CN114423788B

CN114423788B - 抗nrp1a抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途

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Publication number: CN114423788B
Application number: CN202080066882.5A
Authority: CN
Inventors: N·齐佩尔; P·古普塔; 韩飞; Y·黄; S·露; J·普雷斯特尔; L·托马斯
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2019-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2025-04-01
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: AU2020355599A1; US20230416378A1; MX2022003544A; JP2022549005A; CN114423788A; TW202126685A; CO2022003324A2; PH12022550619A1; IL291522A; BR112022005024A2; US20210087282A1; JP7691976B2; SA522432069B1; US11661458B2; CA3154654A1; KR20220069076A; DOP2022000059A; EP4034161A1; JOP20220074A1; WO2021058636A1

Abstract

本发明涉及靶向神经纤毛蛋白‑1的A域(Nrp1A)的抗体及其片段。更具体地，本发明公开抗Nrp1A抗体及用于治疗各种疾病或病症的使用方法。

Description

抗NRP1A抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途

技术领域

本发明大体上涉及靶向神经纤毛蛋白1(Nrp1)，更精确而言Nrp1的A域(Nrp1A)的抗体及其片段。更具体地，公开抗Nrp1A抗体及用于治疗各种疾病或病症的使用方法。还公开包含抗Nrp1A抗体的药物组合物。

现有技术

糖尿病性视网膜病为糖尿病的最致衰弱并发症之一。尽管在理解此疾病的发病机制及当前疗法的功效方面取得重大进展，但糖尿病性视网膜病仍为工作年龄人当中新发作失明的主要原因。

糖尿病性视网膜病的特征为血管、胶质及神经元层级上出现异常发展。血管并发症之一为引起视网膜缺血的较小毛细血管减少。缺血性视网膜病的特征在于视网膜血管的减少或功能障碍，其导致血流减少及缺氧。毛细管压差通常在凹陷无血管区域(FAZ)周围体现，从而扩展其大小，这是称作糖尿病性黄斑缺血(DMI)的病状。视网膜缺血导致促血管生成生长因子及血管排斥(vasorepulsion)因子同时上调，从而引起误导血管生成。不会出现缺血性视网膜的血管再生，而玻璃体(通常不含血管的眼睛区域)中存在稳固的病理性新血管生成。增生性视网膜病的这些异常新血管的生长会产生对视力的大多数威胁，这是因为所述血管可能渗漏、导致出血或导致疤痕，可能最终引起视网膜脱落。当前用于增生性视网膜病的治疗试图破坏现有病理性血管，但不能解决驱动其生长的根本性缺血。当前，用于增生性视网膜病的标准治疗涉及通过激光损坏一部分视网膜以试图停止新血管生长并保护中央视觉。然而，这些治疗在一定程度上是低效的。尽管一些患者可能维持稳定的视力许多年，但高比例的患有视网膜病的患者最终遭受全部视觉丧失。

视网膜病变也可能以视网膜血管渗漏增加导致黄斑水肿为特征。当前，患有糖尿病黄斑水肿的患者用靶向血管内皮生长因子A(VEGF-A)的化合物进行治疗，该血管内皮生长因子A是驱动血管生成及血管渗透性两者的生长因子。此治疗策略可能被证明不足以用于治疗患有黄斑缺血及黄斑水肿两者的患者。

因此仍需要用于治疗可受益于VEGF-A的促血管生成特性的患者，特别是患有黄斑缺血及黄斑水肿两者的患者的治疗性方法。因此，仍需要用于高效治疗眼或视网膜疾病的新型治疗方法。

发明内容

神经纤毛蛋白(NRP)是作为轴突导向因子的3类信号蛋白家族(SEMA)的成员及血管生成因子的血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员的受体在神经元及血管系统产生中起重要作用的跨膜糖蛋白受体。已识别两种神经纤毛蛋白，神经纤毛蛋白-1(Nrp-1)及神经纤毛蛋白-2(Nrp-2)。其胞外区含有三个域：两个CUB同源性域(Nrp1的A域，本文中也称为“Nrp1A”)作为Sema3配体结合域，两个凝血因子V/VIII同源性域(Nrp1的B域，本文中也称为“Nrp1B”)作为VEGF结合域，及参与Nrp-1二聚合的MAM域(c)。Nrp-1可结合VEGF-A165、VEGF-B、VEGF-E、PlGF、Sema3A、Sema3B及Sema3C，而Nrp2结合VEGF-A165、VEGF-A145、VEGF-C、VEGF-D、SEMA3B、Sema3C、Sema3F及Sema3G。VEGF配体的结合位点已定位于Nrp1的B域上，而信号蛋白的结合已定位于Nrp1的A域上。

人类Nrp1的序列可在在线获得，Nrp1同功异型物A前驱体描绘于SEQ ID NO:26中且可在参考蛋白质序列NP_003864下获得。已关于肿瘤血管生成及转移研究Nrp1数年，但仍未完全理解其对于视网膜血管再生及新血管生成的作用。本发明人在此表明，靶向Nrp1，特别是Nrp1的A-结构域，是治疗眼睛和视网膜疾病的一个非常有效的策略。

在第一方面中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区；及

-包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列的重链可变区；及

-包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列的轻链可变区。

-包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列的轻链可变区；

其中：

-重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；且

-轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在又一实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区；及

-包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.分别包含SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

b.分别包含SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

c.分别包含SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

d.分别包含SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

e.分别包含SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；

f.分别包含SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链；或

g.分别包含SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:11的氨基酸序列的可变重链及可变轻链。

-包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列，优选地由其组成的重链；及

-包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选地由其组成的轻链。

在一特定实施方案中，本发明涉及一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链；

b.包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链；

c.包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链；

d.包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链；

e.包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链；

f.包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链；或

g.包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

在一特别优选的实施方案中，抗Nrp1A抗体为人源化抗Nrp1A抗体。

在第二方面中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其结合于如SEQID NO:26中所描绘的人类Nrp1的氨基酸区域68至77内的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其结合于如SEQ ID NO:26中所示的氨基酸区域内的至少一个氨基酸残基。在一优选实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其结合如SEQ ID NO:27中所示的氨基酸区域。

在第三方面中，本发明提供一种用作药物的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A或抗原结合片段，其用于抑制Sema3A的血管排斥作用和/或用于改善视网膜的血管再生。在另一实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A或抗原结合片段，其用于抑制由Sema3A诱导的血液视网膜屏障(BRB)的渗透性及用于抑制由VEGF，优选地VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。.

在另一实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A或抗原结合片段，其用于：

-将血管生成重引导至缺血性区域以改善视网膜的血管再生；

-预防玻璃体区域的病理性新血管生成；

-预防由Sema3A诱导的血液视网膜屏障破坏；及

-预防由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障破坏。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其用于治疗或预防视网膜或眼疾病。

在另一实施方案中，本发明涉及一种用于治疗一种或多种视网膜或眼疾病的方法，该方法包括根据有需要的患者来施用药学上有效量的抗体或抗原结合片段。

在第四方面中，本发明提供一种用于治疗或预防疾病的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，该疾病选自由以下组成的群：视网膜病；增生性视网膜病(PR)，诸如早产儿视网膜病、缺血性视网膜病；糖尿病性视网膜病(DR)，包括增生性糖尿病性视网膜病(PDR)及非增生性糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性黄斑缺血(DMI)；年龄相关的黄斑变性；色素性视网膜炎；遗传性视网膜营养不良；近视退化；视网膜静脉闭塞；视网膜动脉闭塞；眼内炎；葡萄膜炎；囊样黄斑水肿；继发于任何视网膜疾病的脉络膜新血管生成性膜；视神经神经病变；青光眼；视网膜脱落；毒性视网膜病；辐射性视网膜病；创伤性视网膜病；药物诱导的视网膜血管病变；视网膜新血管生成；息肉状脉络膜血管病变；视网膜血管炎；视网膜微动脉瘤；富克斯氏营养不良(Fuch's dystrophy)；黄斑毛细管扩张；尤塞氏综合征(usher syndrome)及斯特格氏病(Stargardt disease)。

在另一实施方案中，本发明提供一种用于治疗或预防疾病的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，该疾病选自由以下组成的群：糖尿病性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病及非增生性糖尿病性视网膜病；缺血性视网膜病；糖尿病性黄斑水肿；糖尿病性黄斑缺血；年龄相关的黄斑水肿；视网膜新血管生成；青光眼及脉络膜新血管生成。优选地，该疾病为糖尿病性黄斑水肿和/或糖尿病性黄斑缺血。

在一优选实施方案中，本发明提供一种用于治疗糖尿病性黄斑缺血的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其通过促进缺血性视网膜内的血管再生(血管再生成)且减少眼睛的玻璃体区域的病理性新血管生成。在一个实施方案中，根据本发明的抗体并不抑制由VEGF，优选地VEGF-A诱导的血管生成。

在另一优选实施方案中，本发明提供一种用于治疗糖尿病性黄斑水肿的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其通过减小，优选地预防由Sema3A诱导的血液视网膜屏障的渗透性且通过减小，优选地预防由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。

在第五方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载剂。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段或一种包含抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段通过非经肠施用途径、静脉内施用途径、玻璃体内施用途径或皮下施用途径，优选地通过玻璃体内途径施用。

在第六方面中，本发明提供一种或多种分离的多核苷酸，其包含：

-编码如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中所展示的重链或如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中所展示的重链可变区的序列；及

-编码如SEQ ID NO:19中所展示的轻链或如SEQ ID NO:11中所展示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种包含一种或多种分离的多核苷酸的表达载体，该一种或多种分离的多核苷酸包含编码如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中所展示的重链或如SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中所展示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:19中所展示的轻链或如SEQ ID NO:11中所展示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种包含一种或多种分离的多核苷酸的病毒载体，该一种或多种分离的多核苷酸包含编码如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中所展示的重链或如SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中所展示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:19中所展示的轻链或如SEQ ID NO:11中所展示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种包含表达载体或一种或多种分离的多核苷酸的宿主细胞，该一种或多种分离的多核苷酸包含编码如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中所展示的重链或如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中所展示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:19中所展示的轻链或如SEQ ID NO:11中所展示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于制造抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括获得包含表达载体或一种或多种分离的多核苷酸的宿主细胞；及培养该宿主细胞，该一种或多种分离的多核苷酸包含编码如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中所展示的重链或如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中所展示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:19中所展示的轻链或如SEQ ID NO:11中所展示的轻链可变区的序列。

在一个实施方案中，用于制造抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的方法进一步包含回收且纯化抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。

附图说明

图1：Sema3A在人眼中的定位

此图式展示与年龄匹配对照(Age ctrl)及患有糖尿病但无眼部病变的个体(DMctrl)相比，来自具有糖尿病性视网膜病或原发性开角型青光眼(POAG)病史的人类供体的预定视网膜样本中的Sema3A在人眼中的定位。在视网膜血管的血管结构壁中发现Sema3A。另外，在视网膜神经节细胞层中观察到未识别但独特的Sema3A荧光目标。

图2：抑制VEGF介导的作用-棕色挪威大鼠(Brown Norway rats)的视网膜中VEGF-A诱导的渗透性

视网膜伊凡氏蓝(Evans Blue)荧光用作渗透性的读出以评估血管渗漏。玻璃体内注射VEGF-A诱导视网膜的高渗透性。类似于VEGF捕获剂(阿柏西普(aflibercept))，结合于Nrp1的A域的本发明的抗体抑制VEGF-A诱导的视网膜渗透性。针对Nrp1配体信号蛋白3A的抗体(Sema3A抗体)并不抑制视网膜中VEGF-A诱导的渗透性。

图3：本发明的抗体及抗VEGF治疗对于小鼠OIR模型中的尖端细胞密度、无血管区及视网膜前簇(tuft)的作用

在小鼠幼畜的氧诱导视网膜病模型中研究尖端细胞密度、无血管区及视网膜前新血管生成(簇)。动物暴露于P7至P12的75％氧气且在P12返回常氧之后接受单一玻璃体内注射的抗体。对照抗体为针对三硝基苯酚。在P17时，视网膜平铺片(flatmount)经制备，用同工凝集素B4染色且用于计数尖端细胞及测定视网膜无血管区的大小。结合于Nrp1的A域的本发明的抗体增大尖端细胞密度且减小无血管区，然而VEGF捕获剂阿柏西普并未如此(3A、3C)。尖端细胞密度与无血管区之间的相关性展示于(3B)中。对侧眼用于眼杯的组织学分段且对视网膜前细胞核进行计数。阿柏西普相较于本发明的抗体更强地抑制视网膜前新血管生成(3D)。

图4：本发明的抗体与VEGF及Nrp1的结合

使用生物膜层干涉测量术(Bio-Layer Interferometry；BLI)完成在生物素标记的人类血管内皮生长因子-165(hVEGF165)存在下本发明的抗体与人类Nrp1(hNrp1)的结合。将生物素标记的hVEGF165捕获于链霉亲和素传感器尖端上。洗涤传感器尖端之后，经由hVEGF165捕获100nM人类Nrp1。最后，将传感器浸渍至不同浓度的本发明的抗体(100nM及400nM)中以查看是否观察到结合。图式证实hNrp1结合于生物素标记的hVEGF165。图式进一步展示在此相互作用之后，本发明的抗体仍能够结合于hNrp1，甚至在其同时结合于hVEGF165时。此指示本发明的抗体并不预防VEGF与人类Nrp1的结合。

图5：VEGF-A诱导的内皮细胞增殖

使用Incucyte系统(Sartorius)研究人类视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)中的内皮细胞增殖。在此功能性分析中，将重组VEGF-A蛋白质添加至HRMEC的亚汇合层来诱导其增殖。本发明的抗体并不预防由VEGF-A诱导的内皮细胞增殖，而VEGF捕获剂阿柏西普展示VEGF-A诱导的HRMEC增殖的剂量依赖型减小。

图6：VEGF-A诱导的内皮细胞网络形成分析

在内皮细胞/纤维母细胞共培养中在网络形成分析中评估体外血管生成。在此功能性分析中，VEGF-A诱导内皮细胞网络形成于纤维母细胞的汇合层的顶部上。本发明的例示性抗体及VEGF捕获剂(贝伐珠单抗(bevacizumab)，)的功效及效能(IC50)经评估为预防10ng/mL VEGF-A诱导的网络形成。本发明的抗体并不预防由VEGF-A诱导的内皮细胞网络形成，而VEGF捕获剂(贝伐珠单抗，)展示VEGF-A诱导的网络形成的剂量依赖型减小。

