CN114350767A - 检测jak2基因v617f突变的引物和探针及其应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针及其应用和试剂盒，涉及生物技术领域。本发明提供的检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，特异性好，灵敏度高，能够用于制备检测JAK2基因V617F突变的产品，实现对JAK2基因V617F突变位点的特异性扩增和检测。本发明提供的检测JAK2基因V617F突变的试剂盒，特异性高，通过引入LNA封闭核苷酸序列用以选择性抑制PCR中突变型探针对野生等位基因的非特异性扩增；灵敏度高，最低可以检测到10ng基因组背景下突变含量为0.5％的DNA样本；能够实现单孔检测，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针及其应用和试剂盒。
背景技术
目前用于JAK2基因V617F突变检的技术和专利文献较多，有一代测序、高分辨溶解曲线法和AS-PCR。一代测序是SNP检测的金标准，但检测过程时间长、操作繁琐、检测灵敏度低，检测下限仅为20％。高分辨溶解曲线法由于操作复杂和技术本身的局限性，因而不适合在临床广泛推广。AS-PCR作为一种快速、便捷和灵敏度高的方法成为定性检测JAK2 V617F突变位点的主要检测手段，然而其检测灵敏度在1％左右。因此，针对JAK2基因V617F突变，还缺少一种灵敏度高的检测方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供上述引物和探针在制备检测JAK2基因V617F突变产品中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种检测JAK2基因V617F突变的试剂盒。
第一方面，本发明提供了一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，所述引物包括JAK2基因V617F突变型上游引物和JAK2基因V617F突变型下游引物，所述JAK2基因V617F突变型上游引物具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述JAK2基因V617F突变型下游引物具有如SEQ ID NO.2所示序列；
所述探针为JAK2基因V617F突变型探针，所述JAK2基因V617F突变型探针具有如SEQ ID NO.3所示序列。
作为进一步技术方案，所述JAK2基因V617F突变型探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种；
所述荧光猝灭基团包括MGB。
第二方面，本发明提供了上述引物和探针在制备检测JAK2基因V617F突变产品中的应用。
第三方面，本发明提供了一种检测JAK2基因V617F突变的试剂盒，包括DNA聚合酶和反应液；
所述反应液包括Buffer、Mg2+、dNTP、LNA封闭核苷酸序列以及上述引物和探针；
所述LNA封闭核苷酸序列具有如SEQ ID NO.7所示序列。
作为进一步技术方案，所述DNA聚合酶包括高保真酶；
优选地，所述Buffer包括Tris-HCl缓冲液。
作为进一步技术方案，所述反应液还包括内参引物和内参探针。
作为进一步技术方案，所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物；
所述内参上游引物具有如SEQ ID NO.4所示序列，所述内参下游引物具有如SEQID NO.5所示序列；
所述内参探针具有如SEQ ID NO.6所示序列；
作为进一步技术方案，所述内参探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种，但选择与JAK2突变型探针不相同的荧光报告基团；
所述荧光猝灭基团包括MGB。
作为进一步技术方案，还包括阳性对照；
所述阳性对照包括阳性质粒和内参质粒；
优选地，所述阳性对照为含有阳性质粒和内参质粒的TE溶液，其中，内参质粒的浓度为1-5ng/μL，优选为1.8ng/μL；阳性质粒的浓度为0.1-0.5ng/μL，优选为0.2ng/μL；
优选地，所述阳性对照的制备方法包括：分别将所述阳性质粒和内参质粒的浓度用TE稀释到2ng/ul，制备得到阳性质粒溶液和内参质粒溶液；然后将阳性质粒溶液和内参质粒溶液按照体积比为1:9混合，制备得到阳性对照。
作为进一步技术方案，还包括空白对照；
所述空白对照包括无核酸酶水。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，特异性好，灵敏度高，能够用于制备检测JAK2基因V617F突变的产品，实现对JAK2基因V617F突变位点的特异性扩增和检测。
