CN114315919A - 利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用DNA编码化合物库技术制备On‑DNA 1,2,4‑三氮唑类化合物的方法：以On‑DNA氨基硫脲为底物，在脱硫试剂和碱的存在下，与小分子醛类试剂通过缩合反应以及脱硫关环反应制得On‑DNA 1,2,4‑三氮唑类化合物。本发明所提供的反应方法为On‑DNA三氮唑类合成提供了新的方法，三氮唑类骨架多见于小分子药物中，合成该类化合物可以显著增加DNA编码化合物库的多样性，利用本发明所提供的反应方法制备On‑DNA 1,2,4‑三氮唑类化合物，产率高，底物普适性广，条件温和，操作方便，适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Description

利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合 物的方法

技术领域

本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法。

背景技术

美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381, 专利：US5573905)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行DNA标记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将极少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的化合物库分子先被洗掉，留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来，这时得到的化合物库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，但是通过DNA 独有的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的有机小分子试剂与每个具体DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的有机小分子试剂，我们再通过传统的有机合成方法把这些有机小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，再检测并确认其对靶标的生理活性。

DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA 模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导公司为主利用DNA标记技术得到的 DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen 公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。

除了DNA起始片段外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得，再通过DNA合成仪得到具体的 DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到。

DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称On-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的On-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA编码化合物库的合成所需要的。目前公开报道的On-DNA化学反应种多达上百种，包括水相的、固相的和DNA模板反应，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，On-DNA化学反应的种类越多，条件越丰富，普适性越好，在DNA编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终DNA编码化合物库的合成成功率才越高，得到的 DNA编码化合物库的多样性才越丰富。

三氮唑核心骨架常见于许多具有生物活性的化合物中。目前公开报道的应用于DRCL构建的On-DNA的三氮唑类化合物主要通过经典的铜催化的Click反应——铜催化的叠氮-炔基环加成反应(CuAAC)来实现的，所得到的三氮唑类化合物仅为1,2,3-三氮唑类化合物，并且常用叠氮类试剂为反应物，存在试剂稳定性低，市售种类少，易爆等缺点，极大地限制了相关方法在DNA编码化合物库中的应用。其它三氮唑类的合成方法目前仅有一例报道，文献(Chem.Eur.J.,2021,27(31),8214-8220)介绍了On-DNA酰肼类化合物与亚胺酯盐酸盐类化合物的反应生成On-DNA的1,2,4-三氮唑的方法，亚胺酯盐酸盐类化合物需自行通过腈类化合物制备所得，而市售的腈类化合物数量有限，这些都会从不同层面限制该反应在DNA编码化合物库合成中的应用。

为了解决DNA编码化合物库构建中On-DNA的三氮唑类化合物尤其是1,2,4-三氮唑类化合物的合成方法限制，亟需开发一种原料易得，反应条件温和，产率高，反应的底物普适性好，适合于使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成过程，并可以增加DNA编码化合物库的多样性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4- 三氮唑类化合物的方法，所述方法用于在多孔板上批量操作进行，以On-DNA氨基硫脲为底物，在脱硫试剂和碱的存在下，与小分子醛类试剂通过缩合反应以及脱硫关环反应制得 On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物，其特征在于，包括以下步骤：

1)取1摩尔当量的On-DNA氨基硫脲溶液，加入10～2000摩尔当量的醛类化合物溶液中，在0～100℃下反应0.5～24小时；

2)加入1～100摩尔当量脱硫试剂和1～100摩尔当量的碱，在0～100℃下反应0.5～24小时；

其中，所述On-DNA氨基硫脲由水合肼与一段DNA序列的氨基在分子水平通过共价键进行连接所得，所述On-DNA氨基硫脲的结构式为

所述结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，所述醛类化合物是仅含有一个醛基的脂肪醛或者仅含有一个醛基的芳香醛。

具体地，所述醛类化合物为分子量在1000以内的小分子化合物。

优选的，所述醛类化合物为分子量在500以内的小分子化合物。

具体地，所述On-DNA氨基硫脲溶液的摩尔浓度是0.1～5.0mM。

优选地，所述On-DNA氨基硫脲溶液的摩尔浓度是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、 3.5mM、4.0mM、4.5mM或5.0mM；更优选地，所述On-DNA氨基硫脲化合物的摩尔浓度为 1.0mM

具体地，步骤1)中，所述On-DNA氨基硫脲溶液包括乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂，且最终On-DNA氨基硫脲溶液中水的含量不低于20％。