图7：棕色挪威大鼠在眼部激光光凝之后的脉络膜新血管生成性病变面积

动物已在第1天及第8天接受两次玻璃体内注射的IgG对照抗体(109微克/眼(μg/eye))、本发明的抗体(低剂量54.5毫克/眼(mg/eye)；高剂量109微克/眼)或VEGF捕获剂(200微克/眼)。在第1天紧接在第一次玻璃体内注射之前执行激光光凝。在第15天通过同工凝集素B4染色RPE/脉络膜/巩膜平铺片来分析病变面积。数据为均值±SEM。通过不成对的双侧t检定进行统计分析(****，p<0.0001)。

具体实施方式

定义

抗体或免疫球蛋白的通用结构为本领域技术人员所熟知，这些分子为通常约150,000道尔顿的由两条相同轻(L)链及两条相同重(H)链构成的杂四聚糖蛋白。每一轻链通过一个二硫键共价连接至重链以形成杂二聚体，且杂三聚分子经由杂二聚体的两个相同重链之间的共价二硫键形成。尽管所述轻链及重链通过一个二硫键连接在一起，但两个重链之间的二硫键数目因免疫球蛋白同种型而不同。每一重链及轻链亦具有规律地间隔开的链内二硫桥键。每一重链在氨基末端具有可变域(V_H＝可变重链)，随后为三个或四个恒定域(C_H1、C_H2、C_H3及C_H4)以及C_H1与C_H2之间的铰链区。每一轻链具有两个域，氨基端可变域(V_L＝可变轻链)及羧基端恒定域(C_L)。V_L域非共价缔合V_H域，而C_L域通常经由二硫键共价连接至C_H1域。特定氨基酸残基被认为在轻链可变域与重链可变域之间形成界面(Chothia等人,1985,J.Mol.Biol.186:651-663)。

亦即，不同抗体之间极不同的可变域内的某些域为“高变的”。这些高变域含有直接参与每一特定抗体与其特异性抗原决定子的结合及特异性的残基。轻链可变域及重链可变域中的高变性集中于三个称为互补决定区(CDR)或高变环(HVL)的区段中。CDR通过Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.中的序列比较进行定义，而HVL在结构上根据可变域的三维结构进行定义，如Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917所描述。在这些两种方法导致CDR的略不同标识的情况下，结构性定义是优选的。如Kabat所定义，在轻链可变域中，CDR-L1位于约残基24-34处，CDR-L2位于约残基50-56处，且CDR-L3位于约残基89-97处；在重链可变域中，CDR-H1位于约残基31-35处，CDR-H2位于约残基50-65处，且CDR-H3位于约残基95-102处。因此，重链及轻链的CDR1、CDR2、CDR3定义对既定抗体具有特异性的特有及功能特性。

重链及轻链中的每一者内的三个CDR通过构架区(FR)分隔开，该构架区含有往往不太可能改变的序列。自重链可变域及轻链可变域的氨基端至羧基端，FR及CDR按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR的主要β片构型使各链内的CDR彼此紧密靠近以及紧密靠近来自另一链的CDR。所得构象有助于抗原结合位点(参见Kabat等人,1991,NIH公开案第91-3242号,第I卷,第647-669页)，但并非所有CDR残基必需直接参与抗原结合。

FR残基及Ig恒定域不直接参与抗原结合，但有助于抗原结合和/或介导抗体效应功能。认为一些FR残基以至少三种方式对抗原结合产生显著作用：通过直接非共价结合于表位、通过与一个或多个CDR残基相互作用及通过影响重链与轻链之间的界面。恒定域不直接参与抗原结合，但介导各种Ig效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。

脊椎动物免疫球蛋白的轻链基于恒定域的氨基酸序列而分配至两个明确不同的类别之一：κ(kappa)及λ(lambda)。通过比较，根据恒定域的序列将哺乳动物免疫球蛋白的重链分配至五个主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA进一步划分成亚类(同种型)，例如分别为IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。所述类别的原生免疫球蛋白的亚基结构及三维构型已为熟知的。

术语“抗体”、“抗Nrp1A抗体”、“人源化抗Nrp1A抗体”及“变体人源化抗Nrp1A抗体”在本文中以最广义使用且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及抗体片段，诸如抗体的展现所需生物活性(例如结合于Nrp1A)的可变域及其他部分。

术语“单克隆抗体”(mAb)是指大体上同质的抗体群体中的抗体；亦即那些群体中的个别抗体相同，但其中可能存在少量天然存在的突变。单克隆抗体针对单一抗原决定子“表位”具有高度特异性。因此，修饰语“单克隆”指示针对相同表位的大体上同质的抗体群，且不应视为需要通过任何特定方法来产生抗体。应理解，单克隆抗体可通过本领域中已知的任何技术或方法制得；包括例如杂交瘤方法(Kohler等人,1975,Nature 256:495)、或本领域中已知的重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)、或使用Clackson等人,1991,Nature 352:624-628及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-597中所述的技术分离使用噬菌体抗体库以重组方式产生的单克隆的方法。

嵌合抗体由来自一个物种(例如非人类哺乳动物，诸如小鼠)的抗体的重链可变区及轻链可变区及另一物种(例如人类)抗体的重链恒定区及轻链恒定区组成，且可通过如下获得：将编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体的可变区的DNA序列连接至来自第二(例如人类)物种的抗体的恒定区的DNA序列，且通过含有连接序列的表达载体使宿主转化以使其产生嵌合抗体。或者，嵌合抗体亦可为重链和/或轻链的一个或多个区或域与来自另一免疫球蛋白类别或同种型的单克隆抗体中或来自共有或生殖系序列的对应序列一致、同源或为其变体的抗体。嵌合抗体可包括此类抗体的片段，其限制条件为该抗体片段展现其亲本抗体的所需生物活性，例如结合于同一表位(参见例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。

术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗Nrp1A抗体片段”、“人源化抗Nrp1A抗体片段”、“变体人源化抗Nrp1A抗体片段”是指全长抗Nrp1A抗体的一部分，其中保持可变区或功能性能力，举例而言，特定Nrp1表位结合。抗体片段的例子包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、双功能抗体、线抗体、单链抗体、微型抗体、由抗体片段形成的双功能抗体及由抗体片段形成的多特异性抗体。

全长抗体可用诸如木瓜酶或胃蛋白酶的酶处理，以产生适用抗体片段。使用木瓜酶消化以产生两种相同的各自具有单一抗原结合位点的抗原结合抗体片段(称为“Fab”片段)，及残余“Fc”片段。Fab片段亦含有轻链的恒定域及重链的C_H1域。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在C_H1域的C端存在额外残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')₂抗体片段是通过铰链区中的半胱氨酸残基连接的Fab'片段对。亦已知抗体片段的其他化学偶合。

“Fv”片段含有由一个重链可变域及一个轻链可变域紧密非共价缔合的二聚体组成的完整抗原识别及结合位点。在此构型中，每一可变域的三个CDR相互作用以界定V_H-V_L二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同地赋予抗体以抗原结合特异性。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段为包含抗体的V_H域及V_L域的单链Fv变体，其中所述域存在于单一多肽链中。单链Fv能够识别且结合抗原。scFv多肽亦可任选含有位于V_H域与V_L域之间的多肽连接符以有助于通过scFv形成抗原结合所需的三维结构(参见例如Pluckthun,1994,In The Pharmacology of monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg and Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页)。

其他识别的抗体片段包括包含一对串叠型Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)以形成一对抗原结合区的那些抗体片段。这些“线抗体”可为双特异性或单特异性的，如例如Zapata等人,1995,Protein Eng.8(10):1057-1062中所述。

人源化抗体或人源化抗体片段是特定类型的嵌合抗体，其包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，能够结合于预定抗原且包含实质上具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个FR及实质上具有非人类免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个CDR。通常称为“导入”序列的此非人类氨基酸序列通常获自“导入”抗体域，特别是可变域。一般而言，人源化抗体至少包括插入人类重链可变域或轻链可变域的FR之间的非人类抗体的CDR或HVL。

本发明描述特异性人源化抗Nrp1A抗体，其包含插入人类生殖系序列重链可变域及轻链可变域的FR之间的衍生自鼠类或嵌合抗体的CDR。应了解，某些鼠类FR残基对于人源化抗体的功能可为重要的，且因此，某些人类生殖系序列重链及轻链可变域残基经修饰为与对应鼠类序列的那些残基相同。

如本文中所用，表述“本发明的抗体”及“本发明的抗Nrp1A抗体”是指本文中所述的针对Nrp1，优选地Nrp1的A域的抗体或其抗原结合片段。优选地，该本发明的抗体包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区。

在一个实施方案中，本发明涉及人源化抗Nrp1A。人源化抗体包含大体上所有的至少一个且通常两个可变域(诸如包含在例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中)，其中所有或大体上所有CDR对应于非人类免疫球蛋白的那些CDR，且本文中具体地，CDR为鼠类序列且FR为人类免疫球蛋白共有或生殖系序列的那些FR。在另一方面中，人源化抗Nrp1A抗体也包括免疫球蛋白Fc区，通常人类免疫球蛋白的至少一部分。通常，抗体将含有轻链以及至少重链的可变域两者。适当时，抗体亦可包括重链的C_H1、铰链、C_H2、C_H3和/或C_H4区中的一者或多者。

人源化抗Nrp1A抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。举例而言，恒定域可为补体固定恒定域，其中需要人源化抗体展现细胞毒性活性且同种型通常为IgG₁。在不需要此类细胞毒性活性的情况下，恒定域可具有另一同种型，例如IgG₂。替代的人源化抗Nrp1A抗体可包含来自超过一个免疫球蛋白类别或同种型的序列，且选择特定恒定域以使所需效应功能达最佳在一般本领域技术人员的能力内。在特定实施方案中，本发明提供为IgG₁抗体，且更特别是为特征在于效应功能减小的IgG₁抗体的抗体。

在一优选实施方案中，本发明的抗Nrp1A抗体为格式化为IgG1KO的人源化抗体。

人源化抗Nrp1A抗体的FR及CDR或HVL无需精确对应于亲本序列。举例而言，导入CDR、或HVL、或共有或生殖系FR序列中的一个或多个残基可通过取代、插入或缺失而改变(例如，诱变)，使得所得氨基酸残基不再与亲本序列的对应位置中的原始残基相同，但尽管如此抗体仍保持结合于Nrp1的功能。此类改变通常是非大范围的且将为保守性改变。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应于亲本共有或生殖系FR及导入CDR序列的那些残基，更通常至少90％，且最通常大于95％、或大于98％或大于99％。

影响重链可变区与轻链可变区之间的界面(“V_L-V_H界面”)的免疫球蛋白残基是影响两个链相对于彼此的接近度或定向的那些残基。可参与链间相互作用的某些残基包括V_L残基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98及V_H残基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103(利用Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1987)中所示的编号系统)。美国专利第6,407,213号也论述诸如V_L残基43及85及V_H残基43及60的残基也可参与此相互作用。尽管这些残基仅指示用于人类IgG，但其在物种间均适用。合理预期参与链间相互作用的重要抗体残基经选择用于取代至共有序列中。

术语“共有序列”及“共有抗体”是指在任何特定类别、同种型或亚基结构的所有免疫球蛋白中的每一位置(例如人类免疫球蛋白可变域)处包含最常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。共有序列可基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。应了解，“共有”序列、结构或抗体涵盖如某些实施方案中所述的共有人类序列，且是指在任何特定类别、同种型或亚基结构的所有人类免疫球蛋白中的每一位置处包含最常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。因此，共有序列含有在每一位置具有存在于一个或多个已知免疫球蛋白中的氨基酸的氨基酸序列，但其不可精确地重复任何单一免疫球蛋白的整个氨基酸序列。可变区共有序列并非获自任何天然产生的抗体或免疫球蛋白(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth，Bethesda,Md.)及其变体。重链及轻链共有序列的FR及其变体提供适用于制备人源化抗Nrp1A抗体的序列。参见例如美国专利第6,037,454号及美国专利第6,054,297号。

人类生殖系序列天然地见于人类群体中。那些生殖系基因的组合产生抗体多样性。抗体的轻链的生殖系抗体序列来自保守人类生殖系κ或λv基因及j基因。类似地，重链序列来自生殖系v基因、d基因及j基因(LeFranc,M-P及LeFranc,G,“The ImmunoglobulinFacts Book”Academic Press,2001)。

“分离的”抗体为已自其天然环境的组分识别出且分离和/或回收的抗体。抗体的天然环境的污染物组分为可干扰抗体的诊断或治疗用途的那些物质，且可为酶、激素及其他蛋白性或非蛋白性溶质。在一个方面中，将抗体纯化至按抗体的重量计的至少大于95％分离。

术语“抗体效能”是指有助于抗原的抗体识别或抗体的体内效用的因素/特性。在一优选实施方案中，抗体效能是指抗体预防视网膜细胞的细胞骨架瓦解的能力。抗体的氨基酸序列的变化可影响诸如折叠的抗体特性，且可影响物理因素，诸如抗体结合于抗原的初始速率(k_a)、抗体与抗原的解离常数(k_d)、抗体对于抗原的亲和力常数(Kd)、抗体的构象、蛋白质稳定性及抗体的半衰期。

如本文所使用，在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“一致”或“一致性百分比”是指在比较及比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。为测定一致性百分比，出于最佳比较目的进行序列比对(例如为与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入间隙)。接着比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。若第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则分子在该位置处一致。两个序列之间的一致性百分比为所述序列共有的一致位置数的函数(即，一致性％＝一致位置数#/位置(即重叠位置)总数#×100)。在一些实施方案中，适当时，在序列内引入间隙之后，进行比较的两个序列长度相同(例如不包括延长超过比较序列的额外序列)。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导序列和/或恒定域序列。对于两个序列之间的序列比较，“对应”CDR是指两个序列中相同位置的CDR(例如每一序列的CDR-H1)。

