CN114317730B - Ttpal作为胃癌监测或预后判断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了通过测量TTPAL蛋白或其片段表达水平来对个体中的胃癌进行监测或预后判断的方法以及相应的试剂盒。本申请还提供了检测TTPAL蛋白或其片段表达水平的方法。此外，本申请还提供了包含用于特异性抑制TTPAL蛋白表达的试剂的药物组合物以及其用于抑制胃癌细胞生长的用途。

Description

TTPAL作为胃癌监测或预后判断标志物的应用

发明领域

本申请涉及医学和生物技术领域。具体地，本申请提供了用于对胃癌进行监测或预后判断的试剂盒及相关应用。

发明背景

胃癌是世界范围内第四大常见癌症，每年确诊大约1,000,000例。胃癌是一种高死亡率疾病，发病率在男性和发展中国家(包括许多亚洲国家)中明显更高。胃癌在早期通常没有症状或者仅表现出非特异性的症状，因此在很多情况下，直到疾病发展到晚期才能做出诊断。这导致预后通常较差。

胃癌TNM分期目前是判断胃癌预后的最重要的临床预测指标。然而，许多患者即使TNM分期属于早期，肿瘤仍有可能复发。因此，需要研发新的用于胃癌监测或风险评估的预后标志物。

发明概述

一方面，本申请提供了用于对个体中的胃癌进行监测或预后判断的试剂盒，其包含用于检测来自所述个体的样本中α-生育酚转移蛋白类似物(TTPAL)蛋白或其片段表达水平、或者所述TTPAL蛋白或其片段的mRNA表达水平的试剂。

另一方面，本申请提供了用于检测来自个体的样本中TTPAL蛋白或其片段表达水平、或者TTPAL蛋白或其片段的mRNA表达水平的试剂在制备用于对所述个体中的胃癌进行监测或预后判断的试剂盒或药物中的用途。

在一些实施方案中，所述TTPAL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示，更优选地，所述TTPAL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在一些实施方案中，所述TTPAL蛋白的片段包含SEQ ID NO:1或2所示序列的氨基酸残基1-179。

在一些实施方案中，上述试剂包括特异性结合所述TTPAL蛋白或其片段的结合剂，优选地，所述结合剂为TTPAL蛋白或其片段的抗体。在另一些实施方案中，所述试剂包括能与TTPAL或其片段的mRNA特异性杂交的多核苷酸探针。

在一些实施方案中，上述样本选自胃组织、血清、血浆或细胞培养物上清，在具体的实施方案中，所述样本为胃癌新鲜组织样本或包埋的标本。

在一些实施方案中，上述试剂盒还包括用于对组织进行免疫化学染色的一种或多种其他试剂。

在一些实施方案中，如果来自所述个体的样本中TTPAL蛋白或其片段、或者TTPAL蛋白或其片段的mRNA表达水平高于某一阈值，则指示所述个体的胃癌预后不良。

另一方面，本申请提供了一种用于抑制胃癌细胞生长的药物组合物，其包括特异性抑制TTPAL蛋白或其片段表达、或者TTPAL蛋白或其片段的mRNA表达的试剂。在具体的实施方案中，所述试剂为干扰RNA。

另一方面，本申请提供了特异性抑制TTPAL蛋白或其片段表达、或者TTPAL蛋白或其片段的mRNA表达的试剂在制备用于抑制胃癌细胞生长的药物中的用途。

再一方面，本申请提供了检测样本中TTPAL蛋白或其片段表达、或者TTPAL蛋白或其片段的mRNA表达的方法，其包括将所述样本用上述试剂盒中的试剂处理，在具体的实施方案中，所述样本为胃癌组织样本。

附图简要说明

图1显示了对胃癌组织(图B)及癌旁正常对照组织(图A)进行免疫组织化学染色的结果，其中TTPAL在胃癌组织中的表达显著升高(图B)，胃癌组织与正常对照的TTPAL表达评分有显著的统计学差异(图C)。P<0.001，与癌旁正常对照相比较。

图2显示了评估TTPAL的表达水平和临床特征的相关性的多因素COX回归分析结果，表明TTPAL高表达可作为胃癌独立的预后诊断因子。

图3显示了胃癌患者存活的Kaplan-Meier分析曲线。P<0.01，与TTPAL低表达组比较。

图4显示了TTPAL在胃癌细胞株MGC803和BGC823过表达后对胃癌细胞生长的促进作用，其中通过单因素方差分析比较细胞的生长速度，***P<0.001，与空载体组比较；通过t检验比较细胞的集落形成能力，**P<0.01，***P<0.001，与空载体组比较。图A证实了TTPAL在MGC803和BGC823中的过表达；图B和图C分别显示了TTPAL过表达后对胃癌细胞MGC803和BGC823生长的促进作用；图D显示了代表性的集落形成图像；图E和图F分别显示了MGC803和BGC823过表达TTPAL后的集落形成能力的分析结果。