本发明提供的检测JAK2基因V617F突变的试剂盒，采用Taqman探针联合LNA技术对JAK2基因V617F突变位点进行检测，具有以下优点：1)特异性高，通过引入LNK封闭引物用以选择性抑制PCR中突变型探针对野生等位基因的非特异性扩增；2)灵敏度高，最低可以检测到10ng基因组背景下突变含量为0.5％的DNA样本；3)能够实现单孔检测，操作简单。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试验例1提供的野生型扩增曲线；
图2为本发明试验例2提供的突变型扩增曲线；
图3为三种引物探针检测结果；
图4为含LNA修饰核苷酸序列的体系的检测结果；
图5为不含LNA修饰核苷酸序列的体系的检测结果；
图6为突变频率稀释梯度扩增曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，所述引物包括JAK2基因V617F突变型上游引物和JAK2基因V617F突变型下游引物，所述JAK2基因V617F突变型上游引物具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述JAK2基因V617F突变型下游引物具有如SEQ ID NO.2所示序列；
所述探针为JAK2突变型探针，所述JAK2基因V617F突变型探针具有如SEQ ID NO.3所示序列。
在一些优选的实施方式中，所述JAK2基因V617F突变型探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团。
所述荧光报告基团包括但不限于FAM或VIC，或者本领域技术人员所熟知的其他荧光报告基团。
所述荧光猝灭基团包括但不限于MGB。以MGB修饰的探针用于检测，结果更精确，因此优选采用MGB作为荧光猝灭基团。
本发明提供的检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，特异性好，灵敏度高，能够用于制备检测JAK2基因V617F突变的产品，实现对JAK2基因V617F突变位点的特异性扩增和检测。
第二方面，本发明提供了上述引物和探针在制备检测JAK2基因V617F突变产品中的应用。
本发明提供的引物和探针，特异性好，灵敏度高，因此，能够用于制备检测JAK2基因V617F突变产品。
第三方面，本发明提供了一种检测JAK2基因V617F突变的试剂盒，包括DNA聚合酶和反应液；
所述反应液包括Buffer、Mg2+、dNTP、LNA封闭核苷酸序列以及上述引物和探针。其中Buffer例如可以选择Tris-HCl缓冲液(pH8.9左右)，或者本领域技术人员所熟知的其他缓冲液；Mg2+可以以MgCl2引入。
所述LNA封闭核苷酸序列具有如SEQ ID NO.7所示序列。
锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，可增加PCR引物或探针的融解温度(值)，从而显著增加对等位基因的区分能力。
LNA封闭核苷酸序列为锁核酸(LNA)修饰的寡核苷酸序列，能够特异性的与野生型JAK2基因结合，从而选择性抑制PCR中突变型探针对野生等位基因的非特异性扩增，提高试剂盒检测特异性。
在一些优选的实施方式中，所述DNA聚合酶包括高保真酶，高保真酶错配率低，有助于提高检测准确性。
在一些优选的实施方式中，所述反应液还包括内参引物和内参探针。例如可以在非突变区域设一对引物和探针做野生型对照，提高检测准确性。
在一些优选的实施方式中，所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物；
所述内参上游引物具有如SEQ ID NO.4所示序列，所述内参下游引物具有如SEQID NO.5所示序列；
所述内参探针具有如SEQ ID NO.6所示序列。
以上具有特定序列的内参引物和探针特异性好，灵敏度高。
在一些优选的实施方式中，所述内参探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种，但选择与JAK2突变型探针不相同的荧光报告基团，从而将二者区分开来。
所述荧光猝灭基团优选为MGB。
在一些优选的实施方式中，还包括阳性对照；
所述阳性对照包括阳性质粒和内参质粒，其中阳性质粒具有能够被本发明提供的检测JAK2基因V617F突变的引物和探针识别并扩增的基因序列；内参质粒具有能够被本发明提供的内参引物和内参探针识别并扩增的基因序列。
优选地，所述阳性对照为含有阳性质粒和内参质粒的TE溶液，其中，内参质粒的浓度为1-5ng/μL，优选为1.8ng/μL；阳性质粒的浓度为0.1-0.5ng/μL，优选为0.2ng/μL；
优选地，所述阳性对照的制备方法包括：分别将所述阳性质粒和内参质粒的浓度用TE稀释到2ng/ul，制备得到阳性质粒溶液和内参质粒溶液；然后将阳性质粒溶液和内参质粒溶液按照体积比为1:9混合，制备得到阳性对照。
在一些优选的实施方式中，还包括空白对照；所述空白对照包括无核酸酶水。
