CN114414642A - 用于人乳头瘤病毒16型e6癌蛋白检测的电化学传感器 - Google Patents

Abstract

本发明属于电化学传感器技术领域，公开了一种用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器，所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法包括：合成材料；建立电化学生物传感器；分别利用直接法和间接法测定靶标，绘制标准曲线；分析该传感器的重复性、稳定性和特异性；其中，所述合成材料包括：合成树枝状三元纳米粒子PdBP NSs；合成介孔二氧化硅MSN；合成信号标签。本发明提供的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器，能够实现定量检测，且操作简单，不需要额外的专业技术人员，成本低，线性范围宽，检测限低，能够有效解决现有检测E6癌蛋白的方法中存在的操作相对复杂，设备昂贵，需要专业技术人员等问题。

Description

用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器

技术领域

本发明属于电化学传感器技术领域，尤其涉及一种用于人乳头瘤病毒16型 E6癌蛋白检测的电化学传感器。

背景技术

目前，宫颈癌是威胁女性生命健康的第四大常见癌症。2018年，超过30万女性死于宫颈癌。大多数患者为高危型HPV持续感染所致，其中HPV16约占 50％。研究表明，检测过表达的E6癌蛋白可以区分一过性感染和癌前病变或癌变女性。因此，HPV16 E6癌蛋白被认为是宫颈癌的生物标志物。目前，免疫细胞化学法、免疫金凝集法和Onco E6试验是检测E6癌蛋白的方法。但它们也存在一定的缺点，如操作相对复杂，设备昂贵，需要专业技术人员。电化学免疫传感器是一种替代技术，其操作简单、成本效益高、灵敏度高和检测限低，使该方法成为检测生物标志物的潜在策略。因此，亟需设计一种新的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有检测E6癌蛋白的方法，操作相对复杂，设备昂贵，需要专业技术人员。

解决以上问题及缺陷的难度为：仅要求方法简单，低成本不足以解决实际问题，所设计的新方法还需要有较宽线性范围和较低的检测限。此外，蛋白酶作为一种生物大分子，其活性受pH和温度的影响大，某些蛋白酶需要金属离子作为激活剂，并且蛋白酶的制作工艺、复杂费用高昂。解决以上问题及缺陷的意义为：相比之下，纳米粒子或许是个好的选择。很多具有优异催化性能的纳米材料在低温常压的条件下就能合成。这类纳米材料通常性能稳定，易于保存，不易降解。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于人乳头瘤病毒16型E6 癌蛋白检测的电化学传感器及其制备方法。

本发明是这样实现的，一种用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法包括以下步骤：

步骤一，合成材料；

步骤二，建立电化学生物传感器；

步骤三，分别利用直接法和间接法测定靶标，并绘制标准曲线；

步骤四，分析传感器的重复性、稳定性和特异性。

实现人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白快速、灵敏的定量检测宫颈癌是女性常见的癌症。人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白是宫颈癌的可靠生物标志物。虽然还有其他检测E6癌蛋白的方法，但电化学方法更具优势，如成本低、方便快捷。在这项工作中，开发了一种基于高效催化剂和信号标签的新型双信号电化学免疫传感器，用于快速灵敏地检测人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白。在此，为了实现快速检测，钯-硼-磷树枝状三元纳米球(PdBP NSs)不仅充当催化H2O2的催化剂，而且还充当捕获抗体的载体材料。此外，为了实现灵敏检测，合成了载有亚甲蓝并包覆壳聚糖(MBSi-Chi)的介孔二氧化硅纳米复合材料作为信号标签，可产生电化学信号。在最佳条件下，无标记型免疫传感器的线性范围为100 fg/mL至4ng/mL，检测限为72.8fg/mL(S/N＝3)，夹心型免疫传感器的线性范围为50fg/mL至4ng/mL，检测限为34.1fg/mL(S/N＝3)。所制备的双信号免疫传感器具有理想的特异性、稳定性和可重复性，这意味着其在临床实验室中的潜在应用。

