CN114288401B - 抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗领域，特别涉及抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒。本发明提供了SAG13和/或SAG14在制备预防和/或治疗斯氏艾美耳球虫感染疾病的疫苗中的应用。重组SAG13和SAG14安全性高，能不同程度地减少或减轻临床症状、减少增重损失、减少卵囊排出和减轻肝脏病变。

Description

抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒

技术领域

本发明涉及疫苗领域，特别涉及抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒。

背景技术

斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedae)是危害家兔的优势虫种之一，主要危害断奶后至3月龄的幼兔，常引起严重的肝脏病变和功能障碍，甚至造成死亡，给养兔业造成重大的经济损失。目前兔球虫病的防治主要依赖抗球虫药物，但球虫耐药性、药物在兔产品中的残留以及药物的环境污染等问题日趋严重，因此迫切需要开展防控技术研究。

兔球虫疫苗研究主要集中在活虫苗，尤其是早熟弱毒苗上，已成功选育多种兔球虫的早熟株，在此基础上开展了多种早熟株混合免疫的研究，但目前尚无商业化生产的兔球虫疫苗。相比于活虫苗，基因重组亚单位疫苗具有安全稳定、易于大规模生产及成本相对较低等优势。球虫生活史复杂，不同发育阶段抗原构成和分布不一致，其内生发育早期比后期有性繁殖阶段具有更强的免疫原性。艾美耳球虫表面抗原家族(Surface antigens，SAGs)位于侵袭期虫体表面，结构特点明显且家族庞大。在鸡球虫基因重组亚单位疫苗的研究中，原核表达的艾美耳球虫SAGs能够有效减轻肠道病变，降低体重损失，显示出一定的免疫保护效果。

兔球虫病疫苗研究起步较晚，相对滞后。强毒苗是开发兔球虫疫苗最初的尝试，研究者用黄艾美耳球虫活虫苗加倍递增剂量免疫无球虫兔，取得了良好的免疫保护效果。强毒苗由于其较高的致病风险和较复杂的免疫程序并未得到应用，相比之下，早熟弱毒苗因其低致病性、强免疫原性而备受期待。大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、梨形艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、肠艾美耳球虫等兔球虫早熟株已成功选育，方素芳等用不同剂量的大型艾美耳球虫早熟株、肠艾美耳球虫早熟株和中型艾美耳球虫早熟株混合卵囊免疫家兔，用其相应亲本株的混合卵囊进行攻虫，发现免疫组接种后均未出现临床症状，日增重与未免疫未攻虫对照组相似，卵囊产量与未免疫攻虫对照组相比有显著差异，表明早熟弱毒苗具有很好的免疫保护效果。相比于活虫苗，基因重组亚单位疫苗安全性更好，更有利于工业化生产。孟庆玲构建了斯氏艾美耳球虫微线蛋白5(MIC-5)和兔IL-15重组载体并在真核细胞中成功共表达，进而制备携带MIC-5的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗，接种该疫苗后幼兔无不良反应，相对增重率达84.4％，显示出具有良好的安全性和一定的保护作用。

研究者发现用斯氏艾美耳球虫感染兔的胆汁抗原和粪便抗原免疫兔后均能引起兔卵囊排出减少，显示出一定的保护作用；且这两种可溶性抗原中的主要抗原分子均由裂殖生殖阶段分泌。顶复门原虫的入侵是虫体和宿主细胞相互作用的结果，通过糖基化磷脂酰肌醇锚定在侵袭期虫体表面的SAGs能够非特异性地黏附宿主细胞，启动入侵，同样SAGs也能直接接触宿主的免疫系统，刺激宿主作出免疫应答，因此，SAGs被认为是重要的保护性抗原候选。顶复门原虫SAGs存在表达上的时序性，弓形虫SAG1和SAG2是速殖子阶段特异性抗原，SAG4是缓殖子阶段特异性抗原，而SAG3在速殖子和缓殖子阶段均存在；在柔嫩艾美耳球虫中，SAG1属于子孢子特异性抗原，SAG16、SAG22和SAG23在子孢子和裂殖生殖阶段均存在，其余的SAGs属于裂殖生殖阶段特异性抗原。

