CN114317382B

CN114317382B - 一种应用于河道水体cod降解的厌氧菌种及其应用

Info

Publication number: CN114317382B
Application number: CN202210218505.XA
Authority: CN
Inventors: 邱建贺; 翁雯; 周国彪; 陈淼银
Original assignee: Foshan City Yuhuang Ecological Environment Science And Technology Co ltd
Current assignee: Yuhuang Ecological Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-03-08
Also published as: CN114317382A

Abstract

本发明公开了一种应用于河道水体COD降解的厌氧菌种及其应用，涉及环境微生物技术领域。本发明提供的一种副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022018，保藏日期为2022年01月05日；所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1能在厌氧条件下有效提高河道水体中COD的降解率，可用于降低河道水体中有机物的污染，加快水体净化，具有较高的应用价值。

Description

一种应用于河道水体COD降解的厌氧菌种及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种应用于河道水体COD降解的厌氧菌种及其应用。

背景技术

城市河道水环境作为城市生态环境中的重要组成部分，在城市的生态建设、水源供给、交通运输、环境调节、旅游休闲等方面都发挥着举足轻重的作用。但随着城市经济的不断发展、工农业生产规模的不断扩大，城市水体污染已成为普遍现象，并且其受污染程度也越来越严重。河道水体污染会导致水质恶化，水资源短缺，威胁人类健康和生活环境。因此，河道水体修复技术是当前环境科学研究和工程应用领域的关注热点。

河道水体难修复的原因是由其特性决定的，黑臭水体主要有以下几种特点：有机物浓度高、成分复杂、含有毒物质等。如果不及时修复水体，会使多数水生生物死亡。富含有机物、氮和磷等元素使得水体缺氧，水质日益恶化，产生臭味，影响环境卫生。同时，水体中的致病微生物和寄生虫也会大量繁殖，且大量有毒有机物会在水体、土壤等自然环境中不断累积、储存，最后进入人体，最终危害人体健康。

目前，河道水体修复技术分为生物法、物理法、化学法和物理化学法四种。其中生物修复相较于化学和物理修复是一种成本较低、效率较高、净化较彻底以及环保无污染的方法，是未来解决河道水体污染的主流方法。生物修复技术是利用微生物降解水体中的污染物作为自身的营养和能量，同时使被污染的水体得到净化的方法。在此过程中，最重要的是需要拥有高效降解污染物能力的菌种。化学需氧量（COD）是反映水体有机物污染的重要指标之一，近年来人们对COD降解菌的研究受到越来越多的关注，但已报道的大多数COD降解菌属于好氧菌，而黑臭河道往往是由于厌氧环境造成的，这就需要在水体修复过程中实施大量曝气来改变水体的溶氧程度，才能使好氧COD降解菌正常生长并发挥作用。如果能够筛选到厌氧条件下的高效COD降解菌，将大大降低曝气的能耗，对河道水体修复将起到极其重要的意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种河道水体COD降解的厌氧菌种及其应用，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其相关目的，本发明第一方面提供一种河道水体COD降解的厌氧菌种，经鉴定为副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌种名称为Bacillus paralicheniformis E1，保藏日期为2022年01月05日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022018。

所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1，含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1，为革兰氏阳性菌，杆状，菌落形态为浅白色、圆形、表面光滑湿润且有光泽、边缘整齐无褶皱。

所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1，属于厌氧菌，在溶解氧（DO）为0~0.5 mg/L的河道水体中生长良好。

所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1，最高盐耐受浓度为100g/L氯化钠。

所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1对水体COD的耐受范围为0~1000 mg/L。

所述的副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1，对河道水体的COD降解率达80%以上。

本发明第二方面提供一种液体菌剂，包含副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1，副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1的浓度至少为1×10⁸ cfu/mL。

本发明第三方面提供液体菌剂的制备方法，包含如下步骤：将副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1的纯菌种接种于CYS液体培养基中多级扩大厌氧培养，培养结束后即得到液体菌剂。

CYS液体培养基：3.0 g/L蛋白胨、2.0 g/L酵母提取物、1.0 g/L可溶性淀粉、3.0g/L氯化钠、0.125 g/L氯化镁、0.5 g/L氯化钙、0.01 g/L七水硫酸亚铁、100 μL/L微量元素液（12 g/L钼酸钠、5 g/L氯化锰、0.6 g/L七水硫酸锌、0.15 g/L五水硫酸铜、8 g/L六水氯化钴、0.2 g/L六水氯化镍），pH值7.0~7.5。

