CN114324205A - 对样品进行光谱测定的方法、系统以及流式细胞仪 - Google Patents

Abstract

本公开提供一对样品进行光谱测定的方法、系统以及流式细胞仪。在该方法和系统中，采用波分模块将来自光源的所述广谱光束在空间上分离获得具有不同波长段的多个波长分量的波分光束，采用调制模块同时对波分光束的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束，使多个已调制波长分量中的至少一部分同时照射样品，并且通过吸收光谱模块组对包含样品吸收光谱信息的待解调信号进行解调，或者通过荧光光谱模块组对包含样品荧光信息的待解调信号进行解调。本公开提供了一种紧凑型吸收光谱和/或荧光光谱检测系统，可以同时用多个波长分量照射样品，进而可以快速实时地获得样品的全部的荧光和/或吸收光信息。

Description

对样品进行光谱测定的方法、系统以及流式细胞仪

技术领域

本公开涉及对样品进行光谱测定的技术领域，尤其涉及对样品进行吸收光谱及荧光光谱测定的方法及系统。

背景技术

现有技术中已有各种对样品进行吸收光谱和荧光光谱进行测定的仪器，借助于吸收光谱和荧光光谱的测定，可以对样品的进行各种定性和定量的分析。

吸收光谱仪和荧光光谱仪互补地涵盖了化学科学和生物科学中大多数物质的定性和定量分析。越来越多的场合要求能够同时获取物质吸收光谱和荧光光谱。

中国专利申请CN103649726A公开了一种用于荧光和吸收率分析的系统。该系统包括输入光源、从输入光源接收光并用多个波长中的每一个波长循序地照亮该样品的双减色单色仪、接收并基本同时检测该样品对该多个激发波长中的每一个激发波长发射的多个光波长的多通道荧光检测器、接收并检测穿过该样品的光的吸收检测器、以及计算机，该计算机与单色仪、荧光检测器及吸收检测器通信，以控制单色仪用多个波长中的每一个波长循序地照亮该样品，同时基于从该荧光和吸收检测器接收到的多个信号测量该样品的吸收和荧光。

此外，现有的荧光光谱仪通常具有可动的光学机械部件，这些可动的光学机械部件需要有非常高的重复性精度才能保证光谱仪的测量重复性。然而，由于这些运动部件的存在，在实际工业应用中很难使得光谱仪实现小型化，且可动部件也会降低仪器使用的可靠性。虽然，可以采用诸如电荷注入检测器(CCD)、多像素光子计数器(MPPC)等高灵敏度和高分辨率的检测器阵列，以减少部分运动部件的使用，但仍不能完全解决可动部件带来的问题。

此外，对于荧光光谱在化学分析中有很多应用，现有的连续荧光测定光谱仪需要分别扫描激发波长和荧光波长以获得一维(荧光波长为横坐标)或者二维(激发波长和荧光波长分别为一个坐标轴)荧光光谱。这样的操作比较费时，而且通常只适用于静态样品，对于流动样品，由于样品在流动过程中浓度会发生变化，因此，现有的技术不适合对流动样品的荧光光谱进行测定。另外，目前有一些流式细胞仪虽然可以测量连续流动的细胞样品的荧光，但所获得的荧光光谱在波长域是不连续的，即例如其激发光波长分别为405nm、488nm、 561nm、637nm，荧光检测使用8-16个滤波片，获得8-16个不同的且不连续波段的荧光。

发明内容

为克服现有技术中的不足，本公开提供了一种对样品进行光谱测定的方法，包括以下步骤：

a.将广谱光束中不同波长段的波长分量在空间上分离，从而获得包括具有不同波长段的多个波长分量的波分光束；

b.同时对波分光束中的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束；以及

c.使多个已调制波长分量中的至少一部分同时照射样品；

本公开的方法还包括以下用于获得样品吸收光谱的第一组步骤和用于获得样品荧光光谱的第二组步骤中的至少一组。

第一组步骤包括：

d1.同时接收穿过样品的多个已调制波长分量，以获得第一待解调信号；和

e1.对第一待解调信号进行解调，以获得样品的吸收光谱。

第二组步骤包括：

d2.同时接收样品由多个已调制波长分量激发的荧光，以获得第二待解调信号；和

e2.对第二待解调信号进行解调，以获得样品的荧光光谱。

采用本公开的方案，可以同时用多个波长分量照射样品，进而可以快速实时地获得样品的全部的荧光和/或吸收光信息。譬如要获得样品在 200nm-400nm(分辨率10nm)波段范围内的激发光照射下的荧光400-900nm(分辨率10nm)所有光谱，如果需要循序地扫描激发光，需要20次，假设荧光积分时间1s，则至少需要20s完成测量，并且需要在这20s内将样品保持在样品池内。而本公开的方案由于采用多个波长分量同时照射样品，因此在同样的荧光积分时间为1s情况下，总共只需要1s即可获得上述荧光光谱，样品只需要在1s内保持在样品池内即可，因此非常适合流动样品的测量，相应也显著提高了光谱测定的效率。

较佳地，在步骤b中，以不同的质数频率对不同波长段的多个波长分量进行调制。更佳地，多个调制频率被选择为任何两个频率间的差值都不相同。由此，可以避免高次谐波干扰，提高检测的精度。

较佳地，在第二组步骤中，步骤e2还包括：将第二待解调信号转换为二维荧光光谱。采用本公开的方案，可以从流动的样品中获得二维的荧光光谱，提高的检测效率。

较佳地，步骤d1进一步包括：分别同时接收穿过样品的多个已调制波长分量中的第一部分和穿过样品的多个已调制波长分量中的第二部分，获得包括分别对应于第一部分和第二部分的两部分时域信号的第一待解调信号；步骤e1 进一步包括：将两部分时域信号分别进行解调，并根据第一部分和第二部分的光强比例以及根据第一部分和第二部分的接收放大比率获得样品的吸收光谱。第一部分的光强通常与第二部分的光强不同。将多个已调制波长分量分成两部分进行解调，能够显著增大信号检测的动态范围。

较佳地，当采用获得样品吸收光谱的第一组步骤时，在步骤b之后步骤c 之前，同时接收多个已调制波长分量中的未照射到所述样品的部分，并获得该部分的时域信号作为参考时域信号；在步骤e1中，第一待解调信号为时域信号，对参考时域信号和第一待解调信号进行解调获得样品的吸收光谱。较佳地，未照射到样品的部分的光强小于等于所述调制波分光束的光强的50％。由于引入了参考时域信号，因此，可以有利地消除光源本身的噪声和波动，提高吸收光谱的信噪比。

根据本公开再一个方面，在对样品进行光谱测定的方法中，步骤d2还包括：分别同时接收荧光的第一荧光部分和第二荧光部分，获得包括分别对应于所述第一荧光部分和第二荧光部分的两部分待解调信号的第二待解调信号，所述第一荧光部分的光强小于可接收荧光的总光强的10％；步骤e2还包括：对第二待解调信号进行解调，并根据第一荧光部分和第二荧光部分的光强比例以及第一荧光部分和第二荧光部分的接收放大比率获得样品的荧光光谱。将荧光分成接收荧光分成两部分进行解调，能够显著增大信号检测的动态范围。

此外，本公开还提供了一种对样品进行光谱测定的系统，包括：光源，光源构造成发射广谱光束；波分模块，波分模块将来自光源的广谱光束中不同波长段的波长分量在空间上分离，从而获得具有不同波长段的多个波长分量的波分光束；调制模块，所述调制模块同时对波分光束的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束；以及样品模块，样品模块构造成允许多个已调制波长分量中的至少一部分同时照射样品；系统还包括以下吸收光谱模块组和荧光光谱模块组中的至少一个模块组。吸收光谱模块组包括：第一检测模块，第一检测模块同时接收穿过样品的多个已调制波长分量，并获得第一待解调信号；和第一解调模块，第一解调模块对第一待解调信号进行解调，以获得样品的吸收光谱。荧光光谱模块组包括：第二检测模块，第二检测模块同时接收所述样品由多个已调制波长分量激发的荧光，获得第二待解调信号；和第二解调模块，第二解调模块对第二待解调信号进行解调，以获得样品的荧光光谱。

