CN114306311A - 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗心脏病的药物中的应用 - Google Patents
组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗心脏病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗心脏病的药物中的应用，属于化合物的医疗用途技术领域。本发明构建了心肌敲除CDK13的小鼠模型，确认了心肌中CDK13缺失可导致扩张型心肌病和心力衰竭等心脏功能障碍；发现了CDK13通过调控DMD基因表达下调导致心肌病的分子机制。本发明利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂No.1217(其分子式为C24H27N3O4)对心肌敲除CDK13小鼠进行药物治疗，结果发现，连续给药一个月后，心肌敲除CDK13小鼠的心功能、心脏纤维化病理进程以及dystrophy蛋白水平本部分逆转。本发明找到了靶向CDK13治疗心肌病的有效分子和治疗策略，对心脏病的治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗心脏病的药物中的应用，属于化合物的医疗用途技术领域。
背景技术
心脏病是一种破坏性疾病，在临床多表现为心力衰竭和心脏栓塞，其特征主要在于间质纤维化、房室重塑、心室顺应性降低和血液流动性降低。成年心脏病病人很大一部分是由于基因突变导致的蛋白质失活所引发的心脏心肌功能丧失。
在2016年的一项发育障碍研究中，人们发现CDK13蛋白(cyclin-dependentkinase 13，细胞周期素依赖激酶13)的新发突变与人类先天性心脏缺陷综合症的发病密切相关。在这些发现的儿童患者身上，除了CDK13新发突变以外，并未检测到其他已知与先天性心脏病有关的致病基因突变，所有已发现报道的7例CDK13激酶结构域错义突变(已发现的CDK13基因突变主要位于其激酶催化结构域，通过使CDK13丧失其激酶活性而造成功能缺失)的心脏病患儿中，有2例患心室间隔缺损，5例患有心房间隔缺损。该项研究首次发现了CDK13在心脏发育中的关键作用，CDK13功能缺失会导致心脏发育不全性心脏病。目前，对于CDK13突变导致的DMD缺乏型心肌病，缺乏有效的治疗手段。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACI)，简称HDACIs，是一类化合物，有干扰与组蛋白去乙酰化酶的功能。组蛋白去乙酰化酶抑制剂通常可分为两大类：NAD+-依赖性酶和Zn2+依赖性酶。Zn2+依赖性蛋白酶包括HDACsⅠ、Ⅱ、Ⅳ亚族；NAD+-依赖性酶主要是HDACsⅢ亚族。组蛋白去乙酰化酶抑制剂是有针对性的抗癌药物：组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度，提高p21等基因的表达水平等途径，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞分化和/或凋亡。组蛋白去乙酰化酶抑制剂已成为肿瘤靶向治疗的研究新热点，其对肿瘤细胞迁移、侵袭、转移的抑制作用和抗肿瘤血管生成作用也被证实。目前尚未见到有关组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗心脏病的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了组蛋白去乙酰化酶抑制剂的新用途——在制备治疗CDK13功能缺失相关疾病的药物中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)在制备治疗CDK13功能缺失相关疾病的药物中的应用。
进一步地，所述CDK13功能缺失相关疾病，选自CDK13缺失型心脏病。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗cyclin蛋白功能缺失相关疾病的药物中的应用。
进一步地，所述cyclin蛋白选自cyclin K蛋白。
进一步地，所述cyclin蛋白功能缺失相关疾病，选自cyclin蛋白功能缺失型心脏病。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗抑制异染色质化的药物中的应用。
