CN114316069B

CN114316069B - 合成多肽和IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法及应用

Info

Publication number: CN114316069B
Application number: CN202111584102.9A
Authority: CN
Inventors: 陈凌; 冯波; 陈志龙
Original assignee: Xiamen United Respiratory Health Research Institute; Xiamen Fuchen Baiao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xiamen United Respiratory Health Research Institute; Xiamen Fuchen Baiao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114316069A

Abstract

本发明公开了一种合成多肽，由多肽N1、多肽N2、多肽N3中任意两种或三种混合得到；其中多肽N1，其氨基酸序列为GKPTSVNVSVVLSDI；多肽N2，其氨基酸序列为TEEQRVNGFLQ；多肽N3，其氨基酸序列为LIRSTNKSHGKPT。本发明还公开了IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，包括步骤：制备多肽，将多肽分别与KLH耦联，制备免疫原，按比例混合后注射入免疫动物的体内，得到IgNAR恒定区多克隆抗体血清；对IgNAR恒定区多克隆抗体血清进行亲和纯化，得到多克隆抗体。本发明还公开了采用本发明多克隆抗体进行鲨鱼血清效价的检测方法。本发明提供了一种可特异性识别条纹斑竹鲨IgNAR恒定区的多克隆抗体，可以用于鲨鱼血清效价评估，具有重要的指导价值。

Description

合成多肽和IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其是涉及一种合成多肽，IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，以及应用其的鲨鱼血清效价的检测方法。

背景技术

抗体药是一个新兴的产业，然而传统抗体存在许多缺点，开发新型的抗体成为了热门的研究领域。纳米抗体在近些年是研究的热点，这类抗体目前只在骆驼科和软骨鱼类中发现。其中在鲨鱼体内天然存在缺失轻链的的免疫球蛋白新抗原(Ig new antigenreceptor,IgNAR)，包括5个恒定区和1个可变区，此类抗体的可变区结构域(Variableparts of IgNARs)具有完整的抗原结合能力，被称为重链抗体、单链抗体或者纳米抗体。在研发过程中，需要对免疫后鲨鱼血清效价功能进行评价，然而目前只有针对护士鲨恒定区的鼠单抗，鲨鱼种类繁多，抗体序列存在一定的差异，因此需要开发特异识别条纹斑竹鲨IgNAR的抗体。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种合成多肽，可用于制备IgNAR多克隆抗体；本发明的目的之二在于提供一种多克隆抗体的制备方法，可用于特异性检测条纹斑竹鲨IgNAR恒定区，且用于鲨鱼血清效价的检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明公开了一种合成多肽，由多肽N1、多肽N2、多肽N3中任意两种或三种混合得到；其中多肽N1，其氨基酸序列为GKPTSVNVSVVLSDI；多肽N2，其氨基酸序列为TEEQRVNGFLQ；多肽N3，其氨基酸序列为LIRSTNKSHGKPT。

优选的，采用多肽N1和多肽N2分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N1和多肽N3分别与KLH进行耦联按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N2和多肽N3分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N1、多肽N2、多肽N3分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)：(0.25～3)混合。

进一步的，多肽N1和多肽N2按质量比1：1混合，或者多肽N1和多肽N3按质量比1：1混合，或者多肽N2和多肽N3按质量比1：1混合，或者多肽N1、多肽N2、多肽N3按质量比1：1：1混合。

本发明还公开了IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，

S1.制备上述的多肽N1、多肽N2、多肽N3中的任意两种或三种。

S2.将步骤S1中制备的多肽分别与KLH耦联，制备免疫原，按比例混合后注射入免疫动物的体内，得到IgNAR恒定区多克隆抗体血清。

S3.对IgNAR恒定区多克隆抗体血清进行亲和纯化，得到多克隆抗体。

优选的，步骤S2的具体过程为：

S21.将选取的多肽分别与KLH进行耦联制成免疫原；将耦联后的多肽按质量比混合得到合成多肽。

S22.初次免疫：将合成多肽与弗氏完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入免疫动物体内。

S23.将合成多肽与弗氏不完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入免疫动物体内，进行加强免疫若干次。

S24.最后一次免疫后，取免疫动物全血，收集得到IgNAR恒定区多克隆抗体血清。

优选的，合成多肽与弗氏完全佐剂或者弗氏不完全佐剂以1：1等体积混合乳化；初次免疫的免疫剂量为1mg/只，加强免疫的免疫剂量为0.5mg/只；初次免疫后进行4～5次加强免疫，间隔2周免疫1次，最后一次免疫7～10天后采用股动脉取全血。