可使用数学算法实现判定两个序列之间的一致性百分比或相似性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性例子为Karlin及Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，如Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中所修改。将此类算法并入至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可通过NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)执行，以获得与编码所关注蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)执行，以获得与所关注蛋白质同源的氨基酸序列。为获得比较目的之间隙式比对，可如Altschul等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所述来使用间隙式BLAST。或者，PSI-Blast可用于执行检测分子(同上文献)间的远缘关系的叠代检索。当利用BLAST、间隙式BLAST及PSI-Blast程序时，可使用各别程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性例子为Myers and Miller,CABIOS(1989)的算法。将此类算法并入至ALIGN程序(2.0版)中，该ALIGN程序为GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、间隙长度罚分12及间隙罚分4。用于序列分析的额外算法是本领域中已知的且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA内，ktup为设定检索的灵敏度及速度的控制选项。若ktup＝2，则通过查看比对残基对得到比较的两个序列中的类似区；若ktup＝1，则检查单一比对氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可设定为2或1，或对于DNA序列设定为1至6。若ktup未得以指定，则对于蛋白质默认值为2，且对于DNA为6。或者，可使用CLUSTAL W算法进行蛋白质序列比对，如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所描述。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞株”及“细胞培养物”可互换使用且所有此类名称包括其子代。因此，“转化体”及“转化细胞”包括主要个体细胞及来源于其的培养物，而与转移数目无关。

出于治疗的目的，术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜与农畜及动物园、竞技或宠物动物，诸如狗、马、猫、奶牛及其类似动物。优选地，哺乳动物为人类。

如本文中所用，“疾病”或“病症”是将受益于用本文所述的人源化抗Nrp1A抗体治疗的任何病状。此病状包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的病症的那些病理病状。

术语“玻璃体内注射”具有其在本领域中的正常含义且是指将抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段引入至患者的玻璃体中。

术语“皮下施用”是指通过相对地减缓的持续递送将抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段自药物容器引入至动物或人类患者的皮肤下，优选皮肤与下层组织之间的袋内。捏起或拉起皮肤且远离下层组织可产生袋。

术语“皮下输注”是指通过相对缓慢的持续递送将药物自药物容器引入至动物或人类患者的皮肤下，优选皮肤与下层组织之间的袋内，保持一段时间，包括(但不限于)30分钟或更小、或90分钟或更小。任选，输注可通过植入于动物或人类患者的皮肤下的药物递送泵的皮下植入来进行，其中泵递送预定量的药物，保持预定时段，诸如30分钟、90分钟或横跨治疗方案长度的时段。

术语“皮下推注”是指动物或人类患者的皮肤下方的药物施用，其中推注药物递送小于大致15分钟；在另一方面中，小于5分钟，且在又一方面中，小于60秒。在甚至又一方面中，施用为在皮肤与下层组织之间的袋内，其中袋可通过捏起或拉起皮肤且远离下层组织而产生。

术语“治疗有效量”用以指抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段减轻或改善所治疗病症的症状中的一者或多者的量。在此情况下，其为具有有益患者结果的量。功效可依据待治疗的病状以常规方式测量。举例而言，在由表达Nrp1A的细胞表征的眼/视网膜疾病或病症中，功效可通过测定反应率(例如视力的复原)或通过评定直至疾病进展的延迟时间来测量。

如本文中所用，术语“治疗”及“疗法”及其类似术语是指包括疾病或病症的治疗性以及防治性或抑制措施，从而产生任何临床上需要或有益的作用，包括(但不限于)缓解或减轻一种或多种症状，消退、减缓或停止疾病或病症的进展。因此，例如，术语治疗包括在疾病或病症的症状发作之前或之后施用抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，由此预防或去除疾病或病症的一种或多种迹象。作为另一例子，该术语包括在疾病的临床表达之后施用抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段以对抗疾病的症状。此外，发作之后及已出现临床症状(在施用影响疾病或病症的临床参数时，治疗是否引起疾病的改善)之后施用抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段包含如本文中所用的“治疗”或“疗法”。此外，只要与在不使用抗Nrp1A抗体组合物或其抗原结合片段下的症状相比较，本发明的组合物单独或与另一治疗剂组合减轻或改善所治疗病症的至少一种症状，则结果即应视是有效治疗潜在病症，而与病症的所有症状是否减轻无关。

术语“药品说明书”用以指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有关于适应症、用法、施用、禁忌和/或关于使用此类治疗产品的警告的信息。

本发明的抗体

在第一方面中，本发明涉及一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。优选地，该抗体为人源化抗Nrp1A抗体，更优选地人源化单克隆抗Nrp1A抗体。

在初始特征中，靶向Nrp1A变体的抗体库为通过将衍生自噬菌体库的鼠类抗体或人类抗体的CDR放置至人类共有重链及轻链可变域的FR中且进一步通过工程改造FR以具有不同的改变来产生。

此产生如本文所公开的具有增强特性的针对Nrp1A的人源化抗体。本发明的抗体的序列展示于下表1中。

表1：

-包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列的重链可变区；及

-包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区；及

-包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区。

在一优选实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选地由其组成的轻链。

a.包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链，该抗体被称为“克隆I”；

b.包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链，该抗体被称为“克隆II”；

c.包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链，该抗体被称为“克隆III”；

d.包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链，该抗体被称为“克隆IV”；

e.包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链，该抗体被称为“克隆V”；

f.包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链，该抗体被称为“克隆VI”；或

g.包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链，该抗体被称为“克隆VII”；

已通过将突变引入Fc区中而得到IgG1-KO突变体。减小或抑制效应功能的突变是本领域技术人员所熟知的且充分地公开于现有技术中，例如Wang等人,Protein Cell2018,9(1):63-73及Stewart等人，Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014,2:29中。通常地，引入IgG1 Fc区中以便减小Fc的效应功能的突变的非限制清单包含：

-L234A及L235A；

-L234A、L235A及N297Q；

-L234A、L235A及P329G；或

-L234A、L235A及D265A；

其中残基根据Kabat的EU索引编号。

在一优选实施方案中，本发明的抗体在Fc区中包含两个突变L234A及L235A以减小效应功能。

本文中公开且描绘于SEQ ID NO:1至6中的CDR根据下表2中的CCG(化学计算组(Chemical Computing Group)，如Almagro等人,Proteins 2011；79:3050-3066及Maier等人,Proteins 2014；82:1599-1610中所说明)呈现。

表2

CDR	CCG序列	CCG位置	SEQ ID NO:
				HCDR1	GFTFSSYAMS	26-35	1
HCDR2	SISRTGYTYYAESVKG	-50-65	2
				HCDR3	VGTAFDY	98-104	3
LCDR1	RASQSISSYLN	24-34	4
				LCDR2	AASSLQS	50-56	5
LCDR3	QQSYSTPLT	89-97	6

基于Kabat编号的其他编号系统概述于下表3中。

表3：

基于Chothia的其他编号系统呈现于下表4中。

表4：

因此，在一特定方面中，本发明涉及一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

-包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区；及包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区；或

-包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区；或

-包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:9的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，及包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区。

本发明的抗Nrp1A抗体以高亲和力结合于人类Nrp1A。在关于此方面的一个实施方案中，本发明的抗Nrp1A抗体以K_D<50nM结合于人类Nrp1A。在另一实施方案中，本发明的抗Nrp1A抗体以K_D<15nM结合于人类Nrp1A，如实施例8中所例示。

本发明的抗Nrp1A抗体也与食蟹猴Nrp1A、小鼠Nrp1A、大鼠Nrp1A及沙鼠Nrp1A结合。

本发明的抗体的高结合亲和力促进延长玻璃体内注射之后中和Nrp1A的时间且进一步允许注射频率减小。更高结合亲和力进一步允许施用更低剂量，从而限制潜在副作用。提高的结合亲和力及减小的注射频率显著改善治疗有需要的患者的功效。其也为患者提供宝贵益处，特别是改善的药物观测及顺应性。

本发明的抗Nrp1A抗体以小于130pM，优选地小于110pM，更优选地小于100pM的功能性效力来预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架瓦解。在一优选实施方案中，本发明的抗Nrp1抗体以98pM的功能性效力预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架瓦解，如实施例4中所例示。结果说明本发明的抗体抑制由Sema3A诱导的血管排斥的功效。

本发明的抗Nrp1A抗体进一步以小于4nM，优选地小于3nM，更优选地小于1nM的功能性效力来抑制由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。在一优选实施方案中，本发明的抗Nrp1A抗体以0.74nM的功能性效力来预防VEGF诱导的视网膜细胞完整性丧失，如实施例5中所例示。结果说明本发明的抗体抑制由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性的功效。

在另一方面中，本发明的抗Nrp1A抗体经证明具有低免疫原性风险，如实施例9中所描述。此依赖于抗体的免疫原性的电脑(in silico)预测。免疫原性风险通常通过熟知的各种方法来分析，诸如通过用于预测T细胞表位(主要免疫原性影响因子)的计算机算法。实际上已报导含有存在于所关注蛋白质中的T细胞表位的序列可通过使用基于演算矩阵方法(商品名为EpiMatrix(由EpiVax生产))的算法来预测。本领域技术人员可参考Van Walle等人,Expert Opin Biol Ther.2007年3月；7(3):405-18及Jawa等人,Clin Immunol.2013年12月；149(3):534-55。

本发明的抗体与基于靶向Sema3的治疗方法不同。实际上，根据本发明的抗体抑制由VEGF，优选地VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性，但并未观察到靶向Sema3A的化合物的此作用。因此，基于本发明的抗体的抗Nrp1A治疗性方法具有以下优势：

-抑制Sema3A的血管排斥作用；

-抑制由Sema3A诱导的血液视网膜屏障的渗透性；及

-抑制由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。

本发明的抗体与基于VEGF抑制的治疗方法不同。实际上，本发明的抗体抑制Sema3A与Nrp1的结合，使得抑制由Sema3A诱导的血管排斥，最终特别改善患有DMI的患者的血管再生。

另外，本发明人已在VEGF诱导的细胞完整性丧失分析中将本发明的抗体的效能特别与及的效能进行比较，如实施例5中所说明。及皆靶向VEGF，而本发明的抗体靶向Nrp1的A域。值得注意的是，VEGF诱导的细胞完整性丧失分析中的本发明的抗体的效能与及的效能类似，且优于的效能，因此本发明人已研发出具有以下作用的抗体：

-预防Nrp1与Sema3A的结合，从而抑制通过Sema3A的血管排斥及诱导血液视网膜屏障的渗透性，且

-出乎意料地影响由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。

本发明人已说明本发明的抗体相较于现有技术中所提及且本文实施例3中所述的靶向Nrp1的其他抗体或片段展示更有利的特性。所述其他抗体靶向Nrp1上的不同表位。本发明人已将根据本发明的抗体与以下抗体的特性进行比较：

-针对Nrp1的A域的抗体(YW64.3)；及

-针对Nrp1的B域的抗体(YW107.4.87)。

本发明人已展示，在Sema3A诱导的细胞骨架瓦解分析中，本发明的抗体是有效的，然而YW107.4.87并不(实施例4)。这些结果说明本发明的抗体特别在患有DMI的患者中抑制由Sema3A诱导的血管排斥，使得改善血管再生特性。

本发明人已进一步展示与YW64.3相比，本发明的抗体具有提高的热稳定性，如通过DSC所测量(实施例11)。这些结果说明本发明的抗体在生理温度下保持其天然且活性构象。值得注意的是，更高热量转变中点(T_m)反映蛋白质在低温下的稳定性提高。因此，本发明人已展示本发明的抗体展示提高的热稳定性特性，其有助于提高的治疗功效，同时允许减小对于患者的注射剂量及频率。另外，T_m指示治疗性产品的更高储存期限及提高的时间稳定性。

人源化及氨基酸序列变体

可基于SEQ ID NO:1至6中所描绘的序列下所识别的CDR集合来对其他变体抗Nrp1A抗体及抗体片段进行工程改造。应理解，在所述变体抗Nrp1A抗体及抗体片段中，CDR的氨基酸序列保持不变，但例如FR区的周围区域可经工程改造。抗Nrp1A抗体的氨基酸序列变体可通过将适当核苷酸变化引入至抗Nrp1A抗体DNA中或通过肽合成来制备。此类变体包括例如自本文中的实施例的抗Nrp1A抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构建物，其限制条件为该最终构建物拥有所需特征。氨基酸变化亦可改变人源化或变体抗Nrp1A抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

抗体的另一类型氨基酸变体涉及改变抗体的原始糖基化模式。在此上下文中，术语“改变”是指缺失一个或多个抗体中可见的碳水化合物部分，和/或添加一个或多个先前不存在于抗体中的糖基化位点。

在一些方面中，本发明包括编码本文所述的抗Nrp1A抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。编码抗Nrp1A抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域中已知的多种方法制备。这些方法包括(但不限于)自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过抗Nrp1A抗体的早期制备变体或非变体版本进行寡核苷酸介导的(或定点)突变诱导、PCR突变诱导及卡匣突变诱导来制备。

在某些实施方案中，抗Nrp1A抗体为抗体片段。存在已开发用于产生抗体片段的技术。片段可经由完整抗体的蛋白水解消化衍生(参见例如Morimoto等人,1992,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人,1985,Science229:81)。或者，片段可在重组宿主细胞中直接产生。举例而言，Fab'-SH片段可自大肠杆菌(E.coli)直接回收且经化学偶合以形成F(ab')₂片段(参见例如，Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-167)。通过另一方法，F(ab')₂片段可自重组宿主细胞培养物直接分离。用于产生抗体片段的其他技术将是本领域技术人员显而易见的。

抗Nrp1A抗体及其抗原结合片段可包括修饰。

在某些实施方案中，可能需要使用抗Nrp1A抗体片段，而非完整抗体。可能需要修饰抗体片段以增加其血清半衰期。此情况可例如通过将救助受体结合表位并入至抗体片段中来达成。在一种方法中，抗体片段的适当区域可经改变(例如，经突变)，或可将表位并入至肽标签中，接着例如通过DNA或肽合成在任一末端或在中部中融合至抗体片段。参见例如WO 96/32478。