进一步地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自组蛋白去乙酰化酶抑制剂No.1217，其化学分子式为C24H27N3O4，其结构式如图1所示，标准名称为N-[4-[(羟基氨基)羰基]苯基]氨基甲酸[6-[(二乙基氨基)甲基]-2-萘基]甲酯，CAS编号为497833-27-9，该物质可通过商业途径购买得到。
一种治疗CDK13功能缺失相关疾病的药物组合物，其有效成分包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
一种具有抑制异染色质化的药物组合物，其有效成分包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
进一步地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自组蛋白去乙酰化酶抑制剂No.1217。
进一步地，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体。
在遗传疾病中，如何正确地利用转基因动物模型重现这种疾病一直是困扰该疾病能否继续进行深入研究的瓶颈。虽然有报道基于临床大规模测序找到了CDK13基因突变与心脏病的关系，但仍然缺乏明确的支持证据。针对这一不足，为了研究CDK13与心脏疾病的相关性及作用机制，本发明构建了全身性敲除CDK13和心肌特异性敲除CDK13两种小鼠模型，结果发现CDK13全身性纯合敲除可导致小鼠E13.5天的心脏出现心室间隔缺损的表型，而且这种敲除小鼠在胚胎期死亡。而心肌特异敲除CDK13的小鼠则在成年期死亡且寿命缩短，这与携带CDK13突变成人患者的心脏缺陷表型一致，心脏超声结果显示此类小鼠患有扩张型心肌病和心力衰竭，并且出现心脏栓塞及心脏纤维化。通过基因表达分析发现，心肌敲除CDK13能够导致下游杜氏肌营养不良症(DMD)基因表达和dystrophy蛋白表达下调，明确了CDK13突变可以导致典型的心功能障碍。
本发明特异性地构建了CDK13心肌诱导缺失小鼠模型，明确了CDK13突变的确可以导致心脏功能障碍性心脏病。将临床遗传筛选结果通过转基因小鼠进行了模型再现，成功地模拟了CDK13突变导致心脏功能障碍的模型，为后续疾病发生机理的研究以及针对性药物筛选建立了可靠的动物模型。
针对遗传突变类疾病，一般首选的方法是通过基因治疗直接回补目标基因所丧失的功能，比如，对于因DMD单基因突变造成缺失、重复、重排或突变所引起的罕见病DMD缺失性的肌营养不良，基于重组腺病毒(AAV)载体治疗法回补功能正常的DMD蛋白是最适合DMD功能恢复性治疗的手段。在目前已有的针对DMD治疗AAV血清中，血清型1、6、8、9对于DMD的治疗表现较为良好。而通过全身载体给药的心脏基因传递，AAV9表现为最佳。但是该技术仅针对罕见病DMD缺失性的肌营养不良进行治疗，是否可以特异性靶向心肌尚存疑问，且临床效果是否得当依然未知。
本发明避开了上述常规的治疗思路，首先利用构建的CDK13转基因小鼠，对其调控机制进行了分析，找到了受其调控的特异变化基因，并对基因表达异常的表观遗传机制进行了分析。按照这一思路，本发明找到了心肌细胞功能障碍的原因是DMD基因表达水平下降，进一步研究结果表明DMD下降的原因是其异染色质化水平升高，从而导致了DMD的基因表达水平受到抑制。针对以上的机制研究结果，本发明利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂No.1217对心肌敲除CDK13小鼠进行了药物治疗，结果发现，连续给药一个月后，心肌敲除CDK13小鼠的心功能、心脏纤维化病理进程以及dystrophy蛋白水平本部分逆转，组蛋白去乙酰化酶抑制剂No.1217表现出极好的治疗扩张型心肌病的潜力。
本发明在厘清CDK13调控机制的基础之上，针对其下游异常的表观遗传调控机制进行干预，避开了现有针对遗传疾病进行遗传治疗的常规技术和思路，从通路调控的角度入手，直接寻找CDK13异常导致的心肌细胞功能缺失的效应蛋白，并针对效应蛋白的调控异常进行针对性干预，取得了良好的治疗效果。
针对异染色质异常升高这一表观遗传调控异常调控的干预，有多种思路可以选择，例如DNA甲基转移酶抑制剂、EZH2抑制剂、组蛋白修饰酶抑制剂等等，并且多为小分子化学药物，它们的作用特点是特异性强，通过调控某一种特定的表观遗传修饰来发挥作用。但是，在现有利用异染色质化升高这一表观遗传调控作为干预靶点的技术中，遵循的却是修饰-修饰酶这样类似“锁-钥”关系的直接线索。而本发明避开现有的这种“锁-钥”思路，仅仅针对如何降低CDK13缺失导致异染色质化水平升高这一问题展开试验，通过筛选找到了HDAC抑制剂No.1217潜在作用。组蛋白乙酰化水平的升高可以提高染色质的可接近性，从而拮抗其异染色质化水平，因此理论上抑制组蛋白去乙酰化酶的活性即可抵抗异染色质化。因此，本发明以HDAC抑制剂作为候选小分子药物对CDK13缺陷心肌病小鼠模型的处理既有理论依据，又有实验结果佐证。