较佳地，调制模块包括具有多个空间段的MEMS光学元件阵列，其中每个一空间段被设置成以不同的调制频率对波分光束中的一个波长分量进行调制，其中不同的调制频率为不同的质数频率。更佳地，多个不同的调制频率被选择为任何两个频率间的差值都不相同。MEMS光学元件阵列使用使得系统的整体结构更为紧凑，能够实现批量生产，成本上更为高效。

较佳地，第二解调模块构造成将第二待解调信号转换为二维荧光光谱。采用本公开的方案，可以从流动的样品中获得二维的荧光光谱，提高的检测效率。

另一方面，在根据本公开系统的吸收光谱模块组中，第一检测模块包括第一检测器和第二检测器，利用第一检测器接收穿过所述样品的多个已调制波长分量中的第一部分，利用第二检测器接收穿过样品的多个已调制波长分量中的第二部分，由此获得的第一待解调信号包括分别由第一检测器和第二检测器获得的两部分时域信号；第一解调模块将两部分时域信号分别进行解调，并根据第一检测器和第二检测器的放大比率获得样品的吸收光谱。较佳地，吸收光谱模块组还包括分束器，分束器将穿过样品的调制波分光束成第一部分和第二部分，第一部分的光强与第二部分的光强不同。将多个已调制波长分量分成两部分分别利用第一检测器和第二检测器进行解调，能够显著增大信号检测的动态范围。

根据本公开的另一个方面，系统还包括第三检测模块，利用第三检测模块接收多个已调制波长分量中的未照射到样品的部分，并获得该部分的时域信号作为参考时域信号，系统包括吸收光谱模块组，其中第一待解调信号为时域信号；第一解调模块包括差分放大器和转换器，差分放大器和转换器对来自参考时域信号和时域信号进行差分放大并解调获得样品的吸收光谱。由于引入了第三检测模块来提供参考时域信号，因此，可以有利地消除光源本身的噪声和波动，提高吸收光谱的信噪比。

根据本公开的另一个方面，对于荧光光谱模块组，第二检测模块包括第三检测器和第四检测器，荧光的第一荧光部分由第三检测器检测，荧光的第二荧光部分由第四检测器检测，由此获得的第二待解调信号包括分别由第一荧光部分和第二荧光部分获得的两部分待解调信号，其中所第一述荧光部分的光强小于荧光的总光强的10％，第二解调模块构造成对第二待解调信号进行解调，并根据第一荧光部分和第二荧光部分的光强比例以及第三检测器和第四检测器的放大比率获得样品的荧光光谱。较佳地，荧光检测模块包括光电倍增管(PMT) 阵列和多像素光子计数器(MPPC)中至少一种的光电检测器构成的成对检测器，每一个检测器具有多排多通道阵列，相邻两排的通道阵列之间不对齐。将荧光分成接收荧光分成两部分分别使用两个检测器进行检测并随后进行解调，能够显著增大信号检测的动态范围。

较佳地，波分模块包括光色散元件、光衍射元件、光栅和棱镜中的至少一种，而样品模块包括布置成样品能够从中流过的流通池。流通池提供了对样品的动态容纳，利用本公开的方法和系统能够即时地提供流动样品的二维荧光光谱。

本公开还提供了一种流式细胞仪，该流式细胞仪包括构造成发射广谱光束的光源；波分模块，波分模块将来自光源的广谱光束中不同波长段的波长分量在空间上分离，从而获得具有不同波长段的多个波长分量的波分光束；调制模块，调制模块同时对所述波分光束的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束；流通池，流通池构造成允许多个已调制波长分量中的至少一部分同时照射移动通过流通池的细胞流上；以及荧光光谱模块组，荧光光谱模块组包括：检测模块，检测模块同时接收细胞流由多个已调制波长分量激发的荧光，获得待解调信号；和解调模块，解调模块对待解调信号进行解调，以获得细胞流的荧光光谱。较佳地，流式细胞仪的解调模块包括取样积分器(BoxCar)。

本公开的流式细胞仪能够采用连续的波长段的激发光激发产生荧光，再结合取样积分器的信号处理可以获得细胞样品在波长域上连续的荧光光谱的统计分布规律。此外，本公开提供了一种用于荧光检测的液相色谱仪，其具备上述光源、波分模块、调制模块、样品模块、解调模模块以及荧光光谱模块组。这样的液相色谱仪可以在液体泵连续工作的情况下获得二维荧光光谱。

在本公开的优选实施例中，对于荧光光谱的检测，在使用流动样品的情况下就能即时获得二维的荧光光谱。根据本公开的系统没有机械运动部件，系统整体更为紧固和可靠，系统布置更为紧凑，能够实现光谱测定系统的小型化。

在本公开的优选实施例中，根据本公开的技术样品光谱检测系统和方法，吸收光谱模块组和荧光光谱模块组可以同时设置在系统中，这样仅需要一套光源模块、波分模块、调制模块和样品模块就能同时对吸收光谱和荧光光谱进行检测。

附图说明

为了更完全理解本公开的技术方案，可参考结合附图来理解示例性实施例的下述描述，附图中：

图1A为根据本公开的第一较佳实施例的样品吸收光谱测定系统的原理示意图。

图1B为根据本公开的第一较佳实施例的样品吸收光谱测定系统的光路示意图。

图2A为图1A所示系统中检测模块输出的示例性时域信号图。

图2B为从图2A所的时域信号转换获得的示例性频域信号图，即吸收光谱。

图3A为根据本公开的第二较佳实施例的样品吸收光谱测定系统的原理示意图。

图3B为根据本公开的第二较佳实施例的对样品吸收光谱测定系统的光路示意图。

图4为根据本公开的第三较佳实施例的对样品进行吸收光光谱测定的系统的原理示意图。

图5A为根据本公开的第四较佳实施例的样品荧光光谱测定系统的原理示意图。

图5B为根据本公开的第四较佳实施例的样品荧光光谱测定系统的光路示意图。

图6A为根据本公开的第五较佳实施例的样品荧光光谱测定系统的原理示意图。

图6B至图6D为根据本公开的第五较佳实施例的样品荧光光谱测定系统的原理示意图。

图7A为图5A和图6A所示系统中检测模块输出的示例性时域信号图。

图7B为图7A所示时域信号图转换获得的示例性频域信号图，即二维荧光光谱。

图8A为根据本公开的第六较佳实施例的同时测量吸收光谱和荧光光谱的系统原理示意图。

图8B为根据本公开的第六较佳实施例的同时测量吸收光谱和荧光光谱的系统光路示意图。

图9A示出了采用质数调制频率的光谱。

图9B示出了采用非质数调制频率的光谱。

图10示出了适用于本公开的系统的波分模块和调制模块的一变形例的原理示意图。

图11(a)-图11(f)示出了示例性的吸收光谱动态范围的模拟实施例。

图12(a)-图12(d)示出了示例性的荧光光谱动态范围的模拟实施例。

图13为图12(a)-图12(d)所示模拟实施例中采用的检测器的示意图。

附图标记列表

10 光源

20 波分模块

30 调制模块

40 样品模块

50 透射光检测模块

60 荧光检测模块

70 解调模块

11 发光件

12 入射狭缝

21 凹面光栅

29 止光器

31 MEMS反射镜阵列

32 光学透镜

33 反射镜

35 分束器

41 流通池

42 凹面镜

43 光学透镜

44 出射狭缝

45 滤波片

47 光栅

51、52 检测器

61、62、63、64 荧光检测器

110 广谱光束

120 波分光束

130 调制波分光束

301 光调制器

302 调制驱动器

310 角度调制模块

320 光束选向模块

501、502 透射光检测器

503 参考光检测模块

601、602 荧光检测器

701、702 模数转换单元

703 信号处理单元

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本公开作进一步说明，在以下的描述中阐述了更多的细节以便于充分理解本公开，但是本公开显然能够以多种不同于此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本公开内涵的情况下根据实际应用情况作类似推广、演绎，因此不应以此具体实施例的内容限制本公开的保护范围。

除非另作定义，权利要求书和说明书中使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现在“包括”或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”或者“包含”后面列举的元件或者物件及其等同元件，并不排除其他元件或者物件。