在其他实施方案中，本发明包括抗Nrp1A抗体的共价修饰。共价修饰包括半胱氨酰基残基、组氨酰基残基、赖氨酰基及氨基端残基、精氨酰基残基、酪氨酰基残基、羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)、谷氨酰胺酰基及天冬酰胺酰基残基、或丝氨酰基、或苏氨酰基残基的修饰。另一类型的共价修饰涉及以化学方式或酶促方式将糖苷偶合至抗体。若适用，则此类修饰可通过化学合成或通过抗体的酶促或化学裂解进行。可通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或氨基或羧基端残基反应的有机衍生药剂反应来将抗体的其他类型的共价修饰引入至分子中。

存在于抗体上的任何碳水化合物部分的移除可以化学方式或酶促方式实现。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131描述。抗体上的碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol 138:350所述的多种内糖苷酶及外糖苷酶来达成。

另一类型的适用共价修饰包含以美国专利第4,640,835号、美国专利第4,496,689号、美国专利第4,301,144号、美国专利第4,670,417号、美国专利第4,791,192号及美国专利第4,179,337号中的一者或多者中所述的方式将抗体连接至多种非蛋白质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。

表位结合

在第二方面中，本发明涉及一种识别特异性“Nrp1A表位”的抗体。特别是，本发明的抗体结合于如SEQ ID NO:26中所示的人类Nrp1A的表位。

在一个方面中，本发明涉及一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其结合于如SEQID NO:26中所示的人类Nrp1A的氨基酸区域68至77内的至少一个氨基酸残基。

在另一方面中，本发明涉及一种Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其结合于SEQ IDNO:27中所描绘的序列。

序列SEQ ID NO:26及27描绘于下表5中。

表5

如本文中所用，术语“Nrp1A表位”是指能够结合于抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的分子(例如肽)或分子的片段。这些术语进一步包括例如由本发明的抗体或抗体片段中的任一者识别的Nrp1A抗原决定子，其具有选自SEQ ID No:1至3的重链CDR及SEQ ID NO:4至6的轻链CDR的轻链及重链CDR组合。

Nrp1A抗原表位可包括于蛋白质、蛋白质片段、肽或其类似物中。表位最常为蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(亦即，模拟Nrp1抗原的抗体结合特性的有机化合物)或其组合。

已发现，本发明的抗体结合于人类Nrp1A的特有表位。优选地，该抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段结合于人类Nrp1A的胞外域的氨基酸区域68至77内的至少一个氨基酸残基，如SEQ ID NO:26中所阐述。

在表位结合的情形下，词组“氨基酸区域X至Y内的结合”是指抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段结合于序列中指定的氨基酸区域内的至少一个，优选地所有氨基酸残基。

在另一方面中，抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段结合于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的SEQ ID NO:27中所描绘的氨基酸序列。优选地，抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段结合于SEQ ID NO:27中所描绘的序列。

治疗用途

在第三方面中，本发明涉及一种用作药物的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。

如先前所提及，Sema3A为NRP1的天然配体。更精确而言，Sema3A结合于Nrp1的A域。本发明人已例示信号蛋白3A为由缺血性/无血管视网膜中的低氧视网膜神经节细胞分泌且充当血管排斥提示。本发明人已证实Sema3A实际上通过诱导这些细胞中的细胞骨架瓦解而排斥新血管以远离缺血性区域，从而抑制视网膜的血管再生且增强病理性视网膜前新血管生成。

通过靶向Nrp1，优选地Nrp1的A域，本发明的抗体预防Nrp1与Sema3A的结合。本发明人已展示通过Nrp1A抗体调节血管排斥活动增大了尖端细胞的数目且将血管生成重引导至缺血性区域(实施例6)，诸如患有糖尿病性黄斑缺血的人体的经病理性放大的中央窝无血管区域。

除预防Nrp1的A域与Sema3A结合之外，本发明的抗体展示抑制由VEGF，优选地VEGF-A诱导的视网膜渗透性的出人意料的特性。如先前所提及，VEGF-A为Nrp1的B域的天然配体。本发明的抗体靶向Nrp1的A域且并不特异性靶向Nrp1B与VEGF-A的结合。然而，本发明人观察到本发明的抗体抑制由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。不希望由理论限制，本发明人假定通过针对Nrp1的A域的抗体，优选地本发明的抗体抑制由VEGF-A诱导的视网膜渗透性由空间干扰由Nrp1、VEGF受体2及其他共受体组成的信号传导全受体(holoreceptor)复合物所引起。

VEGF-A特别是由低氧星形胶质细胞分泌。VEGF-A是产生增生性DR及DME两者的重要因子，通过调节黏附接面，诸如VE-钙黏素或紧密接面(诸如闭合蛋白)来改变视网膜毛细管渗透性。VEGF-A刺激内皮细胞释放基质金属蛋白酶(MMP)及尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化子，从而导致基底膜降解且使得细胞迁移变得可能。

因此，低氧条件下的VEGF-A分泌为加重因子，这是由于其促成视网膜渗透性，使黄斑水肿恶化。另外，本发明人已展示Sema3A及VEGF-A两者通过结合于Nrp1而提升血管渗透性，从而导致血管渗漏，因此促成黄斑水肿。

本发明人已通过研发靶向Nrp1A的抗体解决此病理性情况，其证明高度有助于：

-将血管生成重引导至缺血性区域以改善视网膜的血管再生；

-预防玻璃体区域的病理性新血管生成；

-预防由Sema3A诱导的血液视网膜屏障破坏；且

-预防由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障破坏。

因此，通过将两种出人意料的作用组合，本发明的抗体证明高度有益于：

-通常在患有PDR(特别是DMI)的患者的视网膜中，改善缺血性无血管区域的血管再生；

-通常地在患有PDR(特别是DME)的患者中，预防由Sema3A分泌诱导的血管渗漏；且

-通常在患有PDR(特别是DME)的患者中，预防由VEGF-A分泌诱导的血管渗漏。

因此，本发明提供一种用于治疗或预防视网膜或眼疾病的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。

值得注意的是，根据本发明的抗体并不预防VEGF与Nrp1的结合，如实施例12中所说明。本发明的抗体并不影响VEGF诱导的血管生成(这是由于本发明的抗体并不预防VEGF-A诱导的内皮细胞增殖)且仅影响VEGF-A诱导的视网膜渗透性。

本发明人实际上已展示本发明的抗体并不预防内皮细胞增殖，如实施例13中所说明。本发明人已进一步展示本发明的抗体并不影响在VEGF诱导的网络形成分析(实施例14)以及激光诱导的脉络膜新血管生成(实施例15)中的VEGF诱导的血管生成。因此，本发明人证实本发明的抗体并不抑制由VEGF-A诱导的血管生成。

如本发明的整个公开内容所解释，本发明的抗体抑制Sema3A的血管排斥作用，因此允许将血管生成重引导至缺血性区域。另外，本发明的抗体预防由Sema3A及VEGF-A两者诱导的血液视网膜屏障破坏。不管其对于由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性的抑制作用如何，本发明的抗体出乎意料地对由VEGF-A诱导的血管生成不具有作用。

另外，本发明的抗体并不预防血管再生。因此其将不妨碍缺血性区域的血管生成。因此，本发明的抗体极其有助于待促进血管再生的临床情况，例如用于改善缺血性无血管区域的血管再生，通常地在患有PDR(特别DMI)的患者的视网膜中。

在第四方面中，本发明涉及一种用于治疗或预防疾病的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，该疾病选自由以下组成的群：视网膜病；增生性视网膜病，诸如早产儿视网膜病、缺血性视网膜病；糖尿病性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病及非增生性糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性黄斑缺血；年龄相关的黄斑变性；色素性视网膜炎；遗传性视网膜营养不良；近视退化；视网膜静脉闭塞；视网膜动脉闭塞；眼内炎；葡萄膜炎；囊样黄斑水肿；继发于任何视网膜疾病的脉络膜新血管生成性膜；视神经神经病变；青光眼；视网膜脱落；毒性视网膜病；辐射性视网膜病；创伤性视网膜病；药物诱导的视网膜血管病变；视网膜新血管生成；息肉状脉络膜血管病变；视网膜血管炎；视网膜微动脉瘤；富克斯氏营养不良；黄斑毛细管扩张；尤塞氏综合征及斯特格氏病。

本发明的抗Nrp1A抗体特别适用于治疗或预防糖尿病性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病及非增生性糖尿病性视网膜病；缺血性视网膜病；糖尿病性黄斑水肿；糖尿病性黄斑缺血；年龄相关的黄斑水肿；视网膜新血管生成及脉络膜新血管生成。

在一优选实施方案中，该疾病为糖尿病性黄斑缺血且本发明的抗体促进缺血性视网膜内的血管再生(血管再生成)且预防眼睛的玻璃体区域的病理性新血管生成。

在另一优选实施方案中，该疾病为糖尿病性黄斑水肿且本发明的抗体减小由Sema3A及VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。

在另一优选实施方案中，本发明提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其用于抑制Sema3A诱导的缺血性区域的血管退化(vasoregression)、抑制Sema3A诱导的血液视网膜屏障的渗透性且抑制VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性。

如本文中所用，表述“抑制血液视网膜屏障(BRB)的渗透性”、“抑制视网膜渗透性”及“抑制血管渗透性”可互换地使用且指代潜在地导致血管渗漏的血液视网膜屏障破坏。该血管渗漏可一方面由Sema3A诱导且另一方面由VEGF，优选地VEGF-A诱导。本发明人现已研发出可抑制由Sema3A诱导的BRB的渗透性以及抑制由VEGF-A诱导的BRB的渗透性的抗体。因此，本发明的抗体预防血液视网膜屏障的破坏且预防由Sema3A和/或VEGF-A诱导的视网膜细胞完整性丧失。

在一优选方面中，本发明的抗体适用于治疗糖尿病性黄斑水肿(DME)和/或糖尿病性黄斑缺血(DMI)。在一优选实施方案中，本发明的抗体适用于治疗患有DME及DMI的患者。优选地，本发明的抗体用于治疗如由超过15％、20％、25％、且更优选地30％中央窝无血管区域(FAZ)放大所定义的DMI。

本发明证明极其适用于患有DMI及DME两者的患者，这是由于本发明的抗体抑制由VEGF-A诱导的视网膜渗透性，而不影响VEGF-A对于缺血性视网膜内的血管再生可能具有的促血管生成作用。

抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段通过任何适合手段施用，包括玻璃体内、经口、非经肠、皮下、腹膜内、肺内及鼻内。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，抗Nrp1A抗体宜通过脉动输注施用，特别是以降低的抗体剂量施用。在一个方面中，部分地视施用的短期或长期性而定，可通过注射，最佳地静脉内或皮下注射来提供给药。优选地，经由玻璃体内注射将抗Nrp1A抗体施用至眼中。

为预防或治疗疾病，抗体的适当剂量将视各种因素而定，所述因素诸如上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重度及病程、是否为预防或治疗目的而施用抗体、先前疗法、患者的临床病史及对抗体的反应以及主治医师的判断。抗体适宜一次性或历经一系列治疗施用患者。

在一优选实施方案中，每次注射适用的本发明的抗体的剂量范围通常为1毫克/眼睛至10毫克/眼睛，优选地1.5毫克/眼睛与5毫克/眼睛之间，更优选地2毫克/眼睛与3毫克/眼睛之间，且甚至更优选为约2.5毫克/眼睛。

术语“抑制”在本文中在与“改善”及“减轻”相同的情形下使用，是指减轻或减少疾病的一个或多个特征。

抗体组合物将以与良好医学实践一致的方式调配、给药及施用。在此情形下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病状、病症起因、药剂的递送部位、施用方法、施用排程及医学从业者已知的其他因素。待施用的抗体的“治疗有效量”将由此类考虑因素调节且为预防、改善或治疗由本发明的抗体处理的眼或视网膜疾病所必需的最小量。

抗体并非必须而为任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起调配。此类其他药剂的有效量视存在于调配物中的抗Nrp1A抗体的量、病症或治疗的类型及如上文所述的其他因素而定。这些药剂一般以如上文所用的相同剂量及施用途径或迄今使用的剂量的约1％至99％使用。

治疗方法

在另一方面中，本发明亦涵盖用于治疗或预防有需要的患者的眼或眼部疾病的任何方法，该方法包括施用本发明的抗Nrp1A抗体。

优选地，本发明涉及一种使用根据本发明的抗体抑制SemaA3的血管阻遏(vasorepressive)作用的方法。更优选地，本发明涉及用于改善视网膜的血管再生的该方法。

优选地，本发明涉及一种用于治疗或预防眼或视网膜疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用药学上有效量的根据本发明的抗体。优选地，该疾病选自由以下组成的群：视网膜病；增生性视网膜病，诸如早产儿视网膜病、缺血性视网膜病；糖尿病性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病及非增生性糖尿病性视网膜病；糖尿病性黄斑水肿；糖尿病性黄斑缺血；年龄相关的黄斑变性；色素性视网膜炎；遗传性视网膜营养不良；近视退化；视网膜静脉闭塞；视网膜动脉闭塞；眼内炎；葡萄膜炎；囊样黄斑水肿；继发于任何视网膜疾病的脉络膜新血管生成性膜；视神经神经病变；青光眼；视网膜脱落；毒性视网膜病；辐射性视网膜病；创伤性视网膜病；药物诱导的视网膜血管病变；视网膜新血管生成；息肉状脉络膜血管病变；视网膜血管炎；视网膜微动脉瘤；富克斯氏营养不良；黄斑毛细管扩张；尤塞氏综合征及斯特格氏病。更优选地，该疾病选自由以下组成的群：糖尿病性视网膜病，包括增生性糖尿病性视网膜病及非增生性糖尿病性视网膜病；缺血性视网膜病；糖尿病性黄斑水肿；糖尿病性黄斑缺血；年龄相关的黄斑水肿；视网膜新血管生成；青光眼及脉络膜新血管生成。在又一优选实施方案中，该疾病为糖尿病性黄斑水肿和/或糖尿病性黄斑缺血。

本文中所述的所有公开的技术特征适用于该治疗方法。

药物组合物及其施用

可向患有眼或视网膜疾病或具有眼或视网膜疾病风险的个体施用包含抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的组合物。本发明进一步提供一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用于预防或治疗Nrp1A相关疾病的药物。如本文中所用，术语“个体”是指可施用抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的任何哺乳动物患者，包括例如人类及非人类哺乳动物，诸如灵长类动物、啮齿动物及犬。特别期望使用本文所述的方法治疗的个体包括人类。抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段可单独或与其他组合物组合施用。