其中，所述的免疫动物为新西兰大白兔。

优选的，步骤S3的具体过程为：

S31.取IgNAR恒定区多克隆抗体血清用PBS稀释后，加入proteinA，得到混合物，室温下孵育。

S32.将步骤S31的混合物转移至重力纯化柱中，使液体缓慢留出，并收集流穿液。

S33.用10～20倍柱体积的冰预冷的PBS加入重力纯化柱中，进行洗涤。

S34.用柠檬酸加入重力纯化柱中进行洗脱，收集洗脱液并用Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，即得到纯化好的抗体。

进一步的，还包括步骤：S35.抗体保存：将纯化好的抗体转移至超滤管中进行超滤，当超滤管中剩余0.5～1mL液体时加入PBS溶液，此过程重复3-4次，最后一次在液体剩余0.5～1mL时停止超滤，取出液体于-18℃～-20℃冰箱中保存备用。

优选的，步骤S31中，取1～2mL血清用PBS稀释10倍，加入1～2mLproteinA，室温孵育1.5～2.5小时；步骤S34中用10～15mL0.1M，pH 2.5的柠檬酸进行洗脱，收集洗脱液后立即用1MpH 8.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱液。

本发明还公开了一种鲨鱼血清效价的检测方法，采用上述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法制备得到的多克隆抗体检测鲨鱼的血清效价。

进一步的，包括以下检测步骤：

a.包被：将用于免疫鲨鱼的免疫原用包被液稀释后包被在酶标板中。

b.封闭：用PBST配置脱脂奶粉封闭液，每孔加入封闭液，室温封闭后弃去孔中液体，用PBST洗液洗板若干次。

c.加样：将免疫后鲨鱼血清用5％脱脂奶粉溶液梯度稀释，分别取部分液体加入孔中，于36℃～38℃孵育1～2小时，用PBST洗液洗板若干次。

d.一抗：将权利要求5～10任一项所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法制备得到的多克隆抗体稀释成4～6mg/mL后，按1:1000～1:10000体积比进行稀释，每孔加入部分多克隆抗体稀释液，于36℃～38℃孵育1-2小时，用PBST洗液洗板若干次。

e.酶标二抗：每孔加入酶标羊抗兔二抗，于36℃～38℃孵育1～2小时，用PBST洗液洗板若干次。

f.显色：每孔加入TMB/E，暗处显色10～15min。

g.终止：每孔加入H₂SO₄溶液终止反应。

h.读数：用酶标仪读取450波长的吸光度值。

由于采用了上述方案，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的合成多肽，可用于制备条纹斑竹鲨IgNAR恒定区多克隆抗体，采用两种或三种多肽混合，可以提高免疫效率，产生识别更多位点的多克隆抗体。

2、本发明公开的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，可制备出用于特异性识别条纹斑竹鲨IgNAR恒定区的抗体，且可用于鲨鱼血清效价的检测。

附图说明

图1是条纹斑竹鲨血清效价检测吸光度值曲线图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例一

本实施例公开了一种合成多肽，用于制备条纹斑竹鲨IgNAR恒定区多克隆抗体。

合成多肽由多肽N1、多肽N2、多肽N3中任意两种或三种混合得到，多肽N1和多肽N2分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N1和多肽N3分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)混合，或者多肽N2和多肽N3分别与KLH进行耦联后按质量比1：(0.25～3)混合。如下表1所示：

表1合成多肽的氨基酸序列

多肽种类	氨基酸序列	序列表序号
			多肽N1	GKPTSVNVSVVLSDI	SEQIDNO.1
多肽N2	TEEQRVNGFLQ	SEQIDNO.2
			多肽N3	LIRSTNKSHGKPT	SEQIDNO.3

本实施例中，多肽N1和多肽N2按质量比1：1混合，或者多肽N1和多肽N3按质量比1：1混合，或者多肽N2和多肽N3按质量比1：1混合，或者多肽N1、多肽N2、多肽N3按质量比1：1：1混合。

实施例二

本实施例公开了IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，本实施例选用的免疫动物为新西兰大白兔，除此之外，可以根据需要选择其它免疫动物，如小鼠。本施例制备得到兔多克隆抗体，其步骤详述如下。

