CN114350659B

CN114350659B - elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法

Info

Publication number: CN114350659B
Application number: CN202111444510.4A
Authority: CN
Inventors: 孙永华; 刘成杰; 叶鼎
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN114350659A

Abstract

本发明提供一种elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的elovl4b基因上设计打靶位点，在体外合成特异性gRNA和Cas9 mRNA后，显微共注射进入斑马鱼单细胞期受精卵内。胚胎培养后，进一步通过PCR扩增筛选elovl4b基因突变斑马鱼胚胎，进行下一代培养，并通过elovl4b基因表达分析、RNA原位杂交分析等手段进一步确定elovl4b突变斑马鱼的视觉细胞病变情况，从而构建了elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型，该模型与人类疾病相似性好，能够更准确地诱发出具有类似人类疾病特征的发生机制。

Description

elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法。

背景技术

眼睛是人体接收外界信息的重要器官，因而视力的缺损和丧失将严重影响人的生活质量。在世界范围内，每4000个人中就有1个人有患有视网膜色素变性疾病，在2006年就有超过100万人正在经受这种疾病的困扰。该病导致视锥-视杆细胞的逐渐丧失。患者通常在青春期丧失夜视能力，在青年期丧失侧视能力，在晚年丧失中心视力，直到完全失明(Hartong,Dyonne T.,Eliot L.Berson,and Thaddeus P.Dryja."Retinitispigmentosa."The Lancet 368.9549(2006):1795-1809.)。

斑马鱼与人类等脊椎动物的基因有着高度的同源性，斑马鱼属于鲤形目鲤科，原产于印度东部及其周边河流区域。斑马鱼作为被广泛利用的模式生物，有很多优点：个体小，易于饲养，能适应16～34℃的较广范围的水温，食性广，繁殖力强，通常3～4个月就能达到性成熟，每周一次交配能产下200左右的受精卵，从而获得大量胚胎，且早期胚胎透明易观察。作为一种新型实验动物，具有良好的性价比和成熟的胚胎及成熟的遗传操作技术等特点，因而可以显著缩短新药的开发周期，被广泛地应用于毒理学、药理学、病理学、新药筛选等领域。

斑马鱼还是理想的视觉模型。斑马鱼具有和人类相似的巩膜、脉络膜、角膜、晶状体和视网膜等眼睛结构。它的视网膜中心布满视锥细胞，约占视网膜总细胞的40％，这一点和人类相似，而小鼠和大鼠等夜间活动的啮齿类动物，它们的视网膜只有3％的细胞为视锥细胞，跟人类视觉细胞组成有很大区别。另外，成年斑马鱼罕见地具有视网膜再生能力。当视网膜受损后，Müller胶质细胞可以去分化成为神经元干祖细胞。这一特性使得斑马鱼成为一个视网膜再生研究的模型。

研究表明，人类的ELOVL4基因突变会导致常染色体显性遗传的视网膜色素变性疾病(Zhang K,Kniazeva M,Han M,et al.A 5-bp deletion in ELOVL4 is associatedwith two related forms of autosomal dominant macular dystrophy[J].NatureGenetics,2001,27(1):89-93.)。Elovl4感光细胞特异性敲除小鼠突变体视网膜中含有VLC-PUFAs的甘油磷脂显著减少，脂滴和脂褐素样颗粒异常积累，同时表现出视觉反应异常(Harkewicz R,Du H,Tong Z,et al.Essential role of ELOVL4 protein in very longchain fatty acid synthesis and retinal function[J].Journal of BiologicalChemistry,2012,287(14):11469-11480.)。这些证据强烈表明了elovl4b基因与视网膜色素变性疾病存在显著关联。研究过程中发现elovl4b基因突变引发斑马鱼幼鱼出现视网膜视觉细胞严重缺失，这与人的视网膜视觉细胞损伤减少极为相似，但是现有技术还没有将elovl4b基因突变所引起的视网膜感光神经元病变的斑马鱼作为一种视网膜视觉细胞损伤修复和再生的药物评价和大规模候选药物筛选的动物模型及该动物模型的构建方法。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法。本发明通过根据CRISPER/Cas9敲除原理，设计了位于elovl4b基因第5号外显子上的基因突变靶位点及靶向斑马鱼elovl4b基因的sgRNA，通过PCR方法构建gRNA体外转录模板，并利用该模板进行体外转录和纯化回收后，将制备得到的gRNA与Cas9 mRNA混合注入斑马鱼单细胞期受精卵后，进一步通过PCR和测序方法筛选elovl4b基因有效突变胚胎，进行饲养至性成熟，并对性成熟个体的下一代胚胎再次通过PCR和测序方法筛选elovl4b基因有效突变个体，进而最终获得elovl4b基因纯合突变体。通过elovl4b基因表达、RNA原位杂交和HE染色组织形态学观察、免疫荧光分析确定构建的斑马鱼模型是否存在elovl4b缺失突变所导致的视网膜感光神经元病变情况的发生。