图5显示了TTPAL敲低对胃癌细胞生长的抑制作用，其中通过单因素方差分析比较细胞的生长速度，***P<0.001，与siNC组比较；通过t检验比较细胞的集落形成能力，***P<0.001，与siNC组比较。图A证实了TTPAL在胃癌肿瘤细胞MKN74和AGS的表达降低；图B和图C分别显示了TTPAL敲低后对胃癌肿瘤细胞MKN74和AGS生长的抑制作用；图D显示了代表性的集落形成图像；图E和图F分别显示了TTPAL敲低后抑制MKN74和AGS的集落形成能力的分析结果。

图6显示了过表达TTPAL对裸鼠皮下移植瘤生长的促进作用,其中通过单因素方差分析比较肿瘤的生长速度(P<0.0001，与空载体组比较)；通过t检验分析比较肿瘤的重量(*P<0.05，与空载体组比较)。图A和图B分别显示了皮下肿瘤从小鼠分离前和分离后的形态；图C和图D分别显示了皮下肿瘤的体积和重量；图E和图F分别显示了免疫组织化学染色的图像和评分。

序列说明

SEQ ID NO:1：TTPAL亚型-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2：TTPAL亚型-2的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3：TTPAL的cDNA序列。

具体实施方式

本申请提供了TTPAL在对胃癌患者的疾病进展进行监测或预后判断中的应用。TTPAL由全基因组测序发现，又名α-生育酚转移蛋白类似物，该基因定位在20号染体长臂q13.12。TTPAL至少包含两个亚型：亚型-1和亚型-2。TTPAL亚型-1的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。TTPAL亚型-2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。TTPAL的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示。

本申请的发明人首次发现，TTPAL蛋白或其片段在胃癌细胞中的表达与胃癌的预后相关。TTPAL蛋白或其片段在胃癌组织中的高表达指示胃癌较差的预后。也就是说，TTPAL或其片段的高水平表达与患者的不良预后成正相关。这一发现为对胃癌进行风险评估或预后判断提供了重要的手段。TTPAL或其片段可以作为新的胃癌的预后预测标志物。

本文公开的试剂盒能够用于监测胃癌患者的疾病状态。例如，如果利用上述试剂盒检测到TTPAL蛋白或其片段、或者TTPAL蛋白或其片段的mRNA在胃癌患者中高水平表达，表明患者预后较差，例如存在较多的风险因素，存活率较低。在具体的实施方案中，TTPAL高表达可作为独立的胃癌预后诊断因子。

在某些实施方案中，TTPAL蛋白的片段包含至少20-300个氨基酸，例如，至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300个以及上述任两值之间的任一数值的氨基酸。例如，在一些具体的实施方案中，所述TTPAL蛋白的片段包含SEQ ID NO:1或2所示序列的氨基酸残基1-179。

在某些实施方案中，TTPAL蛋白片段与SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列相差约1-30个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在一些具体的实施方案中，TTPAL蛋白片段是在SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列的C端或N端区域被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，TTPAL蛋白片段与SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同源性。在优选的实施方案中，多肽变体与SEQ ID NO:1所示序列具有99％以上的同源性。本文所述的“同源性”被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。

在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包含与TTPAL蛋白或其片段特异性结合的结合剂。在描述具体分子与蛋白或肽的结合关系的情况下使用短语“特异性地结合”时，是指能在蛋白和其他生物制品的异质群体中确定蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的结合测试条件下，指定的结合试剂(如抗体)与具体蛋白的结合是背景的至少两倍，并且不会以显著的量明显结合存在于样品中的其他蛋白。因此，如果结合剂与TTPAL或其片段蛋白以可检测的水平(例如，在ELISA测定中)发生反应，并且在相似条件下不与无关多肽以统计学显著方式发生可检测的反应，则称所述结合剂与TTPAL蛋白或其片段“特异性结合”。

在具体实施方案中，结合剂选自抗体、可溶性受体、适体、抗体模拟物等。在优选的实施方案中，所述结合剂为抗体。任选地，所述抗体被可检测部分标记。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含至少两种不同的抗体，一种用于特异性地结合TTPAL蛋白或其片段(即，一抗)，另一种用于检测一抗(即，二抗)，二抗通常连接有可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分选自酶(例如辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，荧光基团(例如FITC、Rhodamine、TexasRed、PE、Rhodamine、Dylight等)、生物素、金颗粒等，对于Western Blot和ELISA，常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。

在一些实施方案中，所述结合剂例如抗体具有至少约1nM的对所述TTPAL蛋白或其片段的亲和力。在某些示例性实施方案中，所述结合剂例如抗体具有至少约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM的对TTPAL蛋白或其片段的亲和力。在某些实施方案中，所述结合剂结合位于SEQ ID NO:1或2所示序列的TTPAL蛋白独特剪接点内的表位。

本文公开的术语“抗体”是指具有基本四个多肽链结构的抗原结合蛋白，由两条重链和两条轻链组成。抗体具有特异性地结合抗原的能力。术语“抗体”还指抗体的可用于免疫亲和力测试中的抗原结合和表位结合片段，如Fab片段。有很多详细表征的抗体片段。例如，胃蛋白酶会从铰链区中二硫键的C端消化抗体，得到F(ab')₂，即，Fab'的二聚体，Fab'自身是通过二硫键与V_H-C_H1连接的轻链。在温和条件下，F(ab')₂可以被还原而破坏铰链区中的二硫键，由此将(Fab')₂二聚体转变成Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分铰链区的Fab(关于其他抗体片段更为详尽的描述，参见例如Fundamental Immunology,Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993))。尽管各种抗体片段是根据对完整抗体的消化进行定义的，但是本领域技术人员理解，可以通过化学方式或者使用重组DNA法从头合成片段。因此，术语抗体还包括通过改变完整抗体产生的或者使用重组DNA法合成的抗体片段。如本文描述和本领域已知的，术语抗体包括抗体的各种变型，例如FAB、人抗体、修饰的人抗体、单链抗体、非人抗体等。