总体而言，本公开提供了对样品进行光谱测定的方法和系统。光谱测定包括吸收光谱测定和荧光光谱测定两部分，它们可以独立进行，也可以同时进行。

具体而言，在根据本公开的对样品进行光谱测定的方法中，较佳地，提供广谱光束，广谱光束指不同波长段的光束的总合，这些不同波长段的光束在空间上未被分离。接着，将广谱光束中不同波长段的子光束按波长的不同在空间上分离。在此定义，每一个不同波长段的子光束被称为“波长分量”，其中的每一个不同波长段可以理解为覆盖一小段波长区域。由此获得在空间上分离的具有不同波长段的多个波长分量的波分光束，在此定义，“波分光束”指空间分离的多个不同波长段的子光束的集合。可以理解，经过波分处理获得的波分光束包括多个不同波长段的波长分量。随后，同时对波分光束中的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行光强的幅度调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束。使用多个已调制波长分量中的一部分或全部同时照射待测样品。

一方面，当多个已调制波长分量的一部分或全部穿过样品后，这些穿过样品的已调制波长分量由检测模块同时接收，从而获得第一待解调信号。对第一待解调信号进行解调，便可获得样品的吸收光谱。

另一方面，多个已调制波长分量的一部分或全部同时照射样品激发使其产生荧光，由例如另一检测模块接收这些激发的荧光，从而获得第二待解调信号。对第二待解调信号进行解调，便可获得样品的荧光光谱。较佳地，波分光束的调制周期时间应至少大于荧光寿命的10倍。

当对样品的吸收光谱进行检测时，较佳地可以采用双检测器差分方式进行解调。较佳地，在获得具有空间上分离波长分量的波分光束后，可以从波分光束中分出一部分强度的光束，分出的光束也具有多个空间分离波长分量，这一部分光束的强度较佳地可小于调制波分光束的光强的50％。分出的部分光束不照射样品，而是直接被检测以获得参考信号，例如参考时域信号。余下部分的调制波分光束则仍照射样品，随后同时接收到穿过样品的多个已调制波长分量，从而获得包含样品吸收光谱信息的第一待解调信号，其也为时域信号。这样，借助于差分放大器和转换器来对参考信号和第一待解调信号进行差分放大并解调获得样品的吸收光谱，由此可以消除来自光源本身引起的噪音和波动。

此外，在一种替代方式中，当对样品吸收光谱进行检测时，在使用多个已调制波长分量中的一部分或全部同时照射待测样品之后，将穿过样品的已调制波长分量按光强分成不同的两部分，即穿过所述样品的多个所述已调制波长分量的第一部分和穿过所述样品的多个所述已调制波长分量的第二部分，第一部分和第二部分的光强较佳地不同。使用两个检测器分别同时接收穿过样品的多个已调制波长分量的第一部分和穿过样品的多个已调制波长分量的第二部分，这时获得第一待解调信号包括分别对应于第一部分和第二部分的两部分时域信号，例如时域信号。根据第一部分和第二部分的光强比例以及检测器的放大比例，解调两部分待解调信号，从而获得吸收光谱。采用成对检测器对两部分样品的已调制波长分量进行检测，可以获得较大的动态检测范围。

在对样品进行荧光光谱进行检测时，使用多个已调制波长分量中的一部分或全部同时照射待测样品激发产生荧光后，将样品激发出的荧光按光强分成不同的两部分，即，第一荧光部分和第二荧光部分，其中第一荧光部分的光强小于可接收的荧光总光强的10％，相应地，第二荧光部分的光强则大于可接收的荧光总光强的90％。使用两个检测器对第一荧光部分和第二荧光部分进行检测，并获得包括分别对应于第一荧光部分和第二荧光部分的两部分待解调信号的第二待解调信号，例如时域信号。对第二待解调信号进行解调，并根据第一荧光部分和第二荧光部分的光强比例以及第一荧光部分和第二荧光部分的接收放大比率获得样品的荧光光谱。荧光光强分成两部分由成对检测器进行检测，可以获得较大的动态检测范围。

采用根据本公开荧光检测方法，由检测模块可以获得的荧光信号含有不同激发波长所激发的样品荧光全谱光谱信号，通过解调信号，进而能够同时获得不同激发波长的荧光光谱，即二维荧光光谱。

较佳地，在对空间分离的波分光束进行幅度调制时，调制频率较佳地从质数中进行选择，从而可以避免高次谐波干扰，并且任意两个调制频率之间的差应不同，以避免拍频干扰。调制占空比的范围从0.1％到99.9％，在解调时，积分时间至少大于一个调制周期。

以下，结合附图对本公开的各较佳实施例作具体描述。

图1示出了根据本公开第一较佳实施例的对样品的吸收光谱进行测定的系统的原理示意图。该系统主要包括提供广谱光束110的光源10、波分模块20、调制模块30、样品模块40、透射光检测模块50(即，第一检测模块)以及解调模块70(即，第一解调模块)。

系统中采用的光源10可以是红外光源、可见光源或紫外光源，包括卤素灯、氙灯或其他适于提供广谱光束110的光源10。由光源10发出的广谱光束 110可以视作为多个不同波长段的波长分量的集合。由光源10发出的广谱光束 110可以直接照射到光路中位于光源10下游的波分模块20，也可以经配置的任意光学元件，例如准直透镜、反射镜等将广谱光束110引导至波分模块20。

系统中的波分模块20构造成能够将来自光源10的广谱光束110中不同波长段的波长分量在空间上分离。这样，来自光源10的广谱光束110经过波分模块20后，经过波分处理，便获得了具有空间分离的不同波长段的多个波长分量的波分光束120。较佳地，波分模块20将不同波长段的多个波长分量以基本平行的空间位置关系分离，即，波分光束120包括多个平行的波长分量。

离开波分模块20的多个波长分量的一部分或全部接着同时射照射调制模块30。调制模块30构造成同时对波分光束120的不同波长段的波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束130。离开调制模块30的调制波分光束130的各个已调制波长分量通常在空间上仍被分离，并且每一个已调制波长分量都具有特定的调制频率。较佳地，对于吸收光谱的测定，进入调制模块30的波长分量的数量与离开调制模块30的已调制波长分量的数量一致。在替代实施方式中，根据需要，通过调制模块30的配置，可以使离开调制模块30的已调制波长分量的数量少于进入调制模块30 的波长分量的数量。

在经过调制模块30后，多个已调制波长分量通向样品模块40。样品模块 40构造成允许需要被测定的样品接纳在其中。较佳地，样品模块40包括流通池41(flow cell)，样品流动地接纳到其中。样品模块40的构造设置成允许多个已调制波长分量中的一部分或者全部同时照射到样品上。较佳地，调制波分光束130的各个已调制波长分量在样品中心局部空间上是会聚的。

多个已调制波长分量穿过样品模块40之后，这些已调制波长分量同时照射到透射光检测模块50，从而被透射光检测模块50接收而获得第一待解调信号。对于吸收光谱的测量，较佳地，穿过样品模块40后的已调制波长分量在透射光检测模块50的局部空间上是会聚的。从透射光检测模块50获得的第一待解调信号随后被输送到解调模块70，解调模块70对信号进行解调，由此获得样品的吸收光谱。

较佳地，从透射光检测模块50获得的信号为时域信号，如图2A所示。经过如图1A中的解调模块70，该时域信号被转换成图2B所示的样品吸收率(Ab) 对应于波分光束各个波长的吸收光谱。较佳的，如图1A所示，调制模块30与解调模块70通过总线相连，以同步调制、解调频率和相位信息进行锁相放大 (Lock-in Amplify)，进而获得吸收光谱。

在替代实施例中，调制模块30与解调模块70不通过总线相连，这时需要解调模块70对时域信号进行傅里叶变换来获得吸收光谱。波分光束的各个波长与调制频率的对应关系在设计、装调波分模块20和调制模块30时就已经确定，所述对应关系的信息也会作为解调模块70的输入信息。

将时域信号变换成吸收光谱通常分为如下几步骤：1)通过锁相放大或傅里叶变换将时域信号变换成透射光强对应于调制频率的信号谱图，2)通过波分光束的各个波长与调制频率的对应关系，将步骤1)中所述信号谱图变换成透射光强对应于波分光束的各个波长的透射谱图，3)根据预先测量并保存的背景(无样品)的透射谱图，样品的透射谱图变换成样品的吸收谱图。