本发明提供如下技术方案：靶向斑马鱼elovl4b基因的sgRNA，所述sgRNA具有如SEQ ID No.1的核苷酸序列；

SEQ ID No.1：

5’-GGTGGTATTACATCTCCAAGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT-3’。

本发明还提供用于构建合成sgRNA模板的引物序列，所述引物序列包括如SEQ IDNo.2的正向引物序列和如SEQ ID No.3的反向引物序列：

SEQ ID No.2：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGGTATTACATCTCCAAGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；

SEQ ID No.3：

5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。

本发明还提供视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：根据CRISPER/Cas9敲除原理，设计并合成elovl4b基因靶位点的sgRNA序列，所述sgRNA具有如SEQ ID No.1的核苷酸序列；

S2：合成用于构建合成sgRNA模板的PCR引物，引物序列包括如SEQ ID No.2的正向引物序列和如SEQ ID No.3的反向引物序列；

S3：使用所述S2步骤合成的引物，以pMD19T-gRNA为PCR反应的模板进行PCR，对PCR产物进行纯化回收，纯化产物作为gRNA体外转录模板；优选地，此步骤的纯化回收，使用了GeneJET PCR纯化试剂盒(赛默飞，K0701)，操作方法依照试剂盒说明书进行；

S4：将所述S3步骤制备得到的gRNA体外转录模板用T7转录酶进行体外转录，最终获得纯化以后的gRNA；优选地，此步骤的体外转录使用了国产诺唯赞公司T7 High YieldRNA Transcription Kit(TR101-01)试剂盒，操作方法依照试剂盒说明书进行。转录后产物用DNase I消化后。消化产物用SigmaSpin^TM测序反应清除试剂盒(Sigma,S5059-70EA)纯化回收,操作方法依照试剂盒说明书进行；

S5：将所述S4步骤获得的gRNA和Cas9 mRNA混合后显微注射入斑马鱼单细胞期受精卵中；

S6：所述S5步骤的注射完成后，培养24小时，收集部分显微注射后的单细胞期斑马鱼受精卵，培养24小时后，将胚胎提取基因组，PCR扩增包含靶位点的目标序列并测序；优选地，此步骤中的培养环境为将部分显微注射后的单细胞期斑马鱼受精卵置于0.3xDanieau’s buffer中；

S7：测序结果在靶点附近显示乱峰的注射批次胚胎进入饲养系统，饲养待性成熟；通过筛选其下一代胚胎检测有效突变类型斑马鱼，从而获得elovl4b缺失突变斑马鱼，即得到视网膜感光神经元病变斑马鱼模型。