研究报道鸡柔嫩艾美耳球虫SAG1及巨型艾美耳球虫EmSAG的原核表达产物免疫鸡后卵囊减少率分别达83.42％、75.93％，相对增重率分别达90.3％、86.3％。

然而目前尚未有一种SAG已被报道能够用于斯氏艾美耳球虫疫苗研发。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒。该应用可以为疫苗研发提供参考。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了SAG13和/或SAG14在制备预防和/或治疗斯氏艾美耳球虫感染疾病的疫苗中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，上述预防和/或治疗包括减少或减轻由斯氏艾美耳球虫引起的病症。

在本发明的一些具体实施方案中，上述SAG13和/或SAG14能够减少增重损失、卵囊排出或减轻肝脏病变中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，上述疫苗用于家兔。

本发明还提供了一种疫苗，其抗原蛋白包括SAG13和/或SAG14。

在本发明的一些具体实施方案中，上述疫苗包括皂甙Quil A等其他抗原成分。

在本发明的一些具体实施方案中，上述疫苗所包括的药学上可接受的辅料，为氢氧化铝、矿物油、吐温-80、弗氏佐剂、胞苷酸或脂质体。

本发明还提供了扩增SAG13的引物组，其包括：

(I)上游引物具有如SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列或其互补序列；和/或

(II)下游引物具有如SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列或其互补序列；和/或

(III)与(I)或(II)的核苷酸序列所编码的蛋白质相同，但因遗传密码的简并性而与(I)或(II)的核苷酸序列不同的序列；和/或

(IV)与(I)或(II)或(III)所述序列的同源性达90％以上的序列；和/或

(V)如(I)或(II)或(III)或(IV)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)或(II)或(III)或(IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明还提供了扩增SAG14的引物组，包括：

(VI)上游引物具有如SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列或其互补序列；和/或

(VII)下游引物具有如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列或其互补序列；和/或

(VIII)与(VI)或(VII)的核苷酸序列所编码的蛋白质相同，但因遗传密码的简并性而与(VI)或(VII)的核苷酸序列不同的序列；和/或

(IX)与(VI)或(VII)或(VIII)所述序列的同源性达90％以上的序列；和/或

(X)如(VI)或(VII)或(VIII)或(IX)所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(VI)或(VII)或(VIII)或(IX)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的引物组的核苷酸序列与上述引物组的核苷酸序列的同源性为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰为成倍扩增。

在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。

在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的缺失为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。

在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基。

本发明还提供了包括上述引物组在制备扩增或检测SAG13和/或SAG14的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种试剂盒，包括上述引物组，以及可接受的辅料或助剂。

本发明的抗原蛋白的应用有如下效果：

(1)rEs-SAG13和rEs-SAG14均能识别阳性兔血清，具有良好的免疫反应性。

(2)用rEs-SAG13和rEs-SAG14初次免疫、二次加强免疫后实验动物并未出现明显不良反应，说明rEs-SAG13和rEs-SAG14重组蛋白具有良好的安全性。

(3)攻虫阳性对照组出现兔肝球虫病典型症状：食欲减退、精神沉郁、喜卧；消瘦、腹泻偶有便秘；可视黏膜黄染、腹围增大、肝区触诊敏感；而rEs-SAG13免疫组和rEs-SAG14免疫组兔肝球虫病临床症状不明显，偶有食欲稍减退，可视黏膜轻度黄染，腹围略有增大。rEs-SAG13和rEs-SAG14能减轻临床症状。

(4)卵囊排出量试验结果表明攻虫对照组平均OPG达1.83×106，而rEs-SAG13免疫组和rEs-SAG14免疫组的平均OPG与攻虫对照组相比均显著减少，分别为3.15×105(P＜0.01)和8.84×105(P＜0.05)。rEs-SAG13免疫组和rEs-SAG14免疫组的卵囊减少率分别达82.8％和51.9％。rEs-SAG13和rEs-SAG14能减少卵囊排出量。

