CN114262726A - 一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，以胞苷和氯化胆碱作为底物，ATP和多聚磷酸盐作为磷源供体，多酶体系下进行反应催化合成胞磷胆碱钠。反应转化率>99％时，反应液加热过滤、纳滤、浓缩后过柱纯化，洗脱液浓缩后加入95％乙醇结晶获得胞磷胆碱钠粗品，粗品进一步精制获得胞磷胆碱钠成品。成品HPLC纯度>99％，总收率>90％。

Description

一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法

技术领域

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法。

背景技术

胞磷胆碱钠(Citicoline or CDP-choline)是细胞膜磷脂质中的主要成分，作为内源性合成磷脂酰胆碱的中间体可促进神经细胞膜磷脂的合成。其作为脑代谢激活剂，具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力等作用。临床上主要用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍；治疗帕金森氏综合症；神经性耳聋；对老年痴呆症、抑郁症、延缓衰老，提高学习效果和记忆力等有一定疗效。

目前，生产胞磷胆碱钠的方法主要有三种，包括化学合成法、微生物转化法和酶催化合成法。化学合成法存在反应转化率低、副产物较多、生产成本高、环境污染严重且安全隐患多等问题。

例如，中国专利文献CN201410250694.4A公开的制备方法，以胞苷酸、磷酸胆碱为底物，对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺存在下缩合成胞磷胆碱钠。其工艺路线如下：

此方法的缺陷在于，胞磷胆碱钠与缩合剂分离较难，产品不适合药用。

中国专利文献CN102016000492243A中公开的制备方法，以氯化磷酸胆碱钙盐为原料，通过与苯进行二元共沸除去氯化磷酸胆碱钙盐中的结晶水，再与碳酸钠反应生成碳酸钙沉淀，过滤后的固体粘稠物与乙酰氯反应，产物再与胞苷酸反应得到胞磷胆碱钠。

此方法虽一定程度上解决了胞磷胆碱钠和缩合剂分离难的问题，但其缺陷在于，步骤复杂，合成过程中带来大量的环境污染。

中国专利文献CN201610158305.4A中公开的制备方法，以二氯磷酰吗啉为原料，和乙二醇反应得到乙二醇酯磷酰吗啉；然后直接和胞苷酸缩合，得到乙二醇酯磷酰胞苷酸，最后三丁胺对乙二醇酯磷酰胞苷酸的乙二醇酯开环，得到胞磷胆碱钠。其工艺路线如下：

此方法的缺陷在于，原料二氯磷酰吗啉市场量较小，采购困难且价格较高，不利于工业化生产。

微生物转化法的原理为利用微生物细胞体内的酶系，在微生物细胞中将原料胞苷酸与磷酸胆碱进行多步酶催化反应进而得到目标产物胞磷胆碱钠。微生物转化法存在产物浓度低、杂质多、产率不高等问题。

中国专利文献CN201110232740.4B中公开的制备方法，以磷酸胆碱、5’-胞苷酸为底物，以葡萄糖作为能量供体，通过无机盐提高ATP再生速率，利用东方伊萨酵母(I.orientalis)透性细胞制备胞磷胆碱钠。其工艺路线如下：

此专利方法虽可利用酵母体内的酶系，以及酵母体内ATP进行胞磷胆碱钠的生成，但转化率不高，产物浓度较低；由于反应液中含有大量的葡萄糖和各种无机盐，给后续的分离纯化带来较大困难。中国专利文献CN201310358526.2B中通过化学诱变选育高活力CMP激酶和高活力磷酸胆碱胞苷酰转移酶的酿酒酵母菌株，以求提高胞磷胆碱钠的转化率，虽转化率有提升，但上述问题依然存在。