具体地，步骤2)中，所述脱硫试剂为碘(I₂)、醋酸碘苯(DIB)、戴斯-马丁氧化剂(DMP)、 2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)、2-碘酰苯甲酸(IBX)、碘甲烷(MeI)、二环己基碳二亚胺 (DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、溴乙酸乙酯(BrCH₂COOEt)、对甲苯磺酰氯(TsCl)、氧化汞(HgO)、过氧化氢(H₂O₂)、溴化铜(CuBr₂)、氯化铜(CuCl₂)、醋酸铜(Cu(OAc)₂)、三氟甲磺酸铜(Cu(OTf)₂)、高氯酸铜(Cu(ClO₄)₂)、硫酸铜(CuSO₄)、氯化亚铜(CuCl)、溴化亚铜(CuBr)、碘化亚铜(CuI)、醋酸汞(Hg(OAc)₂)、氯化汞(HgCl₂)、溴化汞(HgBr₂)、三氟乙酸汞(Hg(OCOCF₃)₂)、碘化汞(HgI₂)、硫酸汞(HgSO₄)、氧化镍 (NiO)、硝酸银(AgNO₃)、超氧化钾(KO₂)的一种或几种的混合物。

优选地，所述脱硫试剂为对甲苯磺酰氯。

具体地，所述脱硫试剂的摩尔当量是1～100当量。

优选的，所述脱硫试剂的摩尔当量是1当量、2当量、3当量、4当量、5当量、6当量、7当量、8当量、9当量、10当量、20当量、30当量、40当量、50当量、60当量、70当量、80当量、90当量或100当量，更优选地，所述脱硫试剂的当量为30当量。

具体地，所述1～100摩尔当量的碱为硼酸钠、硼酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、醋酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠、碳酸氢钾、吡咯烷、二异丙基乙胺、三乙胺、二异丙基胺、二乙基胺、吡啶、哌啶、四丁基氟化铵、四丁基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵中的一种或几种的混合物。

优选地，所述碱为三乙胺。

具体地，所述碱的摩尔当量是1～100当量。

优选的，所述碱的当量是10当量、20当量、30当量、40当量、50当量、60当量、70当量、 80当量、90当量、100当量，更优选地，所述碱的当量为30当量。

具体地，所述醛类化合物的摩尔当量是10～2000当量。

优选的，所述醛类化合物的当量是10当量、20当量、30当量、40当量、50当量、60当量、70当量、80当量、90当量、100当量、150当量、200当量、250当量、300当量、350当量、400当量、450当量、500当量、550当量、600当量、650当量、700当量、750当量、800当量、850 当量、900当量、950当量、1000当量、1500当量或2000当量，更优选地，所述醛类化合物的当量为200当量。

具体地，步骤1)中，所述反应的温度为0～100℃；优选地，所述反应的反应温度为20℃、 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃，更优选地，反应温度为20℃；步骤2)中，所述反应的温度为0～100℃；优选地，所述反应的反应温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、 70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃，更优选地，反应的温度为60℃。

具体地，步骤1)中，所述反应的时间为0.5～24小时；优选地，所述反应的时间为0.5小时、 1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12 小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22 小时、23小时或24小时；更优选地，所述反应的时间为16小时，步骤2)中，所述反应的时间为0.5～24小时；优选地，所述反应的时间为0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、 6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时；更优选地，反应的时间为2小时。

本发明为DNA编码化合物库构建中On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的合成提供新的方法，本发明通过使用廉价易得、试剂种类多的小分子醛为反应试剂，可以增加DNA编码化合物库的多样性和新颖性，大大提高了DNA编码化合物库的类药性，适合大批量多孔板的DNA 编码化合物库的生产。

附图说明

图1为本发明由DNA-NH₂制得On-DNA氨基硫脲类化合物的化学反应式；

图2为本发明用On-DNA氨基硫脲类化合物制得On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的化学反应式；

图3为本发明用On-DNA氨基硫脲类化合物制得On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的转化率分布(转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)；

图3中，纵坐标表示试剂个数，横坐标表示转化率区间，如0-30％表示0％＜转化率≤30％。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1On-DNA氨基硫脲的合成

DNA-NH₂溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，与二(2-吡啶)硫代碳酸酯(DPT)反应得到相应的On-DNA硫代异氰酸酯中间体化合物，随后加入水合肼发生反应得到氨基硫脲类化合物，转化率>90％后采用乙醇沉淀处理，使用3K Millpore超滤管超滤，浓缩干燥后直接用于下一步反应，如图1所示，为由DNA-NH₂制得On-DNA氨基硫脲类化合物的化学反应式。

实施例2对甲苯磺酰氯促进的On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的合成

On-DNA氨基硫脲化合物

溶于pH＝5.5的磷酸钠水溶液中，配制成1mM 浓度溶液，分装到96孔板中(8μL,8nmol,1mM水溶液)，加入小分子醛类化合物(8.0μL,1600 nmol,200mM乙腈溶液,200eq.)，离心让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后封膜，96孔板在摇床中20℃下反应16小时，随后进行乙醇沉淀。

沉淀后用8μL的pH＝7.02的磷酸钠水溶液溶解固体，得到近1mM的溶液，向每个孔中加入对甲苯磺酰氯(2.4uL,240nmol，100mMN-甲基吡咯烷酮溶液，30eq.)和三乙胺(2.4uL, 240nmol，100mM的N-甲基吡咯烷酮溶液，30eq.)，离心让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后封膜，在PCR中60℃下反应2小时(盖帽温度75℃)。降温，并进行乙醇沉淀操作。