本发明虽然是以CDK13转基因小鼠为对象寻找的机制及药物筛选，但事实上CDK13作为cyclin依赖激酶家族的成员，其激酶活性的形成离不开细胞周期素cyclin蛋白与其形成异二聚体来发挥作用，降低其配体周期素蛋白cyclin尤其是cyclin K的水平也有降低CDK13激酶活性的作用，产生类似CDK13蛋白缺失的细胞生理反应。因此，本发明对cyclin蛋白尤其是cyclin K蛋白功能缺失相关的心脏病具有类似的治疗作用。
本发明的实验虽然是靶向CDK13基因突变对心脏病治疗，主要针对的是因为CDK13缺失所导致的异染色质化水平升高这一事实，但也不能排除本发明可适用于其他器官或组织的CDK13缺失综合症，主要依据是CDK13缺失导致的异染色质化水平升高这一现象并不仅限于心脏组织，在多种不同组织或器官特异性降低CDK13的活性均有这一现象发生，本发明也观察到在动物模型的血液系统、面部、头颅、大脑均有这一现象。因此，本发明的实验研究虽然针对的是靶向CDK13治疗心脏病，但其适应范围不排除针对其他疾病，从CDK13缺失导致异染色质化水平升高的这一保守作用机制，提示本发明的治疗方式同样适用于其他CDK13功能缺失相关疾病。
综上所述，本发明的贡献，主要体现在以下几个方面：
1、构建了心肌敲除CDK13的小鼠模型，确认了心肌中CDK13缺失可导致扩张型心肌病和心力衰竭等心脏功能障碍；
2、发现了CDK13通过调控DMD基因表达下调导致心肌病的分子机制；
3、找到了通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂降低CDK13所导致的心肌功能障碍的干预途径；
4、找到了CDK13缺失导致DMD型心肌病的原因，发现CDK13缺失引起心肌细胞功能异常与心肌细胞功能蛋白DMD基因表达降低之间的关系；
5、找到了靶向CDK13治疗心肌病的有效分子和治疗策略。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：Cdk13敲除小鼠模型示意图。
图2：转基因小鼠胚胎心脏的HE染色结构示意图，其中，S370(雌)，S452(雄)，S1150(雄)，S577(雌)为对照鼠；S358(雌)，S1147(雄),S441(雄),S1138(雄)为Cdk13基因敲除鼠。
图3：Mhc-Cre驱动心肌细胞特异性敲除Cdk13小鼠E17.5胚胎心脏结构观察示意图，其中，a.心脏整体成像照片，体视镜4倍物镜拍照。标尺0.5mm；#236-1、#236-4、#236-5为对照鼠；#236-2、#236-3、#236-6为敲除鼠。b.经4％PFA固定、石蜡包埋的心脏组织H&E切片染色，标尺：200μm。
图4：Mhc-Cre驱动心肌细胞特异性敲除Cdk13小鼠出生后P4心脏结构观察示意图，其中，a.上图为心脏整体成像照片，体视镜2倍物镜拍照，#196、#197、#198为对照鼠；#193、#194、#195为敲除鼠，标尺：1mm；下图为经4％PFA固定、石蜡包埋的心脏组织H&E切片染色，标尺：500μm。b.P4小鼠的心脏体重比。。
图5：Mhe-Cre心肌特异敲除Cdk13成年小鼠的生存周期缩短示意图。
图6：Mhc-Cre心肌敲除Cdk13的5月龄成年小鼠心脏功能受损严重示意图，其中，a.心脏超声成像对小鼠心脏室间隔(IVS)，左心室内径(LVID)以及左心室后壁(LVPW)检测结果代表图。b.对5月龄成年小鼠心脏超声结果EF、FS、LVID；s、LVPW；s、LVPS；d、LV mass等数据的统计图。数据检验方法为T检验，ns代表P>0.05.对照组(control)雄鼠4只，敲除组(Mhc-Cre；Cdk13fl/fl)雄鼠9只。
图7：Mhc-Cre心肌敲除Cdk13的8月龄成年小鼠心脏功能受损严重示意图。a.心脏超声成像对小鼠心脏室间隔(IVS)，左心室内径(LVID)以及左心室后壁(LVPW)检测结果代表图。b.对8月龄成年小鼠心脏超声结果EF、FS、LVID；s、LVPW；s、LVPS；d、LV mass等数据的统计图。数据检验方法为T检验，ns代表P>0.05，***代表P<0.001.****代表P<0.0001.对照组(control)6雄5雌11只，敲除组(Mhc-Cre；Cdk13fl/fl)雄鼠5只。