中国专利文献CN201110052603.2A中公开的制备方法，通过将来源于酵母的磷酸胆碱转胞苷酰酶(CTT)、及E.coli中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿苷酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(NDK)和胞苷三磷酸连接酶(pyrG)整合至E.coli 工程菌中获得重组菌K1-E/pUGG-CCT，利用重组菌在含有葡萄糖、乳清酸、磷酸胆碱、多种无机盐及有机溶剂的液体中进行生物转化获得胞磷胆碱钠。

此专利方法改用成本较便宜的乳清酸替代传统的5’-胞苷酸做底物，一定程度上降低了成本，但由于乳清酸至胞磷胆碱的生物路线过于繁长，所需酶系过于繁多，各个酶在重组菌中的表达情况不一，致使反应控制较困难，从而影响转化率及产率。此方法想法较好，但离生产放大还有很长一段距离。

酶催化合成法最早期是利用磷酸胆碱转胞苷酰酶(CTT)催化胞苷三磷酸(CTP)和磷酸胆碱合成胞磷胆碱钠，此方法成本太高。

近年来，广大的生物化学工作者们一直在探索一种温和、高效、经济、方便、对环境友好的胞磷胆碱钠制备工艺方法。生物工作者针对酶催化合成法成本较高的缺点，开发了以胞苷酸和氯化胆碱为原料，多酶体系催化合成胞磷胆碱钠的方法(Appl MicrobiolBiotechnol 101:1409-1417)，反应式如下所示：

此方法的优点是以成本更低的5’-胞苷酸和氯化胆碱替代价格昂贵的CTP和磷酸胆碱，利用ATP再生体系循环利用ATP降低其添加量，一定程度上降低了生产成本。但此方法的缺点是ATP再生体系中乙酰磷酸盐的添加会抑制酶的催化活性，造成转化率不高，或者底物浓度不高。此方法还不具备产业化条件。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中胞磷胆碱钠制备方法反应步骤复杂、收率低、成本较高、环境污染严重且安全隐患较多的问题，进而提供一种反应步骤简单、收率高、成本低、环保且安全的制备胞磷胆碱钠的方法。

本发明所要解决的第二个问题是提供酶法制备胞磷胆碱钠所需要的酶。

本发明所要解决的第三个问题是提供一种可产业化应用的制备胞磷胆碱钠的生产工艺。

本发明提供一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其中，所述胞磷胆碱钠结构如下：

所述利用胞苷酶法制备胞磷胆碱钠的方法包括以下步骤：

a、取胞苷溶于水中，加入ATP、多聚磷酸盐、UCK酶液和PPK酶液，于预定温度、PH 值条件下反应一段时间，得到反应液A；

b、在所述反应液A中继续加入氯化胆碱、CMK酶液、NDK酶液、CCT酶液和CKI酶液，在预定温度、PH值条件下继续反应一段时间，得到反应液B，HPLC监控反应进程；

c、当所述反应液B的转化率到达预定数值时，所述反应液B加热搅拌后过滤，滤液进行纳滤，得到纳滤浓液；

d、所述纳滤浓液过柱树脂，水洗去杂质，HCl洗脱，洗脱液浓缩，得到浓缩液；

e、所述浓缩液调pH到预定值，加入溶媒，搅拌降温结晶，固液分离后固体即胞磷胆碱钠粗品；

f、所述胞磷胆碱钠粗品进一步精制得到胞磷胆碱钠成品。

具体的，a步骤中预定温度为35～37℃、PH6.0～PH8.0，ATP、多聚磷酸盐的加入量分别为底物胞苷摩尔当量的0.01～0.03eq、1～3eq；UCK酶液和PPK酶液加入量分别为胞苷重量的10～30％、10～30％；反应时间为8～12h。

具体的，a步骤中多聚磷酸盐为三聚磷酸钠、四聚磷酸钠或六偏磷酸钠中的一种。

具体的，b步骤中氯化胆碱的加入量为底物胞苷摩尔当量的1～1.3eq，CMK酶液、NDK 酶液、CCT酶液和CKI酶液的加入量分别为胞苷重量的10～30％、10～30％、10～30％和10～30％；反应时间为12～16h。