(5)增重评估结果显示攻虫对照组的平均增重显著低于免疫组和空白对照组(P＜0.05)，相对增重率仅为空白对照的39.08％，感染后14d-21d个别试验兔体重出现负增长；rEs-SAG13免疫组平均增重与空白对照无显著差异(P＞0.05)，相对增重率达88.77％；rEs-SAG14免疫组平均增重与空白对照差异明显(P＜0.05)，相对增重率为67.48％。rEs-SAG13和rEs-SAG14能减少增重损失。

(6)料肉比评估结果显示攻虫对照组自感染起到感染后21d的料肉比达9.67:1，而空白对照组料肉比为3.78:1，rEs-SAG13免疫组料肉比为4.26:1，rEs-SAG14免疫组料肉比为5.60:1。rEs-SAG13和rEs-SAG14能减缓料肉比的增加。

(7)肝指数评估结果表明攻虫对照组的平均肝指数达6.66，而空白对照组平均肝指数为3.44，rEs-SAG13免疫组平均肝指数为4.52较攻虫对照组差异显著(P＜0.05)，rEs-SAG14免疫组平均肝指数为5.27。肝脏病变评分结果显示攻虫对照组平均病变记分为4.2，rEs-SAG13免疫组平均病变记分为2.7，较攻虫对照组差异极显著(P＜0.01)，rEs-SAG14免疫组平均病变记分为3.7，较攻虫对照组差异不显著(P＞0.05)rEs-SAG13和rEs-SAG14能减轻肝脏病变。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示Es-SAGs在斯氏艾美耳球虫不同的发育阶段的转录水平；其中，第一行依次示SAG1、SAG3、SAG6、SAG9；第二行依次示SAG10、SAG12、SAG13、SAG14；W为未孢子化卵囊；B为孢子化卵囊；M为裂殖生殖阶段虫体；G为配子生殖阶段虫体；

图2示Es-SAG13、Es-SAG14基因克隆片段的凝胶电泳检测结果；其中，左图示Es-SAG13；右图示Es-SAG14；M为DNA分子质量标准DL2000；泳道1为Es-SAG13；泳道2为Es-SAG14；

图3示rEs-SAG13和rEs-SAG14的原核表达和可溶性分析：M为蛋白质分子质量标准；泳道1、2均为rEs-SAG13上清；泳道3为rEs-SAG13包涵体；泳道4、5均为rEs-SAG14上清；泳道6为rEs-SAG14包涵体；

图4示rEs-SAG13和rEs-SAG14的纯化效果；其中，左图示rEs-SAG13；右图示rEs-SAG14；M为蛋白质分子质量标准；泳道1、2分别为rEs-SAG13和rEs-SAG14纯化产物；

图5示rEs-SAG13和rEs-SAG14的免疫印迹分析：M为蛋白质分子质量标准；泳道1、2分别为rEs-SAG13和rEs-SAG14表达产物；

图6示各组兔子的肝脏剖检图：A为空白对照组；B为攻虫对照组；C为rEs-SAG13免疫组；D为rEs-SAG14免疫组。

具体实施方式

本发明公开了一种抗原蛋白、制备方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本研究通过结合斯氏艾美耳球虫表面抗原SAGs不同发育阶段转录水平和生物信息学分析，筛选出裂殖生殖阶段特异性表达的SAGs，然后进行原核表达并研究重组蛋白的免疫保护效果，为兔斯氏艾美耳球虫基因重组亚单位疫苗的研制提供参考。在本次实验中我们发现Es-SAG13和Es-SAG14属于斯氏艾美耳球虫裂殖生殖阶段特异性抗原，在免疫保护试验中能大幅度减少卵囊排出量，rEs-SAG13免疫组和rEs-SAG14免疫组的卵囊减少率分别达82.8％和51.9％；另外免疫组均能不同程度减少增重损失，相对增重率分别为88.77％、67.48％。同时，攻虫对照组的肝脏病理变化也十分典型，肝脏高度肿胀，表面充满沿胆小管分布的黄白色结节；其中rEs-SAG13免疫能明显减轻这种肝脏病理变化，其肝脏病变记分显著低于攻虫对照组(P＜0.01)，与鸡的巨型艾美耳球虫EmSAG的原核表达产物免疫鸡后显著降低平均病变评分的结果相类似。因此，免疫保护试验结果初步表明rEs-SAG可作为斯氏艾美耳球虫基因重组亚单位疫苗的候选抗原。