在优选的实施方案中，本文公开的试剂盒包含的抗体特异性识别SEQ ID NO:1所示序列的TTPAL蛋白，并与其特异性结合，显著提高了针对胃组织中表达的TTPAL蛋白的检测水平，包括例如检测特异性和灵敏度等。

在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包含能与TTPAL mRNA特异性杂交的多核苷酸探针。任选地，用可检测部分(例如荧光团)对所述多核苷酸进行标记。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含用于通过PCR、尤其是RT-PCR扩增TTPAL DNA或mRNA的至少一个区段的至少两个寡核苷酸引物。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法。

本文使用的多核苷酸杂交方法是检测预先确定的多核苷酸序列的存在和/或量的方法，其基于该多核苷酸序列在合适的杂交条件下与序列已知的多核苷酸探针形成Watson-Crick碱基配对的能力。所述杂交方法的实例包括Southern印迹、Northern印迹、微阵列和原位杂交。多核苷酸探针可以缀合能产生可检测荧光信号的化学部分，例如但不限于荧光部分或荧光团。在一些实施方案中，探针是分子信标。

在一些实施方案中，本文所公开的试剂盒还可以包含合适的标准对照。在具体的实施方案中，所述标准对照指示未患胃癌的健康个体的胃上皮中TTPAL蛋白或其片段或TTPAL mRNA的平均值。在一些实施方案中，标准对照可以以设定值的形式提供。另外，本发明的试剂盒可以提供指导使用者分析测试样品和评估测试个体中胃癌的存在情况、风险或状态的操作说明书。

本文使用的“标准对照”是指存在于正常无病组织样品(例如正常胃上皮组织样品)中的预定量或浓度的多核苷酸序列或多肽，如TTPAL mRNA或蛋白。标准对照值适合用于本发明的方法，用作测试样品中存在的TTPAL mRNA或蛋白的量的比较基础。用作标准对照的建立的样品提供没有患常规定义的任何胃病、特别是胃癌的平均健康人的胃上皮组织样品(如胃粘膜)通常具有的TTPAL mRNA或蛋白的平均量。标准对照值可以根据样品性质以及其他因素而变化，所述其他因素例如作为对照值建立基础的个体的性别、年龄、种族等。

本申请还提供了检测样本中TTPAL蛋白或其片段表达的方法。在一些实施方案中，使用免疫组化染色来检测和评估TTPAL蛋白或其片段的表达。在具体的实施方案中，上述方法包括将制备好的组织切片脱蜡至水、抗原修复、非特异性位点封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、染核、脱水封片等步骤。

本申请发明人还发现，TTPAL能够促进胃癌肿瘤细胞的生长。例如，在一些实施方案中，在胃癌细胞株中过表达TTPAL后，胃癌细胞生长加快，细胞的集落形成能力增强。在一些实施方案中，敲低TTPAL后能够抑制胃癌细胞的生长和集落形成能力。在另一些实施方案中，将过表达TTPAL的胃癌细胞株注射至动物皮下后，促进动物皮下移植瘤的肿瘤生长。

基于上述，本申请还提供了特异性抑制TTPAL蛋白或其片段表达或者TTPAL mRNA表达的试剂在抑制胃癌细胞生长中的应用。在一些实施方案中，所述特异性抑制TTPAL蛋白的试剂为TTPAL蛋白特异性结合剂，例如抗体。在一些实施方案中，所述特异性抑制TTPALmRNA表达的试剂为特异性降低TTPAL mRNA表达的干扰RNA。

本申请所述的“个体”，是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫以及诸如大鼠和小鼠的啮齿类动物。本申请的方法和试剂盒适用于来自人的生物样本。在特定实施方案中，个体已确定存在患有癌症或疑似患有癌症的风险。

本申请的方法和试剂盒还可以用于监测胃癌疗法的有效性。在可选的实施方案中，在某一个体中，如果治疗方案有效，TTPAL蛋白或TTPAL mRNA表达的水平可以随时间减少；如果治疗方案无效，所述生物标志物的水平将不改变或者可以随时间增加。

在本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。

应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。

下述实施例仅是说明性的，并不意图限制本申请实施方案的范围或者所附的权利要求的范围。

实施例

实施例1：TTPAL可以作为胃癌的预后判断标志物

1.1样本处理

样本处理的步骤如下：

1)收集胃癌肿瘤组织及癌旁正常组织(作为对照)，制作胃癌新鲜组织样本或已包埋的蜡块标本；

2)对新鲜组织梯度脱水，包埋；

3)对包埋好的组织切片，切片厚度5微米，备用。

1.2免疫组织化学染色

免疫组织化学染色的步骤如下

1)切片脱蜡至水：将组织切片依次放入二甲苯1、二甲苯2、100％无水乙醇1、100％无水乙醇2、95％无水乙醇、90％无水乙醇、80％无水乙醇、70％无水乙醇，每种试剂浸泡10分钟；-