各种递送系统为已知的且可用以施用抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。引入方法包括(但不限于)玻璃体内、滴眼剂、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口途径。抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段可例如通过输注、推注或注射施用，且可连同其他生物活性剂一起施用。施用可为全身性或局部的。在优选实施方案中，通过玻璃体内注射进行施用。用于此类注射的调配物可以例如预填充注射器制备。

在典型实施方案中，根据常规程序将药物组合物调配成适用于向人类静脉内或皮下施用的药物组合物。通常，通过注射施用的组合物是于无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可包括增溶剂及诸如利多卡因(lignocaine)的局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。一般而言，所述成分单独提供或以单位剂型混合在一起，例如呈于指示活性剂量的气密密封容器(诸如安瓿或药囊)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当通过输注施用药物时，其可用含有无菌药物级水或生理盐水的输注瓶来配药。当通过注射施用药物时，可提供注射用无菌水或生理盐水的安瓿，使得所述成分可于施用前混合。

此外，药物组合物可以药物试剂盒形式提供，该药物试剂盒包含(a)含有呈冻干形式的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的容器及(b)含有药学上可接受的注射用稀释剂(例如无菌水)的第二容器。药学上可接受的稀释剂可用于复水或稀释冻干抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。任选与该一种或多种容器相关的可为呈由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定的形式的注意事项，该注意事项反映该机构对人类施用的制造、使用或销售机构的批准。

有效治疗或预防眼或视网膜疾病的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的量可通过标准临床技术判定。另外，体外分析可任选用于帮助识别最佳剂量范围。待用于调配物中的精确剂量亦将视施用途径及病症阶段而定，且应根据从业者的判断及每一患者的情况来决定。可根据来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推出有效剂量。

举例而言，抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的毒性及治疗功效可通过用于测定ED₅₀(在50％群体中治疗上有效的剂量)的标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定。展现较大治疗指数的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段为优选的。

自细胞培养分析及动物研究获得的数据可用于调配一系列用于人类的剂量。抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的剂量通常处于包括具有极小或不具有毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。剂量可视所采用剂型及所用施用途径而在此范围内变化。对于方法中所用的任何抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，治疗有效剂量最初可由细胞培养物分析估计。可在动物模型中调配剂量以达成包括如在细胞培养物中所测定的IC₅₀(即，达成症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地测定适用于人类的剂量。例如可通过高效液相色谱、ELISA及其类似方法测量血浆中的含量。

对于抗Nrp1A抗体的玻璃体内注射，通常优选治疗之间的间隔较长。由于其效力改良，故本发明的抗Nrp1A抗体可以较长间隔施用。

在一个实施方案中，每6周，优选地每7周，优选地每8周，优选地每9周，优选地每10周，优选地每11周且更优选地每12周施用抗Nrp1A抗体。在又一优选实施方案中，每3个月施用本发明的抗Nrp1A抗体一次。

由于可向眼睛施用的体积受到严格限制，因此极重要的是本发明的抗Nrp1A抗体可调配至高浓度。此外，抗Nrp1A抗体的效力极其重要，这是由于有效抗体在甚至更低的剂量下仍可发挥其作用，且由此延长活性以及治疗之间之间隔。

本发明的抗体可调配至极高剂量，其包括(但不限于)20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。优选地，本发明抗体可调配呈约50mg/ml的液体调配物形式。

可向患者施用的典型剂量为约2.5毫克/眼睛。可用于此类调配物的典型缓冲液组分包含例如乙酸钠、PS20及二水合海藻糖。

在一个实施方案中，抗Nrp1A抗体为通过10mM组氨酸缓冲液、240mM蔗糖、0.02w/v％聚山梨醇酯20(pH 5.5)调配，其中最终蛋白质浓度为60mg/mL。

在一些实施方案中，包含抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的药物组合物可进一步包含结合或未结合至结合剂的治疗剂。

对于用于组合施用的治疗方案，在一特定实施方案中，将抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段与治疗剂同时施用。在另一特定实施方案中，在施用抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段之前或之后至少一小时且长达若干月，例如在施用抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段之前或之后至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月施用治疗剂。

多核苷酸、载体、宿主细胞及重组方法

在第六方面中，本发明涵盖包含编码抗Nrp1A抗体的序列的分离的多核苷酸、包含多核苷酸的载体及宿主细胞、及用于产生该抗体的重组技术。分离的多核苷酸可编码抗Nrp1A抗体的任何所需形式，包括(例如)全长单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段、双功能抗体、线抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。

包含编码抗Nrp1A抗体或其片段或链的序列的多核苷酸可与如本领域中已知的一个或多个调节或控制序列融合，且可包含于如本领域中已知的适合的表达载体或宿主细胞中。编码重链或轻链可变域的多核苷酸分子中的每一者可独立地融合至编码恒定域(诸如人类恒定域)的多核苷酸序列，从而使得能够产生完整抗体。或者，多核苷酸或其部分可融合在一起，从而提供用于产生单链抗体的模板。

对于重组产生，将编码抗体的多核苷酸插入至用于克隆(DNA扩增)或表达的可复制载体中。可获得许多适用于表达重组抗体的载体。载体组分一般包括(但不限于)以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子组件、启动子及转录终止序列。

抗Nrp1A抗体也可以融合多肽形式产生，其中抗体与异源多肽融合，诸如信号序列或在成熟蛋白或多肽的氨基端具有特异性裂解位点的其他多肽。选定的异源信号序列通常是经宿主细胞识别且处理(亦即，通过信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别且处理抗Nrp1A抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列可经原核信号序列取代。信号序列可为例如碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定肠毒素II前导序列及其类似物。对于酵母分泌，原生信号序列可经例如获自酵母转化酶α因子(包括酵母菌(Saccharomyces)及克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导子)、酸磷酸酶、白色念珠菌(C.albicans)淀粉酶的前导序列或WO90/13646中所描述的信号取代。在哺乳动物细胞中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导子，例如单纯疱疹gD信号。此类前驱体区的DNA在阅读框架中接合至编码人源化抗Nrp1A抗体的DNA。

表达载体及克隆载体含有使得载体能够在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列为使得载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。此类序列对于各种细菌、酵母及病毒而言为熟知的。来自质体pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)，2-υ.质体起点适用于酵母，且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV及BPV)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常可仅使用SV40起点，因为其含有早期启动子)。

表达载体及克隆载体可含有编码可选标记的基因，以便于识别表达。典型可选标记基因编码如下蛋白质，所述蛋白质赋予对抗生素或其他毒素，例如氨苄西林(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲胺蝶呤(methotrexate)或四环素(tetracycline)的抗性，或者补充营养缺陷型缺乏，或在其他替代方案中，提供不存在于复合培养基中的特定营养素，例如编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择疗法的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞生长。经异质基因成功转化的那些细胞产生赋予耐药性的蛋白质且因此在选择疗法中存活下来。此类显性选择的实施例使用药物新霉素、霉酚酸及潮霉素。哺乳动物细胞的常见可选标记为使得能够识别可摄取编码人源化抗Nrp1A抗体的核酸的细胞的标记，诸如DHFR(二氢叶酸还原酶)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I及金属硫蛋白-II(诸如灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷去胺酶、鸟氨酸去羧酶及其类似物。首先通过在含有甲胺蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来识别经DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞系缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(例如DG44)。

或者，经编码抗Nrp1抗体、野生型DHFR蛋白质及另一可选标记(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)可由含有用于可选标记的选择剂，诸如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的细胞生长来选择。参见例如美国专利第4,965,199号。

在酵母细胞作为宿主细胞执行重组生产的情况下，存在于酵母质体YRp7中的TRP1基因(Stinchcomb等人,1979,Nature 282:39)可用作可选标记。TRP1基因为色氨酸中不具有生长能力的酵母突变菌株(例如ATCC编号44076或PEP4-1)提供选择标记(Jones,1977,Genetics 85:12)。接着，酵母宿主细胞基因组中存在trp1病变通过在不存在色氨酸下生长而提供检测转化的有效环境。类似地，诸如ATCC 20,622及38,626的Leu2p缺乏酵母菌株由带有LEU2基因的已知质体来补充。

另外，衍生自1.6μm环形质体pKD1的载体可用于克鲁维酵母的转化。或者，针对克鲁维乳球菌(K.lactis)报导用于大规模产生重组小牛凝乳酶的表达系统(Van den Berg,1990,Bio/Technology 8:135)。亦公开用于通过工业克鲁维酵母菌株分泌成熟重组人类血清白蛋白的稳定多复本表达载体(Fleer等人,1991,Bio/Technology 9:968-975)。

表达载体及克隆载体通常含有通过宿主生物体识别且可操作地连接于编码抗Nrp1A抗体或其多肽链的核酸分子的启动子。适合与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统及杂合启动子，诸如tac启动子。其他已知细菌启动子亦为适合的。用于细菌系统中的启动子亦将含有可操作地连接于编码人源化抗Nrp1A抗体的DNA的夏因-达尔加莫(Shine-Dalgamo，S.D.)序列。

已知多个真核启动子序列。几乎所有的真核基因皆具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因转录起点上游70至80个碱基处发现的另一个序列为CNCAAT区域，其中N可为任何核苷酸。在大部分真核基因的3'端处为AATAAA序列，其可为将聚A尾区添加至编码序列的3'端的信号。所有这些序列宜插入真核表达载体中。

适合与酵母宿主一起使用的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖分解酶的启动子，所述糖分解酶诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶及葡糖激酶。

诱导性启动子具有通过生长条件控制转录的额外优势。这些启动子包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的衍生酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖及半乳糖利用的酶的酵母启动子区。酵母增强子亦宜与酵母启动子一起使用。

自哺乳动物宿主细胞中的载体转录抗Nrp1A抗体例如被获自以下的启动子控制：诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40)的病毒的基因组；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；或热激启动子，限制条件为此类启动子与宿主细胞系统兼容。

SV40病毒的早期及晚期启动子适宜以也含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人类巨细胞病毒的即刻早期启动子适宜以HindIII E限制性片段形式获得。在哺乳动物宿主中使用牛乳头状瘤病毒作为载体表达DNA的系统公开于美国专利第4,419,446号中。此系统的修改描述于美国专利第4,601,978号中。亦参见Reyes等人,1982,Nature297:598-601，其公开在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下，人类p-干扰素cDNA于小鼠细胞中的表达。或者，可使用劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列作为启动子。

可用于重组表达载体中的另一适用要素为增强子序列，其用以增大利用高级真核生物转录编码抗Nrp1A抗体的DNA。现已知来自哺乳动物基因(例如血球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实施例包括复制起点(bp 100-270)后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子及腺病毒增强子。关于真核启动子活化的增强要素的描述亦参见Yaniv,1982,Nature 297:17-18。增强子可在抗Nrp1A抗体编码序列的5'或3'位处剪接至载体中，但优选位于启动子的5'位点处。

真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体可还含有转录终止及稳定mRNA必需的序列。此类序列通常可获自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶尔3'非翻译区。这些区域在编码抗Nrp1A抗体的mRNA的未翻译部分中含有以聚腺苷酸化片段形式转录的核苷酸区段。一种适用的转录终止组分为牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026及其中所公开的表达载体。在一些实施方案中，可使用CHEF系统表达抗Nrp1A抗体。(参见例如美国专利第5,888,809号；其公开内容以引用的方式并入本文中)。

本文中适用于在载体中克隆或表达DNA的宿主细胞是上文所描述的原核生物、酵母或高级真核生物细胞。适用于此目的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescans))及志贺杆菌属(Shigella)；以及杆菌属(Bacilli)(诸如枯草杆菌(B.subtilis)及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710中所公开的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(Pseudomonas)(诸如绿脓杆菌(P.aeruginosa))及链霉菌属(Streptomyces)。一种优选大肠杆菌克隆宿主为大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)及大肠杆菌W3110(ATCC27,325)的其他菌株也是适合的。这些例子是说明性而非限制性的。

除原核生物以外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物为编码抗Nrp1A抗体的载体的适合克隆宿主或表达宿主。在低级真核宿主微生物中，最常用的为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母。然而，多种其他属、种及菌株通常可用且适用于本文，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主，诸如乳酸克鲁维酵母、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、维克拉姆克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假丝酵母(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗厚神经胞子菌(Neurospora crassa)；施氏酵母属(Schwanniomyce)，诸如西方施氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及丝状真菌，诸如红霉菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲菌属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)及黑曲霉(A.niger)。

适用于表达经糖基化抗Nrp1A抗体的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的例子包括植物及昆虫细胞，包括例如许多杆状病毒菌株及变体以及来自诸如以下宿主的对应容许昆虫宿主细胞：草地黏虫(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊虫)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊虫)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)及家蚕(Bombyx mori)(桑蚕(silk worm))。用于转染的各种病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体及家蚕NPV的Bm-5菌株，且此类病毒可特别用于转染草地黏虫细胞。

棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿及烟草的植物细胞培养物亦可用作宿主。

本发明的抗Nrp1A抗体亦可并入于病毒载体中，亦即编码抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的多核苷酸经引入至病毒载体中且接着在感染病毒之后的患者体内表达。

在另一方面中，抗Nrp1A抗体的表达在脊椎动物细胞中进行。脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已变成常规程序且可广泛获得技术。适用哺乳动物宿主细胞株的例子是经SV40转化的猴肾脏CV1细胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)、人类胚胎肾细胞株(经次克隆以便在悬浮培养物中生长的一种或多种293细胞，Graham等人,1977,J.Gen Virol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216；例如DG44)、小鼠塞特利氏细胞(mouse sertolicell)(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人类子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL1442)、人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞及人类肝肿瘤细胞株(Hep G2)。