第一较佳实施例的样品光谱测定系统的光路布置可以参照图1B实现。

可以将带有会聚透镜的卤素灯、氙灯等的发光件11作为光源10。较佳地，发光件11能够提供的广谱光束110具有从190nm到900nm范围内的多个或连续波长。发光件11的功率较佳地是连续可调的，例如可以在1W到20W内连续调节。在发光件11的射出的光路的下游设有入射狭缝12，设置入射狭缝12 能够限定光源尺寸并限制杂散光线的进入，从而获得的广谱光束更好的适配后续的光路。应当理解，在替代实施例中，发光件11可以与入射狭缝12整合在一起，又或者，如果发光件11本身能够确保射入波分模块的学器件的光束的尺寸和发散角，则入射狭缝12也可被省略。

在入射狭缝12的下游设置有作为波分模块20的主要部件的光栅，较佳地为凹面光栅21。凹面光栅21将通过入射狭缝12的广谱光束110在空间上按波长的不同使其分离开，从而形成具有空间分离的多个波长分量的波分光束120。应当理解，在其他替代实施例中，波分模块20也可以包括其他形式的光色散元件、光栅、棱镜、衍射元件或这些光学元件的组合。来自发光件11的广谱光束110通过这些光学元件后能够按波长的不同在空间上分散开，例如空间上从前到后连续地分散出波长从190nm到900nm的波分光束。为190nm、195nm、……900nm的多个波长分量。

如图1B所示，由凹面光栅21提供的波分光束120接着将同时照射到微型化的集成微机电系统(MEMS)光学元件阵列，例如为MEMS反射镜阵列31、MEMS 空间光调制器等。MEMS光学元件阵列具有多个光学元件部段，即阵元，其中每个部段能够以特定的频率调制、特定的角度对每一个波长分量进行调制， MEMS光学元件阵列特别地被设定成每个部段都具有一个与其他部段不同的调制频率。这样，波分光束的多个不同的波长分量的每一个照射到一个特定的光学元件部段上，利用该特定的光学元件部段对该波长分量进行调制，使之具有特定的频率。由于MEMS光学元件阵列每个部段都具有一个与其他部段不同的调制频率，因此，当波分光束经MEMS光学元件阵列调制之后，就能够获得调制波分光束130，该调制波分光束130具有多个已调制波长分量，每一个已调制波长分量具有各自独有的波长、调制频率以及角度。通常所述的一个波长分量是对照射在MEMS中同一个阵元上的波分光束的统称，其实包含了一小段波长区域。譬如300nm到900nm的波分光束均匀地照射到了有200个阵元的 MEMS光学元件上，300nm-900nm的波分光束就被分成了200个波长分量，第一个波长分量覆盖了300nm-303nm的波长范围，该波长分量的中心值为301nm，线宽3nm。

另一方面，MEMS反射镜阵列31的一侧设有止光器29，该器件的作用是防止光向外散射，每个阵元有两种状态，一种是把光导向光学透镜32，另一种是把光导向止光器29,通过高频切换这两种状态，可实现每个波长分量的光强幅度的调制。

从MEMS光学元件阵列射出的调制波分光束130经过诸如光学透镜32和一个或多个反射镜33之类的用于引导光线的光学元件导向流通池41。光学透镜可以是球面透镜、柱面透镜、环形透镜、自由曲面透镜、衍射元件和透镜阵列中的一种或几种的组合。在图1B所示的光路系统中，光学透镜和反射镜的设置使得调制波分光束130的所有的已调制波长分量同时照射到流通池41内部的样品上。应当理解，在其他替代实施方式中，也可以使调制波分光束130 的中的一部分已调制波长分量照射到样品模块40的流通池41内部的样品上。

具有多个已调制波长分量的调制波分光束130穿过流通池41中的样品后射向下游的凹面镜42，凹面镜42的布置使空间上分散的多个已调制波长分量会聚起来，同时照射到检测器51上，从而获得第一待解调信号。此处的凹面镜42也可以换成光学透镜，同时改变检测器51的布局，使空间上分散的多个已调制波长分量会聚并照射到检测器51上。

图3A示出了根据本公开的第二较佳实施例的样品吸收光谱测定系统的原理示意图。与图1A所示的系统相同，第二较佳实施例的系统也包括光源10、波分模块20、调制模块30、样品模块40、检测模块以及解调模块70。

第二较佳实施例的系统相较第一较佳实施例的系统的不同之处于，在调制模块30下游设置了分束器35，该分束器35将从调制模块30获得的调制波分光束分成两部分，其中一部分的光强小于等于50％，另一个部分的光强大于等于50％。较佳地，分束器35将调制波分光束分成两个光强不同的部分，其中光强相对较小的部分不经过样品模块40，而是直接被参考光检测模块503(即，第三检测模块)接收到，从中获得时域信号不包含样品吸收光谱信息而作为参考时域信号。这部分参考时域信号与从样品模块40下游的透射光检测模块50获得的包含吸收光谱信息的第一待解调信号一同被送到解调模块70。该解调模块70通常包括差分放大器和时域-频域转换器，优选地，解调模块70与调制模块30通过总线相连，与调制模块30的调制频率和相位信息进行同步，进而解调模块70基于参考时域信号、调制模块30的调制频率和相位信息来处理第一待解调信号，从而获得吸收光谱。

由于图3A所示的系统中引入了参考时域信号，因此，可以有利地消除光源本身的噪声和波动，提高吸收光谱的信噪比。

对应于图3A所示的系统，图3B示出了适用于本公开的第二较佳实施例的光路布置。该光路布置同样包括发光件11、入射狭缝12、凹面光栅21、MEMS 反射镜阵列31、光学透镜32和反射镜33、流通池41和凹面镜42。特别地，其中流通池41的光路上游增设了一个分束器35，该分束器35使调制波分光束 130中光强小于等于50％的一部分不照射流通池41，而是直接照射到另一个检测器52上，而调制波分光束130中的光强大于等于50％的一部分通过流通池 41照射到检测器51中。应当理解，从分束器35中折射出的这一部分光束同样包括所有的调制信息，即这一部分未照射到流通池41的光束也具备多个已调制波长分量，已调制波长分量的数量与经过流通池41的已调制波长分量的数量一致。检测器52中获得信号被作为对检测器51的信号解调的参考信号。

图4示出了根据本公开的第三较佳实施例的样品吸收光谱测定系统的原理示意图。与图3A所示的系统相同，第三较佳实施例的系统也包括光源10、波分模块20、调制模块30、样品模块40、包括第一透射光检测器501和第二透射光检测器502的检测模块以及解调模块70，同时该系统也包括分束器35。

第三较佳实施例的系统相较第二较佳实施例的系统的不同之处于，该系统中的分束器35设置在了样品模块40的下游。该分束器35将穿过样品模块40 的包含吸收光谱信息的调制波分光束分成两个部分，其中一部分的光强小于等于50％，另一个部分的光强大于等于50％。较佳地，两部分调制波分光束光强不同。

根据第三较佳实施例，样品吸收光谱测定系统中的检测模块包括第一透射光检测器501和第二透射光检测器502，第一透射光检测器501同时接收穿过流通池41的多个已调制波分长量中的第一部分，而第二透射光检测器502同时接收穿过样品的多个已调制波长分量中的第二部分，由此，获得的第一待解调信号包括分别由两个透射光检测器501、502获得的两部分信号。较佳地，这两部分信号均为时域信号。随后，这两部分信号同时被输送到解调模块70 并进行解调。根据第一透射光检测器501和第二透射光检测器502的放大比率可以获得样品的吸收光谱，成对检测器501、502的使用有效增大了信号检测的动态范围。

图5A示出了根据本公开的第四较佳实施例的样品荧光光谱测定系统的原理示意图。该系统主要包括提供广谱光束110的光源10、波分模块20、调制模块30、样品模块40、检测模块60以及解调模块70。

与本公开的第一较佳实施例的用于吸收光谱测定的系统的不同之处在于，检测模块60同时接收样品模块中的样品由于多个已调制波长分量激发产生荧光，从而获得第二待解调信号。获得的第二待解调信号接着被解调模块70接收进行解调，从而获得样品的荧光光谱。此外，对于荧光光谱测定而言，较佳地可使离开调制模块30的波长分量的数量少于进入调制模块30的波长分量的数量，以避免与荧光波长相同的波长分量照射到样品上。