本发明试剂盒采用实时荧光定量检测方法进行检测，针对JAK2基因V617F突变，设计引物和Taqman探针突变型探针，在非突变区域设一对引物和探针做野生型对照，同时引入一条锁核酸(LNA)修饰的寡核苷酸序列，用以选择性抑制PCR中突变型探针对野生等位基因的非特异性扩增，根据各反应中出现的扩增信号情况判定样本中是否含有JAK2基因V617F突变。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，引物包括JAK2基因V617F突变型上游引物和JAK2基因V617F突变型下游引物，JAK2基因V617F突变型上游引物具有如SEQ IDNO.1所示序列，JAK2基因V617F突变型下游引物具有如SEQ ID NO.2所示序列；
探针为JAK2基因V617F突变型探针，JAK2突变型探针具有如SEQ ID NO.3所示序列。
对比例1
一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，引物包括JAK2突变型上游引物和JAK2突变型下游引物，JAK2突变型上游引物具有如SEQ ID NO.8所示序列，JAK2突变型下游引物具有如SEQ ID NO.9所示序列；
探针为JAK2突变型探针，JAK2突变型探针具有如SEQ ID NO.10所示序列。
对比例2
一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，引物包括JAK2突变型上游引物和JAK2突变型下游引物，JAK2突变型上游引物具有如SEQ ID NO.11所示序列，JAK2突变型下游引物具有如SEQ ID NO.12所示序列；
探针为JAK2突变型探针，JAK2突变型探针具有如SEQ ID NO.13所示序列。
将JAK2基因V617F突变质粒，用TE进行梯度稀释，稀释梯度是20000copies/μL、2000copies/μL、200copies/μL和20copies/μL，用着4个梯度的质粒，用实施例1和对比例1-2提供的JAK2引物探针进行比对实验，序列如下表：
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ | 编号 |
| JAK2突变型上游引物 | TCAGAGTCTTTCTTTGAAGCAGCA | (SEQ ID NO.1) |
| JAK2突变型下游引物 | CTGAGAAAGGCATTAGAAAGCC | (SEQ ID NO.2) |
| JAK2突变型探针 | FAM-ATTATGGAGTATGTTTCTGTGGAG-MGB | (SEQ ID NO.3) |
| JAK2突变型上游引物2 | GAAAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTCGT | (SEQ ID NO.8) |
| JAK2突变型下游引物2 | TGAAGCAGCAAGTATGATGAGC | (SEQ ID NO.9) |
| JAK2突变型探针2 | TCCACAGAAACATACTCCATAA | (SEQ ID NO.10) |
| JAK2突变型上游引物3 | GAAGCAGCAAGTATGATGAGCAA | (SEQ ID NO.11) |
| JAK2突变型下游引物3 | CAAAAACAGATGCTCTGAGAAAGG | (SEQ ID NO.12) |
| JAK2突变型探针3 | TCTCCACAGAAACATACTCCA | (SEQ ID NO.13) |
检测结果如图3所示。结合扩增效率和扩增曲线，JAK2突变型上游引物(SEQ IDNO.1)、JAK2突变型下游引物(SEQ ID NO.2)和JAK2突变型探针(SEQ ID NO.3)的扩增效果最佳。
实施例2
一种检测JAK2基因V617F突变的试剂盒，包括DNA聚合酶、反应液、阳性对照和空白对照，如表2所示。
其中DNA聚合酶为高保真酶；
反应液包括Tris-HCl缓冲液、Mg2+、dNTP、突变型引物探针(JAK2突变型上游引物、JAK2突变型下游引物、JAK2突变型探针)、野生型引物探针(内参上游引物、内参下游引物、内参探针)和LNA修饰核苷酸序列，引物探针序列如表1所示；
阳性对照为：分别将阳性质粒和内参质粒的浓度用TE稀释到2ng/ul，然后用内参质粒对阳性质粒进行10倍稀释，即内参质粒和阳性质粒按照体积比为9：1进行混合，即为阳性对照。
空白对照为无核酸酶水。
表1.引物探针
表2.试剂盒组分
JAK2反应液各组分用量
对比例3
一种检测JAK2基因V617F突变的试剂盒，与实施例2的区别在于，不含有LNA修饰核苷酸序列。
用数字PCR定量后的一例强阳性标本，JAK2基因V617F突变比例为80％，用TE进行梯度稀释，梯度分别为80％、8％、0.8％和0.08％，同是做一例阴性标本。如图4-图5所示，图4为含LNA修饰核苷酸序列的体系，图5为不含LNA修饰核苷酸序列的体系，从结果中可以看出，用LNA修饰核苷酸序列可以增加PCR的扩增效率，增加检测的灵敏度，阴性标本在加入LNA修饰核苷酸序列后突变型完全没有扩增。
实施例3