宿主细胞经用于产生抗Nrp1A抗体的上述表达载体或克隆载体转化且在适当时经调节的常规营养物培养基中培养以便诱导启动子、选择转化体或扩增编码所要序列的基因。

用于产生本文所述的抗Nrp1A抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。诸如Ham'sF10(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,Mo.)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.)及达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基((Dulbecco'sModified Eagle's Medium；DMEM)，Sigma-Aldrich Co.)的可商购培养基适合于培养宿主细胞。另外，Ham等人,1979,Meth.Enz.58:44；Barnes等人,1980,Anal.Biochem.102:255；美国专利第4,767,704号、美国专利第4,657,866号、美国专利第4,927,762号、美国专利第4,560,655号、美国专利第5,122,469号、WO 90/103430及WO 87/00195中的一者或多者中所描述的培养基中的任一者可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者可视需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙盐、镁盐及磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷及胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素)、痕量元素(定义为通常以微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能量来源。亦可包括本领域技术人员已知的适当浓度的其他补充剂。培养条件(诸如温度、pH及类似条件)为先前与选择用于表达的宿主细胞使用的培养条件，且对于一般本领域技术人员而言将显而易见。

当使用重组技术时，抗体可于细胞内、周质间隙中产生或直接分泌于培养基中。若抗体于细胞内产生，则第一步可将细胞破坏以释放蛋白质。可例如通过离心或超过滤移除微粒碎片，亦即宿主细胞或裂解片段。Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-167描述用于分离将分泌至大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简单来说，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺酰基氟(PMSF)存在下历时约30min解冻细胞浆料。可通过离心来移除细胞碎片。在抗体分泌至培养基中的情形下，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩此类表达系统的上清液。在任何先前步骤中可包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。可使用多种方法自宿主细胞分离抗体。

由细胞制备的抗体组合物可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析及亲和力色谱加以纯化，其中亲和力色谱为典型纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适合性视抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类及同种型而定。可使用蛋白质A纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见例如Lindmark等人,1983 J.Immunol.Meth.62:1-13)。针对所有小鼠同种型及人类γ3，推荐蛋白质G(参见例如Guss等人,1986 EMBO J.5:1567-1575)。连接亲和配体的基质最常为琼脂糖，但其他基质为可用的。与可通过琼脂糖达成者相比，机械稳定性基质(诸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许较快的流动速率及较短的处理时间。在抗体包含CH3域的情况下，Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。也可根据待回收的抗体利用其他蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、肝素SEPHAROSE^TM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，包含所关注抗体及污染物的混合物可经历通常在低盐浓度(例如约0至0.25M盐)下执行的使用pH在约2.5与4.5之间的洗脱缓冲液的低pH疏水性相互作用色谱。

还包括在如本文所定义的低等、中等及高严格条件下将由编码抗Nrp1A或抗体片段的分离的多核苷酸序列表示的核苷酸序列的所有或部分(例如，编码可变区的部分)杂交的核酸。杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗Nrp1A多肽的一部分或所有核酸的序列(例如重链或轻链可变区)或其互补序列至少80％，例如至少90％、至少95％或至少98％一致。可使用本文所描述类型的杂交核酸例如作为克隆探针、引子(例如PCR引子)或诊断探针。

在一个实施方案中，本发明涉及一种或多种分离的多核苷酸，其包含编码如SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25中所展示的重链或如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17中所展示的重链可变区的序列；及编码如SEQ ID NO:19中所展示的轻链或如SEQ ID NO:11中所展示的轻链可变区的序列。

应了解，在所述抗Nrp1A抗体及抗体片段中，编码CDR的核酸序列保持不变(相对于其所编码的氨基酸不变，由于密码子的简并，故DNA序列的等效物是可能的)，但可对周围区域(例如FR区)进行工程改造。

制品

在另一方面中，包括含有适用于治疗上文所述病症的材料的制品。制品包含容器及标签。适合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及试管。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器固持有效治疗病状的组合物且可具有无菌接取口。举例而言，容器可为具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。组合物中的活性剂为抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段。容器上或与容器相关联的卷标指示该组合物用于治疗所选病状。制品可进一步包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。该制品可进一步包括自商业及使用者的观点来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的药品说明书。

本发明在以下实施例中进一步加以描述，其不意欲限制本发明的范畴。

实施例

实施例1：DME及PDR患者的玻璃体中的Sema3A上调

通过免疫组织化学研究具有糖尿病性视网膜病病史的人类供体的样本视网膜中的Sema3A表达。免疫染色方案如下：

1.在室温(RT)下，使载片解冻且使样本风干30min；

2.绘制免疫组化笔(pap pen)盒且使其干燥；

3.在RT下在1％SDS中撷取抗原，持续5min；

4.在PBS中洗涤载片3次，持续5min；

5.在RT下在1％BSA/0.3％Triton X100/PBS溶液(封闭溶液)中封闭切片，持续30min；

6.在封闭溶液中1:200稀释家兔抗Sema3a(abcam，ab23393)第1抗体。在RT下在载片上孵育切片隔夜；

7.在PBS中冲洗载片3次，持续5min；

8.在DAPI/0.3％Triton X100/PBS溶液中以1:400稀释与驴抗家兔Alexafluor546(Invitrogen，A10040)一起孵育的第2抗体。在RT下在载片上孵育切片3小时；

9.在PBS中冲洗载片3至5次，持续5min；

10.通过Aquamount对切片进行盖玻片放置且使其风干；

11.以40×放大率将切片成像且进行强度分级。

每一人类供体三个切片集合经免疫染色Sema3A。Sema3A标记使用5分定级方案(0＝未检测到，1＝低强度，极少斑点，2＝中等强度，若干斑点，3＝明亮强度、广泛的染色，以及4＝极亮强度、充足检测)由先前为此特定任务进行训练的观测者在这些区域中的每一者中进行独立地评估。观测者不了解眼供体的健康状况。在视网膜内，Sema3A与视网膜血管的血管结构壁相关联。与无眼部病变的糖尿病相比，视网膜血管结构及视网膜脑实质中的Sema3A表达在患有糖尿病性黄斑水肿的患者中增大(图1)。

实施例2：抑制VEGF诱导的渗透性

测量棕色挪威大鼠的视网膜中的渗透性。玻璃体内注射重组人类VEGF-A(250ng/2.5μl)以诱导高渗透性。抗体与VEGF同时注射。在VEGF治疗之后24h将伊凡氏蓝染料(45mg/ml)静脉内注射至正中尾静脉(Vena caudalis mediana)中(1ml/kg)。30分钟后摘除眼睛且固定在福尔马林中。制备视网膜平铺片且使用共焦荧光显微镜及影像分析软件来测量620nm下的伊凡氏蓝荧光。

结果描绘于图2中。本发明的抗体完全抑制由VEGF诱导的渗透性。此类似于通过VEGF捕获剂阿柏西普所观察到的结果。针对Nrp1配体信号蛋白3A的抗体并不抑制视网膜中VEGF-A诱导的渗透性。此证实针对Nrp1的A域的本发明的抗体抑制VEGF-A介导的作用且此能力将本发明的抗体与针对Nrp1配体信号蛋白3A的抗体区分开。本发明人已展示针对Sema3A的抗体完全抑制由Sema3A诱导的渗透性，但不抑制由VEGF-A诱导的渗透性。本发明人假设通过针对Nrp1的A域的抗体抑制VEGF-A诱导的视网膜渗透性是由空间干扰由Nrp1、VEGF受体2及其他共受体组成的信号传导全受体复合物所引起。

实施例3：产生针对Nrp1A及Nrp1B的抗体以用于比较性目的

出于比较目的，本发明人已研发出分别针对Npr1A及Nrp1B的抗体，如WO2008143666及WO2007056470中所公开。这些抗体包括：

-针对Nrp1A的抗体，其被称为“YW64.3”；及

-针对Nrp1B的抗体，其被称为“YW107.4.87”。

抗Nrp1A抗体在WO2007056470中公开为克隆“YW64.3”，其具有以下特征：

-重链可变域为WO2007056470中编号为4的序列，且

-轻链可变域为WO2007056470中编号为3的序列。

抗Nrp1B抗体在WO2007056470中公开为克隆“YW107.4.87”，其具有以下特征：

-重链为WO2007056470中编号为6的序列，且

-轻链为WO2007056470中编号为5的序列。

YW64.3及YW107.4.87的序列如下概括于下表6中。

表6：

实施例4：Sema3A诱导的细胞骨架瓦解分析-本发明的抗体在Sema3A诱导的阻抗降低中的效能及本发明的抗体与克隆YW64.3及YW107.4.87之间的比较

Nrp1抗体的细胞活性通过使用XCELLigence系统(实时细胞分析仪器，如通过ACEABiosciences商品化)来测量人类视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)中的细胞骨架瓦解进行分析。该系统经由细胞阻抗来测量细胞连接、汇合及完整性。HRMEC内源性地表达神经纤毛蛋白-1(Nrp1)及丛蛋白，其为3类信号蛋白全受体的组分。通过结合于此受体复合物，信号蛋白诱导内皮中的F肌蛋白纤维瓦解。在此功能性分析中，将重组Sema3A蛋白质添加至人类视网膜微血管内皮细胞的汇合层使因细胞骨架瓦解及后续细胞收缩所致的细胞阻抗降低，其测定为细胞阻抗减小。

简单来说，E盘经涂布有接合因子。以20000个细胞/孔的密度接种细胞且接着使其在XCELLigence装置内部在其正常生长条件下生长成单层隔夜。在存在3mM CaCl₂下添加具有或不具有Nrp1抗体组合的Sema3A。细胞指数经正规化至添加物质之前的时间点。刺激之后5h进行计算。

为在细胞骨架瓦解分析中判定本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)、克隆YW64.3及YW107.4.87与针对Sema3A的抗体之间的功能性效能及比较，将Sema3A浓度反应曲线与随IC₅₀偏移实验增大的抗体浓度组合。执行Gaddum Schild曲线绘制以计算pA₂值(需要抗体浓度的负对数以将Sema3A浓度反应曲线偏移2个系数)。以M为单位的效能为根据pA₂值计算为POTENCY(10；-X)，且公开于下表7中。

表7

实施例5：VEGF诱导的细胞完整性丧失分析-本发明的抗体在VEGF-A诱导的阻抗降低中的效能及本发明的抗体、克隆YW64.3及YW107.4.87与VEGF捕获剂之间的比较

VEGF-A诱导细胞间接触松弛，其可测量为内皮细胞的暂时阻抗降低。本发明的抗体预防官能性VEGF-A诱导的阻抗降低。Nrp1抗体预防VEGF诱导的细胞完整性丧失的细胞活性为通过使用XCELLigence系统(实时细胞分析仪器，如由ACEA Biosciences商品化)测量人类视网膜微血管内皮细胞的阻抗降低进行分析。HRMEC内源性表达神经纤毛蛋白-1(Nrp1)及VEGFR2，VEGF全受体的组分。VEGF-A诱导内皮细胞之间的细胞接面松弛。在此功能性分析中，将重组VEGF-A蛋白质添加至人类视网膜微血管内皮细胞的汇合层使因细胞完整性丧失所致的细胞阻抗降低。

简单来说，E盘经涂布有接合因子。以20000个细胞/孔的密度接种细胞且接着使其在XCELLigence装置内部在其正常生长条件下生长成单层隔夜。在添加VEGF-A及抗体之前，将培养基变为含有0.5％BSA的无血清培养基持续3小时。细胞指数经正规化至添加物质之前的时间点。刺激之后大致30分钟，以VEGF诱导的阻抗最小值进行计算。

为判定功能性效能，测量抗体预防由固定浓度的重组人类VEGF-A诱导的细胞完整性丧失的EC50。计算个别实验的EC50值的几何平均值。本发明的例示性抗体(具有SEQ IDNO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)及若干比较性分子的结果概括于下表8中。

表8

实施例6：抗VEGF治疗及抗Nrp1A对于小鼠OIR模型中的尖端细胞密度、无血管区及视网膜前簇的作用

在氧诱导的视网膜病(OIR)的小鼠模型中研究本发明的例示性抗体(具有SEQ IDNO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)对于缺血性无血管区的血管再生的作用。使C57Bl/6J小鼠幼仔在产后第7天至产后第12天暴露于75％氧氛围。此导致中央视网膜中的血管退化且形成无血管区。返回至常氧条件之后，此区变为缺血性的。在产后第12天在异氟醚麻醉下，幼畜的每一眼睛接受单一玻璃体内注射的含10μg抗体的0.5μl溶液。在产后第17天，动物经处死且摘除眼睛。将眼睛固定在福尔马林中且制备视网膜平铺片，其中通过同工凝集素B4染色视网膜血管。计数沿完整视网膜的无血管前端(视网膜的血管化周边区与无血管中心区之间的边界)处的尖端细胞(引发新血管形成的特定内皮细胞)数目。尖端细胞通过其显示丝状伪足延伸的特定形态而经识别。将尖端细胞数目正规化为无血管前端的长度以用于分析。使用共焦显微镜及影像分析软件测定无血管区的大小。对侧眼用于眼杯的组织学分段且对视网膜前细胞核进行计数。

本发明的抗体增大小鼠OIR模型的尖端细胞密度(图3A)。此外，其展示无血管区减小(图3C)。相比之下，VEGF捕获剂阿柏西普既不增大尖端细胞密度亦不减小无血管区。尖端细胞密度与无血管区的大小之间存在负相关性(图3B)，其指示两种参数的机制依赖性。总体而言，本发明的抗体减小氧诱导的视网膜病动物模型中的缺血性无血管区大小，其指示对于糖尿病性黄斑缺血的有益作用。由视网膜前细胞核证实的玻璃体的病理性新血管生成经阿柏西普抑制，而本发明的抗体显示此病理性病状的中等减轻(图3D)。

实施例7：家兔眼睛中本发明的抗体与阿瓦斯汀(Avastin)t1/2的比较

本发明人已测量本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)在各种病状中的半衰期。结果概括于以下表9中。

表9：

玻璃体、视网膜及眼房液的计算半衰期分别为4.8、3.5及4.5天。这些半衰期与文献中针对临床所用重组人源化单克隆IgG1抗体阿瓦斯汀(Avastin)(抗VEGF，贝伐珠单抗，Bakri等人,Opthalmology,2007)所报导的半衰期类似，此情况亦以内部实验方式证实。这些结果如所预期，因为全长IgG的玻璃体内消除率主要视其分子尺寸而定，本发明的抗体及阿瓦斯汀的消除率类似。因此，预期本发明的抗体及的人类PK(包括眼部半衰期)是类似的。的所报导人类眼部半衰期为9.73±1.48天(Hutton-Smith，2016)。