进一步地，在S7步骤之后，本发明还设置以下步骤：

S8：取步骤S7的elovl4b缺失突变斑马鱼幼鱼进行elovl4b基因表达分析；

S9：取步骤S7的elovl4b缺失突变斑马鱼幼鱼眼球进行elovl4b基因RNA原位杂交分析；

S10：取步骤S7的elovl4b缺失突变斑马鱼幼鱼眼球进行冰冻切片HE染色组织形态学观察；

S11：取步骤S7的elovl4b缺失突变斑马鱼幼鱼眼球进行冰冻切片的视觉细胞特异的免疫荧光分析；

S12：通过对步骤S8-11获得数据进行分析描述elovl4b缺失突变斑马鱼的视觉细胞病变情况。

进一步地，所述S1步骤中的sgRNA序列所针对的靶位点位于elovl4b基因第5号外显子上。

进一步地，sgRNA序列所针对的靶位点的位点序列如SEQ ID No.4所示：

SEQ ID No.4：5’-GGTGGTATTACATCTCCAAGGG-3’。

进一步地，所述S5步骤中注射的单细胞期斑马鱼受精卵胚胎数为200～500个。

进一步地，所述S6步骤筛选elovl4b基因突变体所用的引物序列包括SEQ ID No.5的正向引物序列和如SEQ ID No.6的反向引物序列：

SEQ ID No.5：5’-CATATGCCACATTTATTAATG-3’；

SEQ ID No.6：5’-CGTGTGTGTGTCTATGTGTG-3’；

所述如SEQ ID No.5的引物也是Sanger DNA测序用引物。

本发明还提供elovl4b基因突变斑马鱼的检测方法，采用如SEQ ID No.5的正向引物序列和SEQ ID No.6的反向引物序列，以斑马鱼基因组为模板进行PCR反应，并利用SEQID No.5测序，筛选得到elovl4b基因突变斑马鱼。

本发明还提供elovl4b基因在制备视网膜感光神经元病变斑马鱼模型中的应用。

本发明还提供如上所述的sgRNA在构建视网膜感光神经元病变斑马鱼模型中的应用。

本发明的有益效果为：

1、本发明采用elovl4b基因缺失突变斑马鱼作为实验动物，该突变在elovl4b基因5号外显子上，导致elovl4b基因发生了移码突变和Elovl4b蛋白催化功能结构域的变异和Elovl4b蛋白翻译提前终止。该斑马鱼模型复制的疾病模型与人类疾病相似性好，能够更准确地诱发出具有类似人类疾病特征的发生机制。

2、本发明建立了系统的针对斑马鱼视网膜感光神经元病变模型的病理特征诊断方法。

3、本发明提供的构建视网膜感光神经元病变动物模型的方法成本低、周期短、重复性好、可靠性强，可以有效降低药理学实验和药物筛选成本，有利于深入研究视网膜感光神经元病变病理机制，为网膜感光神经元再生修复寻找新的治疗手段。

4、本发明提供的构建视网膜感光神经元病变动物模型的方法有助于认识视网膜感光神经元病变发生发展规律，为推动视网膜感光神经元病变医疗事业的发展提供有力基础。

附图说明

下文将基于实施例并参考附图来对本发明进行更详细的描述。其中：

图1为本发明提供的elovl4b基因靶位点序列示意图、包含突变位点的测序结果峰图和野生型及预测的突变型Elovl4b蛋白质结构示意图；

图2为以elovl4b基因突变斑马鱼幼鱼为材料进行elovl4b基因表达分析柱状图；

图3为以elovl4b突变斑马鱼幼鱼眼球为材料进行elovl4b基因RNA原位杂交分析示意图；

图4为以elovl4b突变斑马鱼幼鱼眼球为材料进行冰冻切片HE染色组织形态学观察切片示意图；

图5为以elovl4b突变斑马鱼幼鱼眼球为材料进行冰冻切片的视觉细胞特异的免疫荧光分析示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：根据CRISPER/Cas9敲除原理，设计并合成包含elovl4b基因靶位点序列的sgRNA序列，其中elovl4b基因靶位点如图1所示(图中基因序列中的下划线为靶点序列，方框中的8个碱基：TACATATC为插入突变的具体序列)，优选地，gRNA的靶点序列位于elovl4b基因第5号外显子上，位点序列为如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，SEQ ID No.4：5’-GGTGGTATTACATCTCCAAGGG 3’；所述sgRNA具有如SEQ ID No.1的核苷酸序列；