S1.制备实施例一的多肽N1、多肽N2、多肽N3中的任意两种或三种。比如：本实施例中制备多肽N1和多肽N2。

S2.制备IgNAR恒定区多克隆抗体血清

S21.将选取的多肽N1和多肽N2分别与KLH进行耦联制成免疫原。

S23.初次免疫：将合成多肽与弗氏完全佐剂以1：1等体积混合乳化，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入新西兰大白兔体内，初次免疫的免疫剂量为1mg/只。

S24.将合成多肽与弗氏不完全佐剂以1：1等体积混合乳化，皮下和肌肉多部位注射入新西兰大白兔体内，进行加强免疫若干次。

加强免疫的免疫剂量为0.5mg/只，初次免疫后进行4～5次加强免疫，间隔2周免疫1次。

S25.最后一次免疫7～10天后采用股动脉取全血。收集得到IgNAR恒定区多克隆抗体血清。

S3.亲和纯化

S31.取IgNAR恒定区多克隆抗体血清1～2mL，用PBS稀释10倍，加入1～2mLproteinA，得到混合物。室温孵育1.5～2.5小时。

S34.用10～15mL0.1M，pH 2.5的柠檬酸加入重力纯化柱中进行洗脱，收集洗脱液后立即用1MpH 8.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，即得到纯化好的多克隆抗体。

S35.抗体保存：将纯化好的多克隆抗体转移至超滤管中进行超滤，当超滤管中剩余0.5～1mL液体时加入PBS溶液，此过程重复3～4次，最后一次在液体剩余0.5～1mL时停止超滤，取出液体用分光光度计测定吸光值，计算抗体浓度，于-18℃～-20℃冰箱中保存备用。

重力纯化柱使用后用10-15倍柱体积的0.1M，pH 2.5的柠檬酸洗涤后，再用10-20倍柱体积的超纯水洗涤，最后加入2-3倍柱体积的20％乙醇溶液，封存于4℃，便于下次使用。

实施例三

本实施例公开了一种鲨鱼血清效价的检测方法，采用实施例二的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法制备得到的多克隆抗体进行检测。

鲨鱼血清效价的检测方法，具体包括以下检测步骤：

a.包被

将用于免疫鲨鱼的免疫原(RBD)用包被液稀释成0.5μg/mL后包被在酶标板中，100μL/孔，4℃孵育12-16h后弃去孔中液体，扣干。

b.封闭：用PBST配置5％脱脂奶粉封闭液，每孔加入200μL封闭液，室温封闭1小时后弃去孔中液体，用PBST洗液洗板3-4次，每次2min。

c.加样

将免疫后鲨鱼血清用5％脱脂奶粉溶液梯度稀释，分别取100μL液体加入孔中，于37℃孵育1-2小时，用PBST洗液洗板3-4次，每次2min。

d.一抗

将实施例二的条纹斑竹鲨IgNAR兔多克隆抗体的制备方法制备得到的多克隆抗体稀释成5mg/mL后，按1:1000-1:10000体积比进行稀释，本实施例按1：5000体积比进行稀释，每孔加入100μL多克隆抗体稀释液，于37℃孵育1小时，用PBST洗液洗板3次，每次2min。

e.酶标二抗

加入100μL/孔的酶标羊抗兔二抗，于37℃孵育1小时，用PBST洗液洗板5-6次，每次2min。

f.显色

每孔加入100μL TMB/E，暗处显色10-15min。

g.终止

每孔加入50μL 1M H₂SO₄溶液终止反应。

h.读数

用酶标仪读取450波长的吸光度值。

图1为条纹斑竹鲨血清效价检测吸光度值曲线图，血清第1个稀释度为1:200稀释，依次为2倍梯度稀释，pre-immune为免疫前血清，post-immune为免疫后血清。由图中可以看出，免疫前血清不同梯度稀释后，OD450值基本没有变化并且保持较低水平，免疫后血清则在高浓度下与免疫原(RBD)有较强结合，随着梯度稀释，结合也呈现梯度减弱，可见，本发明所制备的IgNAR恒定区多克隆抗体可用于检测抗原特异性的血清抗体效价检测。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110> 厦门福宸百奥生物技术有限公司, 厦门联合呼吸健康研究院