图8：心肌特异性敲除Cdk13小鼠8月龄的心脏大小及心脏体重比无显著变化。a.8月龄小鼠心脏的代表性照片。b.8月龄小鼠心脏体重比的统计结果。数据检验方法为T检验，ns代表P>0.05.对照组(control)8雄5雌13只，敲除组(Mhc-Cre；Cdk13fl/fl)5雄1雌6只。
图9：心肌特影响敲除Cdk13小鼠8月龄心脏结构的石蜡包埋切片观察示意图。结果显示心室腔变大心室壁变薄。体视镜2×物镜拍照。标尺2mm。对照组(control)5雄2雌7只，敲除组(Mhc-Cre；Cdk13fl/fl)6雄1雌7只。
图10：心肌特异性敲除Cdk13的8月龄小鼠出现大量成纤维细胞型心脏栓塞示意图，其中，上图为8月龄Cdk13敲除小鼠心脏的HE染色，黑色虚线圈出为栓塞，最右侧为栓塞的部分放大图。标尺200μm。a.为石蜡包埋心脏组织的免疫荧光染色结果图，红色为成纤维细胞标志VIM，绿色为pH3染色，蓝色为DAPI染色。b.绿色为激活成纤维细胞标志物α-SMA，红色为pH3染色，蓝色为DAPI染色。c.绿色为心肌细胞标志物cTnT，红色为pH3染色，蓝色为DAPI染色。其中abc所染色的组织来源为同一只小鼠的心脏栓塞部位。
图11：8月龄Cdk13敲除鼠的心脏组织Masson染色示意图，其中，a.心脏组织的染色结果，上排红色为心肌细胞，蓝色为心肌组织纤维化。b.小鼠心脏纤维化面积占比统计结果，通过photopshop将心脏组织中蓝色区域勾选出来计算纤维化面积，再除以总面积得出数值。数据用T检验，***表示P<0.001，对照组(control)鼠5雄2雌7只，Mhc-Cre；Cdk13fl/fl鼠6雄1雌7只。
图12：心肌细胞特异敲除Cdk13的7月龄小鼠心脏成纤维细胞的免疫荧光染色分析示意图，其中，a.绿色荧光为激活成纤维细胞标志物α-SMA免疫染色观察，蓝色荧光为DAPI染色观察细胞核，同一视野下的双荧光重叠观察为merge。标尺为20μm。b.α-SMA阳性染色细胞的比例统计结果。数据分析为T检验，*表示P<0.05.n＝3，4只雄性小鼠。
图13：心肌特异敲除Cdk13基因小鼠心脏细胞的RNA转录分析示意图，其中，上图为差异基因的散点图和火山图展示，与对照相比3.5月龄心肌特异敲除Cdk13基因小鼠的心脏中上调基因和下调基因分别用红点和蓝点表示。中间图为差异基因的GO通路分析，红色为上调基因，蓝色为下调基因。下图为心肌重塑相关基因的qPCR验证。
图14：心肌特异性敲除Cdk13心脏的Dmd基因表达下调示意图，其中，A.qPCR验证3月龄Mhc-Cre；Cdk13fl/fl小鼠中的Dmd基因表达，N＝2。B.免疫荧光染色检测4月龄Mhc-Cre；Cdk13fl/fl小鼠心脏中Dmd蛋白的表达水平。a.为免疫荧光染色拍照，红色荧光为Dmd，绿色荧光为cTnT，蓝色荧光为DAPI染色细胞核，merge表示三色荧光的重叠照片。b.Dmd蛋白免疫荧光染色的统计分析结果。数据检验方法为T检验，****表示P<0.0001，n＝3，均为雌鼠。C.免疫荧光染色检测7月龄Mhc-Cre；Cdk13fl/fl小鼠心脏中Dmd蛋白的表达水平。a.为免疫荧光染色拍照，红色荧光为Dmd，绿色荧光为cTnT，蓝色荧光为DAPI染色细胞核，merge表示三色荧光的重叠照片。b.Dmd蛋白免疫荧光染色的统计分析结果。数据检验方法为T检验，****表示P<0.0001，n＝3，均为雄鼠。
图15：小分子药物No.1217对心肌敲除Cdk13小鼠心脏功能的作用分析示意图。取6月龄的Cdk13心肌特异性敲除小鼠连续腹腔注射小分子药物No.1217(10mg/kg/day)至7月龄后进行心脏超声检测。a.心脏超声进行心功能IVS，LVID以及LVPW分析。b.经1个月药物治疗后，对小鼠心脏超声检查的EF、FS、LVID；s、LVPW；s、LVPW；d、LV mass等数据进行统计。其中control CON表示对照组小鼠经安慰剂注射，3雄2雌5只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/fl CON表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经安慰剂注射，2雄2雌4只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/flNO.1217表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经No.1217小分子药物注射，2雄2雌4只小鼠。数据检验方法为T检验，ns表示p>0.05，*表示p<0.05，**表示p<0.01.