材料：

本发明提供的虫株及其应用中的原材料及试剂均可由市场购得。

试验动物与虫株：4只2月龄及40只45日龄无球虫新西兰幼兔由四川农业大学动物寄生虫病研究中心繁殖提供。兔笼、食具等经烘烤，饲料经高温干燥，饮水中加入抗球虫药。未添加抗球虫药的饲料委托某兔料厂专门生产提供，人工感染前3d开始使用。试验所用虫株为斯氏艾美耳球虫SC分离株，由四川农业大学动物寄生虫病研究中心保存。

主要试剂与仪器：RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR预混液、限制性内切酶(BAMHI和ECORI)、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pMD19-T Vector、质粒小提试剂盒、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒、DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞，购自天根生化科技(北京)有限公司；HRP标记羊抗兔IgG抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；原核表达载体pET32a(+)购自Invitrogen公司；Quil A(皂素)购自Sigma公司；引物合成和菌液测序由上海生工生物工程有限公司进行。PCR仪：Mastercycler Gradient，eppendorf，美国；荧光定量PCR仪：96，Roche，瑞士；中高压层析系统：NGCTM10，Bio-Rad，美国；McMaster计数板，日本富士平工业株式会社。

主要生物信息学数据库：

NCBI(GenBank)数据库：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/；

信号肽及跨膜区预测：http://www.cbs.dtu.dk/Services；

GPI锚定位点预测：http://gpcr.biocomp.unibo.it/predgpi/；

B细胞线性表位预测：http://tools.immuneepitope.org/bcell/。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：斯氏艾美耳球虫SAGs生物信息学分析及不同发育阶段转录水平分析

1、斯氏艾美耳球虫SAGs生物信息学分析

利用NCBI(GenBank)和转录组数据鉴定出斯氏艾美耳球虫的SAG基因序列共计8条。利用生物信息学软件对Es-SAGs氨基酸序列进行分析。利用TMHMM-2.0预测是否含有跨膜区。利用SignalP预测是否含有信号肽。利用PredGPI预测是否含GPI锚定位点。利用IEDB预测B细胞抗原表位。

克隆测序得到的8条Es-SAGs序列，经生物信息学分析发现：Es-SAGs均含有C端GPI锚定位点，均无跨膜区且除SAG9和SAG12外均无信号肽；另抗原表位预测发现Es-SAGs均有较多B细胞线性表位(表1)。

表1 Es-SAGs生物信息学分析和表位预测

2、斯氏艾美耳球虫四个生长阶段的虫体收集、总RNA的提取和反转录

以8×10⁴个卵囊/只的剂量经口感染2月龄无球虫幼兔4只，分别于感染后10d收集裂殖生殖阶段虫体，感染后13d收集配子生殖阶段虫体，感染后28d收集未孢子化卵囊，于液氮中保存。同时将收集的部分未孢子化卵囊孢子化培养，置于4℃保存。取适量各阶段虫体用RNA抽提试剂盒进行RNA抽提，产物保存于-80℃超低温冰箱；取适量各阶段虫体总RNA，用反转录试剂盒在PCR仪上进行反转录，产物cDNA于-80℃超低温冰箱保存。