2)抗原修复：脱蜡后的切片在水中浸泡15分钟，用3％双氧水-甲醇溶液浸泡30分钟，然后倒掉3％双氧水-甲醇溶液，PBS清洗3次，每次5分钟，加入柠檬酸抗原修复液，微波煮沸3次，每次间隔3分钟；冷却至室温，暴露抗原位点；

3)非特异性位点封闭：载玻片冷却至室温后，换成PBS缓冲液，清洗3遍，每遍5分钟，加入山羊血清封闭，37℃，1小时；

4)一抗(购自Novus公司,货号为NBP1-92544)孵育过夜：将载玻片取出，用吸水纸擦干反面和正面，加入一抗，该一抗为胃癌预后判断标志物TTPAL的抗体，阴性对照组加上PBS。4℃冰箱，孵育过夜；

5)二抗孵育：载玻片取出后放入PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟，擦干载玻片，加上二抗(二抗为过氧化物酶标记的与一抗抗体对应的二抗)，37℃下在温箱中孵育1小时；

6)染色：对组织切片用DAB显色液进行显色；

7)染核：标记细胞数目，用苏木素对组织切片染核，1-3分钟；然后用自来水冲洗15分钟；

8)脱水封片：将染好的组织切片依次放入二甲苯1、二甲苯2、100％无水乙醇2、70％无水乙醇，80％无水乙醇、90％无水乙醇、95％无水乙醇、100％无水乙醇3、100％无水乙醇4、二甲苯3、二甲苯4，每种试剂浸泡5分钟，封片剂封片晾干，备用。

1.3读片评分

对封好的组织切片进行评分，其中染色强度评分分为0分(阴性)，1分(1+)，2分(2+)，3分(3+)；染色阳性率评分分为0分(阴性)，1分(即有1-25％的细胞染色)，2分(有26％-50％的细胞染色)，3分(有51-75％的细胞染色)，4分(有76％-100％的细胞染色)。以“染色强度评分”和“染色阳性率评分”的乘积为总评分。总评分≤4为低表达组，总评分＞4为高表达组。

1.4实验结果

1)如图1所示，通过对86对胃癌组织(图1B)及癌旁正常对照组织(图1A)进行免疫组织化学染色分析，发现TTPAL在胃癌组织中的表达显著升高。胃癌组织的TTPAL表达评分明显高于对照组织的评分(图1C,P<0.001)。

2)如上所述，免疫组化评分总评分≤4为低表达组，总评分＞4为高表达组。在86例胃癌组织中，TTPAL高表达的(即评分＞4)有30例，进一步评估TTPAL的表达水平和临床特征的相关性，包括病人肿瘤的大小、病理分级、TNM分期等，多因素COX回归分析结果(如图2所示)表明，TTPAL高表达可作为胃癌独立的预后诊断因子。

3)图3显示了对胃癌患者预后的Kaplan-meier分析曲线。由图中可以看出，肿瘤组织TTPAL的表达水平高的患者比表达水平低的患者预后的存活率低(P<0.01)，这表明可以根据TTPAL的表达水平来判断胃癌患者的预后情况。

实施例2 TTPAL在体外促进胃癌肿瘤细胞生长

本实施例中以下所用的MTT法的具体操作过程如下：将细胞按1000个/孔的细胞密度接种到96孔板，同时接种5板，每隔24小时拿出一板，每孔加入MTT溶液(5mg/ml，溶于PBS)10μl，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加200μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

本实施例中以下所用的细胞集落形成实验的具体操作过程如下：将细胞按1000个/孔的细胞密度接种到6孔板中，培养7-10天后，用甲醇固定，使用0.1％结晶紫染色，观察克隆数目并统计。

本实施例中过表达TTPAL的步骤如下：

1)过表达TTPAL慢病毒载体构建：以PCMV6-TTPAL的DNA为模板，将TTPAL分子克隆至PLV-Puro慢病毒载体，测序完全正确后，制备病毒液。

2)包装病毒液：将目的基因质粒和病毒包装质粒PSPAX2以及PMD2G按3:2:1比例以Lipofectmine2000转染至HEK293FT细胞中，4-6h进行换液，24h补液，48h离心收集细胞培养上清，过滤后即为包装好病毒液。

3)病毒介导的转染及稳定表达TTPAL细胞系的筛选：将病毒液和10％FBS培养基以1:1比例加入细胞中，48h后对转染后细胞进行抗性筛选，以正常未转染的细胞作为对照，待正常对照全部被抗生素杀死后，即可扩大培养，使用PCR和Western blot进行验证，细胞模型构建成功后可用于后续研究。

本实施例中所述的敲低TTPAL的具体操作过程如下：将siNC(对照质粒)、备选siTTPAL-1(siTTPAL^#2)和siTTPAL-1(siTTPAL^#1)分别转染至TTPAL高表达的胃癌细胞系，利用q-PCR及RT-PCR验证干扰效率，选取干扰效率高(敲低超过70％)的siTTPAL干扰序列转染细胞，提取转染后24h的细胞总RNA，通过RT-PCR检测TTPAL的mRNA表达；提取转染后48h的细胞总蛋白，通过Western Blot检测TTPAL蛋白表达。