具体的，c步骤中加热温度为70～90℃，搅拌时间10～30min；纳滤选择200道尔顿的纳滤膜。

具体的，d步骤中树脂为强碱性阴离子交换树脂，HCl洗脱液浓度为0.05～0.1M；浓缩采用减压蒸馏，浓缩至胞磷胆碱钠浓度为200～400g/L。

具体的，e步骤中浓缩液调pH值为6.0～8.0，溶媒为95％乙醇，加入量为浓缩液体积的3～5倍；搅拌转速为50～150rpm；温度为0～10℃；分离时间为10～20h。

具体的，f步骤中进一步精制的步骤为：胞磷胆碱钠粗品加纯水重新溶解后，加入活性炭搅拌过滤，滤液加入3～4倍体积的95％乙醇，搅拌下降温至0～10℃，10～20h后分离固液，固体真空干燥后即为胞磷胆碱钠成品。

本发明所述酶法制备胞磷胆碱钠的反应式如下：

本发明的上述技术方案，相比现有的技术具有以下优点：

(1)相比较现有生产工艺利用胞苷酸和磷酸胆碱作为起始原料，本发明则选择以胞苷和氯化胆碱作为起始原料，后者价格便宜，极大地程度上降低了成本；

(2)底物转化率>99％，不仅保证了高收率，同时也简化了后续的分离纯化；

(3)反应过程中可以控制各个酶之间的比例，使反应平衡达到最佳，且无副产物；

(4)反应条件常温、常压、水相无有机溶剂、安全环保，适合于工业化生产。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。

实施例1

a、胞磷胆碱钠的酶催化反应：

取自来水940ml于2000ml的三口瓶中，加入胞苷50g，六偏磷酸钠100g，ATP.2Na1.1g，升温至37℃，调pH值至7.0，再加入UCK酶液10g，PPK酶液10g，37℃下搅拌反应8h，HPLC监控反应进程。

b、胞磷胆碱钠的酶持续催化反应：

反应8h后，加入氯化胆碱34g，CMK酶液10g，NDK酶液10g，CCT酶液10g和CKI酶液10g，37℃下搅拌反应16h，过程中取样检测，HPLC监测反应进程。

c、胞磷胆碱钠的酶催化反应终止：

16h后HPLC监测胞苷转化率>99％，将反应液加热至80℃，保温搅拌15min后过滤去除固体不溶物；将滤液进行纳滤，纳滤选择200道尔顿的纳滤膜。

d、胞磷胆碱钠反应液后处理粗制：

纳滤后的浓液上柱强碱性阴离子树脂，水洗去除杂质，0.05M HCl洗脱下胞磷胆碱，减压浓缩至胞磷胆碱钠浓度为300g/L。

e、胞磷胆碱钠粗品浓缩液固液分离：

将d步骤中得到的浓缩液调pH值至7.0，加入4倍体积的95％乙醇，降温至0℃，保温搅拌结晶16h后进行固液分离，获得的固体即胞磷胆碱钠粗品。胞磷胆碱钠粗品的HPLC 纯度>99％。

f、胞磷胆碱钠的精制：

将胞磷胆碱钠粗品加纯水溶解至浓度为300g/L，加入粗品重量1％的活性炭搅拌脱色 30min后过滤，滤液中加入5倍体积的95％乙醇，降温至0℃，保温搅拌结晶16h后进行固液分离，固体用80％乙醇淋洗，真空干燥后即得胞磷胆碱钠成品，共计95g。胞磷胆碱钠成品的HPLC纯度>99.5％，总收率>90％。