图5B示出了第四较佳实施例的样品荧光光谱测定系统的光路布置。

与根据第一较佳实施例用于吸收光谱测定系统的光路布置类似，该光路布置同样包括带有会聚透镜的卤素灯、氙灯之类的发光件11、接收来自发光件 11的广谱光束110的入射狭缝12、按波长段的不同使光束在空间上分离的凹面光栅21、MEMS反射镜阵列31、光学透镜32、反射镜33及流通池41。

流通池41中的样品被来自反射镜33的调制波分光束激发产生荧光。荧光通过另一聚光透镜43、出射狭缝44以及滤波片45后射向另一光栅47。出射狭缝44的设置能够排除样品荧光之外的一些杂散光线。衍射光栅47的上游处设置的滤波片45的设置则能有选择地阻挡部分波长范围的样品激发的荧光和激发光的散射光。

光栅47可以是线性光栅(linear grating)、凹面光栅，也可以是凹面阶梯光栅(Echelle grating)。光栅47布置成使得荧光光束在空间上按照波长段的不同而分散开并转向至光路下游的荧光检测器61，以便在荧光检测器61上进行检测。

图6A示出了根据本公开的第五较佳实施例的样品荧光光谱测定系统的原理示意图。

与第四实施例的样品荧光光谱测定系统类似，图6A所示系统主要包括提供广谱光束110的光源10、波分模块20、调制模块30、样品模块40、检测模块以及解调模块70。特别地，第五较佳实施例的检测模块包括成对荧光检测器 601和602(即，第三检测器和第四检测器)。样品模块40中的样品被激发产生的荧光的第一荧光部分由成对荧光检测器601和602中的一个检测，第二荧光部分由成对荧光检测器601和602中的另一个进行检测，从而获得包括两部分待解调信号的第二待解调信号。较佳地，第一部分荧光为光强小于可接收的荧光总光强的10％，相应地，第二部分荧光的光强大于等于可接收的荧光总光强的90％。

通常，从两个荧光检测器601和602获得的第二待解调信号为时域信号，获得的每一个时域信号均包含了以具有不同调制频率的已调制波长分量激发的样品的荧光信息，例如如图7A所示。基于从调制模块30获得的调制频率和相位信息，系统中的解调模块70根据两部分荧光的光强比例以及两个荧光检测器601和602的放大比例对两部分待解调信号进行解调，从而获得所需的样品的荧光光谱。由于采用了成对检测器，显著提高信号检测的动态范围。

特别地，检测模块的时域信号通过解调模块70能够即时地转换成2维荧光信号，如图7B所示，其中λ_E为激发波长，λ_F荧光波长，I_F为荧光强度，其中激发波长维度对应于调制频率维度。

图6B、图6C和图6D示出了用于图6A的样品荧光光谱测定系统的三种光路布置。这三种光路布置在检测器上游的光学元件的布置与图5B所示的光路布置基本一致。

如图6B所示，在衍射光栅47的光路下游具有成对的荧光检测器62，它们可以是光电倍增管(PMT)阵列，也可以是多像素光子计数器(MPPC)。检测模块被上下成对布置成两个排阵列，从而形成了两个检测器，其中一排作为第一检测器对大于等于90％的可接收荧光进行检测，而另一排作为第二检测器对小于10％的荧光部分进行检测，从而获得两部分待解调信号。

作为替代实施例，如图6C所示，成对的检测器可以相互独立布置，各自具有独立的入射窗。中一个检测器的入射窗接收到大于等于90％的可接收荧光进行检测，而另一检测器的入射窗接收到小于10％的可接收荧光进行检测，从而获得两部分待解调信号。

作为另一种替代实施例，如图6D所示，成对的检测器64中的每一个均可包括光电倍增管(PMT)阵列或多像素光子计数器(MPPC)。一个检测器的入射窗接收到光强大于90％的荧光部分，进行检测，而另一检测器的入射摄窗对光强小于10％的荧光部分进行检测，从而获得两部分待解调信号。

每个检测器可以具有N(N>1)排检测阵列，并且每一排检测阵列具有多个检测通道。相邻两排的通道阵列之间不对齐，即，相邻的两排的检测通道相互偏置或缩进。较佳地，相邻两排的检测通道以检测通道的长度的1/N的偏置或缩进，使得每一个检测通道检测荧光的每个波长分量的不同部分。这样，由所有排的检测阵列荧光光谱组合起来能够获得分辨率提高了N倍。

例如，如图6D所示，每个检测器具有3排检测阵列，每排检测阵列具有多个检测通道。上下相邻的检测通道相互偏置1/3的通道宽度，中间一排检测阵列相对最下方一排检测阵列向左侧偏置1/3，最上方一排检测阵列相对最下方一排检测阵列向左侧偏置2/3。由此，可能使检测分辨率提高3倍。

在替代实施方式中，相邻排检测阵列的偏置量可以以质数比率设置。具体地，N排检测阵列，第二排相对第一排、第三排相对第二排、第四排相对第三排直到第N排相对于第N－1排的偏置量比为p1:p2:p3：…pN,其中，p1、p2、 p3…pN选择为不同质数，例如p1:p2:p3为1:3:5。同时，TP为各相邻偏置量的总合，即，TP＝p1+p2+p3…+pN。

例如，每个检测器可以具有上下设置4排像素通道阵列，其中至上而下的第二排、第三排和第四排分别以检测通道宽度的3/15、5/15、7/15相对相邻的一排偏置或缩近，即它们是以质数3、5、7的比例缩进，对于检测精度的增加的更为有利。

上述实施例中的调制模块30可进一步包括角度调制模块310和光束选向模块320。具体而言，如图10所示，由光源10发出的广谱光束110经过例如包括光色散元件、光栅、棱镜、衍射元件或其组合的波分模块20，获得具有空间分离的多个波长分量的波分光束120，这些波长分量到达角度调制模块310 的MEMS光学元件阵列，阵列具有多个空间段，每一个空间以一个特征频率调制对应的一个波长分量的出射角度，使该波长分量与其他波长分量具有不同的调制频率。接着，经过频率调制的波长分量达到光束选向模块320。如图10所示，光束选向模块320较佳地包括会聚波分光束120的光学元件、放在光束焦点上的光阑和使各波长分量准直的光学元件。光束选向模块320的作用是使入射角度为0的光透过，并阻挡其他角度入射的光。将角度调制模块310和光束选向模块320合用，可以获得光强幅度被调制的波分光束，并且每个波长分量的调制频率不同。

上述的样品吸收光谱和荧光光谱系统可以整合在一起构成用于同时测定样品的吸收光谱和荧光光谱的系统。该系统包括光源10、波分模块20、调制模块30、样品模块40、吸收光谱模块组和荧光光谱模块组。其中吸收光谱模块组进一步包括吸收光谱检测模块和吸收光谱解调模块，而荧光光谱模块组进一步包括荧光光谱检测模块和荧光光谱解调模块。

具体而言，波分模块20接收到来自光源10的广谱光束110，将其转换成具有在空间上分离的不同波长段的多个波长分量的波分光束120。调制模块30 构造成同时对波分光束120的不同波长段的波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束130。离开调制模块30的调制波分光束130的各个已调制波长分量各自在空间上分离，并且每一个已调制波长分量都具有特定的调制频率。样品模块40同时接收来自调制模块30的调制波分光束130的多个已调制波长分量。样品模块40一方面允许多个已调制波长分量的至少一部分通过并同时照射到透射光检测模块50获得关于吸收光谱的待解调信号，另一方面允许样品模块40处的样品被多个已调制波长分量激发，产生包括多个波长段的荧光，荧光照射到荧光光谱检测模块以获得关于荧光光谱的待解调信号。两部分信号分别被解调模块70解调，从而获得相应的吸收光谱和荧光光谱。该系统能够实现同一样品吸收光谱和荧光光谱的同时检测。需说明的是，该双重光谱检测系统中的两个解调模块70可以整合在同一数据处理设备中，该数据处理设备可以与检测系统集成在一起，也可以是借助于通过数据总线远程连接的设备。