3、qRT-PCR引物设计和反应

根据Es-SAGs基因序列设计特异性qRT-PCR引物并参考GenBank中公布的Es-18SrRNA(HQ173837.1)基因序列结合转录组数据库中的Es-β-Actin、Es-GAPDH的基因序列设计内参基因的特异性qRT-PCR引物如表2所示。目的基因相对表达量采用2^-△△Ct方法计算。以E.stiedai未孢子化卵囊、孢子化卵囊、裂殖生殖阶段虫体和配子生殖阶段虫体的cDNA为模板，对8个Es-SAG基因进行qRT-PCR扩增，用Es-18S、Es-β-Actin、Es-GAPDH作为内参基因进行综合分析。反应体系为12.5μL SYBR Premix Ex TaqMix 2×，1μL上游引物(10mmol·L^-1)，1μL下游引物(10mmol·L^-1)，2μL cDNA，8.5μL ddH2O，共计25μL，反应条件见表3。

表2 qRT-PCR引物

表3 qRT-PCR反应条件

结果发现Es-SAG基因的转录水平在各个阶段存在差异，其中Es-SAG13、Es-SAG14在裂殖生殖阶段表达高于其他阶段，且差异极其显著(P＜0.001)(图1，表4)。

表4 Es-SAGs在不同发育阶段的相对转录水平

实施例2：Es-SAG13、Es-SAG14原核表达、纯化和免疫印迹分析

1、rEs-SAG13和rEs-SAG14的表达与纯化

结合荧光定量PCR的结果筛选出Es-SAG13、Es-SAG14，用Primer Premier 5.0软件设计含限制性酶切位点的引物(SAG13上游5’-CGGGATCCATGAACGCGGCTCGAGCC-3’BAMHI，即SEQ ID No.23；下游5’-CGGAATTCTTACAAGAGTGAATACACGAGAGGGG-3’ECORI，即SEQ IDNo.24；SAG14上游5’-CGGGATCCATGGGAGAGGAATCCGG-3’BAMHI，即SEQ ID No.25；下游5’-CGGAATTCCTAAAATCCGCCCTGGT-3’ECORI，即SEQ ID No.26)进行PCR扩增。将目的条带与pMD19-T载体连接，以测序结果正确的重组质粒为模板再次进行PCR扩增，所得产物和pET32a(+)质粒共同双酶切、T4连接后转入表达感受态BL21(DE3)中，培养阳性菌至菌液OD₅₉₀至0.6后，加入1.0mmol/L IPTG，37℃诱导表达8h(110r/min)；菌液7000r/min离心10min后，于菌体沉淀中加入裂解液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0)重悬菌体，反复冻融3次后超声破碎。取上清和尿素溶解的沉淀进行SDS-PAGE判断原核表达重组蛋白的可溶性。用镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白，并将纯化后的重组蛋白用PBS进行透析，SDS-PAGE分析效果。

根据使用说明进行如下纯化步骤：

a.Ni2+亲和层析柱从4℃冰箱拿出，让其温度升至室温。

b.机器清洗。A、B泵接入去离子水中，流速5mL/min开始清洗仪器直到A280基线维持稳定。

c.上柱。系统流速调为1mL/min，拧松亲和层析柱的旋钮接入层析系统，上柱后流速调整到3mL/min，继续用去离子水清洗直到A280基线维持稳定(至少5个柱体积)。

d.平衡层析柱。A、B泵接入Binding Buffer中，流速3mL/min开始平衡层析柱直到A280基线维持稳定(至少5个柱体积)。

e.平衡后即可将蛋白样品注入上样环中，流速1.5mL/min开始上样。

f.洗脱。上样完成后，将B泵换入Elution Buffer中，调整B泵的比例(即不同的咪唑浓度)，流速调为2mL/min开始梯度洗脱(13％、25％、50％、100％)，此时出现洗脱峰即为目的蛋白，收集蛋白保存。

g.清洗层析柱。使用浓度400mM的咪唑，流速3mL/min清洗层析柱至A280基线维持稳定(约4个柱体积)；换Binding Buffer，流速3mL/min清洗层析柱至A280基线维持稳定(至少5个柱体积)；再使用去离子水，流速3mL/min清洗层析柱至A280基线维持稳定，离子浓度降为0；最后换提前预冷的20％酒精，流速3mL/min清洗层析柱。

