CN114316033A - 一种特异性识别诺如病毒的单克隆抗体及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种特异性识别诺如病毒的单克隆抗体及制备方法与应用。本发明从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到的抗原具有高度保守性，利用该高度保守的抗原制备得到的单克隆抗体，能够特异性靶向诺如病毒的VP1蛋白，从而能够特异性识别诺如病毒，并可结合ELISA技术，实现对诺如病毒的检测分析。本发明单克隆抗体可用于制备检测诺如病毒的检测试剂或检测装置中，从而更有效地及时预防诺如病毒感染。

Description

一种特异性识别诺如病毒的单克隆抗体及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种能特异性识别诺如病毒的单克隆抗体及制备方法与应用。

背景技术

食品安全问题一直是这几年来最为人们关注的焦点问题之一。食源性病原菌造成的食物中毒是真正严重威胁人民健康的食品安全问题，对社会经济造成了巨大的损失。

在发达国家，食品工业的规模化、产业化和系统化以及食品工业和广大消费者食品安全意识较高，食品相关的法律法规及监管机构的分工合作比较完善。其食品安全问题主要集中于食源性病原菌和毒素造成的食物中毒。在微生物污染中，细菌性污染是涉及面最广、影响最大、问题最多的一种污染。根据WHO统计，全球每年大约有150000万例食源性腹泻病，约70％是由微生物性污染引起；美国每年的食源性疾病病例目前在7600万例左右，32万住院病例和5000人因饮食感染病菌导致死亡。食源性疾病不但威胁人民身心健康，还给社会造成巨大的经济损失。统计表明，美国5种主要的食源性病原菌给社会带来了350亿美元的经济损失。在发展中国家，致病性微生物造成的食源性疾病，也仍然是危害公众健康的最重要因素。与世界各国一样，我国的食品安全危害问题主要是微生物病原菌和生物毒素造成的食物中毒。据中国CDC的一项初步调查，我国每由于微生物病原菌和生物毒素造成的食物中毒事件在2-4亿例以上，给公共安全造成很大的威胁和巨大的经济损失。目前，我国尚没有建立起完善的食源性疾病报告系统。根据世界卫生组织估计，发展中国家食源性疾病的漏报率在95％以上。按照卫生部提供的统计数字，中国最近几年由食源性疾病引起的食品安全问题呈现出上升趋势。近年中国卫生部每年接到食物中毒报告一二百起，涉及数千人发病，百余人死亡，除意外事故外，大部分是由致病微生物引起的。从食品种类来看，动物性食品是中国主要的食物中毒原因食品。其中以肉及肉制品引起的食物中毒最多，为21.88％；其次为水产品，占10.11％。2002年中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况进行了连续的主动监测，结果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62％，化学性食物中毒占38.56％，动植物性和原因不明的食物中毒均在10％左右。统计数据表明，由肠道致病菌(沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、伤冷沙门菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等)污染食品而引起的食品中毒以及疾病散发是直接造成人体健康损害的主要食源性危害。近年来，发生食用被沙门氏菌感染的禽肉而广泛发生于学校、家庭、公共餐饮单位的食物中毒多起，其中不乏有上百人的大型食物中毒。

除了细菌性病原，诺沃克病毒(又称诺如病毒，norovirus)是造成食品中毒的最为普遍的因素。诺沃克病毒具有高度传染性病原体。它是在世界范围造成非细菌性肠胃炎的急性传染病的重要病原体，并在美国每年造成约二千三百万感染个案。在香港和内地也存在大量的诺沃克病毒感染病例。诺沃克类病毒经常通过食物和水传播。海鲜和即食食品被认为是食源性诺沃克病毒感染的重要媒介。在我国，每年都有大型的爆发案例。2013年3月，广州大学城多所高校出现因感染诺如病毒，而导致的聚集性腹泻病例。累计确诊200多例，无人死亡。2013年4月，广东省揭阳市揭阳职业技术学院近400名学生感染诺如病毒，有173名学生送医院诊治观察。2014年2月，浙江嘉兴的海宁市、海盐县两地部分学校400多人感染。