一种用于检测JAK2基因V617F突变的方法，包括以下的检测内容：
1)提取全血样本中的DNA；
2)按照表3配置反应体系，混匀，进行PCR扩增，反应程序如表4；
3)根据CT值，确定样本中突变情况。
表3.反应体系
| qPCR混合体系 | 体积(μl) |
| JAK2-PCR反应液 | 19.5 |
| 酶 | 0.5 |
| DNA | 5.0 |
| 总体积(μL) | 25.0 |
表4.反应程序
试验例1阴阳性符合率
采用本发明实施例2提供的试剂盒对50例一代测序验证为JAK2基因V617F野生型和50例一代测序验证为JAK2基因V617F突变型的标本进行检测，试剂盒检测扩增曲线如图1和图2所示，检测结果均与一代测序结果一致。
试验例2特异性实验
选取10例其它突变类型的阳性标本，提取DNA用本发明实施例2提供的试剂盒进行检测，结果均为阴性。
其它突变类型如下表：
| 突变基因 | 突变位点 |
| JAK1突变核酸 | S703I |
| JAK3突变核酸 | L857P |
| ASXL1突变核酸 | R693* |
| CALR突变核酸 | K385Nfs*47 |
| TP53突变核酸 | R273H |
| U2AF1突变核酸 | S34F |
| DNMT3A突变核酸 | R882H |
| EZH2突变核酸 | E137* |
| MPL突变核酸 | W515L |
| MPL突变核酸 | W515K |
试验例3检出限实验
将JAK2基因V617F突变阳性和阴性临床血液样本，提取DNA后，用Quibit对阳性标本和阴性标本DNA进行浓度检测，用数字PCR确认阳性标本DNA的突变比例。用TE对阳性和阴性标本进行梯度稀释，分别稀释到2ng/ul，用阴性标本的DNA对阳性标本进行稀释，稀释后的突变频率依次为40％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％和0.2％这8个梯度，每个梯度样本用本发明实施例2提供的试剂盒重复检测3次，扩增曲线图如图6所示，试验结果如下：
表5.检出限
根据临床样本检出限，用质检合格的本发明实施例1提供的试剂盒检测突变频率为1％、0.5％和0.2％的阳性样本各20次，确定试剂盒检出率。严格根据产品说明书进行操作，结果如下。
表6.检出限重复验证
| 突变频率 | 检测阳性数/样本数 | 平均Ct值 | 阳性率(％) |
| 1％ | 20/20 | 28.99 | 100％ |
| 0.5％ | 20/20 | 30.00 | 100％ |
| 0.2％ | 18/20 | 30.99 | 90％ |
结果表明：该试剂盒最低可以检测到10ng基因组背景下突变含量为0.5％的DNA样本。
试验例4抗干扰实验
抗干扰实验结果：
PCR实验过程中存在的干扰物可能会影响扩增检测结果，将已经用数字PCR检测证明为强阳性的标本剩余的血液标本，用干扰物质如胆红素(342μmol/L)、甘油三酯(37mmol/L)和血红蛋白(2g/L)进行10倍稀释，同时用稀释液对强阳性标本进行10倍稀释，提取DNA后，对用干扰物质和稀释液稀释标本提取的DNA用该试剂盒进行3次重复实验的检测，检测出来的结果为阳性。实验结果表明胆红素(342μmol/L)、甘油三酯(37mmol/L)、血红蛋白(2g/L)、生理盐水等对扩增体系无影响。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉海希生物科技有限公司
<120> 检测JAK2基因V617F突变的引物和探针及其应用和试剂盒
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcagagtctt tctttgaagc agca 24
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<212> DNA
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ctgagaaagg cattagaaag cc 22
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attatggagt atgtttctgt ggag 24
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gaaagcctgt agttttactt actctcgt 28
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tgaagcagca agtatgatga gc 22
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ttgatctcca tattccaggc ttacacaggg gtttcctcag aacgttgatg gcagttgcag 60
gtccatataa agggaccaaa gcacattgta tcctcatcta tagtcatgct gaaagtagga 120