实施例8：对人类Nrp1A的结合亲和力

本发明人已分析本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)的结合亲和力。

此实验的运作缓冲液及所有稀释液(除所陈述之外)由具有0.01％Tween20的PBS-T-EDTA[将100μl 100％Tween20添加至2L PBS-T-EDTA中得到最终Tween 20浓度为0.01％]实现。GLM传感器芯片根据制造商的建议正规化且预调节。传感器芯片在水平方向上用EDC/s-NHS的等量混合物以30μl/min的流动速率激活300sec，且在水平方向上用重组蛋白质A/G(6μg/ml/10mM乙酸盐(pH 4.5))以30μl/min的流动速率固定300sec，在表面上产生约4370至4875RU的蛋白质A/G。传感器芯片在水平方向上用1M乙醇胺HCl以30μl/min的流动速率失活化300sec。传感器芯片用0.85％磷酸以100μl/min的流动速率稳定18sec，水平方向3次及竖直方向3次。

本发明的抗体(0.6μg/ml)以30μl/min的流动速率在蛋白质A/G表面上竖直地捕获300sec，产生约1678RU捕获量。通过以100μl/min的流动速率水平地注射PBS-T-EDTA60 sec以及解离120sec来稳定基线。以30μl/min的流动速率将分析物水平注射于所捕获抗体上300sec且解离1800sec。分析物的浓度为0nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM及100nM。表面通过以100μl/min的流动速率注射0.85％磷酸18sec，水平方向一次及竖直方向一次而再生。以100μl/min的流动速率注射PBS-T-EDTA60 sec，竖直方向一次且水平方向一次。

自原始数据减去点间(与传感器表面的相互作用)及空白(具有0.01％Tween20或0nM分析物的PBS-T-EDTA)。接着将传感器图谱全部拟合为1:1朗格缪尔(Langmuir)结合，以得到缔合速率(ka)、解离速率(kd)及亲和力(K_D)值。

结果概括于以下表10中。

表10：

实施例9：分析本发明的抗体的免疫原性

本发明人已分析根据本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)的经预测免疫原性。为此目的，本发明人已使用电脑工具来预测此类T细胞表位(由EpiVax研发的EpiMatrix)。

通过筛选多个人类抗体分离物的序列，EpiVax已识别出被认为具有调节潜力的若干高度保守性HLA配体。实验证据表明这些肽中的多者在大部分个体中为积极耐受的。这些高度保守的调节且混杂的T细胞表位被称为调节T细胞表位(Tregitopes)(De Groot等人，Blood.2008年10月15日；112(8):3303-11)。可在大量调节T细胞表位存在下有效地控制人源化抗体中所含有的新表位的免疫原性潜能。

出于抗体免疫原性分析的目的，EpiVax包括经调节T细胞表位调节的EpiMatrix分数及抗治疗性抗体反应的相应预测。为计算经调节T细胞表位调节的EpiMatrix分数，自EpiMatrix蛋白质分数扣除调节T细胞表位的分数。经调节T细胞表位调节的分数已展示与23种商购抗体集合的所观察临床免疫反应充分相关(De Groot等人，Clin Immunol.2009年5月；131(2):189-201)。

EpiMatrix评分的结果概括于以下表11中。

表11：

本发明的抗体的序列的分数在EpiMatrix评分的低端上，其指示本发明的抗体具有对免疫原性的较强限制潜能。该EpiMatrix评分为本领域技术人员所熟知的且可特别发现于出版物Mufarrege等人，Clin Immunol.,2017年3月；176:31-41的图2中。

实施例10：本发明的抗体、YW64.3及YW107.4.87对于人类Nrp1的结合亲和力的比较

本发明人已分析本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)对于人类Nrp1的结合亲和力以及YW64.3及YW107.4.87对于人类Nrp1的结合亲和力。

此实验的运作缓冲液及所有稀释液(除所陈述之外)由具有0.01％Tween20的PBS-T-EDTA[将100μl 100％Tween20添加至2L PBS-T-EDTA中得到最终Tween 20浓度为0.01％]实现。GLM传感器芯片根据制造商的建议正规化且预调节。传感器芯片在水平方向上用EDC/s-NHS的等量混合物以30μl/min的流动速率激活300sec，且在水平方向上用重组蛋白质A/G(60μg/ml/10mM乙酸盐，pH 4.5)以30μl/min的流动速率固定300sec。传感器芯片在水平方向上用1M乙醇胺HCl以30μl/min的流动速率失活化300sec。传感器芯片用0.85％磷酸以100μl/min的流动速率稳定18sec，水平方向3次及竖直方向3次。

本发明的例示性抗体及YW64.3及YW107.4.87经捕获于6个竖直信道中的3个信道上的蛋白质A/G表面上。在PBS-T-EDTA缓冲液中以100、50、25、12.5、6.25及0nM的浓度制备人类Nrp1A。使用PBS-T-EDTA缓冲液注射液作为动力学数据分析的双参考。将人类Nrp1A溶液及PBS-T-EDTA缓冲液中的每一者以40μL/min的流动速率历时5min在6个水平通道上方同时注射，随后为30min解离阶段。表面通过以100μL/min的流动速率注射0.85％磷酸18sec，随后以100μL/min的流动速率注射PBS-T-EDTA 60sec而再生。自原始数据减去点间(与传感器表面的相互作用)及空白(具有0.01％Tween20或0nM分析物的PBS-T-EDTA)。接着将传感器图谱全部拟合为1:1朗格缪尔结合，以得到缔合速率(ka)、解离速率(kd)及亲和力(K_D)值。

结合于人类Nrp1的本发明的抗体、YW64.3及YW107.4.87的动力学及亲和力数据分别列于下表12中。

表12：

样本名称	对于人类Nrp1的Kd
		抗Nrp1A(YW64.3)	11.3nM
抗Nrp1B(YW107.4.87)	37.5nM
		本发明的抗体	11.1nM

实施例11：本发明的抗体与YW64.3的蛋白质热稳定性的比较

差示扫描热量测定(DSC)是热力学技术，其测量随温度变化而变化的热容量且构成分析蛋白质构象的热稳定性的最准确方法。DSC广泛用于分析蛋白质热稳定性及构象变化。将来自样本细胞的信号与一致溶液环境中的缺乏蛋白质的参考细胞相比。随着细胞的温度增大，连续地测量参考细胞与样本细胞之间的温度差且校准至功率单元。此数据信道称为DP信号或参考细胞与样本细胞之间的差异功率。DP信号经转换为热容量。随温度变化连续地记录热容量。所得热分析图的缓冲减法及分析之后，可获得每一转变的焓及(明显)热量转变中点(T_m)。

蛋白质解折叠温度(T_m)与抗体稳定性相关联，特别是与治疗性产品的储存期间的聚集及长期稳定性相关联。单克隆抗体CH2及CH3域的热转变对同种型内的不同抗体是不同的，其中CH2域在CH3域之前解折叠。

本发明人已比较以下抗体的T_m：

-本发明的抗体，更精确而言具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ IDNO:11中所描绘的序列作为VL的“克隆I”，及

-克隆YW64.3，如本文实施例3中所公开，用于比较性目的。

主导化合物及YW64.3以1mg/ml在pH 6.0的10mM组氨酸中的热解折叠及聚集经由自动化毛细管差示扫描热量测定(MicroCal，LLC)以60℃/h的扫描速率自25℃至110℃进行监测。使用Origin 7.0软件(Origin-Lab)分析数据。所有热分析图使用Origin的2态模型进行基线校正且拟合，以获得用于解折叠的明显中点温度(T_m)。

主导化合物及YW64.3的熔融曲线公开于下表13中。

表13：

	Tm1(℃)	Tm2(℃)	Tm3(℃)
				本发明的抗体	68.33	83.23	89.70
克隆YW64.3	68.50	81.96	84.65

对于pH 6的10mM组氨酸中的本发明的抗体，第一T_m出现在68.33℃下，此有可能对应于CH2域的解折叠。两个其他T_m：83.23℃及89.70℃分别对应于CH3域及Fab区。类似地，对于YW64.3，CH2域在68.5℃下解折叠，随后CH3在81.96℃下解折叠，且最后Fab域在84.65℃下解折叠。因此，本发明的抗体的Fab解折叠温度相较于YW64.3高约5℃。

更高T_m值意味着在给定温度下更少分子填充解折叠状态。因此，更高T_m值有益于治疗性蛋白质药物，这是由于高T_m值维持生理温度下的活性构象。

实施例12：本发明的抗体并不预防Nrp1与VEGF的结合

本发明人已进一步展示在竞争性分析中，本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆i)可结合于人类Nrp1，甚至在VEGF存在且结合于Nrp1的情况下。

为此目的，通过在样本盘中将每一传感器浸没在以1×动力学缓冲液(MolecularDevices)制备的10ug/mL生物素标记的hVEGF165溶液中2分钟来将生物素标记的人类血管内皮生长因子-165(hVEGF165)捕获于链霉亲和素传感器尖端(Molecular Devices,LLC.San Jose CA)上。接着将传感器移动至具有1×动力学缓冲液的孔以洗除任何未结合分子2分钟。接着经由hVEGF165捕获以1×动力学缓冲液制备的100nM人类Nrp1 10分钟。最后，将传感器浸渍至不同浓度(100nM及400nM)的本发明的抗体中10分钟。

将来自活性传感器的数据与不包括hVEGF165捕获物、hNrp1及抗体的若干对照进行比较。

数据展示本发明的抗体可结合于人类Nrp1，甚至在VEGF存在且结合于Nrp1的情况下(图4)。

此指示本发明的抗体并不预防VEGF与人类Nrp1的结合。

实施例13：本发明的抗体并不预防VEGF-A诱导的内皮细胞增殖

VEGF-A为诱导增殖的内皮细胞的最重要生长因子之一。使用Incucyte系统(Sartorius)研究人类视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)中的内皮细胞增殖。在此功能性分析中，将重组VEGF-A蛋白质添加至HRMEC的亚汇合层来诱导其增殖。

简单来说，96孔盘经涂布有明胶。以3000个细胞/孔的密度接种细胞且接着使其连接于完整内皮生长培养基中18个小时。将细胞用补充有2％FCS的内皮基础培养基洗涤一次且接着在相同培养基中培养八小时。添加VEGF-A和/或抗体(包括本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I))且使细胞在Incucyte装置内部生长。每4小时获得相对比图像，持续总计96小时。使用所述影像来评估细胞计数。细胞计数经正规化至添加物质之前的时间点。曲线下面积是根据生长曲线计算的且已减去基线值(图5)。

本发明人已展示本发明的抗体并不预防由10ng/mL VEGF-A诱导的内皮细胞增殖，然而VEGF捕获剂阿柏西普展示VEGF-A诱导的HRMEC增殖的剂量依赖型减小。

实施例14：VEGF诱导的网络形成分析-在具有纤维母细胞的共培养中本发明的抗体在VEGF-A诱导的内皮网络样结构形成中的功效及本发明的抗体与VEGF捕获剂之间的比较

VEGF-A为血管生成的关键调节因子，其强有力地诱导自预先存在的血管生长新血管。当在纤维母细胞细胞层的顶部上培养时，血管生成可经体外测量作为内皮细胞配置呈网络样结构的能力。可在通过内皮细胞标记物CD31染色之后定量网络形成。

本发明人已分析且比较以下抗体预防VEGF诱导的内皮网络形成的能力：

-本发明的例示性抗体(具有SEQ ID NO:10中所描绘的序列作为VH及SEQ ID NO:11中所描绘的序列作为VL的克隆I)，及

-抗VEGF抗体(贝伐珠单抗，)。

更精确而言，所述化合物预防VEGF诱导的内皮网络形成的细胞活性是通过其在具有纤维母细胞的共培养物中预防VEGF-A诱导的内皮网络结构形成的能力来分析的。HUVEC内源性表达神经纤毛蛋白-1(Nrp1)及VEGFR2，VEGF全受体的组分。在此功能性分析中，将重组VEGF-A蛋白质添加至接种于纤维母细胞的汇合层顶部上的内皮细胞使内皮网络形成增大。

简单来说，在相等份的FGM-2及EGM培养基的混合物中，将来自幼年型包皮(NHDF)的正常人类真皮纤维母细胞以25000个细胞/孔的密度接种于CellCarrier Ultra 96孔盘中将NHDF在正常生长条件下培养7天，其中一个培养基改变。移除该培养基且将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)以5000个细胞/孔的密度接种于NHDF的顶部上的1/10EGM/EBM混合物中。

使HUVEC连接于培养箱中4小时。移除培养基且接着以固定浓度的重组人类VEGF-A刺激细胞及抗体在1/10EGM/EBM培养基中的浓度反应曲线。将细胞在正常培养条件下培养7天，其中第3天更换为新鲜制备的刺激培养基。

接着在冰上将细胞固定于70％乙醇/H₂O中30min，随后在DPBS+1％BSA中封闭30min。在室温下将内皮细胞用CD31抗体(Miltenyi 130-108-038)染色60min。在用DPBS洗涤3次后，添加488标记的二级抗体(抗小鼠IgG PAb-A488 PLUS；Thermo A32723)及Hoechst且在室温下在黑暗中孵育60min。将细胞用DPBS洗涤3次。在AF488及Hoechst的通道处使用具有5×空气物镜的Opera Phenix使所述盘成像。细胞核的Hoechst染色仅用于证实在染色程序之后细胞层是完整的，但不包括于影像分析中。使用Harmony 4.9软件计算每孔的488阳性网络面积。

为判定功能性效能，测量抗体预防由固定浓度的重组人类VEGF-A诱导的内皮网络形成的IC₅₀。

计算VEGF-A诱导的网络面积(＝平均VEGF-A诱导的网络面积-平均基础网络面积)且设定成100％。结果展示于图6中。

关于VEGF-A作用的数据呈现为均值±SD。计算个别实验的IC₅₀值的几何平均值。计算在最高抗体浓度下的最大功效，其呈VEGF诱导的网络面积的抑制百分比形式；且计算均值。结果概述于表14中。

表14：

本发明人已展示本发明的抗体对VEGF-A诱导的体外血管生成不具有显著作用。相比之下，VEGF捕获剂(贝伐珠单抗，)有效且强有力地预防VEGF-A诱导的网络形成。

这些结果证实本发明的抗体并不影响VEGF-A诱导的血管生成，但预防由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障破坏的令人惊讶且意外的特性。