图16：心肌特异性敲除Cdk13小鼠经药物处理1个月后的心脏大小及心脏体重比分析示意图，其中，a.经1个月药物治疗的7月龄小鼠心脏成像照片。b.经1个月小分子药物治疗的8月龄小鼠心脏体重比的统计结果。其中control CON表示对照组小鼠经安慰剂注射，3雄2雌5只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/fl CON表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经安慰剂注射，2雄2雌4只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/fl NO.1217表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经No.1217小分子药物注射，2雄2雌4只小鼠。数据检验方法为T检验，ns表示p>0.05。
图17：心肌特异性敲除Cdk13小鼠经药物处理1个月后的心脏纤维化情况分析示意图，其中，a.经1个月药物治疗的小鼠心脏切片和Masson染色照片，红色为心肌，蓝色为心肌纤维化。b.经1个月小分子药物治疗的8月龄小鼠心脏纤维化的统计结果。其中control CON表示对照组小鼠经安慰剂注射，3雄2雌5只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/fl CON表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经安慰剂注射，2雄2雌4只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/fl NO.1217表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经No.1217小分子药物注射，2雄2雌4只小鼠。数据检验方法为T检验，ns表示p>0.05，*表示p<0.05。
图18：心肌特异性敲除Cdk13小鼠经药物处理1个月后的心肌Dmd蛋白水平分析示意图，其中，a.经1个月药物治疗的小鼠心脏切片Dmd和cTnT免疫荧光染色照片，红色为Dmd，绿色为cTnT，蓝色为DAPI。b.经1个月小分子药物治疗小鼠心脏Dmd蛋白表达水平的统计结果。其中control CON表示对照组小鼠经安慰剂注射，3雄2雌5只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/flCON表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经安慰剂注射，2雄2雌4只小鼠；Mhc-Cre；Cdk13fl/flNO.1217表示Cdk13心肌特异敲除小鼠经No.1217小分子药物注射，2雄2雌4只小鼠。数据检验方法为T检验，**表示p<0.01，****表示p<0.0001。
图19：No.1217的化学结构式。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实验1CDK13心肌诱导缺失小鼠模型的构建与研究
(1)CDK13敲除小鼠模型构建：CDK13基因外显子3(exon3)和外显子4(exon4)在不同CDK13 mRNA的剪切产物中都有保留，而且其对应是CDK13蛋白的激酶结构域，exon3和exon4的缺失会造成基因的阅读框移码突变，从而导致基因完全失活。如图1所示(利用FLP-FRT重组，把两个FRT位点之间的neo和lacZ序列除去，切除后的LoxP位点由3个减少到2个；再利用Cre-LoxP重组系统，CDK13基因的exon3和exon4被除去)，首先通过转基因技术在exon3和exon4两侧插入两个LoxP位点。利用CDK13fl/fl小鼠与生殖细胞中表达Cre重组酶Ddx4-Cre的小鼠交配获得Ddx4-Cre；Cdk13+/fl小鼠，该小鼠生殖细胞在Cdk13基因两个LoxP位点之间的exon3和exon4被Cre-LoxP重组系统敲除，获得缺失两个外显子的配子。Ddx4-Cre；Cdk13+/fl小鼠与Cdk13+/+交配后得到Cdk13+/-小鼠子代，而Cdk13+/-小鼠相互交配后便得到纯合敲除小鼠Cdk13-/-子代，所得小鼠所有细胞中的CDK13表达均被敲除。