然而，目前诺如病毒的检测方法主要基于RT-PCR，此方法的不足之处是要求较高的技术、设备和较长的时间，而且无法实现实时检测分析。冷冻电镜法是检测分析诺如病毒的另一个传统技术，同样该方法对技术和设备都有很高的要求，从而限制了广泛应用。利用免疫学方法对诺如病毒进行检测分析是另一个快速、简便、灵敏和特异的方法，但目前已有的免疫学检测技术具有较低的检测灵敏度问题。究其原因，其中一个可能就是抗体的特异性较差，导致对诺如病毒的识别强度不够，或者不能用来检测分析诺如病毒。

因此，现有技术仍有待于改进和发展。

发明内容

鉴于此，为了更好地预防和监控食品中诺如病毒的污染情况，以及实现对诺如病毒的实时实地方便快捷的检测分析，本发明提供一种单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性靶向诺如病毒的表面VP1蛋白，从而能够特异性识别诺如病毒，并可结合ELISA技术，实现对诺如病毒的检测分析。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，其中，从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原，以所述抗原作为免疫原，通过所述免疫原制备得到所述单克隆抗体。

进一步地，所述抗原的氨基酸序列如下所示：

VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

进一步地，所述单克隆抗体能够特异性地识别诺如病毒的抗原，所述抗原的氨基酸序列如下所示：VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

本发明的第二方面，提供一种单克隆抗体的制备方法，其中，包括步骤：

从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原；

合成所述抗原；

将合成得到的所述抗原作为免疫原免疫小鼠，获得免疫后的小鼠；

从所述免疫后的小鼠中提取效应B淋巴细胞，将所述效应B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选，得到杂交瘤细胞；

采用所述杂交瘤细胞分泌得到单克隆抗体。

进一步地，利用生物信息学手段和多重序列比对技术，从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原。

进一步地，所述抗原的氨基酸序列如下所示：

VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

进一步地，所述单克隆抗体能够特异性地识别诺如病毒的抗原，所述抗原的氨基酸序列如下所示：VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

本发明的第三方面，提供一种诺如病毒检测试剂盒，其中，包括本发明所述的单克隆抗体或者本发明所述的制备方法制备得到的单克隆抗体。

本发明的第四方面，提供一种诺如病毒检测装置，其中，包括本发明所述的单克隆抗体或者本发明所述的诺如病毒检测试剂盒。

本发明的第五方面，提供本发明所述的单克隆抗体在制备检测诺如病毒的产品中的应用。

有益效果：本发明从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到的抗原具有高度保守性，利用该高度保守的抗原制备得到的单克隆抗体，能够特异性靶向诺如病毒的VP1蛋白，从而能够特异性识别诺如病毒，并可结合ELISA技术，实现对诺如病毒的检测分析。本发明可用于制备检测诺如病毒的检测试剂或检测装置中，从而更有效地及时预防诺如病毒感染。

附图说明

图1为本发明具体的实施例1中抗原VP1和经protein G介质纯化的靶向诺如病毒的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳分析结果图。

图2为本发明具体的实施例2中靶向诺如病毒的单克隆抗体结合ELISA技术对抗原VP1以及诺如病毒的检测分析结果图。

具体实施方式

本发明提供一种能特异性识别诺如病毒的单克隆抗体及制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种诺如病毒抗原，其从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到。

发明人研究发现，诺如病毒的VP1蛋白(YP_009237898.1)由535个氨基酸残基组成，对VP1蛋白分析发现，VP1蛋白没有跨膜区，全部暴露在诺如病毒表面，其通过约位于90-130处的氨基酸残基靶定在病毒上。另外，通过BLAST和多序列比对分析显示，VP1蛋白，尤其是其1-350位氨基酸残基，在不同诺如病毒基因型中具有高度保守性。综上，VP1蛋白，尤其是从其氮端开始的、长度为350个氨基酸残基的区域，是一个良好的抗原，可以用来制备能特异性识别诺如病毒的单克隆抗体。但从经济性和高效性角度考虑，最终从VP1蛋白上筛选确定长度为37个氨基酸残基的多肽片段即VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC，作为抗原。

本发明实施例提供一种单克隆抗体，其中，从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原，以所述抗原作为免疫原，通过所述免疫原制备得到所述单克隆抗体。