SEQ ID No.1：

S2：合成用于构建合成sgRNA模板的PCR引物，合成的引物序列包括如SEQ ID No.2的正向引物序列和如SEQ ID No.3的反向引物序列；

SEQ ID No.2：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGGTATTACATCTCCAAGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；

SEQ ID No.3：

5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。

S3：使用所述S2步骤合成的引物，以pMD19T-gRNA为PCR反应的模板进行PCR，对PCR产物进行纯化回收，制备gRNA体外转录模板；

按如下反应体系进行PCR扩增来获得gRNA模板：

准备200μL体系，PCR程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。PCR产物纯化回收步骤如下：

1.柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。

2.估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。

3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

4.向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

5.重复操作步骤4。

6.将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

7.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。

S4：将所述S3步骤制备得到的gRNA体外转录模板用T7转录酶进行体外转录、纯化回收获得gRNA。

T7 RNA转录酶体外转录获取gRNA，按如下体系加入各成份混匀：

37℃反应1小时后，对合成的gRNA进行纯化，具体步骤如下：

a.DNase I处理：加入2.5μL 10X buffer和2μL DNase I，37℃反应15min以去除DNA模板；

b.再用SigmaSpin ^TM Sequencing reaction clean-up kit进行纯化：将纯化柱置于2mL收集管中，2800rpm离心15s；

c.拧断管底密封柱，再扔掉管盖，将纯化柱放回收集管中，2800rpm离心2min；

d.将纯化柱置于一个新的RNase-free EP管中，弃掉收集管；

e.将gRNA合成液加入到纯化柱中，2800rpm离心4min；

f.收集过柱液，电泳检测并测定浓度后置于-80℃冰箱中保存备用。

合成Cas9 mRNA的具体步骤如下：

将含有斑马鱼密码子优化的Cas9全长序列的质粒用限制性内切酶进行酶切线性化，使用GeneJET PCR Purification Kit进行纯化回收用作转录模板。

PCR产物纯化回收步骤如下：

5.重复操作步骤4。

7.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。使用Ambion公司的mMessage mMachine体外转录试剂盒，体外转录合成Cas9 mRNA。

反应体系如下：

反应体系配好后混匀，37℃水浴孵育2小时。

按照以下步骤进行纯化和回收Cas9 mRNA：

a.向反应体系中加入1μL试剂盒中附带的DNA酶，混匀，37℃水浴15分钟；

b.加入20μL的5M醋酸铵，混匀，冰上放置10分钟；

c.4℃，12000rpm离心15分钟，白色沉淀即为mRNA；

d.弃掉上清，用75％乙醇清洗沉淀，4℃，7500rpm离心5分钟；

e.弃掉上清，晾干沉淀，加10μL无酶水溶解沉淀；

f.取0.5μL RNA稀释20倍，检测浓度和纯度，再取10μL稀释液进行琼脂糖凝胶电泳，检测降解程度。

S5：将所述S4步骤获得的gRNA和Cas9 mRNA混合后显微注射入单细胞期斑马鱼受精卵中，每个胚胎注射1nL。

gRNA和Cas9 mRNA合成好以后，按以下体系配制注射样品，3μL的注射体系如下：

优选地，所述S5步骤中注射的单细胞期斑马鱼受精卵胚胎数为200～500个。

更优选地，所述S5步骤中注射的单细胞期斑马鱼受精卵胚胎数为500个。

S6：S5步骤的注射完成后，培养24小时，收集部分显微注射后的单细胞期斑马鱼受精卵培养得到的胚胎，提取基因组，PCR扩增包含靶位点的目标序列并测序；

按如下反应体系进行PCR扩增包含靶位点的目标序列：

PCR程序如下：94℃ 5min；94℃ 30s；60℃ 30s；72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min