2.1通过MTT法及细胞集落形成实验研究了TTPAL过表达对胃癌肿瘤细胞生长的影响。具体地，我们在两种胃癌细胞株MGC803和BGC823中过表达TTPAL(图4A)后，通过单因素方差分析发现，TTPAL表达升高促进胃癌细胞的生长，细胞活力增加(图4B和4C，***P<0.001)。代表性的集落形成图像如图4D所示。通过t检验分析显示，过表TTPAL提高了细胞的集落形成能力(图4E和4F,**P<0.01,***P<0.001)。

2.2通过MTT法及细胞集落形成实验研究了TTPAL敲低后对胃癌肿瘤细胞生长的影响。具体地，通过小干扰RNA siTTPAL敲低胃癌肿瘤细胞AGS和MKN74中的TTPAL。TTPAL表达降低(如图5A所示)后，通过单因素方差分析显示，胃癌细胞的生长被抑制，细胞活力降低(图5B和5C,***P<0.001)。通过t检验分析显示，TTPAL敲低后抑制胃癌细胞的集落形成能力(图5E和5F,***P<0.001)。

实施例3 TTPAL促进体内胃癌肿瘤细胞生长

在本实施例中，我们随机将对照细胞株MGC823/载体或MGC823/TTPAL(1X10⁶个细胞)注入裸鼠背侧，并对肿瘤的生长进行比较。每2天测量一次肿瘤体积，持续到15天，测量肿瘤最长和最短的肿瘤直径长度，计算肿瘤体积，体积＝0.5X最大径X最小径的平方。实验第15天时，裸鼠被处死，收集皮下肿瘤组织，测量大小，称重量，包埋部分组织进行免疫组织化学染色评分。图6A和图6B分别显示了皮下肿瘤从小鼠分离前和分离后的形态。图6C和图6D分别显示了皮下肿瘤的体积和重量。可以看出，与MGC823/载体组相比，MGC823/TTPAL组肿瘤生长速度明显增加(图6C，单因素方差分析，p<0.0001)。而且，MGC823/TTPAL组肿瘤重量也比MGC823/载体组显著增加(图6D，t检验，p<0.05)。同时，我们还应用前述的免疫组织化学染色法，对组织进行染色(图6E)和评分(图6F)，结果显示MGC823/TTPAL组评分显著高于MGC823/载体组。

在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征或实施方案组合使用。

序列表

<110> 香港中文大学深圳研究院

<120> TTPAL作为胃癌监测或预后判断标志物的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 342

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ser Glu Glu Ser Asp Ser Leu Arg Thr Ser Pro Ser Val Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Pro Glu Pro Pro Gly Tyr Val

20 25 30

Cys Ser Leu Thr Glu Asp Leu Val Thr Lys Ala Arg Glu Glu Leu Gln

35 40 45

Glu Lys Pro Glu Trp Arg Leu Arg Asp Val Gln Ala Leu Arg Asp Met

50 55 60

Val Arg Lys Glu Tyr Pro Asn Leu Ser Thr Ser Leu Asp Asp Ala Phe

65 70 75 80

Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ala Arg Lys Phe Asp Tyr Asp Arg Ala Leu

85 90 95

Gln Leu Leu Val Asn Tyr His Ser Cys Arg Arg Ser Trp Pro Glu Val

100 105 110

Phe Asn Asn Leu Lys Pro Ser Ala Leu Lys Asp Val Leu Ala Ser Gly

115 120 125

Phe Leu Thr Val Leu Pro His Thr Asp Pro Arg Gly Cys His Val Val

130 135 140

Cys Ile Arg Pro Asp Arg Trp Ile Pro Ser Asn Tyr Pro Ile Thr Glu

145 150 155 160

Asn Ile Arg Ala Ile Tyr Leu Thr Leu Glu Lys Leu Ile Gln Ser Glu

165 170 175

Glu Thr Gln Val Asn Gly Ile Val Ile Leu Ala Asp Tyr Lys Gly Val

180 185 190

Ser Leu Ser Lys Ala Ser His Phe Gly Pro Phe Ile Ala Lys Lys Val

195 200 205

Ile Gly Ile Leu Gln Asp Gly Phe Pro Ile Arg Ile Lys Ala Val His

210 215 220

Val Val Asn Glu Pro Arg Ile Phe Lys Gly Ile Phe Ala Ile Ile Lys

225 230 235 240

Pro Phe Leu Lys Glu Lys Ile Ala Asn Arg Phe Phe Leu His Gly Ser

245 250 255

Asp Leu Asn Ser Leu His Thr Asn Leu Pro Arg Ser Ile Leu Pro Lys

260 265 270

Glu Tyr Gly Gly Thr Ala Gly Glu Leu Asp Thr Ala Thr Trp Asn Ala

275 280 285

Val Leu Leu Ala Ser Glu Asp Asp Phe Val Lys Glu Phe Cys Gln Pro

290 295 300

Val Pro Ala Cys Asp Ser Ile Leu Gly Gln Thr Leu Leu Pro Glu Gly

305 310 315 320

Leu Thr Ser Asp Ala Gln Cys Asp Asp Ser Leu Arg Ala Val Lys Ser

325 330 335

Gln Leu Tyr Ser Cys Tyr

340

<210> 2

<211> 308

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ser Glu Glu Ser Asp Ser Leu Arg Thr Ser Pro Ser Val Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ser Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Pro Glu Pro Pro Gly Tyr Val

