充分混匀后，离心，收集下层有机相，将下层有机相与0.5-1.5％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀后于再次离心，弃去上层获得下层有机相；将有机相减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂；
(3)鱼头磷脂和糖脂的分离：
将步骤(2)获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离；洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为70-80mL/min，进样量15-20mL，进样浓度20-30mg/mL，收集甲醇和乙醇洗脱液旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂；
(4)乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体：
按重量份计，取步骤(3)获得的鱼头磷脂1份，加入鱼头糖脂0-1份，混合后，即得混合脂质，向混合脂质中加入胆固醇0.08-0.12份，无水乙醇3-5份，在45-55℃下水浴加热并搅拌溶解；另取质量为混合脂质重量8-12倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.1-0.5g/L，混合均匀，得到混合脂质溶液；将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌10-30min，混合均匀；在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液；
(5)膜挤出法调节脂质体粒径大小：
取步骤(4)获得的脂质体溶液，依次通过聚碳酸酯膜的脂质体挤出器，获得目标粒径的脂质体。
3.根据权利要求2所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声处理具体操作为：在鱼头浆中以固液比kg/L1：3-5加入无水乙醇，20-30℃、35-45kHz、60-80W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1-2h，合并乙醇提取液。
4.根据权利要求2所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心具体操作为：在3-5℃下4000-5000r/min离心15-20min。
5.根据权利要求2所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，按重量份计，乙醇粗提物1份，加入2-3份氯仿、1-2份甲醇和0.8-1.2份蒸馏水。
6.根据权利要求2所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心具体操作为：在20-30℃下4000-6000r/min离心10-20min；所述震荡的时间为0.8-1.2min；所述减压浓缩温度为40-50℃。
7.根据权利要求2所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述洗脱的检测波长205nm，监测波长210nm。
8.根据权利要求2所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述水浴加热的温度为45-55℃。
9.根据权利要求2所述的具有神经保护作用脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)鱼头预处理：
取新鲜鱼头去鳃、脸肉后用清水反复冲洗以去尽杂质和血水；将鱼头打碎，在4℃下4000-5000r/min离心15-20min后弃上层油层和血水，收集下层鱼头浆并称重；在鱼头浆中以固液比kg/L1：3-5加入无水乙醇，25℃、40kHz、60-80W超声功率下进行超声处理，抽滤得到鱼头渣和乙醇提取液，向鱼头渣中继续加入无水乙醇超声处理，超声处理共重复三次，每次1.5h，合并乙醇提取液；将合并后的乙醇提取液减压蒸发浓缩后获得乙醇粗提物；
(2)鱼头总脂的粗提取：
按重量份计，取步骤1获得的乙醇粗提物1份，加入2-3份氯仿、1-2份甲醇和1份蒸馏水，充分混匀后，在25℃下4000-6000r/min离心10-20min，收集下层有机相，将下层有机相与0.5-1.5％(w/v)NaCl溶液混合，震荡混匀1min后于再次离心，弃去上层获得下层有机相；将有机相在45℃下减压浓缩至浸膏状，获得鱼头总脂；
(3)鱼头磷脂和糖脂的分离：
将步骤2获得的鱼头总脂用氯仿溶解，经中压纯化与制备硅胶色谱柱分离；洗脱条件如下：梯度洗脱流动相A依次分别为氯仿、丙酮和甲醇，流动相B为乙醇，洗脱流速为70-80mL/min，进样量15-20mL，进样浓度20-30mg/mL，检测波长205nm，监测波长210nm；收集甲醇和乙醇洗脱液于45℃旋转蒸发浓缩至浸膏状，然后用氮气吹干分别得到鱼头中性脂、磷脂和糖脂；
(4)乙醇注入法制备鱼头磷/糖脂复合脂质体：
按重量份计，取步骤3获得的鱼头磷脂1份，加入鱼头糖脂0-1份，混合后，即得混合脂质，向混合脂质中加入胆固醇0.08-0.12份，无水乙醇3-5份，在50℃下水浴加热并搅拌溶解；另取质量为混合脂质重量8-12倍的磷酸盐缓冲液，加入吐温-80至浓度为0.1-0.5g/L，混合均匀，得到混合脂质溶液；将混合脂质溶液用微量注入器缓慢注入缓冲液中，搅拌10-30min，混合均匀；在40℃下减压旋蒸，除去残留乙醇，得到脂质体溶液；
(5)膜挤出法调节脂质体粒径大小：
取步骤4获得的脂质体溶液1-2mL，依次通过聚碳酸酯膜孔径为1000nm、400nm、200nm和\或100nm的脂质体挤出器，获得粒径不同的脂质体。
10.权利要求1-8任一项所述的脂质体在制备神经保护药物中的应用。
11.权利要求1-8任一项所述的脂质体在制备具有预防或治疗阿尔茨海默症疾病功能药物的应用。
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Citations (2)
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| CN105601666A (zh) * | 2016-01-12 | 2016-05-25 | 武汉轻工大学 | 一种从鲢鱼鱼头中提取磷脂的方法及其产品 |
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Patent Citations (2)
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