层析柱及仪器维护。层析柱中充满20％酒精后即可取下，继续使用20％酒精冲洗仪器后，即可关闭系统。

结果：

用含限制性酶切位点的引物扩增出的Es-SAG13、Es-SAG14如图2所示。

两个重组蛋白在诱导剂IPTG终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导表达8h(110r/min)的条件下成功表达(rEs-SAG13、rEs-SAG14大小分别在51KDa和37KDa左右)，且大部分表达在上清，呈可溶性表达(图3)。两重组蛋白经镍离子亲和层析后的纯化效果良好，无明显杂条带(图4)。

2、rEs-SAG13和rEs-SAG14的反应原性分析

以1:200稀释的斯氏艾美耳球虫阳性兔血清为一抗，1:1000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，按常规方法进行免疫印迹分析。

结果显示rEs-SAG13和rEs-SAG14均能识别阳性兔血清(图5)，具有良好的免疫反应性。

实施例3：斯氏艾美耳球虫rEs-SAG13、rEs-SAG14免疫保护效果观察

40只45日龄的无肝球虫幼兔分组和免疫程序如表5所示：

表5试验动物分组和免疫程序

对实验结果进行评价。评价指标如下：

安全性观察：初次免疫、二次免疫和攻虫时称量体重，免疫后观察所有试验兔的健康状况。

感染后观察各组精神状态、饮食欲、腹围、肝区敏感度、眼结膜色泽等；若出现死亡，记录死亡时间并剖检；每隔7d记录一次体重，于感染后第21d剖杀所有试验兔，观察肝脏病变并记分，测定肝指数、相对增重率、料肉比等。参考最新公布的动物球虫病诊断技术国家标准(GB/T 18647-2020)，剖检时收集适量直肠粪样进行卵囊排出量的定量检查，统计各组平均每克粪便卵囊数(oocyst per gram，OPG)，并计算卵囊减少率。

肝指数＝肝重/体重×100％；

相对增重率＝试验组平均增重/对照组平均增重×100％；

料肉比＝(饲喂前饲料总量-剖杀后剩余饲料总量)/感染后增重总量；

卵囊减少率＝(攻虫对照组OPG﹣免疫组OPG)/攻虫对照组OPG×100％；

病变记分参考Peeters等提出的5分制：0分为无病变；1分表示表面有1～10个粟粒状结节；2分表示表面有11～50个豆状结节或部分融合为泡状的大结节；3分表示表面有50～100个泡状大结节；4分表示肝高度肿胀，表面有许多融合的泡状大结节；5分表示表面泡状结节融合为团块状。

利用SPSS 22.0进行方差分析，对肝指数、平均增重、料肉比、肝脏病变记分进行组间差异的显著性检验。

结果：

(1)临床症状：

初次免疫、二次加强免疫后各组并未出现明显不良反应，说明重组蛋白具有良好的安全性。在经口感染1×10⁴个/只孢子化卵囊后攻虫对照组出现兔肝球虫病典型症状：感染后前两周症状不明显，感染后第三周表现为食欲减退，精神沉郁，喜卧；消瘦，腹泻偶有便秘；可视黏膜黄染，腹围增大，肝区触诊敏感；而rEs-SAG13免疫组和rEs-SAG14免疫组兔肝球虫病临床症状不明显，感染后第三周偶有食欲稍减退，可视黏膜轻度黄染，腹围略有增大。经口感染后各组均未出现死亡。

(2)卵囊排出量：

感染后21d进行卵囊排出量的检查，空白对照组的粪便样本中未检查到斯氏艾美耳球虫卵囊；攻虫对照组平均OPG达1.83×10⁶，而rEs-SAG13免疫组和rEs-SAG14免疫组的平均OPG与攻虫对照组相比均显著减少，分别为3.15×10⁵(P＜0.01)和8.84×10⁵(P＜0.05)(表6)。rEs-SAG13免疫组和rEs-SAG14免疫组的卵囊减少率分别达82.8％和51.9％。