20 25 30

Cys Ser Leu Thr Glu Asp Leu Val Thr Lys Ala Arg Glu Glu Leu Gln

35 40 45

Glu Lys Pro Glu Trp Arg Leu Arg Asp Val Gln Ala Leu Arg Asp Met

50 55 60

Val Arg Lys Glu Tyr Pro Asn Leu Ser Thr Ser Leu Asp Asp Ala Phe

65 70 75 80

Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ala Arg Lys Phe Asp Tyr Asp Arg Ala Leu

85 90 95

Gln Leu Leu Val Asn Tyr His Ser Cys Arg Arg Ser Trp Pro Glu Val

100 105 110

Phe Asn Asn Leu Lys Pro Ser Ala Leu Lys Asp Val Leu Ala Ser Gly

115 120 125

Phe Leu Thr Val Leu Pro His Thr Asp Pro Arg Gly Cys His Val Val

130 135 140

Cys Ile Arg Pro Asp Arg Trp Ile Pro Ser Asn Tyr Pro Ile Thr Glu

145 150 155 160

Asn Ile Arg Ala Ile Tyr Leu Thr Leu Glu Lys Leu Ile Gln Ser Glu

165 170 175

Glu Thr Gln Asp Gly Phe Pro Ile Arg Ile Lys Ala Val His Val Val

180 185 190

Asn Glu Pro Arg Ile Phe Lys Gly Ile Phe Ala Ile Ile Lys Pro Phe

195 200 205

Leu Lys Glu Lys Ile Ala Asn Arg Phe Phe Leu His Gly Ser Asp Leu

210 215 220

Asn Ser Leu His Thr Asn Leu Pro Arg Ser Ile Leu Pro Lys Glu Tyr

225 230 235 240

Gly Gly Thr Ala Gly Glu Leu Asp Thr Ala Thr Trp Asn Ala Val Leu

245 250 255

Leu Ala Ser Glu Asp Asp Phe Val Lys Glu Phe Cys Gln Pro Val Pro

260 265 270

Ala Cys Asp Ser Ile Leu Gly Gln Thr Leu Leu Pro Glu Gly Leu Thr

275 280 285

Ser Asp Ala Gln Cys Asp Asp Ser Leu Arg Ala Val Lys Ser Gln Leu

290 295 300

Tyr Ser Cys Tyr

305

<210> 3

<211> 6248

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

gtcacttccg gcgcgagagg ccgggcaggc cgggcaggga gtgcgggtcg gttctgcgtg 60

cgctgccgga cgaggctccc gccgccgatt gacccgcgct ccgcccgtag tcgggccgtt 120

ctgttccaag agataaccat tgggaccttg gtagctaatg tccgaagaaa gtgactctct 180

gagaaccagc ccttctgtgg cctcactctc tgaaaatgag ctgccaccac cacctgagcc 240

tccgggctat gtgtgctcac tgacagaaga cctggtcacc aaagcccggg aagagctgca 300

ggaaaagccg gaatggagac ttcgagatgt gcaggccctt cgtgacatgg tgcggaagga 360

gtaccccaac ctgagcacat ccctcgacga tgccttcctg ctgcgcttcc tccgagcccg 420

caagtttgat tacgaccggg ccctgcagct cctcgtcaac taccacagct gtagaagaag 480

ctggcccgaa gtcttcaata acttgaagcc atcagcctta aaagatgtcc ttgcttccgg 540

gttcctcacc gtgctgcccc acactgaccc caggggctgc catgtcgtct gcatccgccc 600

agacagatgg ataccaagca actatccaat tactgaaaac atccgagcca tatacttgac 660

cttagaaaaa ctcattcagt ctgaagaaac ccaggtgaat ggaattgtaa ttcttgcaga 720

ctacaaagga gtgagtttat caaaagcatc tcactttggc ccttttatag ccaaaaaggt 780

gattggcatc ctccaggatg gtttccccat tcggataaaa gcagtccatg tggtgaatga 840

acctcgaata tttaaaggca tttttgccat cataaaacca tttctaaagg agaaaatagc 900

aaacagattc ttcctccatg ggtctgactt gaactctctc cacacaaacc ttccaagaag 960

catcctcccc aaggagtatg ggggcacggc tggggagctg gacactgcca cctggaacgc 1020

ggtactgctg gcttcagaag acgattttgt gaaagagttc tgccaacctg ttcctgcctg 1080

tgacagcatc ctgggccaga cgctgctgcc cgagggcctg acctcagatg cacagtgtga 1140

cgactccttg cgagctgtga agtcacagct gtactcctgc tactagcccg tcccccaggg 1200

tcaccatctt taattctttt ccttcttttc tttggagagg cacaaggaga atttaagggt 1260

ccatggattc agtcttgctc cttgtaatta aactgcagga tggaggaaca gcctgagata 1320

tgagcatgag cccattttgg ggtaagcctt tggttacttt aattactcca tggaagacat 1380

ggaaaatgtc cccactgatt cttaaacatt tggaatccca gtctgcaact attaatctgg 1440

aggctatatc tattttgttt tgctttttgg ttggggggtg gtgatctggt tcttacacat 1500

cttggaagca agaacaatca ggaccaaagt cactttgatc ccacttttcc aggagaaaaa 1560

ccacctgttt ggccagtgag aactacttgt atgaaataat ttggccaaac cttcagtgtg 1620

accaaatgtg agactgggag tttgtgtttt tcacaggaac cctaagtata gacctctgct 1680

gctcatcagg aaacttactg gagatgaagg ccccagctgt tgtcaccggg tttggaaagc 1740

accttaactg aatcatgtaa gcatcaggac ataagcagca ctttgtggtc aaatgtggaa 1800

gccggagact tcaaagcacc tctgggaccc actggttgaa gtttgcaata gaaacttaag 1860

ttttcccaaa tccataaagc cttagccctg gttctcaata gaatcaggga cctagcagga 1920

aatgatttta ctcaacctaa aatgctggat cccaggcccg tgtagctata agaattctgg 1980

cctggatccc aggtgtacaa ctatggacaa gatatgggcc tctactttct cctctataaa 2040

atgaggctgg atgaaatgtc agctagggcc attttggctg ctgaggctct gggatttggt 2100

ttagttactg aatgttagat tttctgccta gaaagataac tatctagata caagtggttg 2160

gatcctgttt ttgtttgtgg tacatgtgtc tttccaagag agatgtgtca ccaattagcc 2220

ctgcctttaa agaaactatt atgtgtattc ctgggactca ctgacaccaa ttttcttttt 2280

atagtgatgg ttcaattttg aaaagatggc ttttgtgagg ccaggttaag gtgaccagga 2340

tcttgtatga tgaattcctt ccatccctga gactctggta ctatattgta aacctggcta 2400

cagtagttaa ttacttgaga ttctttaatt ttggtctctg agctgggcgt ggtggttcat 2460

gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggtgtgcgga tcacaaggtc aggagttcga 2520

gacccgcctg gccaagatgg tgaaacccca tctctactaa aaatacaaaa attagctggg 2580

cgtggtggcg ggctcctgta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagaa gaatcacgtg 2640

aacccaggag gcagaagtgg cagtgagcca agatcgcacc actgcactcc agcctgggcg 2700

acagagcaag actctgcctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatttttt tttttttggt 2760