进一步，所述步骤一中的合成材料包括：

(1)合成树枝状三元纳米粒子PdBP NSs；

(2)合成介孔二氧化硅MSN；

(3)合成信号标签。

进一步，所述步骤(1)中的树枝状三元纳米粒子的合成过程包括：

向5mL 9mg/mL的DODAC溶液中加入500μL 0.337M的NH₄F、500μL 0.101M的H₃BO₃和800μL 8.5M的Na₂PdCl₄；400rpm磁力搅拌5min后，向混合溶液中加入400μL 10wt％NH₃·H₂O持续搅拌至溶液变为无色；

加入500μL 2.5mg的NaH₂PO₂，将得到的混合溶液置于硅油浴中95℃加热20min后，滴加500μL DMAB，继续加热30min；在12000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀后，在相同离心条件下分别用超纯水、无水乙醇和超纯水各清洗一次；最后通过冷冻干燥处理得到PdBP粉末。

进一步，所述步骤(2)中的介孔二氧化硅的合成过程包括：

将含有25mg CTAB、7mg NaOH加至12mL超纯水中，再移至烧瓶中，将烧瓶在硅油浴中加热至80℃并持续1h；将125μL TEOS滴加到烧瓶中，保持加热2h；将所得溶液以10000rpm转速离心10min，去除上清收集沉淀，并在相同离心条件下用甲醇清洗3次；将洗涤后所得沉淀分散在无水乙醇中；

将4mL萃取液加入上述无水乙醇分散液中，在90℃下油浴加热45min；在 10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用超纯水、无水乙醇和超纯水分别清洗一次；重复萃取步骤一次，并将清洗后所得沉淀物在37℃下真空干燥20h。

进一步，所述萃取液由7.2mL无水乙醇和0.8mL浓盐酸组成。

进一步，所述步骤(3)中的信号标签的合成过程包括：

将1mL 10mM的亚甲蓝溶液MB与1mL 5mg/mL的MSN分散液混合，超声30min后，在室温下400rpm磁力搅拌4h；在溶液中加入10μL冰醋酸和4mg 壳聚糖Chi，在室温下1500rpm剧烈搅拌12h；

在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用超纯水清洗3次并收集沉淀MBSi-Chi；将所收集的MBSi-Chi 37℃真空干燥20h 后，将MBSi-Chi分散在超纯水中获得1mg/mL的分散液；

将400μL MBSi-Chi、1.2mL E6抗体和466μL 5％戊二醛溶液加入到小烧杯中，在4℃冰箱中磁力搅拌12h；在溶液中加入40μL 0.5％BSA，继续搅拌6h；在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用 Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液清洗3次，将得到的信号标签，即MBsi-Chi复合物重新分散在500μL超纯水中，4℃待用储存。

进一步，所述步骤三中的直接法包括：

①分别用0.3μm和50nm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面后，分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

②将10μL电极修饰材料树枝状三元纳米粒子PdBP NSs滴加在电极表面， 37℃干燥；

③将10μL E6抗体滴加在干燥后的电极表面，37℃孵育2h；

④用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加6μL 0.5％BSA，室温孵育 30min；

⑤用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加8μL E6蛋白，37℃孵育2h；

⑥将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；

⑦将电极置于5mL 0.1M PBS溶液中进行表征，隔40s加入20μL，3.0M H₂O₂，通过安培电流法测量其电流值；

⑧根据所得电流变化值与靶蛋白浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

进一步，所述步骤三中的间接法包括：

①分别用0.3μm和50nm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面后，分别按超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

②将10μL电极修饰材料树枝状三元纳米粒子PdBP NSs滴加在电极表面， 37℃干燥；

③将10μL E6抗体滴加在干燥后的电极表面，37℃孵育2h；

④用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加6μL 0.5％BSA，室温孵育 30min；

⑤用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加8μL E6蛋白，37℃孵育2h；

⑥用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加10μL信号标签，即 MBsi-Chi复合物，37℃孵育2h；