(3)相对增重、料肉比和肝指数：

初次免疫、二次免疫和攻虫时各组体重无明显差异。感染21d后攻虫对照组平均体重为2461.2g±450g与空白对照组平均体重2642.5g±182g、rEs-SAG13免疫组平均体重2488.5g±168g、rEs-SAG14免疫组平均体重2401.2g±411g均无明显差异(P＞0.05)；但攻虫对照组的平均增重显著低于免疫组和空白对照组(P＜0.05)，相对增重率仅为空白对照的39.08％，感染后14d-21d个别试验兔体重出现负增长；rEs-SAG13免疫组平均增重与空白对照无显著差异(P＞0.05)，相对增重率达88.77％；rEs-SAG14免疫组平均增重与空白对照差异明显(P＜0.05)，相对增重率为67.48％(表6)。

攻虫对照组自感染起到感染后21d的料肉比达9.67:1，而空白对照组料肉比为3.78:1，rEs-SAG13免疫组料肉比为4.26:1，rEs-SAG14免疫组料肉比为5.60:1。各组肝指数均有明显差异，攻虫对照组的平均肝指数达6.66，而空白对照组平均肝指数为3.44，rEs-SAG13免疫组平均肝指数为4.52较攻虫对照组差异显著(P＜0.05)，rEs-SAG14免疫组平均肝指数为5.27(表6)。

(4)解剖病变与病变记分：

剖检发现空白对照组肝脏无病变，而攻虫对照组出现兔肝球虫病典型病理变化：肝脏高度肿胀，充满整个前腹部，表面布满黄白色融合豆状甚至融合的泡状结节；胆囊扩张，胆汁瘀滞，大部分胆囊都充满黄色渗出物，腹水明显，膀胱积尿；rEs-SAG13免疫组病变较轻微，肝脏肿胀不明显，有一定数量的粟粒状或豆状结节，有的有少许泡状结节；rEs-SAG14免疫组肝脏明显肿胀，肝表面有一定量的泡状大结节，且组内存在明显差异(图6)。对各组进行肝脏病变记分，攻虫对照组平均病变记分为4.2，rEs-SAG13免疫组平均病变记分为2.7，较攻虫对照组差异极显著(P＜0.01)，rEs-SAG14免疫组平均病变记分为3.7，较攻虫对照组差异不显著(P＞0.05)(表6)。

表6免疫保护评价指标统计结果

注：同列数据后所标字母不同表示差异显著(P＜0.05)，所标字母相同表示差异不显著(P＞0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 抗原蛋白的应用、引物组以及试剂盒

<130> MP21033250

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgacggagca caacaagaa 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaccaggct ctcaaatacg c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agttcgggga gaatctgtat g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taagtggacg ttggacgtg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagcggaag agaaagagg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgtgtgttt gacttctccg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgaacttcg gagccattc 19

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacaggacag caggatcaag 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccgaaccct gagaaatac 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctttacaat cccaagcga 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctacaggggc ttccatacg 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gttgcgagaa aggcatgat 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgaagatgaa gaggatgagg a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgtttcttc cacttccgat 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaggagtgcg acgagtctg 19

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcaagactcc caacaacact g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tctgagaagg agccctcagc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgccttgtc cttgctggtg 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggcggacg aggaggttca g 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggagcatcat cacccgcaac tc 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggagttgacg aaagggcacc ac 22

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gccatgcacc accacccata g 21

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgggatccat gaacgcggct cgagcc 26

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cggaattctt acaagagtga atacacgaga gggg 34

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgggatccat gggagaggaa tccgg 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cggaattcct aaaatccgcc ctggt 25

Claims (4)

1.扩增SAG13的引物组，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

2.扩增SAG14的引物组，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

3.如权利要求1或2所述的引物组在制备扩增或检测SAG13和/或SAG14的试剂盒中的应用。

4.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的引物组，以及药学上可接受的辅料或助剂。