<120> 合成多肽和IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 1

Gly Lys Pro Thr Ser Val Asn Val Ser Val Val Leu Ser Asp Ile

1 5 10 15

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 2

Thr Glu Glu Gln Arg Val Asn Gly Phe Leu Gln

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 条纹斑竹鲨

<400> 3

Leu Ile Arg Ser Thr Asn Lys Ser His Gly Lys Pro Thr

1 5 10

Claims

1.一种合成多肽，其特征在于，由多肽N1、多肽N2混合得到；其中

多肽N1，其氨基酸序列为GKPTSVNVSVVLSDI，SEQ IDNO.1；

多肽N2，其氨基酸序列为TEEQRVNGFLQ，SEQ IDNO.2。

2.如权利要求1所述的合成多肽，其特征在于，采用多肽N1和多肽N2分别与KLH进行耦联后按质量比1：（0.25～3）混合。

3.如权利要求2所述的合成多肽，其特征在于，多肽N1和多肽N2按质量比1：1混合。

4.IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

S1.制备权利要求1～3任一项所述的多肽N1、多肽N2；

S2.将步骤S1中制备的多肽分别与KLH耦联，制备免疫原，按比例混合后注射入免疫动物的体内，得到IgNAR恒定区多克隆抗体血清；

5.如权利要求4所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S2的具体过程为：

S21.将选取的多肽分别与KLH进行耦联制成免疫原；将耦联后的多肽按质量比混合得到合成多肽；

S22.初次免疫：将合成多肽与弗氏完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入免疫动物体内；

S23.将合成多肽与弗氏不完全佐剂混合，经注射器乳化充分，形成油包水的乳浊液，皮下和肌肉多部位注射入免疫动物体内，进行加强免疫若干次；

6.如权利要求5所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：合成多肽与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂以1：1等体积混合乳化；初次免疫的免疫剂量为1mg/只，加强免疫的免疫剂量为0.5 mg/只；初次免疫后进行4～5次加强免疫，间隔2周免疫1次，最后一次免疫7～10天后采用股动脉取全血；所述的免疫动物为新西兰大白兔。

7.如权利要求4所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤S3的具体过程为：

S31.取IgNAR恒定区多克隆抗体血清用PBS稀释后，加入proteinA，得到混合物，室温下孵育；

S32.将步骤S31的混合物转移至重力纯化柱中，使液体缓慢留出，并收集流穿液；

S33.用10～20倍柱体积的冰预冷的PBS加入重力纯化柱中，进行洗涤；

S34.用柠檬酸加入重力纯化柱中进行洗脱，收集洗脱液并用Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，即得到纯化好的多克隆抗体。

8.如权利要求7所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法，其特征在于：还包括步骤S35：

S35.抗体保存：将纯化好的多克隆抗体转移至超滤管中进行超滤，当超滤管中剩余0.5～1mL液体时加入PBS溶液，此过程重复3-4次，最后一次在液体剩余0.5～1mL时停止超滤，取出液体于-18℃～-20℃冰箱中保存备用；

步骤S31中，取1～2mL血清用PBS稀释10倍，加入1～2mLproteinA，室温孵育1.5～2.5小时；步骤S34中用10～15mL0.1M，pH 2.5的柠檬酸进行洗脱，收集洗脱液后立即用1MpH 8.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱液。

9.一种鲨鱼血清效价的检测方法，其特征在于：采用权利要求4～8任一项所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法制备得到的多克隆抗体用于检测鲨鱼免疫后的血清效价。

10.如权利要求9所述的鲨鱼血清效价的检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：

a.包被：将用于免疫鲨鱼的免疫原用包被液稀释后包被在酶标板中；

b.封闭：用PBST配置脱脂奶粉封闭液，每孔加入封闭液，室温封闭后弃去孔中液体，用PBST洗液洗板若干次；

c.加样：将免疫后的鲨鱼血清用5%脱脂奶粉溶液梯度稀释，分别取部分液体加入孔中，于36℃～38℃孵育1～2小时，用PBST洗液洗板若干次；

d.一抗：将所述的IgNAR恒定区多克隆抗体的制备方法制备得到的多克隆抗体稀释成4～6mg/mL后，按1:1000～1:10000体积比进行稀释，每孔加入部分多克隆抗体稀释液，于36℃～38℃孵育1-2小时，用PBST洗液洗板若干次；

e.酶标二抗：每孔加入酶标羊抗兔二抗，于36℃～38℃孵育1～2小时，用PBST洗液洗板若干次；

f.显色：每孔加入TMB/E，暗处显色10～15min；

g.终止：每孔加入H₂SO₄溶液终止反应；

h.读数：用酶标仪读取450波长的吸光度值。