图8A示出了根据本公开第六较佳实施例的样品吸收光谱和荧光光谱测定系统的电路示意图。

如图8A所示，由光源产生的具有多个波长段的广谱光束110经波分模块 20形成具有多个波长分量的波分光束120一起进入到光调制器301，例如MEMS 反射镜阵列、MEMS空间光调制器等。光调制器301由调制驱动器302驱动，调制驱动器302包括微控制器(ARM处理器或FPGA)、ROM、RAM、时钟和电源。调制驱动器302为光调制器301提供设定的调制方式和控制信号。例如调制驱动器302可选定190nm至900nm的波长作为目标波长，控制光调制器 301对这一范围内的波长进行调节。调制驱动器302还将针对不同波长段的波长分量，选择从2到999983范围内的不同质数“PN”，选定波长的调制频率等于PN*F_base，其中F_base为1Hz或10Hz或100Hz或1000Hz。如果F_base等于10Hz或100Hz，由于存在谐波的影响，系统需要设定比1H更高的信噪比和 ADC采样率。优选地，F_base为1Hz，这样所有调制频率均为质数。调制占空比设置范围可以从10％/90％(ON/OFF)到90/10％(ON/OFF)可调，而调制深度从 25％到100％可调。图9A示出了采用质数调制频率的光谱，其中Ab表示吸收率， W表示波长,其中弱信号能够被检测到，而图9B示出了采用非质数调制频率光谱，其中弱信号被噪声湮没无法被检测到其中Ab表示吸收率，W表示波长。比较两组信噪比的图可知，采用质数调制频率具有更好的信噪比。

光调制器301向样品模块40提供多个已调制波长分量的一部分或全部。多个已调制波长分量通过样品模块40并同时照射到透射光检测模块50获得时域信号，该时域信号包含具有不同调制频率的样品透射光信息。时域信号输出到模数转换器701，其通常包括滤波器、放大器和模数转换电路。模数转换器 701对模拟电子信号进行采样并将其转换为数字信号。较佳地，采样率至少为 100KHz，且至少比最大调制频率高5倍，并且采样精度至少为12bit。由此获得带有样品透射光的数字时域信号。

另一方面，荧光检测模块60接收到被多个已调制波长分量激发的样品模块40中的样品产生的荧光。荧光检测模块60可包括光栅、多通道PMT阵列、或多通道多像素光子检测器等，检测模块60也产生时域信号，此处的时域信号包含由具有不同调制频率的波长分量激发的样品的荧光信息。含荧光信息的时域信号提供到另一模数转换器702，其同样包括滤波器、放大器和模数转换电路，此获得具样品荧光信息的多个检测通道的数字时域信号。

带有样品透射光信息的数字信号和带有样品荧光信息的数字信号送入到信号处理单元703，并获得样品吸收光谱和荧光光谱。优选的信号处理单元703 和调制驱动器302之间有总线相连，以同步调制、解调频率和相位信息进行锁相放大(Lock-in Amplify)，进而获得光谱。可选的，调制模块与信号处理单元 703不通过总线相连，这时需要信号处理单元703对时域信号进行傅里叶变换来获得光谱。波分光束的各个波长与调制频率的对应关系在设计、装调波分模块20和调制模块时就已经确定，所述对应关系的信息也会作为信号处理单元 703的输入信息。

将透射光的数字时域信号变换成吸收光谱通常分为如下几步，1)通过数字锁相放大或数字傅里叶变换将数字时域信号变换成透射光强对应于调制频率的信号谱图，2)通过波分光束的各个波长与调制频率的对应关系，将1)中所述信号谱图变换成透射光强对应于波分光束的各个波长的透射谱图，3)根据预先测量并保存的背景(无样品)的透射谱图，样品的透射谱图变换成样品的吸收谱图。

将荧光的数字时域信号变换成荧光光谱通常分为如下几步，1)通过数字锁相放大或数字傅里叶变换将数字时域信号变换成荧光光强对应于调制频率的信号谱图，2)通过波分光束的各个波长与调制频率的对应关系，将1)中所述信号谱图变换成荧光光强对应于波分光束的各个波长的荧光激发谱图，即荧光强度与激发波长的对应关系谱图，3)根据每个检测通道所对应的荧光波长，将荧光激发谱图拓展成荧光二维谱图。

图8B示出了根据本公开的第六较佳实施例的同时测量吸收光谱和荧光光谱的系统光路示意图。这一光路布置将图1B所示的光路布置中的各器件和图 5B所示的光路布置中的各器件整合在一起。

具体而言，适用于同时测量吸收光谱和荧光光谱的光路布置包括发光件11、入射狭缝12、凹面光栅21、MEMS反射镜阵列31、光学透镜32和反射镜33、流通池41和凹面镜42，并且同时还包括另一聚光透镜43、出射狭缝44以及滤波片45以及另一光栅47。当调制波分光束照射到流通池41中时，一方面，调制波分光束穿过流通池41中的样品后射向下游的凹面镜42，凹面镜42的布置使空间上分散的多个已调制波长分量会聚起来，同时照射到检测器51上，从而获得包含吸收光谱信息的第一待解调信号。另一方面，流通池41中的样品被来自反射镜33的调制波分光束激发产生荧光，荧光通过另一聚光透镜43、出射狭缝44以及滤波片45后射向另一光栅47。光栅47布置成使得荧光光束在空间上按照波长段的不同而分散开并转向至光路下游的荧光检测器61，而获得包含荧光光谱信息的第二待解调信号。采用该光路布置，吸收光谱和荧光光谱能够同时进行检测。

图11(a)-图11(f)示出了图3A和图4所示系统的示例性的吸收光谱动态范围的模拟实例。

在该实例中，提供三个波长分量，它们的波长分别为395±5nm、405±5nm、 415±5nm。将这些波长分量设定为具有相同的光功率和幅度。接着，分别以 12197Hz、14713Hz、15727Hz对三个波长分量进行调制。样品针对395±5nm、 405±5nm、415±5nm波长分量的吸光度分别设置为5.301030Abs、1.000000Abs、 0.000002Abs，Abs为吸光度单位，吸光度计算公式为A(Abs)＝lg(I0/I)，其中I0 为入射光强(光源光强)，I为透射光强。对于三个波长分量原始光强，检测器的响应分别设置为1.0V、1.0V和1.0V。假设三个波长分量的光强噪声均方根值在响应频率为100Hz、10Hz、1Hz、0.1Hz和白噪声时分别为1mv、5mv、10mv、 50mv和10mv。假设电子白噪声均方根值为1mV。

图11(a)是从接收小部分调制波分光束的参考光检测模块503获得的时域信号，其中横轴表示时间(t)，竖轴表示信号幅度(S)。该信号的幅度以因子fr被放大，其中fr＝1/r，其中r是光源被分束到参考光检测模块503的一部分调制波分光束所占比率。右上角的放大图是未经调制的检测器的光源噪声响应。图 11(b)是从接收到通过样品的大部分调制波分光束的透射光检测模块50获得的时域信号，其中横轴表示时间(t)，纵轴表示信号幅度(S)。该信号的幅度以因子fp＝1/p放大，其中p是通过样品的一部分调制波分光束的所占比率。图11(c) 分别是两个检测器的差分放大信号，其中横轴表示时间(t)，纵轴表示信号幅度(S)。第一检测器和第二检测器的放大系数分别为fp和fr。采样率设置为10MHz。

有两种方法可以得到fp和fr因子。第一种方法是直接从分束器的规格中得到p和r，由此计算获得fp和fr。第二种方法是调整fp和fr使得来自两个检测器的波分分量(例如用14713Hz调制的405±5nm波长分量)的傅立叶变换幅度成相等的值，例如，1.0V，以适用于电子放大器和模数转换器 (ADC)。在调整fp和fr之前应移除样本。

经过傅立叶变换将获得如图11(d)、(e)、(f)所示的调制频域中的傅立叶变换幅谱，分别由时域信号(a)、(b)、(c)变换而来，其中横轴表示频率(f)，纵轴表示相应频率信号的幅度(A)。傅里叶变换的积分时间为1s。图11(d)中12197Hz、14713Hz和15727Hz(对应波分，395±5nm、405±5nm、 415±5nm)的幅度分别为1.000000V、1.000000V和000000V。图11(e)中分别为 0.000014V(在图11(e)的左上角局部放大图中可见)、0.100003V和0.999995V。图11(f)中的值为0.999995V、0.900001V和0.000005V(在图11(f)的右上角局部放大图中可见)。

按照图11(e)中的数据，可以计算获得395±5nm、405±5nm和415±5nm 三个波长分量的吸光度，它们分别为：lg(1.0/0.000014)＝4.853872Abs, lg(1.0/0.100003V)＝0.999987A,lg(1.0/0.999995)＝0.000002A.