(2)CDK13纯合敲除影响小鼠胚胎心脏结构及存活能力：选择胚胎发育第13.5天，处死孕鼠后于冰上从子宫中取出胚胎，置于冰上用PBS清洗后用4％PFA固定胚胎过夜，次日进行石蜡包埋。随后通过对转基因小鼠胚胎心脏进行苏木素-伊红(HE)染色观察(图2)，发现Cdk13敲除小鼠的胚胎心脏(Cdk13-/-)都具有严重的心室间隔缺损现象。结果显示，纯合敲除Cdk13的小鼠在胚胎期E13.5天之前致死，无任何后代小鼠出生。
(3)利用Cdk13fl/fl小鼠与表达myosin heavy chain 6-Cre(Mhc-Cre)的小鼠交配最终获得在心肌细胞特异性敲除Cdk13的小鼠(Mhc-Cre；Cdk13fl/fl)：利用Cdk13和Cre的引物，对子代胚胎的基因组DNA进行PCR鉴定，通过对DNA产物的电泳谱带进行分析，筛选出子代中心肌特异性敲除Cdk13个体Mhc-Cre；Cdk13fl/fl胚胎进行分析，并对E17.5天胚胎心脏的结构进行观察，随后通过石蜡包埋切片后进行HE染色分析(图3a、b)。结果显示心肌特异敲除CDK13的小鼠E17.5天胚胎心脏结构正常，心室间隔完好无损，并且心肌敲除Cdk13的子代小鼠可出生并正常生存。
(4)心肌敲除Cdk13小鼠的生存能力下降，寿命缩短：虽然心肌敲除Cdk13小鼠可正常出生并且正常发育至成年，但是通过寿命观察发现(图4、图5)，与对照小鼠相比，它们的存活时间仅8～10个月时间，与临床所见的成年心脏病寿命缩短类似。
解剖前测得各只小鼠的体重，解剖后再对各只小鼠的心脏进行称重，计算心脏体重比并进行T检验，结果如图4所示。
取18只对照鼠(9雌9雄)和17只Cdk13心肌敲除鼠(8雄9雌)进行培养观察其存活时间，绘制生存曲线(如图5所示)，观察时间从出生第1天开始到第392天结束。Mhc-Cre；Cdk13fl/fl小鼠首次死亡时间为174天，最后一只死亡为303天。对照组只有1只死亡，在第208天，其余17只截止观察结束都存活。
(5)利用心脏超声检查，对CDK13心肌缺陷小鼠的心脏功能进行了检查(图6，图7)。结果表明，在小鼠出生5个月内，心肌敲除CDK13不会引起小鼠心功能显著差异。以心脏收缩末期左心室为指标的心室腔和以左心室后壁为指标的心室壁君无差异，基因缺陷小鼠EF和FS所代表的心脏搏血能力无明显差异，LVID；s指标所代表的心脏腔室大小也没有明显变化，LVPW；s、LVPW；d为代表的心室壁厚度也无变化。综合指标显示心肌CDK13缺失在小鼠5月龄时未出现心脏衰竭和扩张型心肌病。
(6)心肌CDK13缺陷小鼠从6月龄时开始死亡，到9个月时死亡殆尽，6～9月龄的CDK13缺陷小鼠表现出急性心脏功能障碍。通过检测8月龄的基因缺陷小鼠(图8，图9)，发现心肌CDK13缺陷小鼠的心室壁变薄、心室腔变大，心脏搏血能力显著降低。综合指标显示CDK13心肌敲除小鼠心脏出现了严重的心力衰竭和扩张型心肌病，是导致转基因小鼠死亡的直接原因。
(7)CDK13心肌缺陷小鼠的心房中出现病理性栓塞组织(图10，图12)，而且栓塞发生的共同位置为心脏左心房，占据了左心房的大部分空间，因此CDK13缺陷小鼠死亡的原因之一是心脏栓塞导致心脏血液流动降低加剧心力衰竭。利用组织细胞免疫染色，发现栓塞组织的细胞成分并不是心肌细胞，而是成纤维细胞，并且有一部分细胞仍处于增殖分裂状态。
(8)CDK13心肌特异性敲除小鼠心脏发生纤维化：除了心室腔成纤维细胞性心脏栓塞形成，心肌组织的纤维化程度也显著升高，CDK13缺陷心肌小鼠心脏组织胶原面积比心机面积相对于对照小鼠显著性增高(图11，图12)，小鼠发生明显的心肌组织纤维化。心肌成纤维细胞增殖活性增加，其细胞激活的标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平升高，成纤维细胞分泌的细胞外基质成分vimentin蛋白水平也显著升高。这些结果都表明，CDK13心肌缺失心脏在8月龄时其心脏心肌功能受损，成纤维细胞激活来弥补缺失组织，从而导致心脏栓塞形成、心肌组织纤维化程度增加，最终导致心力衰竭和扩张型心肌病而死亡。
(9)通过对CDK13心肌特异性缺失小鼠的心脏进行基因表达分析发现(图13)，有159个基因表达下调，208个基因表达上调。其中上调基因集中在细胞迁移、肌肉系统形成以及细胞外基质结构相关通路。其中的上调表达基因如Myh7、acta1、Nppa和Nppb基因是典型的心肌重塑相关的基因，结果表明成纤维细胞的激活导致的心肌重塑是CDK13缺失的细胞病理机制。