⑦将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；

⑧将电极置于5mL 0.1M PBS溶液中进行表征，通过差分脉冲伏安法测量其电流值；

⑨根据所得电流变化值与靶蛋白浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

进一步，所述PBS溶液包括0.1MNa₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄和0.1M KCl。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法制备得到的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器，能够实现定量检测，操作简单，不需要额外的专业技术人员，成本低，线性范围宽，检测限低，能够有效解决现有检测E6癌蛋白的方法中存在的操作相对复杂，设备昂贵，需要专业技术人员等问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的电极构建流程图；A是本发明实施例提供的信号标签(MBSi-Chi复合物的合成过程)图；B是本发明实施例提供的电极构建过程示意图。

图3-图5是本发明实施例提供的实验结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于人乳头瘤病毒16型E6 癌蛋白检测的电化学传感器，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法包括以下步骤：

S101，合成材料；

S102，建立电化学生物传感器；

S103，分别利用直接法和间接法测定靶标，并绘制标准曲线；

S104，分析传感器的重复性、稳定性和特异性。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

1.合成材料

(1)树枝状三元纳米粒子(PdBP NSs)的合成过程：向5mL DODAC溶液 (9mg/mL)中加入500μL NH₄F(0.337M)、500μL H₃BO₃(0.101M)和800μL Na₂PdCl₄(8.5M)。400rpm磁力搅拌5min后，向混合溶液中加入400μL 10wt％ NH₃·H₂O持续搅拌至溶液变为无色。然后，加入500μL NaH₂PO₂(2.5mg)。将上述得到的混合溶液置于硅油浴中95℃加热20min后，滴加500μLDMAB，继续加热30min。在12000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，然后在相同离心条件下分别用超纯水、无水乙醇和超纯水各清洗一次。最后通过冷冻干燥处理得到PdBP粉末。

(2)介孔二氧化硅(MSN)的合成过程：将含有25mg CTAB、7mg NaOH 加至12mL超纯水中，再移至烧瓶中，将烧瓶在硅油浴中加热至80℃并持续1 小时。然后，将125μL TEOS滴加到烧瓶中，保持加热2小时。将所得溶液以 10000rpm转速离心10min，去除上清收集沉淀，并在相同离心条件下用甲醇清洗3次。随后，将洗涤后所得沉淀分散在无水乙醇中。萃取液由7.2mL无水乙醇和0.8mL浓盐酸组成。将4ml萃取液加入上述无水乙醇分散液中，在90℃下油浴加热45min。然后，在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用超纯水、无水乙醇和超纯水分别清洗一次。重复前面的萃取步骤一次。最后，将清洗后所得沉淀物在37℃下真空干燥20小时。

(3)合成信号标签的过程：首先，将1mL亚甲蓝溶液(MB，10mM)与 1mL MSN分散液(5mg/mL)混合，超声30min，然后在室温下磁力搅拌4h (400rpm)。其次，在上述溶液中加入10μL冰醋酸和4mg壳聚糖(Chi)，在室温下剧烈搅拌12h(1500rpm)。在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用超纯水清洗3次并收集沉淀(MBSi-Chi)。第三，将所收集的MBSi-Chi 37℃真空干燥20h。然后，将MBSi-Chi分散在超纯水中获得分散液(1mg/mL)。将400μL MBSi-Chi、1.2mL E6抗体和466μL 5％戊二醛溶液加入到小烧杯中，在4℃冰箱中磁力搅拌12h。然后，在上述溶液中加入 40μL 0.5％BSA，继续搅拌6h。在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液清洗3次，将得到的信号标签(MBsi-Chi复合物)重新分散在500μL超纯水中，4℃待用储存。