实施例15：棕色挪威大鼠中激光诱导的脉络膜新血管生成-本发明的抗体对于棕色挪威大鼠中激光诱导的脉络膜新血管生成的功效及本发明的抗体与VEGF捕获剂之间的比较

VEGF-A为血管生成的关键调节因子，其强有力地诱导自预先存在的血管生长新血管。血管生成可在体内眼睛中测量为在通过激光光凝产生视网膜色素上皮(RPE)及布鲁赫膜(Bruch's membrane)的病变后的VEGF-A相依性脉络膜新血管生成。在RPE、脉络膜及巩膜的平铺片中用同工凝集素B4染色病变之后，可定量新血管生成。此实验性体内模型依赖于激光损伤以使布鲁赫膜穿孔，导致自脉络膜的视网膜下血管募集。此证明适用于对测试抗血管生成疗法进行测试。

本发明人已分析且比较以下各者对于激光诱导的脉络膜新血管生成的作用：

-VEGF捕获剂(阿柏西普，)。

自Charles River Labs(Sulzfeld,Germany)获得体重在160g与180g之间的雄性棕色挪威大鼠(BN/Crl)。在麻醉下，将动物放置于眼底相机的前端中以将视神经定位在影像的中心中。激光处理使用Micron IV系统(Phoenix Research Laboratories,Pleasanton,CA)以532nm波长的绿色氩激光(Merilas)执行。

激光束的直径与视神经的直径匹配且使用能量为400mW且持续时间为150毫秒的激光脉冲来使每一眼睛产生4种病变。

将病变以距视神经约两倍其直径的距离置入大血管之间。布鲁赫膜的成功破坏通过紧接在激光束之后的气泡形成识别且通过OCT扫描证实。

对于玻璃体内注射，大鼠经腹膜内注射氯胺酮(67mg/kg)及赛拉嗪(xylazin)(6.7mg/kg)麻醉。瞳孔通过局部施用Mydrum滴眼剂而扩张且另外，动物接受镇痛滴眼剂(Novesine 0.4％)。通过34G Hamilton注射器在锯齿缘(Ora serrata)进行注射至玻璃体中。每一只眼睛接受两次5μl体积的玻璃体内注射。第一次玻璃体内注射紧接在激光处理之后(在相同麻醉内)在第1天执行，且第二次玻璃体内注射在第8天执行。

动物为在激光处理之后14天在麻醉下通过颈椎脱位术处死。眼睛经摘除且沿锯齿缘切割。角膜、虹膜、晶体、玻璃体及视网膜经摘除，且在4℃下剩余眼杯(由RPE、脉络膜及巩膜组成)在PFA (4％)中固定1h，且接着在4℃下转移至含有0.1％Triton X-100的PBS中1h。眼杯在黑暗中在室温下用FITC标记的同工凝集素B4(10μg/ml/生理盐水)染色隔夜且通过PBS洗涤3次。眼杯经转移至玻璃载片且切割四次以达成平整三叶草样结构。组织经覆盖有封固剂(含有DAPI的Vectashield H-1200)且将盖玻片放置在顶部上以获得RPE/脉络膜/巩膜平铺片(RPE朝上)。样本为通过LSM 700共焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss,Jena)在488nm的波长下进行分析且通过影像分析判定病变大小。

结果展示于图7中。本发明的抗体对病变面积不具有作用，而VEGF捕获剂减小病变面积达24％。因此，本发明的抗体并不影响棕色挪威大鼠的VEGF-A依赖性脉络膜新血管生成。

所述结果证实本发明的抗体并不抑制由VEGF-A诱导的血管生成。此证实本发明的抗体极其有助于将促进血管再生的临床情况，例如患有糖尿病性黄斑缺血的将受益于视网膜的血管再生的患者。

如本发明的整个公开内容所解释，本发明的抗体抑制Sema3A的血管排斥作用，因此允许将血管生成重引导至缺血性区域。另外，其一方面预防由Sema3A诱导的血液视网膜屏障破坏且另一方面预防由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障破坏。

不管其对于由VEGF-A诱导的血液视网膜屏障的渗透性的抑制作用如何，本发明的抗体出乎意料地对由VEGF-A诱导的血管生成不具有作用。

因此，如本文所示，本发明的抗体并不预防血管再生，从而指示其将不妨碍缺血性区域的血管生成。因此，这些结果证实本发明的抗体高度有益于改善缺血性无血管区域的血管再生，通常地在患有PDR(特别DMI)的患者的视网膜中。

SEQUENCE LISTING

<110> 勃林格殷格翰国际有限公司

<120> 抗NRP1A抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途

<130> 01-3397

<150> EP20150942.9

<151> 2020-01-09

<150> EP19199099.3

<151> 2019-09-24

<160> 35

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1 - Kabat

<400> 7

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1 - Chothia

<400> 8

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2 - Chothia

<400> 9

Ser Arg Thr Gly Tyr

1 5

<210> 10

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH – 变体 1

<400> 10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Gln Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Gln Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL – 变体 a

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH – 变体 2

<400> 12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

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Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH – 变体 3

<400> 13

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gln Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH- 变体 4

<400> 14

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1 5 10 15

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35 40 45

Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH- 变体 5

<400> 15

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Val Ser Ser

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<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH- 变体 7

<400> 17

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 I

<400> 18

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 - 克隆 I

<400> 19

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210

<210> 20

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 II

<400> 20

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

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<210> 21

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 III

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

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<210> 22

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 IV

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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<210> 23

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 V

<400> 23

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

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355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

<210> 24

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 VI

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Gln Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Gln Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

<210> 25

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆 VII

<400> 25

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Arg Thr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Gln Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Val Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

<210> 26

<211> 923

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 人 Nrp1A

<400> 26

Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys

20 25 30

Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr

35 40 45

His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr

50 55 60

Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg

65 70 75 80

Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn

85 90 95

Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val

100 105 110

Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu

115 120 125

Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Ile Phe Lys Arg Gly

130 135 140

Pro Glu Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser

145 150 155 160

Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile

165 170 175

Val Phe Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe

180 185 190

Asp Leu Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr

195 200 205

Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile

210 215 220

Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu

245 250 255

Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp

260 265 270

Phe Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser

275 280 285

Asp Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu

290 295 300

Arg Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp

305 310 315 320

Ser Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val

325 330 335

Thr Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys

340 345 350

Tyr Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp

355 360 365

Trp Ile Thr Ile Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn

370 375 380

Thr Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile

385 390 395 400

Thr Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser

405 410 415

Met Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser

420 425 430

Gly Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr

435 440 445

Ser Ser Asn Gln Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu

450 455 460

Val Thr Ser Arg Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr

465 470 475 480

Ile Asn Glu Trp Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg

485 490 495

Gly Ile Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met

500 505 510

Arg Lys Phe Lys Ile Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met

515 520 525

Ile Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn

530 535 540

Asn Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg

545 550 555 560

Phe Ile Arg Ile Tyr Pro Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu

565 570 575

Arg Met Glu Leu Leu Gly Cys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ala Gly Pro

580 585 590

Thr Thr Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Glu Cys Asp Asp Asp Gln Ala

595 600 605

Asn Cys His Ser Gly Thr Gly Asp Asp Phe Gln Leu Thr Gly Gly Thr

610 615 620

Thr Val Leu Ala Thr Glu Lys Pro Thr Val Ile Asp Ser Thr Ile Gln

625 630 635 640

Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp Gly Ser

645 650 655

His Lys Thr Phe Cys His Trp Glu His Asp Asn His Val Gln Leu Lys

660 665 670

Trp Ser Val Leu Thr Ser Lys Thr Gly Pro Ile Gln Asp His Thr Gly

675 680 685

Asp Gly Asn Phe Ile Tyr Ser Gln Ala Asp Glu Asn Gln Lys Gly Lys

690 695 700

Val Ala Arg Leu Val Ser Pro Val Val Tyr Ser Gln Asn Ser Ala His

705 710 715 720

Cys Met Thr Phe Trp Tyr His Met Ser Gly Ser His Val Gly Thr Leu

725 730 735

Arg Val Lys Leu Arg Tyr Gln Lys Pro Glu Glu Tyr Asp Gln Leu Val

740 745 750

Trp Met Ala Ile Gly His Gln Gly Asp His Trp Lys Glu Gly Arg Val

755 760 765

Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu Gly Glu

770 775 780

Ile Gly Lys Gly Asn Leu Gly Gly Ile Ala Val Asp Asp Ile Ser Ile

785 790 795 800

Asn Asn His Ile Ser Gln Glu Asp Cys Ala Lys Pro Ala Asp Leu Asp

805 810 815

Lys Lys Asn Pro Glu Ile Lys Ile Asp Glu Thr Gly Ser Thr Pro Gly

820 825 830

Tyr Glu Gly Glu Gly Glu Gly Asp Lys Asn Ile Ser Arg Lys Pro Gly

835 840 845

Asn Val Leu Lys Thr Leu Asp Pro Ile Leu Ile Thr Ile Ile Ala Met

850 855 860

Ser Ala Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Val Leu Tyr

865 870 875 880

Cys Ala Cys Trp His Asn Gly Met Ser Glu Arg Asn Leu Ser Ala Leu

885 890 895

Glu Asn Tyr Asn Phe Glu Leu Val Asp Gly Val Lys Leu Lys Lys Asp

900 905 910

Lys Leu Asn Thr Gln Ser Thr Tyr Ser Glu Ala

915 920

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 表位

<400> 27

Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 28

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW64.3- HC

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Glu

20 25 30

Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 29

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW64.3-LC

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ser Val Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 30

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW64.3-VH

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Glu

20 25 30

Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Gly Lys Asn Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg Trp Gly Lys Lys Val Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW64.3-VL

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ser Val Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 32

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW107.4.87- HC

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg Met Ser Lys Val Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 33

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW107.4.87- LC

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Gly Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 34

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW107.4.87- VH

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

35 40 45

Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg Met Ser Lys Val Met Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> YW107.4.87- VL

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Gly Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

Claims

1.一种抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其包含：

重链可变区，该重链可变区包含：如SEQ ID NO:1所示的H-CDR1；如SEQ ID NO:2所示的H-CDR2；及如SEQ ID NO:3所示的H-CDR3；及

轻链可变区，该轻链可变区包含：如SEQ ID NO:4所示的L-CDR1；如SEQ ID NO:5所示的L-CDR2；及如SEQ ID NO:6所示的L-CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17至少80％一致的氨基酸序列的重链可变区；及

包含与SEQ ID NO:11至少80％一致的氨基酸序列的轻链可变区。

3.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17至少90％一致的氨基酸序列的重链可变区；及

包含与SEQ ID NO:11至少90％一致的氨基酸序列的轻链可变区。

4.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17至少95％一致的氨基酸序列的重链可变区；及

包含与SEQ ID NO:11至少95％一致的氨基酸序列的轻链可变区。

5.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17至少98％一致的氨基酸序列的重链可变区；及

包含与SEQ ID NO:11至少98％一致的氨基酸序列的轻链可变区。

6.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17至少99％一致的氨基酸序列的重链可变区；及

包含与SEQ ID NO:11至少99％一致的氨基酸序列的轻链可变区。

7.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区；及

包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变区。

8.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:

11的氨基酸序列的轻链可变区。

9.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:

11的氨基酸序列的轻链可变区。

10.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:

11的氨基酸序列的轻链可变区。

11.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:

11的氨基酸序列的轻链可变区。

12.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:

11的氨基酸序列的轻链可变区。

13.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:

11的氨基酸序列的轻链可变区。

14.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:

11的氨基酸序列的轻链可变区。

15.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链；及

包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

16.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

由SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的重链；及

由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成的轻链。

17.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

18.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

19.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

20.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

21.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

22.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

23.根据权利要求1所述的抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。

24.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至23中任一项的抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载剂。

25.根据权利要求1至23中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求24所述的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段通过非经肠施用途径、静脉内施用途径、玻璃体内施用途径或皮下施用途径施用。

26.根据权利要求1至23中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求24所述的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段通过玻璃体内施用途径施用。

27.根据权利要求1至23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求24所述的药物组合物在制备用于治疗或预防糖尿病性黄斑水肿和/或糖尿病性黄斑缺血的药物中的用途。

28.一种抗Nrp1A抗体，其包含：由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的重链及由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成的轻链。

29.一种抗Nrp1A抗体，其包含：由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的重链及由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成的轻链。

30.一种抗Nrp1A抗体，其包含：由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的重链及由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成的轻链。

31.一种抗Nrp1A抗体，其包含：由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的重链及由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成的轻链。

32.一种抗Nrp1A抗体，其包含：由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成的重链及由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成的轻链。

33.一种抗Nrp1A抗体，其包含：由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的重链及由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成的轻链。

34.一种抗Nrp1A抗体，其包含：由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的重链及由SEQ IDNO:19的氨基酸序列组成的轻链。

35.一种药物组合物，其包含根据权利要求28至34中任一项的抗体及药学上可接受的载剂。

36.根据权利要求28至34中任一项的抗体或根据权利要求35所述的药物组合物，其中该抗体通过非经肠施用途径、静脉内施用途径、玻璃体内施用途径或皮下施用途径施用。

37.根据权利要求28至34中任一项的抗体或根据权利要求35所述的药物组合物，其中该抗体通过玻璃体内施用途径施用。

38.根据权利要求28至34中任一项所述的抗体或根据权利要求35所述的药物组合物在制备用于治疗或预防糖尿病性黄斑水肿和/或糖尿病性黄斑缺血的药物中的用途。

39.一种或多种分离的多核苷酸，其包含：

编码如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的重链可变区的序列；及

编码如SEQ ID NO:11所示的轻链可变区的序列。

40.一种或多种分离的多核苷酸，其包含：

编码如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示的重链的序列；及

编码如SEQ ID NO:19所示的轻链的序列。

41.一种表达载体，其包含根据权利要求39或40所述的一种或多种分离的多核苷酸。

42.一种宿主细胞，其包含根据权利要求39或40所述的一种或多种分离的多核苷酸或根据权利要求41所述的表达载体。

43.一种用于制造抗Nrp1A抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：

a.获得根据权利要求42所述的宿主细胞；及

b.培养该宿主细胞。

44.根据权利要求43所述的方法，其进一步包含回收且纯化该抗体或其抗原结合片段。