ctctggaaat gaacacaagg gcaggttatt cctgggtcac ttctgggccc ccctgccctc 2820

ccagccccac ttgagtttct ctctctggtg tgggtgaacc agtcagcctg aatgttctgc 2880

atttcagcac tttagaacct ccctgtgaag attttagcct tagcccaaac atcaaattag 2940

acggttcaca tgatggtttt tgacctattt cctttctaat gtattccaca tgatcatggt 3000

gttaaatagt gaaaagtact gtgttgtgtg tgcaccttct ccgtgcattt attagactaa 3060

ccagtcaagc agacagctca gttagggaga aaacaatact ctgaaatttg aaggccaatc 3120

tgttgttact aagctgttta tctctattgc ctttttaaat gtctggataa gttgttggtg 3180

gaaattaagt tacttaacct cattaatacc aattctagag aaagttcttt tcaccatgga 3240

tagtaaccct ggatcctcta cggtactggc tgagctggaa gtgccaaaaa gcactcctgg 3300

ctgcttctgg ttccatctga tgatgatgtg acacacactg ctgaaaaggc ccaagcaggg 3360

caagtgggat ggctgaagga gggaaggagg gggttcagaa cccactggcc tggatgggag 3420

aactgggtgg aggcttcccc aagagggaag acagataaac aaaacaaaac aaaaactggg 3480

taaagaggaa tgaatcactc agccctgatg tttcaattct acactgcatt cctggccagt 3540

cgcatttgtt ttaatgcagg catggccaca gctctcctag agaattatct caaagaccag 3600

aagggacctg gagaggccta tttcttaggt ttttccagtt ggacaaggaa ggagtggttt 3660

cactcagctt ctagaaggag ttggagccta agtttatctg cctccgggag ctgcttgctt 3720

tgttttggct ccgaagaggt atcagatagt tttgacacct caggaaactt gaaccaagct 3780

gtgaaaccaa gacctccctg cgtgaaaatc aaggtggtct ccttgtggct tcaccaggat 3840

gtttgtgtca ggctgtctca gcagggtggg gaatgaccag ccagggagca cagtgagcct 3900

tactcagcac tggggagcgc actggtgagg caaacccatg aacctcaaga actgggagta 3960

tgttccttca gggagaagtt ctggcccatt gcacaaacac ttggaaatta acttttccct 4020

aaattcaaga tagtgtggtg tcggaaggaa atgggacagt aaattaggag acgcgggctc 4080

cacctttacc ttactacgtg gcctttgatg agctggctta acatccctga gtgattccat 4140

gatagagatc tatactccaa actttattcc tggtatctag ttggcttcac tgccacagac 4200

actgtactct ctctttttag aagttttttt cctttttttt ccccctcaat tggcttattt 4260

agtaaattta ggtctgaatg aattggtacc taaaagcttc caaatctata catttcagaa 4320

tatgggaatt ttcttcctct tcttccccca tatcccaaca tggaattctg gaaaactgtg 4380

cctcttcccc tgttctgcct tcatggggga gagactggat gaaatctaca aaaacagcca 4440

aaagtgccac cctggcttca tgtcttgaat ttctaacttg ctcttggcaa aggtcgcttt 4500

attttttaat ttttttcctt gcattttctt ttttattcta ttgctgctgc aaaaattaag 4560

gcaaaagtag ctttcgatct ttcatatttc atcctggttt cacaaggagt cacttatctt 4620

aggaggtctg taagtcaggt tacaaggccg ggagcggtgg ctcacacctg taatcccaac 4680

actttgagcg gctgaggtgg gtgtatcacc tgaagtccgg agtttgagac cagcctggcc 4740

aacatggtga aaccccgtct ctactaaaaa tacaaaaaat tggctgggca tggtggtggg 4800

tgcctgtaat cccagctact tgggaagctg aagcaggaga atcacttaaa cccaggtggc 4860