实施例2

在实施例1中a和b步骤中使用的UCK、PPK、CMK、NDK、CCT和CKI酶液的制备方法如下：

将分别表达UCK、PPK、CMK、NDK、CCT和CKI酶的重组E.coli菌株的单菌落接种到5ml液体LB培养基，37℃振荡培养12h，取振荡培养后的培养液以1％的接种量转接于100ml液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600值达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，再置于37℃振荡培养16h。培养结束后将培养液于8000rpm下离心10min收集细胞，加10ml 水重悬细胞，将重悬的细胞置于冰浴中超声破碎细胞，将破碎液于8000rpm下离心10min，收集上清液即得到所述用于合成胞磷胆碱钠所需的UCK、PPK、CMK、NDK、CCT和CKI酶液。

实施例3

基于实施例1，其中a步骤胞磷胆碱钠的酶催化反应可以替换以下方法：

取自来水940ml于2000ml的三口瓶中，加入胞苷50g，三聚磷酸钠50g，ATP.2Na1.1g，升温至35℃，调pH值至6.0，再加入UCK酶液10g，PPK酶液10g，35℃下搅拌反应12h，HPLC监控反应进程。

实施例4

基于实施例1，其中b步骤胞磷胆碱钠的酶持续催化反应可以替换以下方法：

反应12h后，加入氯化胆碱34g，CMK酶液10g，NDK酶液10g，CCT酶液10g和CKI 酶液10g，37℃下搅拌反应15h，过程中取样检测，HPLC监测反应进程。

实施例5

基于实施例1，其中c步骤胞磷胆碱钠的酶催化反应终止可以替换以下方法：

15h后HPLC监测胞苷转化率>99％，将反应液加热至90℃，保温搅拌20min后过滤去除固体不溶物；将滤液进行纳滤，纳滤选择200道尔顿的纳滤膜。

实施例6

基于实施例1，其中d步骤胞磷胆碱钠反应液后处理粗制可以替换以下方法：

纳滤后的浓液上柱强碱性阴离子树脂，水洗去除杂质，0.1M HCl洗脱下胞磷胆碱，减压浓缩至胞磷胆碱钠浓度为400g/L。

实施例7

基于实施例1，其中e步骤粗品浓缩液固液分离可以替换以下方法：

调pH7.0，滤液加入5倍体积的95％乙醇，降温至10℃，保温搅拌结晶20h后进行固液分离，获得的固体即胞磷胆碱钠粗品。胞磷胆碱钠粗品的HPLC纯度>99％。

实施例8

基于实施例1，其中f步骤胞磷胆碱钠的精制可以替换以下方法：

将胞磷胆碱钠粗品加纯水溶解至浓度为400g/L，加入粗品重量1％的活性炭搅拌脱色 30min后过滤，滤液加入3倍体积的95％乙醇，降温至5℃，保温搅拌结晶12h后进行固液分离，固体用80％乙醇淋洗，真空干燥后即得胞磷胆碱钠成品，共计95g。胞磷胆碱钠成品的HPLC纯度>99.5％，总收率>90％。

需要说明的是，上述步骤实施例1的a步骤，按照顺序，升温至37℃还可替换为35～37℃之间的任意值，调pH值至7.0还可替换6.0～8.0之间的任意值，8h还可以替换为8～12h之间的任意值。

需要说明的是，上述步骤实施例1的b步骤，按照顺序，反应8h还可以替换为8～12h之间的任意值，37℃还可替换为35～37℃之间的任意值，反应16h还可以替换为12～16h之间的任意值。

需要说明的是，上述步骤实施例1的c步骤，按照顺序，16h还可以替换为12～16h之间的任意值，加热至80℃还可替换为70～90℃之间的任意值，搅拌15min还可以替换为 10～30min之间的任意值。

需要说明的是，上述步骤实施例1的d步骤，按照顺序，0.05M HCl还可以替换为0.05～0.1M之间的任意值，300g/L还可替换为200～400g/L之间的任意值。