优选地，测序所用的引物序列包括SEQ ID No.5的正向引物序列和如SEQ ID No.6的反向引物序列：

SEQ ID No.5：5’-CATATGCCACATTTATTAATG-3’；

SEQ ID No.6：5’-CGTGTGTGTGTCTATGTGTG-3’；

如SEQ ID No.5的引物也是Sanger DNA测序用引物。

S7：测序结果在靶点附近显示乱峰的注射批次胚胎进入饲养系统，饲养待性成熟；对于性成熟的斑马鱼再次通过以上PCR和测序方法筛选其下一代胚胎，检测有效突变类型斑马鱼，从而获得elovl4b基因突变斑马鱼，即得到视网膜感光神经元病变斑马鱼模型；

S8：取步骤S7的elovl4b基因突变斑马鱼幼鱼进行elovl4b基因表达分析；

如图2所示，突变体的elovl4b的mRNA水平显著低于野生型的(**表示P<0.01)。该结果说明经过本实施例提供的elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法，可以有效地对位于elovl4b基因第5外显子上的gRNA靶点序列进行基因突变。

S9：取步骤S7的elovl4b基因突变斑马鱼幼鱼眼球进行elovl4b基因RNA原位杂交分析；

如图3所示，相对于野生型斑马鱼，采用本实施例提供的elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法，可以有效抑制elovl4b mRNA在视网膜感光神经元中的表达，使构建的斑马鱼模型表现出视网膜感光神经元缺损。

如图4所示，相对于野生型斑马鱼，采用本实施例提供的elovl4b基因突变缺失视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法，可以有效减少视觉细胞层的细胞数量。

如图5所示，相对于野生型斑马鱼，采用本实施例提供的elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法，可以有效减少视觉细胞层中视锥细胞和位于视锥细胞上层的视杆细胞的细胞数量。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtggtatta catctccaag gggttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 60

tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgct 99

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggg tggtattaca tctccaaggg gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggtatta catctccaag gg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catatgccac atttattaat g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtgtgtgtg tctatgtgtg 20

Claims

1.靶向斑马鱼elovl4b基因的sgRNA在构建视网膜感光神经元病变斑马鱼模型中的应用，其特征在于，所述sgRNA靶向斑马鱼elovl4b基因第5号外显子上，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

SEQ ID No.1：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于合成所述sgRNA的模板的引物序列为如SEQ ID No.2所示的正向引物序列和如SEQ ID No.3所示的反向引物序列：

SEQ ID No.2：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGGTATTACATCTCCAAGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；

SEQ ID No.3：

5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：设计并合成elovl4b基因靶位点的sgRNA序列，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

S2：合成用于构建gRNA转录模板的引物，引物序列为如SEQ ID No.2所示的正向引物序列和如SEQ ID No.3所示的反向引物序列；

S3：使用所述S2步骤合成的引物，以pMD19T-gRNA为PCR反应的模板进行PCR，对PCR产物进行纯化回收，纯化产物作为gRNA体外转录模板；

S4：将所述S3步骤制备得到的gRNA体外转录模板用T7转录酶进行体外转录，最终获得纯化以后的gRNA；

S6：所述S5步骤的注射完成后，培养24小时，收集部分显微注射后的单细胞期斑马鱼受精卵，培养24小时后，将胚胎提取基因组，PCR扩增包含靶位点的目标序列并用正向引物测序；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述sgRNA序列所针对的靶位点的位点序列如SEQ ID No.4所示：

SEQ ID No.4：5’-GGTGGTATTACATCTCCAAGGG-3’。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S5步骤中注射的单细胞期斑马鱼受精卵胚胎数为200~500个。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S6步骤筛选elovl4b基因突变体所用的引物序列为如SEQ ID No.5所示的正向引物序列和如SEQ ID No.6所示的反向引物序列：

SEQ ID No.5：5’-CATATGCCACATTTATTAATG-3’；

SEQ ID No.6：5’-CGTGTGTGTGTCTATGTGTG-3’；

所述如SEQ ID No.5所示的引物也是Sanger DNA测序用引物。