乙醇沉淀：向96孔板的每个孔加入反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率。

如图2所示，为用On-DNA氨基硫脲类化合物制得On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的化学反应式。

与On-DNA氨基硫脲反应的小分子醛类试剂共计测试了1785个，转化率>50％的试剂占比63％，转化率＞70％的试剂占比21％(见图2)，其中，芳香醛类试剂有着较好的反应活性，含有羧基、炔基，芳卤类官能团的醛类化合物同样能得到较好的收率，得到的On-DNA1,2,4- 三氮唑类化合物库可以继续使用剩下的功能团进行反应得到不同的子库，以便增加DNA编码化合物库的多样性。

按照实施例2相同的方法步骤进行，其中部分具有代表性的小分子醛类化合物与On-DNA 氨基硫脲反应所得On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的产物结构式及相应的产率见下表所示：

实施例3其他试剂促进的On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的合成

On-DNA氨基硫脲化合物

首先与小分子醛试剂在室温下反应过夜并进行乙醇沉淀后溶解于水中配成1mM浓度的水溶液，向其中加入2当量或5当量或10当量的溴化铜、或单质碘、或2-碘酰苯甲酸，涡旋混匀后置于80℃的PCR仪器中反应1小时，随后进行乙醇沉淀以及检测LC-MS，溴化铜促进的目标产物的收率均不到15％，单质碘或IBX 促进的目标产物的收率均在30％以下。

由该实施例结果可见，本发明所述方法为On-DNA方法中合成1,2,4-三氮唑类的创新方法。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的一些代表性实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法，所述方法用于在多孔板上批量操作进行，以On-DNA氨基硫脲为底物，在脱硫试剂和碱的存在下，与小分子醛类试剂通过缩合反应以及脱硫关环反应制得On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物，其特征在于，包括以下步骤：

1)取1摩尔当量的On-DNA氨基硫脲溶液，加入10～2000摩尔当量的醛类化合物溶液中，在0～100℃下反应0.5～24小时；

2)加入1～100摩尔当量脱硫试剂和1～100摩尔当量的碱，在0～100℃下反应0.5～24小时；

其中，所述On-DNA氨基硫脲由水合肼与一段DNA序列的氨基在分子水平通过共价键进行连接所得，所述On-DNA氨基硫脲的结构式为

所述结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，所述醛类化合物是仅含有一个醛基的脂肪醛或者仅含有一个醛基的芳香醛。

2.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，所述On-DNA氨基硫脲溶液的摩尔浓度是0.1～5.0mM。

3.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，步骤1)中，所述On-DNA氨基硫脲溶液包括乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂，且最终On-DNA氨基硫脲溶液中水的含量不低于20％。

4.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，步骤2)中，所述脱硫试剂为碘(I₂)、醋酸碘苯(DIB)、戴斯-马丁氧化剂(DMP)、2-氯-1-甲基吡啶碘化物(CMPI)、2-碘酰苯甲酸(IBX)、碘甲烷(MeI)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、溴乙酸乙酯(BrCH₂COOEt)、对甲苯磺酰氯(TsCl)、氧化汞(HgO)、过氧化氢(H₂O₂)、溴化铜(CuBr₂)、氯化铜(CuCl₂)、醋酸铜(Cu(OAc)₂)、三氟甲磺酸铜(Cu(OTf)₂)、高氯酸铜(Cu(ClO₄)₂)、硫酸铜(CuSO₄)、氯化亚铜(CuCl)、溴化亚铜(CuBr)、碘化亚铜(CuI)、醋酸汞(Hg(OAc)₂)、氯化汞(HgCl₂)、溴化汞(HgBr₂)、三氟乙酸汞(Hg(OCOCF₃)₂)、碘化汞(HgI₂)、硫酸汞(HgSO₄)、氧化镍(NiO)、硝酸银(AgNO₃)、超氧化钾(KO₂)的一种或几种的混合物。

5.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，所述脱硫试剂的摩尔当量是30当量。

6.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，所述1～100摩尔当量的碱为硼酸钠、硼酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、醋酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铯、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠、碳酸氢钾、吡咯烷、二异丙基乙胺、三乙胺、二异丙基胺、二乙基胺、吡啶、哌啶、四丁基氟化铵、四丁基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵中的一种或几种的混合物。

7.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，所述碱的摩尔当量是30当量。

8.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，所述醛类化合物的摩尔当量是200当量。

9.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，步骤1)中，反应的温度为20℃，步骤2)中，反应的温度为60℃。

10.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA 1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，步骤1)中，反应的时间为16小时，步骤2)中，反应的时间为2小时。

11.如权利要求1所述的利用DNA编码化合物库技术制备On-DNA1,2,4-三氮唑类化合物的方法，其特征在于，所述醛类化合物为分子量在1000以内的小分子化合物。

Images