ggaggttgca gtgagccgac atcgcgccat tgcactccag cctgggtgac gagtgaaact 4920

ccatctcaaa aataaaaatt gaaaaatcag gttacaaaac accatttttc ccgaaataag 4980

acaataagag gcttttctct gaattccttt atattgagcc tttcagaatt ctccctgggt 5040

gggcaatttc tttaaatagt atttgaccct cagatcaatc ctgggaattt ttttcatttg 5100

ggtagcaaaa gctagagtat tgctgtggcg attataatac ttttaaaaag ttttaccatt 5160

ttaaagttgc caacatttaa ttaaggtttt cctttgaagc ctcctttaat ttagggagta 5220

aaatgttagc taaaccaatt atatactata tactatacac tgtatctcct gtggccatga 5280

gaggtgtggc tataccgaac agaaacatgc ctactgttca ggaaagatgt cagttctggt 5340

aacacctctc tgtattggga tctgttaatt ttgtaaatct aaattcttct gctcttggcc 5400

aggtgcagta gttcatgccc tgtaatccta gaactttggg aggctgaagg gggggcggat 5460

catttgaggt caggagtttg agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc atctctacta 5520

aaaagtacaa aaattagctg ggtgtggtgg tgcgtgcctg taatcccaac tacttgggag 5580

gctgaggcag gagaatcgct tgaacctggg aggcagcggt tgcagtaagc caagactatg 5640

ccactgcact cccgcctggg tgacaaagca atattctgtg tcaaataaat aaattcattc 5700

ttctgctctc ctgacttaga gaaatggttt gcttaaaatg ctagtaacaa acatcacagt 5760

caacaggagc ttgcttcatg cgaaggatca atgtgatttg tggatggaga tgatagtgat 5820

gaaattcctg tttcatgggg ctgtttttct tttcatctca ctgggcagca ggtttagtga 5880

ggcagtgaga tgctgctgct gtggattctt gtagctatgc ctcggcttct tggcatatca 5940

ggtaggaacc tgttacaagt gaaatacttg aaacctctct gaccaagagc ctctgatgga 6000

gtgggaggtg agctaattct ctgaccagct tggggcactg tttcagccac tggtcacatt 6060

ccttgcttca aactgaaatt cagtttggct ttgagtatag ggatacatgg tggattcatg 6120

tacttcagtg tttgttttga ccaaagttta tttttctagt gcattttcta agtcaaagtg 6180

gtgaaaatat gtaataattt tagtatgcat gactcagtct gaaacaataa aaatctctga 6240

aaaatgtg 6248

Claims (9)

1.用于检测TTPAL蛋白或其片段表达水平的试剂在制备用于对个体中的胃癌进行监测或预后判断的试剂盒或药物中的用途，其中所述TTPAL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示，所述TTPAL蛋白的片段包含SEQ ID NO:1或2所示序列的氨基酸残基1-179。

2.如权利要求1所述的用途，其中如果来自所述个体的样本中的TTPAL蛋白或其片段表达水平大于阈值，则指示所述个体的胃癌预后不良。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述试剂为所述TTPAL蛋白或其片段的特异性结合剂。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述结合剂为抗体。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述抗体能够特异性识别具有如SEQ ID NO:1或2所示序列的蛋白或者包含SEQ ID NO:1或2所示序列的氨基酸残基1-179的蛋白片段。

6.如权利要求2所述的用途，其中所述样本选自胃组织、血清、血浆或细胞培养物上清。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述样本为胃癌新鲜组织样本或已包埋的标本。

8.如权利要求6所述的用途，其中所述试剂盒还包含用于对胃组织样本进行免疫化学染色的一种或多种其他试剂。

9.特异性抑制TTPAL蛋白或其片段表达的试剂在制备用于抑制胃癌细胞生长的药物中的用途，其中所述TTPAL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示，所述TTPAL蛋白的片段包含SEQ ID NO:1或2所示序列的氨基酸残基1-179。