原始光源白噪声为10mv。考虑到10MHz的采样率，1s的积分时间，光源白噪声被抑制到10mV/sqrt(10e6)＝3uV RMS噪声，或者6*3uV＝18uV峰峰值噪声。傅里叶变换后光源的100Hz到0.1Hz波动得到很好的抑制。这种单检测器方法的检测受到光源白噪声的限制。这种单检测器方法提供10⁵的线性动态范围(最大信号为1V，光源白噪声为10mV，电子白噪声为1mV，采样率为10MHz，积分时间为1s)。

按照图11(f)中的数据，可以计算获得三个波长分量(395±5nm,405±5 nm和415±5nm)的吸光度，它们分别为：lg(1.0/(1.0-0.999995))＝5.301030Abs, lg(1.0/(1.0-0.900001))＝1.000004Abs,lg(1.0/(1.0-0.000005))＝0.000002Abs.

由此这些噪声被差分放大而抑制，因此光源本身的波动和白噪声被很好地抑制了。结合了差分放大器成对检测器的检出限仅受电子噪声的限制，见放大图，即1mV/sqrt(10e6)＝0.3uV RMS噪声，或6*0.3uV＝1.8uV峰峰值噪声。这种成对检测器方法提供10⁶的线性动态范围(最大信号为1V，光源白噪声为 10mV，电子白噪声为1mV，采样率为10MHz，积分时间为1s)。

图12(a)-图12(d)示出了图5A和图6A所示系统的示例性的荧光光谱动态范围的模拟实例。

在该实例中，提供一种光源以产生的三个波长分量照射样品激发荧光，它们的波长分别为395±5nm、405±5nm和415±5nm。将这些波长分量设定为具有相同的光功率和幅度。接着，分别以12197Hz、14713Hz、15727Hz的质数频率对三个波长分量进行调制。样品被三个波长分量分别激发产生荧光，其中 525±5nm的荧光强度分别为0.1x10ct/us(每微秒10个计数)、500x10ct/us 和5000x10ct/us；565±5nm波长的样品荧光强度分别为500x10³x10ct/us、 100x10ct/us和5x10⁶x10ct/us，此时采样率为10Mhz，荧光强度单位为每100 纳秒计数，即每微秒10计数。

使用多通道多像素光子计数器(MPPC)作为成对的检测器。假设第一个检测器接收0.001份荧光，第二个检测器接收0.999份荧光。每个检测器具有三排多个光计数器阵列，如图13所示，每排检测阵列有多个通道，每个通道最大光子计数率为4000x10ct/us。从光栅分散到每个MPPC检测器的荧光的多个波长分量被3行中相应通道接收。因此，每个MPPC检测器最多可接收的每个波长分量的光子计数率为3x4000x10ct/us＝12000x10ct/us。因此，第二个检测器的探测范围从Noise2到12x10³x10ct/us，第一个检测器的探测范围从Noise1到1000x12000x10ct/us＝12x10⁶x10ct/us，因为光子计数第一个检测器的衰减率应乘以衰减比10³，以获得第一个检测器上的实际光子计数。

假设第二个检测器每个通道的峰峰值噪声(包括杂散光)为100x10ct/us。则第一个检测器的每个通道的峰峰值噪声为100x10³x10ct/us。

图12(a)显示了第一个检测器的第一列通道对于565±5nm波长分量的荧光时域信号，图12(b)显示了第二个检测器的第二列通道对于525±5nm波长分量的荧光时域信号，其中横轴表示时间(t)，纵轴表示光子计数(PC)。在本实例中，565±5nm波长分量的荧光较强(10⁶x10ct/us)，第二个检测器的第二列通道已经饱和，但可以被第一个检测器的第二列通道检测到。525±5nm 波长分量的荧光较弱(0.1–500x10ct/us)，无法被第一个检测器的第一列通道检测到，但可以被第二检测器的第二列通道检测到。

图12(c)分别显示了由395±5nm、405±5nm和415±5nm已调制波长分量激发的565±5nm的荧光光谱，其中横轴表示频率(f)，纵轴表示光子计数(PC)。积分时间为1s。荧光计数分别为500x10³x10ct/us、10⁵x10ct/us(图12(c) 的左上角局部放大图中清楚示出)和5x10⁶x10ct/us。左上角放大图显示Noise1＝40x10ct/us。因此，第一检测器的线性动态范围为12x10⁶x10ct/us/(3 x40x10ct/us)＝10⁵，采样率为10MHz，积分时间为1s。

图12(d)分别显示了在被395±5nm、405±5nm和415±5nm已调制波长分量激发的525±5nm荧光光谱，其中横轴表示频率(f)，纵轴表示光子计数(PC)，其中积分时间为1s，荧光计数分别为0.1x10ct/us(图12(c)的左上角局部放大图中清楚示出)、500x10ct/us和5000x10ct/us。左上角放大图显示Noise2 ＝0.004x10ct/us。因此，第一检测器的线性动态范围为12x10³x10ct/us/(3x 0.04x10ct/us)＝10⁵，采样率为10MHz，积分时间为1s。

以单个检测器，运态范围为10⁵，采样率为10MHz，积分时间为1s。如果结合两个检测器，整体的线性动态范围为12x10⁶x10ct/us/(3x0.04x10ct/us) ＝10⁸，采样率为10MHz，积分时间为1s。由此可见，成对检测器的使用显著增加了信号检测的动态范围。

采用根据本公开的技术样品光谱检测系统和方法，吸收光谱和荧光光谱的检测可以同步进行。对于荧光光谱的检测，在使用流动样品的情况下就能即时获得二维的荧光光谱，使得光谱的检测速度更快。根据本公开的系统没有机械运动部件，系统整体更为紧固和可靠，并且系统布置更为紧凑，从而实现系统设备的小型化。

本文描述的技术可以用硬件、软件、固件或其任何组合来实现，除非具体描述为以特定方式实现。描述为模块或部件的任何特征也可以一起实现在集成逻辑设备中，或单独实现为离散但可互操作的逻辑设备。如果用软件实现，可以至少部分地通过包括指令的非瞬态计算机可读存储介质来实现该技术，当指令被执行时，执行上述方法中的一个或多个。非暂态处理器可读数据存储介质可以形成可包括封装材料的计算机程序产品的一部分。程序代码可以用高级过程编程语言或面向对象的编程语言来实现，以便与处理系统通信。如果需要，也可用汇编语言或机器语言来实现程序代码。事实上，本文中所描述的机制不限于任何特定的编程语言的范围。在任何情况下，该语言可以是编译语言或解释语言。

至少一些实施例的一个或多个方面可由存储在机器可读介质上的表示处理器中的各种逻辑的表示性指令来实现，该表示性指令在由机器读取时使得该机器制造用于执行本文中所描述的技术的逻辑。此类机器可读存储介质可以包括但不限于通过机器或设备制造或形成的物品的非暂态的有形安排，其包括存储介质，诸如：硬盘；任何其他类型的盘，包括软盘、光盘、紧致盘只读存储器(CD-ROM)、紧致盘可重写(CD-RW)以及磁光盘；半导体器件，诸如只读存储器(ROM)、诸如动态随机存取存储器(DRAM)和静态随机存取存储器(SRAM)之类的随机存取存储器(RAM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM)、闪存、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)；相变存储器(PCM)；磁卡或光卡；或适于存储电子指令的任何其他类型的介质。

本公开虽然以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本公开，任何本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围内，都可以做出可能的变动和修改。因此，凡是未脱离本公开技术方案的内容，依据本公开的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化及修饰，均落入本公开权利要求所界定的保护范围之内。

Claims (22)