本发明实施例从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到的抗原具有高度保守性，利用该高度保守的抗原作为免疫原，制备得到的单克隆抗体能够特异性靶向诺如病毒的VP1蛋白，从而能够特异性识别诺如病毒，并可结合ELISA技术，实现对诺如病毒的检测分析。

本发明实施例提供一种单克隆抗体，其中，从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到如下氨基酸序列的抗原，以所述抗原作为免疫原，通过所述免疫原制备得到所述单克隆抗体。其中所述抗原的氨基酸序列如下所示：VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

本发明实施例从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到的如上氨基酸序列的抗原具有高度保守性，利用该高度保守的抗原作为免疫原，制备得到的单克隆抗体能够特异性靶向诺如病毒的VP1蛋白，从而能够特异性识别诺如病毒，并可结合ELISA技术，实现对诺如病毒的检测分析。

本发明实施例提供一种单克隆抗体的制备方法，其中，包括步骤：

S10、从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原；

S20、合成所述抗原；

S30、将合成得到的所述抗原作为免疫原免疫小鼠，获得免疫后的小鼠；

S40、从所述免疫后的小鼠中提取效应B淋巴细胞，将所述效应B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选，得到杂交瘤细胞；

S50、采用所述杂交瘤细胞分泌得到单克隆抗体。

本发明实施例从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到的抗原具有高度保守性，利用该高度保守的抗原作为免疫原，以所述免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，由该杂交瘤细胞分泌得到单克隆抗体。本发明实施例利用高度保守的抗原制备得到的单克隆抗体能够特异性靶向诺如病毒的VP1蛋白，从而能够特异性识别诺如病毒，并可结合ELISA技术，实现对诺如病毒的检测分析。

步骤S10中，在一种实施方式中，利用生物信息学手段和多重序列比对技术，从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原。

本发明实施例中，利用生物信息学手段和多重序列比对技术，筛选得到在诺如病毒中高度保守的抗原。进一步地，所述抗原的氨基酸序列如下所示：VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC

步骤S20中，在一种实施方式中，以固相合成法合成所述抗原。

步骤S50中，采用体外培养或注射到小鼠腹腔的方式制备单克隆抗体，并利用protein G介质纯化单克隆抗体。

本发明实施例中，利用生物信息学手段和多重序列比对技术，筛选得到在诺如病毒中高度保守的抗原；合成所述诺如病毒抗原，将合成的抗原感染小鼠，分离获得相应的效应B淋巴细胞；将获得的效应B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备出能够稳定地大量产生目的单克隆抗体的杂交瘤细胞；利用体外培养或注射到小鼠腹腔的方式扩大生产单克隆抗体，并利用proteinG介质纯化单克隆抗体；利用ELISA技术，检验纯化的单克隆抗体对诺如病毒的检测分析效果。

本发明实施例提供一种诺如病毒检测试剂盒，其中，包括如上所述的单克隆抗体或者如上所述的制备方法制备得到的单克隆抗体。

本发明实施例检测试剂盒能够特异性检测诺如病毒，从而更有效地及时预防诺如病毒感染。

本发明实施例提供一种诺如病毒检测装置，其中，包括如上所述的单克隆抗体或者如上所述的诺如病毒检测试剂盒。

本发明实施例所述的单克隆抗体在制备检测诺如病毒的产品中的应用。

下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。

首先需说明的是，以下实施例中若未注明具体的实验条件，其按照本领域技术人员所熟知的常规条件实施，或遵循试剂供应商所建议的方法实施。以下实施例中所涉及的耗材都购于市场，并无特殊要求。

实施例1

抗原VP1和靶向诺如病毒的单克隆抗体的纯化

依照动物实验要求购买饲养小鼠(Balb/c小鼠)，其次按照常规细胞培养方法以及遵循供应商的建议，培养出相应的杂交瘤细胞(由中国北京华大蛋白质研发中心有限公司提供)。然后向小鼠腹腔内注射培养好的杂交瘤细胞，收集腹水。经过滤处理腹水后，遵循供应商提供的方法流程，利用proteinG介质纯化靶向诺如病毒的单克隆抗体，并利用蛋白电泳检验获得的单克隆抗体的纯度，检验结果见图1中的L2：结果显示，纯化获得的单克隆抗体具有很高的纯度和浓度，表现出经典的50kDa(重链)和25kDa(轻链)片段。