本发明第四方面提供副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1在河道水体COD降解中的应用。

本发明的第五方面提供一种河道水体COD降解方法，至少包括如下步骤：

（1）将副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1制备成液体菌剂接种至河道水体中；

（2）在适宜的温度、pH值、DO值条件下进行河道水体COD的降解。

所述接种的接种量为河道水体体积的0.1~5%，优选为1~3%；

所述温度为10~55 ℃，优选为20~40 ℃；

所述pH值为5~9，优选为6~8；

所述DO为0~0.5 mg/L，优选为0~0.2 mg/L。

本发明具有的技术效果

如上所述，本发明的COD降解菌种及其应用，具有以下有益效果：

（1）河道水体COD降解菌副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1耐盐，对水体COD浓度和温度的适应范围广，可应用于不同水质环境的河道水体；

（2）河道水体COD降解菌副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1属于厌氧菌，具有在厌氧条件下高效降解水体中有机污染物的能力，从而改善河道水质；

（3）利用副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis E1修复河道水体，处理效率高、经济效益好、操作方便、无污染。

附图说明

图1为分离纯化菌株对河道水体COD的降解效果；

图2为河道水体COD降解菌株E1的系统进化树图谱；

图3为河道水体COD降解菌株E1在平板上生长的菌落形态；

图4为河道水体COD降解菌株E1对河道水体COD降解率的变化情况。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述。目的是为了更好地解释本发明，但本发明并不局限于下述实施方式，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围内。

实施例1：河道水体COD降解菌的筛选及性能验证

所用到的培养基及其成分如下：

河道水体液体培养基：河道水取自广东佛山某河流，COD浓度为78 mg/L，在河道水中加入5 g/L氯化钠，5 g/L胰蛋白胨，2.5 g/L酵母提取物，pH值7.0。

河道水体固体培养基：河道水取自广东佛山某河流，COD浓度为78 mg/L，在河道水中加入5 g/L氯化钠，5 g/L胰蛋白胨，2.5 g/L酵母提取物，琼脂粉15 g/L，pH值7.0。

CYS固体培养基：3.0 g/L蛋白胨、2.0 g/L酵母提取物、1.0 g/L可溶性淀粉、3.0g/L氯化钠、0.125 g/L氯化镁、0.5 g/L氯化钙、0.01 g/L七水硫酸亚铁、100 μL/L微量元素液（12 g/L钼酸钠、5 g/L氯化锰、0.6 g/L七水硫酸锌、0.15 g/L五水硫酸铜、8 g/L六水氯化钴、0.2 g/L六水氯化镍），17 g/L的琼脂粉，pH值7.0~7.5。

以上培养基配制好后，均在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min，备用。

富集培养：取5 mL河道水至45 mL灭菌的河道水体液体培养基中，混合均匀后放置于37 ℃培养箱中厌氧富集培养96 h。

分离纯化：将培养好的富集液进行梯度稀释后，均匀涂布于河道水体固体培养基，在37 ℃厌氧培养48 h后，挑取菌落形态各异的单克隆，划线纯化后编号保藏。经分离纯化共得到5个菌株。

初步验证：将分离得到的5株菌种分别接种至CYS液体培养基中厌氧培养，按照验证实验水体体积的5%取培养好的菌液，离心后用无菌生理盐水洗涤、重悬，接种至河道水体中，在30 ℃厌氧降解COD，每隔12 h定期取样，测定水体的COD，采用国标HJ 828-2017重铬酸盐法检测，评价各个菌株降解COD的能力。

根据测定数据及以下计算公式（1）计算COD降解率：

COD降解率=[COD₍₀₎-COD_(x)]/COD₍₀₎×100% 公式（1）

COD₍₀₎为刚接种菌株的河道水体初始的COD，COD_(x)为在x时间点所取样本的COD。

结果表明，菌株E1对河道水体的COD降解率最高，在72 h可将COD由106.47 mg/L降为19.59 mg/L，COD降解率达到81.6%（图1）。

性能测定：

（1）用划线法将菌株E1接种至不同NaCl浓度（20~120 g/L）的河道水体固体培养基平板上，在37 ℃培养箱中厌氧培养48 h，定期观察菌株的生长情况，结果发现菌株E1在含100 g/L NaCl的河道水体固体培养基上生长良好，其菌落大小为2~3 mm，在含120 g/LNaCl的河道水体固体培养基上不生长，表明菌株E1生长良好的最高盐耐受浓度为100 g/LNaCl。

（2）将菌株E1分别接种至CYS液体培养基中，在不同的温度（5~60 ℃）条件下厌氧培养，定期取样，用分光光度计法测定OD₆₀₀，结果表明菌株E1在10~55 ℃下生长良好。

（3）将菌株E1分别接种至不同COD浓度（0~1200 mg/L）的河道水体或有机废水中厌氧培养，定期取样，用稀释涂布和菌落计数法观察菌株E1的生长情况，结果表明菌株E1在COD浓度范围为0~1000 mg/L的水体中生长良好。

实施例2：菌株E1的生物学鉴定

提取菌株E1的基因组DNA，并以此为模板，利用一对通用引物（27F，1492R）扩增菌株16S rDNA。上游引物为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’），下游引物为1492R（5’-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3’）。