2.建立电化学生物传感器，测定靶标，绘制标准曲线。

(1)直接法：

①分别用0.3μm和50nm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

②将10μL电极修饰材料树枝状三元纳米粒子(PdBP NSs)滴加在电极表面，37℃干燥；

③将10μL E6抗体滴加在干燥后的电极表面，37℃孵育2h；

④用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加6μL 0.5％BSA，室温孵育 30min；

⑤用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加8μL E6蛋白，37℃孵育2h；

⑥将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；

⑦将电极置于5mL，包含0.1MNa₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄，0.1M KCl的0.1M PBS溶液中进行表征，隔40s加入20μL，3.0M H₂O₂，通过安培电流法测量其电流值；

⑧根据所得电流变化值与靶蛋白浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

(2)间接法：

①分别用0.3μm和50nm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

②将10μL电极修饰材料树枝状三元纳米粒子(PdBP NSs)滴加在电极表面，37℃干燥；

③将10μL E6抗体滴加在干燥后的电极表面，37℃孵育2h；

④用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加6μL 0.5％BSA，室温孵育 30min；

⑤用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加8μL E6蛋白，37℃孵育2h；

⑥用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加10μL信号标签(MBsi-Chi 复合物)，37℃孵育2h；

⑦将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；

⑧将电极置于5mL，包含0.1MNa₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄，0.1M KCl的0.1M PBS溶液中进行表征，通过差分脉冲伏安法测量其电流值；

⑨根据所得电流变化值与靶蛋白浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

电极构建流程图如图2所示；其中，图2的A表示信号标签，即MBSi-Chi 复合物的合成过程；图2的B表示电极构建过程。

下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。

如图3-图5所示，本发明设计了一种双信号免疫传感器来检测人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白。一方面，基于钯-硼-磷纳米球(PdBP NSs)制造了无标记型免疫传感器用于快速检测。PdBP NSs是具有树枝状结构的三元纳米粒子，其树突状结构提供了更大的比表面积，使其能够通过Pd和氨基之间的稳定共价键来固定更多的抗体。此外，发现PdBP NSs对H2O2表现出高度的催化活性。原因可能如下：1)B/P合金促进了Pd表面含氧中间体的分解；2)PdBP NSs的树枝状结构暴露了更多的活性位点并加速了质量/电子转移。综上所述，PdBPNSs 具有大的比表面积、良好的导电性和高催化效率，首次应用PdBP NSs来设计免疫传感器。

另一方面，为了进一步提高灵敏度，使用PdBP NSs作为基底材料和 MBSi-Chi纳米复合材料作为人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的信号标记制造了夹心型免疫传感器。亚甲蓝(MB)由于其电化学氧化还原活性而被广泛用于生物传感器。但亚甲蓝易于电聚合，导致不同的形态。这种现象将限制其应用。介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)是一种常见的载体，具有较大的比表面积和孔结构。将亚甲蓝封装到介孔二氧化硅中(MBSi NPs)不仅避免了其电聚合，而且还放大了信号响应。壳聚糖是一种生物相容性分子，含有活性氨基。戊二醛用作连接体，通过席夫碱将抗体与上述纳米颗粒结合。最后，合成了MBSi-Chi纳米复合材料作为信号标签。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法包括以下步骤：

步骤一，合成材料；

步骤二，建立电化学生物传感器；

步骤三，分别利用直接法和间接法测定靶标，并绘制标准曲线；

步骤四，分析传感器的重复性、稳定性和特异性。

2.如权利要求1所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的合成材料包括：

(1)合成树枝状三元纳米粒子PdBP NSs；

(2)合成介孔二氧化硅MSN；

(3)合成信号标签。

3.如权利要求2所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的树枝状三元纳米粒子的合成过程包括：

向5mL 9mg/mL的DODAC溶液中加入500μL 0.337M的NH₄F、500μL 0.101M的H₃BO₃和800μL8.5M的Na₂PdCl₄；400rpm磁力搅拌5min后，向混合溶液中加入400μL 10wt％NH₃·H₂O持续搅拌至溶液变为无色；