为了验证上述单克隆抗体的特异性，本实施例构建了含有编码VP1基因的重组质粒pET15b-VP1，以大肠杆菌为表达系统，过量表达了含有组氨酸亲和标签的、长度为350个氨基酸残基并且高度保守的VP1(1-350aa)重组蛋白质，利用NTA亲和介质纯化获得了高纯度的VP1融合蛋白质，电泳检验结果见图1中的L1：结果显示，纯化获得的VP1融合蛋白具有很高的纯度和浓度，分子量约为40kDa，符合预测的分子大小。

实施例2

靶向诺如病毒的单克隆抗体结合ELISA技术对抗原VP1以及完整诺如病毒的检测分析结果

ELISA技术可参照传统步骤实施，简要概述为：首先用1×PBS缓冲液稀释VP1蛋白或者灭活处理的诺如病毒，加入高亲和力的96孔板中，每孔100μl，室温轻微震荡孵育2h；弃去上清，用1×洗液清洗3次；用1×封闭缓冲液室温封闭96孔板2h；每孔加入50μL上述纯化的单克隆抗体(2μg·mL^-1)，室温孵育2h；弃去上清，用1×洗液清洗3次；每孔加入100μl HRP标记的抗鼠IgG，室温孵育1h；加入50μLTMB底物，暗处反应20min；最后加入100μl终止反应液，于多功能酶标仪上读取450nm波长下的吸光值，并分析结果，结果见图2，其中A中位于上方的图为96孔中不同浓度VP1与单克隆抗体识别反应后的结果，在达到饱和之前，VP1的浓度越高，颜色就会越深；A中位于下方的图为96孔中不同浓度诺如病毒与单克隆抗体识别反应后的结果，同样，在达到饱和之前，诺如病毒的浓度越高，颜色就会越深；B为量化分析展示A中的结果。本次实验采用的是Abcam的ELISA试剂盒，实际操作时可用类似产品替代。

综上所述，本发明提供的一种诺如病毒的单克隆抗体及其制备方法与应用。本发明从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到的抗原具有高度保守性，利用该高度保守的抗原制备得到的单克隆抗体，能够特异性靶向诺如病毒的VP1蛋白，从而能够特异性识别诺如病毒，并可结合ELISA技术，实现对诺如病毒的检测分析。本发明单克隆抗体可用于制备检测诺如病毒的检测试剂或检测装置中，从而更有效地及时预防诺如病毒感染。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

<110> 香港理工大学深圳研究院

<120> 一种特异性识别诺如病毒的单克隆抗体及制备方法与应用

<160> 1

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

Val Gln Ala Pro Asn Gly Glu Phe Thr Val Ser Pro Arg Asn Ser Pro

1 5 10 15

Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Glu Leu Gly Pro Glu Leu Asn Pro Tyr

20 25 30

Leu Ala His Leu Cys

35

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原，以所述抗原作为免疫原，通过所述免疫原制备得到所述单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如下所示：

VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够特异性地识别诺如病毒的抗原，所述抗原的氨基酸序列如下所示：VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

4.一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤：

从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原；

合成所述抗原；

将合成得到的所述抗原作为免疫原免疫小鼠，获得免疫后的小鼠；

从所述免疫后的小鼠中提取效应B淋巴细胞，将所述效应B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选，得到杂交瘤细胞；

采用所述杂交瘤细胞分泌得到单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用生物信息学手段和多重序列比对技术，从诺如病毒的VP1蛋白上筛选得到抗原。

6.根据权利要求4所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如下所示：

VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

7.根据权利要求4所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体能够特异性地识别诺如病毒的抗原，所述抗原的氨基酸序列如下所示：VQAPNGEFTVSPRNSPGEVLLNLELGPELNPYLAHLC。

8.一种诺如病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或者权利要求4-7任一项所述的制备方法制备得到的单克隆抗体。

9.一种诺如病毒检测装置，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或者权利要求8所述的诺如病毒检测试剂盒。

10.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体在制备检测诺如病毒的产品中的应用。

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