PCR反应体系（20 μL）如下：模板DNA 0.5 μL，PCR Taqmix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，加ddH₂O至反应体系为20 μL。

PCR程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min30 s，以上共循环30次，72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃保存。

由上海杰李生物技术有限公司进行PCR产物的纯化和测序。在NCBI提交通过测序获得的16S r的DNA序列，通过软件与GenBank进行同源性序列比对分析，应用MEGA-X软件构建该菌株系统发育树（如图2所示）。

测序得到菌株E1的16S rDNA长度为1429 bp，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。该序列经过比对分析，与NCBI数据库中Bacillus paralicheniformis（NCBI序列号：MF662528.1）碱基一致性为99.58%，相似性达到99%。综合菌株的其他生物学特性，菌株E1为革兰氏阳性菌，杆状，菌落形态为浅白色、圆形，表面光滑湿润且有光泽、边缘整齐无褶皱，如图3所示，确定筛选的E1菌株为副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis），将其命名为Bacillus paralicheniformis E1。

实施例3：河道水体COD降解菌株E1的液体菌剂的制备

液体菌剂的制备：将E1纯菌接种于5 mL液体培养基，于37 ℃培养箱中厌氧培养24h，然后以体积比为5%的接种量接入到下一级扩大培养的液体培养基中，相同条件下进行多级厌氧扩大培养，即可得到该菌株的液体菌剂。

实施例4：河道水体COD降解菌株E1对黑臭河道水体COD的降解效果

河道水体取自广东佛山某黑臭河道，河道水体的COD为106.47 mg/L，pH值为7.2。将此黑臭水体分别置于两个相同的1 m³反应器内，实验组按照水体体积的1%接种Bacillus paralicheniformis E1的液体菌剂，对照组接入相同体积的液体培养基，控制条件为温度30 ℃、DO值0~0.1 mg/L，自然pH值。在反应过程中每12 h取一次样，按照实施例1中COD的测定方法测定并计算黑臭水体中的COD的降解率。图4显示为菌株E1在72 h内对黑臭河道水体中COD的降解情况，可以看出，菌株E1对COD的降解率最高值达到80.2%，与对照组不接菌的COD降解率25.4%相比，提高了215.7%。说明菌株E1对黑臭河道水体中的有机污染物具有显著的降解效果。

序列表

<110> 佛山市玉凰生态环境科技有限公司

<120> 一种应用于河道水体COD降解的厌氧菌种及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1429

<212> DNA

<213> Bacillus paralicheniformis E1

<400> 1

gcttcggcgg ctggctccaa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180

atttgtggga ttggcttagc ctcgcggctt cgctgccctt tgttctgccc attgtagcac 240

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420

acctgtcact ctgcccccga aggggaagcc ctatctctag ggttgtcaga ggatgtcaag 480

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600

tgcgtttgct gcagcactaa agggcggaaa ccctctaaca cttagcactc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca 720

gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780

cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc 840

ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gcgcgcttta 900

cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960

ttagccgtgg ctttttggtt aggtaccgtc aaggtaccgc cctattcgaa cggtacttgt 1020

ttttccctaa caacagagtt ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc 1080

cgtcagactt ttgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc 1140

cgtgtttcag tcccagtgtg gccgatcacc ctttcaggtt gggtacgcat cgtcgccttg 1200

gtgagccgtt acctcaccaa ctaggtaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtaggta 1260

aaagccacct tttataattg aaccatgcgg ttcaatcaag catccggtat tagccccggt 1320

ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380

ctgacctaag ggagcaagct cccgtcggtc cgctcgactt gcatgtata 1429

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一种副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）E1，其保藏编号为CCTCC NO：M2022018，保藏日期为2022年01月05日。

2.根据权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）E1，其特征在于，所述的副地衣芽孢杆菌含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

3.根据权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis） E1，其特征在于，所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）E1还包含以下特征中的一项或多项：

所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis） E1，属于厌氧菌，在DO为0~0.5 mg/L的河道水体中生长良好；

所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）E1，最高盐耐受浓度为100 g/L氯化钠；

所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）E1，在10~55℃下生长良好。

4.一种菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis） E1。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂为液体菌剂，所述的菌剂中副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis） E1的浓度至少为1×10⁸ cfu/mL。

6.如权利要求4所述的菌剂的制备方法，其特征在于，将所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis） E1的纯菌种接种于CYS液体培养基中多级扩大厌氧培养，培养结束后即得到液体菌剂。

7.一种如权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis） E1在河道水体COD降解中的应用。

8.一种河道水体COD降解的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）E1制备的液体菌剂接种至河道水体；所述接种的接种量为河道水体体积的0.1~5%；

（2）在温度为10~55 ℃、pH值为5~9、DO值0~0.5 mg/L条件下进行河道水体COD的降解。