加入500μL 2.5mg的NaH₂PO₂，将得到的混合溶液置于硅油浴中95℃加热20min后，滴加500μL DMAB，继续加热30min；在12000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀后，在相同离心条件下分别用超纯水、无水乙醇和超纯水各清洗一次；最后通过冷冻干燥处理得到PdBP粉末。

4.如权利要求2所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的介孔二氧化硅的合成过程包括：

将含有25mg CTAB、7mg NaOH加至12mL超纯水中，再移至烧瓶中，将烧瓶在硅油浴中加热至80℃并持续1h；将125μL TEOS滴加到烧瓶中，保持加热2h；将所得溶液以10000rpm转速离心10min，去除上清收集沉淀，并在相同离心条件下用甲醇清洗3次；将洗涤后所得沉淀分散在无水乙醇中；

向烧杯中加入0.8mL浓盐酸和7.2mL无水乙醇并搅拌均匀后制得萃取液；

将4mL萃取液加入上述无水乙醇分散液中，在90℃下油浴加热45min；在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用超纯水、无水乙醇和超纯水分别清洗一次；重复萃取步骤一次，并将清洗后所得沉淀物在37℃下真空干燥20h。

5.如权利要求2所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的信号标签的合成过程包括：

将1mL 10mM的亚甲蓝溶液MB与1mL 5mg/mL的MSN分散液混合，超声30min后，在室温下400rpm磁力搅拌4h；在溶液中加入10μL冰醋酸和4mg壳聚糖Chi，在室温下1500rpm剧烈搅拌12h；

在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用超纯水清洗3次并收集沉淀MBSi-Chi；将所收集的MBSi-Chi 37℃真空干燥20h后，将MBSi-Chi分散在超纯水中获得1mg/mL的分散液；

将400μL MBSi-Chi、1.2mL E6抗体和466μL 5％戊二醛溶液加入到小烧杯中，在4℃冰箱中磁力搅拌12h；在溶液中加入40μL 0.5％BSA，继续搅拌6h；在10000rpm转速下离心10min，去除上清收集沉淀，在相同离心条件下用Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液清洗3次，将得到的信号标签，即MBSi-Chi复合物重新分散在500μL超纯水中，4℃待用储存。

6.如权利要求1所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的直接法包括：

(1)分别用0.3μm和50nm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面后，分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

(2)将10μL电极修饰材料树枝状三元纳米粒子PdBP NSs滴加在电极表面，37℃干燥；

(3)将10μL E6抗体滴加在干燥后的电极表面，37℃孵育2h；

(4)用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加6μL 0.5％BSA，室温孵育30min；

(5)用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加8μL E6蛋白，37℃孵育2h；

(6)将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；

(7)将电极置于5mL 0.1M PBS溶液中进行表征，隔40s加入20μL，3.0M H₂O₂，通过安培电流法测量其电流值；

(8)根据所得电流变化值与靶蛋白浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

7.如权利要求1所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的间接法包括：

(1)分别用0.3μm和50nm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面后，分别按超纯水、无水乙醇和超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

(2)将10μL电极修饰材料树枝状三元纳米粒子PdBP NSs滴加在电极表面，37℃干燥；

(3)将10μL E6抗体滴加在干燥后的电极表面，37℃孵育2h；

(4)用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加6μL 0.5％BSA，室温孵育30min；

(5)用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加8μL E6蛋白，37℃孵育2h；

(6)用超纯水将电极冲洗干净且室温干燥后滴加10μL信号标签，即MBsi-Chi复合物，37℃孵育2h；

(7)将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；

(8)将电极置于5mL 0.1M PBS溶液中进行表征，通过差分脉冲伏安法测量其电流值；

(9)根据所得电流变化值与靶蛋白浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

8.如权利要求6或7所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述PBS溶液包括0.1M Na₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄和0.1M KCl。

9.一种应用如权利要求1～7任意一项所述用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器的制备方法制备得到的用于人乳头瘤病毒16型E6癌蛋白检测的电化学传感器。

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