(10)在心肌缺失CDK13的心脏组织中，心肌特异性基因杜氏营养不良蛋白DMD表达的显著下调。在3.5月龄的基因表达分析中(图14)，Dmd基因的log2FoldChange＝-1.6713，荧光定量PCR进一步检测确认其表达水平下降了70％。在4月龄的心肌组织中Dmd蛋白的免疫荧光染色也显示了显著下调，到7月龄时，Dmd水平的下降进一步加剧，免疫荧光几乎检测不到其表达，这也与前期观察到的6月龄以后小鼠死亡率快速增加相一致。
实验2对CDK13心肌缺陷小鼠的治疗研究
针对CDK13缺陷导致DMD蛋白表达下调与心脏功能退行性病变这一现象，本发明选择小分子药物No.1217进行治疗。选择三组小鼠进行药物作用验证：①对照组为野生型小鼠，以药物溶剂组DMSO处理；②心脏特异性敲除Cdk13小鼠以药物溶剂DMSO处理；③心脏特异性敲除Cdk13小鼠以No.1217处理。其中No.1217药物处理浓度为10mg/kg体重/day，连续给药处理30天。
对CDK13心肌缺陷6月龄小鼠进行药物治疗30天后，对小鼠进行心脏功能超声检测，评价药物处理对Cdk13缺陷小鼠心脏功能恢复的作用，并对完成治疗的小鼠心脏进行解剖分析，比较治疗前后Cdk13缺陷小鼠心肌纤维化、心室壁厚度、心脏栓塞、心肌细胞Dmd基因表达及蛋白水平的改变，并对所得数据进行分析。结果发现，No.1217连续注射1个月以后(图15，图16)，通过心脏超声检测发现小鼠心脏泵血能力有上升趋势，心脏腔室也出现一定的逆转趋势。
对心脏组织马松染色发现(图17)No.1217处理可以部分逆转CDK13缺失所导致的心肌组织纤维化的积累。与未给药组相比，NO.1217处理组小鼠的心脏纤维化水平明显下降，接近对照组的水平。
对心脏组织的免疫组织化学检测发现(图18)No.1217处理可以部分逆转CDK13缺失所导致的DMD蛋白水平的下降。与未给药组相比，NO.1217处理组小鼠的心脏的DMD蛋白水平有升高趋势，心肌数量显著性升高。
通过以上实验可以看出，No.1217可以缓解并治疗Cdk13缺陷导致的心脏功能损伤。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗CDK13功能缺失相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CDK13功能缺失相关疾病，选自CDK13缺失型心脏病。
3.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗cyclin蛋白功能缺失相关疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述cyclin蛋白选自cyclin K蛋白。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述cyclin蛋白功能缺失相关疾病，选自cyclin蛋白功能缺失型心脏病。
6.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗抑制异染色质化的药物中的应用。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的应用，其特征在于：所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自N-[4-[(羟基氨基)羰基]苯基]氨基甲酸[6-[(二乙基氨基)甲基]-2-萘基]甲酯，其分子式为C24H27N3O4。
8.一种治疗CDK13功能缺失相关疾病的药物组合物，其有效成分包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
9.一种具有抑制异染色质化的药物组合物，其有效成分包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于：所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自N-[4-[(羟基氨基)羰基]苯基]氨基甲酸[6-[(二乙基氨基)甲基]-2-萘基]甲酯，其分子式为C24H27N3O4。
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