需要说明的是，上述步骤实施例1的e步骤，按照顺序，调pH7.0还可替换6.0～8.0之间的任意值，4倍体积可以替换3～5之间的任意值，降温至0℃还可替换为0～10℃之间的任意值，16h可以替换10～20h之间的任意值。

需要说明的是，上述步骤实施例1的f步骤，按照顺序，300g/L还可替换为200～400g/L 之间的任意值,30min还可以替换为10～30min之间的任意值,5倍体积可以替换3～5之间的任意值，降温至0℃还可替换为0～10℃之间的任意值，16h可以替换10～20h之间的任意值。

综上所述，相比较现有生产工艺利用胞苷酸和磷酸胆碱作为起始原料，本发明则选择以胞苷和氯化胆碱作为起始原料，后者价格便宜，极大地程度上降低了成本；底物转化率>99％，不仅保证了高收率，同时也简化了后续的分离纯化；反应过程中可以控制各个酶之间的比例，使反应平衡达到最佳，且无副产物；反应条件常温、常压、水相无有机溶剂、安全环保，适合于工业化生产。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来讲，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变动或变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申的显而易见的变动或变化仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取胞苷溶于水中，加入ATP、多聚磷酸盐、UCK酶液与PPK酶液，于预定温度、PH值条件下反应一段时间，得到反应液A；

b、在所述反应液A中继续加入氯化胆碱、CMK酶液、NDK酶液、CCT酶液和CKI酶液，在预定温度、PH值条件下继续反应一段时间，得到反应液B，HPLC监控反应进程；

c、当所述反应液B的转化率到达预定数值时，所述反应液B加热搅拌后过滤，滤液进行纳滤，得到纳滤浓液；

d、所述纳滤浓液过柱树脂，水洗去杂质，HCl洗脱，洗脱液浓缩，得到浓缩液；

e、所述浓缩液调pH到预定值，加入溶媒，搅拌降温结晶，固液分离后固体即胞磷胆碱钠粗品；

f、所述胞磷胆碱钠粗品进一步精制得到胞磷胆碱钠成品。

2.根据权利要求1所述的一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述a步骤中预定温度为35～37℃、PH6.0～PH8.0，ATP、多聚磷酸盐的加入量分别为底物胞苷摩尔当量的0.01～0.03eq、1～2eq；UCK酶液和PPK酶液加入量分别为胞苷重量的10～30％、10～30％；反应时间为8～12h。

3.根据权利要求1所述的一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述a步骤中多聚磷酸盐为三聚磷酸钠、四聚磷酸钠、六偏磷酸钠中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述b步骤中预定温度为35～37℃、PH6.0～PH8.0，氯化胆碱的加入量为底物胞苷摩尔当量的1～1.3eq，CMK酶液、NDK酶液、CCT酶液和CKI酶液的加入量分别为胞苷重量的10～30％、10～30％、10～30％和10～30％；反应时间为12～16h。

5.根据权利要求1所述的一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述c步骤中当转化率>99％时,加热温度为70～90℃，搅拌时间10～30min；纳滤选择200道尔顿的纳滤膜。

6.根据权利要求1所述的一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述d步骤中过柱树脂为强碱性阴离子交换树脂；HCl洗脱液浓度为0.05～0.1M；浓缩采用减压蒸馏，浓缩至胞磷胆碱钠浓度为200～400g/L。

7.根据权利要求1所述的一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述e步骤中浓缩液调pH值为6.0～8.0，溶媒为95％乙醇，加入量为浓缩液体积的3～5倍；搅拌转速为50～150rpm；温度为0～10℃；分离时间为10～20h。

8.根据权利要求1所述的一种利用胞苷酶法合成胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述f步骤中进一步精制的步骤为：胞磷胆碱钠粗品加纯水重新溶解后，加入活性炭搅拌过滤，滤液加入3～5倍体积的95％乙醇，搅拌下降温至0～10℃，10～20h后分离固液，固体真空干燥后即为胞磷胆碱钠成品。