gaaagtgcat ctttattatg gcagagagaa ttttctgaac tatttatgga caacagtcaa 180
acaacaattc tttgtacttt tttttttcct tagtctttct ttgaagcagc aagtatgatg 240
agcaagcttt ctcacaagca tttggtttta aattatggag tatgtttctg tggagacgag 300
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tcctttaggg atctagctct tcgagtggat caaataaggg ataacatggc tggatgaaag 180
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gctgtggact attattacat atatcattat tatataaatc atgatgctag ccagcaaaga 300
tgtgaaaata tctgctcaaa actttcaaag tttagtaagt ttttcttcat gaggccacca 360
gtaaaagaca ttaatgagaa ttccttagca aggattttgt aagaagtttc ttaaacattg 420
tcagttaaca tcactcttgt ctggcaaaag aaaaaaaata gactttttca actcagcttt 480
ttgagacctg aaaaaatta 499
Claims (10)
1.一种检测JAK2基因V617F突变的引物和探针，其特征在于，所述引物包括JAK2基因V617F突变型上游引物和JAK2基因V617F突变型下游引物，所述JAK2基因V617F突变型上游引物具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述JAK2基因V617F突变型下游引物具有如SEQ IDNO.2所示序列；
所述探针为JAK2基因V617F突变型探针，所述JAK2基因V617F突变型探针具有如SEQ IDNO.3所示序列。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述JAK2基因V617F突变型探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种；
所述荧光猝灭基团包括MGB。
3.权利要求1或2所述的引物和探针在制备检测JAK2基因V617F突变产品中的应用。
4.一种检测JAK2基因V617F突变的试剂盒，其特征在于，包括DNA聚合酶和反应液；
所述反应液包括Buffer、Mg2+、dNTP、LNA封闭核苷酸序列以及权利要求1或2所述的引物和探针；
所述LNA封闭核苷酸序列具有如SEQ ID NO.7所示序列。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶包括高保真酶；
优选地，所述Buffer包括Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液还包括内参引物和内参探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物包括内参上游引物和内参下游引物；
所述内参上游引物具有如SEQ ID NO.4所示序列，所述内参下游引物具有如SEQ IDNO.5所示序列；
所述内参探针具有如SEQ ID NO.6所示序列。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述内参探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团；
所述荧光报告基团包括FAM或VIC中的至少一种，但选择与JAK2突变型探针不相同的荧光报告基团；
所述荧光猝灭基团包括MGB。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照；
所述阳性对照包括阳性质粒和内参质粒；
优选地，所述阳性对照为含有阳性质粒和内参质粒的TE溶液，其中，内参质粒的浓度为1-5ng/μL，优选为1.8ng/μL；阳性质粒的浓度为0.1-0.5ng/μL，优选为0.2ng/μL；
优选地，所述阳性对照的制备方法包括：分别将所述阳性质粒和内参质粒的浓度用TE稀释到2ng/ul，制备得到阳性质粒溶液和内参质粒溶液；然后将阳性质粒溶液和内参质粒溶液按照体积比为1:9混合，制备得到阳性对照。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括空白对照；
所述空白对照包括无核酸酶水。
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