1.一种对样品进行光谱测定的方法，包括以下步骤：

a.将广谱光束中不同波长段的波长分量在空间上分离，从而获得包括具有不同波长段的多个波长分量的波分光束；

b.同时对所述波分光束中的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束；以及

c.使所述多个已调制波长分量中的至少一部分同时照射所述样品；

所述方法还包括以下第一组步骤和第二组步骤中的至少一组：

其中所述第一组步骤包括：

d1.同时接收穿过所述样品的多个所述已调制波长分量，以获得第一待解调信号；和

e1.对所述第一待解调信号进行解调，以获得所述样品的吸收光谱；

所述第二组步骤包括：

d2.同时接收所述样品由多个所述已调制波长分量激发的荧光，以获得第二待解调信号；和

e2.对所述第二待解调信号进行解调，以获得所述样品的荧光光谱。

2.如权利要求1所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，步骤b还包括：

-以不同的质数频率对所述不同波长段的所述多个波长分量进行调制。

3.如权利要求2所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，所述步骤b还包括:

-多个所述调制频率被选择为任何两个频率间的差值都不相同。

4.如权利要求1所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，所述方法包括所述第二组步骤，其中步骤e2还包括：

-将所述第二待解调信号转换为二维荧光光谱。

5.如权利要求1所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，所述方法包括所述第一组步骤，

其中步骤d1还包括：

-分别同时接收穿过所述样品的多个所述已调制波长分量中的第一部分和穿过所述样品的多个所述已调制波长分量中的第二部分，获得包括分别对应于所述第一部分和所述第二部分的两部分时域信号的所述第一待解调信号；

步骤e1还包括：

-将所述两部分时域信号分别进行解调，并根据所述第一部分和所述第二部分的光强比例以及根据所述第一部分和所述第二部分的接收放大比率获得所述样品的吸收光谱。

6.如权利要求5所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，所述第一部分的光强与所述第二部分的光强不同。

7.如权利要求1所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，所述方法包括第一组步骤，

其中在步骤b之后步骤c之前还包括：

-同时接收所述多个已调制波长分量中的未照射到所述样品的部分，并获得该部分的时域信号作为参考时域信号；

在步骤e1中，所述第一待解调信号为时域信号；

其中所述步骤e1还包括：

-所述参考时域信号和所述第一待解调信号进行解调获得所述样品的吸收光谱。

8.如权利要求7所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，所述未照射到所述样品的部分的光强小于所述调制波分光束的光强的50％。

9.如权利要求1所述的对样品进行光谱测定的方法，其特征在于，

所述方法包括所述第二组步骤，

其中步骤d2还包括：

-分别同时接收所述荧光的第一荧光部分和第二荧光部分，获得包括分别对应于所述第一荧光部分和所述第二荧光部分的两部分待解调信号的第二待解调信号，所述第一荧光部分的光强小于所述荧光的总光强的10％，

步骤e2还包括：

对所述第二待解调信号进行解调，并根据所述第一荧光部分和所述第二荧光部分的光强比例以及所述第一荧光部分和所述第二荧光部分的接收放大比率获得所述样品的荧光光谱。

10.一种对样品进行光谱测定的系统，包括：

光源，所述光源构造成发射广谱光束；

波分模块，所述波分模块将来自所述光源的所述广谱光束中不同波长段的波长分量在空间上分离，从而获得具有不同波长段的多个波长分量的波分光束；

调制模块，所述调制模块同时对所述波分光束的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束；以及

样品模块，所述样品模块构造成允许所述多个已调制波长分量中的至少一部分同时照射所述样品；

所述系统还包括以下吸收光谱模块组和荧光光谱模块组中的至少一个模块组；

所述吸收光谱模块组包括：

第一检测模块，所述第一检测模块同时接收穿过所述样品的多个已调制波长分量，并获得第一待解调信号；和

第一解调模块，所述第一解调模块对所述第一待解调信号进行解调，以获得所述样品的吸收光谱；

所述荧光光谱模块组包括：

第二检测模块，所述第二检测模块同时接收所述样品由多个所述已调制波长分量激发的荧光，获得第二待解调信号；和

第二解调模块，所述第二解调模块对所述第二待解调信号进行解调，以获得所述样品的荧光光谱。

11.如权利要求10所述系统，其特征在于，

所述调制模块包括具有多个空间段的MEMS光学元件阵列，其中每个一所述空间段被设置成以不同的调制频率对所述波分光束中的一个波长分量进行调制，其中所述不同的调制频率为不同的质数频率。

12.如权利要求11所述的系统，其特征在于，

多个所述不同的调制频率被选择为任何两个频率间的差值都不相同。

13.如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述系统包括所述荧光光谱模块组，

其中所述第二解调模块构造成将所述第二待解调信号转换为二维荧光光谱。

14.如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述系统包括所述吸收光谱模块组；

其中所述第一检测模块包括第一检测器和第二检测器，利用所述第一检测器接收穿过所述样品的多个所述已调制波长分量中的第一部分，利用所述第二检测器接收穿过所述样品的多个所述已调制波长分量中的第二部分，由此获得的所述第一待解调信号包括分别由第一检测器和第二检测器获得的两部分时域信号；

所述第一解调模块将所述两部分时域信号分别进行解调，并根据第一检测器和第二检测器的放大比率获得所述样品的吸收光谱。

15.如权利要求14所述的系统，其特征在于，所述吸收光谱模块组还包括分束器，所述分束器将穿过所述样品的所述调制波分光束成第一部分和第二部分，所述第一部分的光强与所述第二部分的光强不同。

16.如权利要求10所述的系统，其特征在于，

所述系统还包括第三检测模块，利用所述第三检测模块接收所述多个已调制波长分量中的未照射到所述样品的部分，并获得该部分的时域信号作为参考时域信号，

所述系统包括所述吸收光谱模块组，其中所述第一待解调信号为时域信号；

所述第一解调模块包括差分放大器和转换器，所述差分放大器和所述转换器对来自所述参考时域信号和所述时域信号进行差分放大并解调获得所述样品的吸收光谱。

17.如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述系统包括所述荧光光谱模块组；

所述第二检测模块包括第三检测器和第四检测器，所述荧光的第一荧光部分由所述第三检测器检测，所述荧光的第二荧光部分由所述第四检测器检测，由此获得的第二待解调信号包括分别由第一荧光部分和第二荧光部分获得的两部分待解调信号，其中所第一述荧光部分的光强小于所述荧光的总光强的10％，

所述第二解调模块构造成对所述第二待解调信号进行解调，并根据所述第一荧光部分和所述第二荧光部分的光强比例以及所述第三检测器和所述第四检测器的放大比率获得所述样品的荧光光谱。

18.如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述系统包括所述荧光光谱模块组，

其中所述荧光检测模块包括光电倍增管(PMT)阵列和多像素光子计数器(MPPC)中至少一种的光电检测器构成的成对检测器，

每一个所述检测器具有多排多通道阵列，相邻两排的通道阵列之间不对齐。

19.如权利要求10所述的系统，其特征在于，

所述波分模块包括光色散元件、光衍射元件、光栅和棱镜中的至少一种；

所述样品模块包括布置成样品能够从中流过的流通池。

20.一种流式细胞仪，包括：

光源，所述光源构造成发射广谱光束；

波分模块，所述波分模块将来自所述光源的所述广谱光束中不同波长段的波长分量在空间上分离，从而获得具有不同波长段的多个波长分量的波分光束；

调制模块，所述调制模块同时对所述波分光束的不同波长段的多个波长分量以不同的调制频率进行调制，形成具有多个已调制波长分量的调制波分光束；

流通池，所述流通池构造成允许所述多个已调制波长分量中的至少一部分同时照射移动通过所述流通池的细胞流上；以及

荧光光谱模块组，所述荧光光谱模块组包括：

检测模块，所述检测模块同时接收所述细胞流由多个所述已调制波长分量激发的荧光，获得待解调信号；和

解调模块，所述解调模块对所述待解调信号进行解调，以获得所述细胞流的荧光光谱。

21.如权利要求20所述流式细胞仪，其特征在于，

所述调制模块包括具有多个空间段的MEMS光学元件阵列，其中每个一所述空间段被设置成以不同的调制频率对所述波分光束中的一个波长分量进行调制，其中所述不同的调制频率为不同的质数频率。

22.如权利要求20所述的流式细胞仪，其特征在于，

多个所述不同的调制频率被选择为任何两个频率间的差值都不相同。

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